CN106456676B - 经刺激的干细胞的培养基的毛发生长促进功能及其用途 - Google Patents

经刺激的干细胞的培养基的毛发生长促进功能及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN106456676B
CN106456676B CN201580027898.4A CN201580027898A CN106456676B CN 106456676 B CN106456676 B CN 106456676B CN 201580027898 A CN201580027898 A CN 201580027898A CN 106456676 B CN106456676 B CN 106456676B
Authority
CN
China
Prior art keywords
hair
stem cells
medium
cells
conditioned medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201580027898.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106456676A (zh
Inventor
梁允瑄
吴元一
李章荣
崔秀眞
田洪培
金珠渊
林勋
辛承炫
朴元锡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Medipost Co Ltd
Original Assignee
Medipost Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Medipost Co Ltd filed Critical Medipost Co Ltd
Publication of CN106456676A publication Critical patent/CN106456676A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106456676B publication Critical patent/CN106456676B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/98—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin
    • A61K8/981—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin of mammals or bird
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/35—Fat tissue; Adipocytes; Stromal cells; Connective tissues
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/37—Digestive system
    • A61K35/407—Liver; Hepatocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/51—Umbilical cord; Umbilical cord blood; Umbilical stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/98—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin
    • A61K8/981—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution of animal origin of mammals or bird
    • A61K8/983—Blood, e.g. plasma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q7/00—Preparations for affecting hair growth
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/80—Process related aspects concerning the preparation of the cosmetic composition or the storage or application thereof
    • A61K2800/91—Injection

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及预防脱发和促进毛发生长的组合物、其生产方法及其用途，所述组合物含有通过特定的退行期诱导物(包括TGF‑β)刺激的干细胞的培养基作为活性成分，以及该组合物的用途为通过退行期诱导物刺激干细胞而非常有效地生长毛发的功能的用途，从而使得能够分泌Wnt3a、Bcl‑2和细胞周期蛋白D‑1等(已知为与毛发组织分化相关的信号传递蛋白)。

Description

经刺激的干细胞的培养基的毛发生长促进功能及其用途
技术领域
本发明涉及用于预防脱发和促进毛发生长的组合物、其制造方法及其用途，所述组合物含有通过特定的退行期诱导物(包括TGF-β)刺激的干细胞的条件培养基作为活性成分。
背景技术
随着环境污染、压力、老龄化和工业发展的进行，秃头症(Alopecia)症状或脱发症状变得更加严重，并且随着福利时代的到来，对生活质量和躯体外观的关注日益增加。
秃头症(头发从头皮脱落的症状)是由各种原因引起的，包括例如内在因素(如遗传性状和雄性激素的作用)；日常生活中的精神压力；以及外部因素(如脂质过氧化物的积累)，并且已知秃头症症状由非常复杂的过程引起。
毛发光秃并不意味着毛发丧失并且永不再生长，而是毛发逐渐变得更细成为绒毛状毛发，并且存在于毛发根部中的真皮乳头变小。随着真皮乳头变得更小，毛发厚度也变得更细，并且毛发周期变得更短，从而使新生长的毛发变得更细。随着光秃不断发展，毛发变成绒毛状毛发，并且使毛发周期更短，从而在短的生长之后失去毛发。另外，目前还关注了已知为自身免疫性疾病的斑秃，以及归因于内分泌疾病、营养缺乏、药物、躯体或精神的压力(例如分娩等)而发生的暂时性秃头症。
最近，不仅是男性型秃头症，而且女性的肥胖性秃头症和年轻人秃头症正在逐渐增加。根据由韩国国家保障服务部的健康福利政策研究所在2009年发布的消息，2008年的国内秃头症患者的数量与2001年相比增加了至少60％。此外，儿童和青少年秃头症患者的数量从2006年的21,643例增加至2011年的23,025例，在5年中表现出了约6.4％的增加。
为了矫正上述脱发现象，市场上已经有了许多类型的毛发生长剂和毛发滋养剂。根据Economy 21的报告，在韩国当前的脱发服务国内市场中，化妆品和准药品占80％，且药品占约20％，其中，看过医生的秃头症患者仅占5％。目前，在使用毛发生长相关产品的人群中，约72.7％的使用者对产品不满意，并且除了由美国FDA在1998年(即大约15年前)公布的经批准的两种制剂
Figure BDA0001162074280000021
和
Figure BDA0001162074280000022
之外，并没有已批准的用于脱发治疗的疗法。因此，这两种制剂不足以治愈所有的各种类型的脱发相关的症状。特别地，作为非那雄胺制剂而制备的
Figure BDA0001162074280000023
并不是毛发生长剂，而是脱发预防剂。
Figure BDA0001162074280000024
仅具有通过阻断5-α还原酶而抑制DHT的产生来最大程度地延缓男性类型的秃头症的进展的作用。
在目前市场上可获得的毛发生长剂和毛发滋养剂(例如
Figure BDA0001162074280000025
和
Figure BDA0001162074280000026
)的情况下，由于应用激素制剂，该试剂可能引起副作用，或者它们仅在发根激活的区域发挥作用。因此，尽管该试剂具有有关预防脱发的作用，但是它们对处于长期休止期的毛发的生长(即毛发生长)的作用可忽略不计，或者只有当它们连续给予或施用时才可能表现出作用，因此，有必要开发用于解决秃头症或脱发症状的有成本效益且稳定的技术。韩国用于秃头症的治疗剂的研发水平在技术上落后于发达国家，并且急需研发用于预防脱发、促进毛发生长和毛发再生的治疗剂。关于针对韩国的脱发的研究，自1950年以来已经公开了关于毛发生长和发根再生的报告，但是由于缺乏再现性等，在过去的50年中毛发再生被认为是不可能的。
然而，美国宾夕法尼亚大学医学院的Costarelis教授在1990年首次发现了毛囊干细胞(Cell，1990)，成功地分离了人毛囊干细胞(J.Clin.Invest，2006)，并发布了其对于毛囊再生的可能性的研究结果(Nature，2007)，其再现性在那时被认为是不可能的，并且开辟了研究秃发本身的基础治疗的可能性。
最近，已经开发了使用基因和干细胞对脱发进行治疗的方法。作为本发明的基础，韩国专利号10-0771171(2007年10月29日)描述了用于毛囊干细胞的分离、扩增和分化的方法，以及用于秃发的治疗组合物。韩国专利申请公开号10-2008-0097593(2008年11月06日)描述了包含来源于人脂肪组织和毛囊细胞的多能干细胞的细胞治疗剂。此外，韩国专利号10-1218101(2013年1月3日)描述了用于促进毛发生长和预防脱发的组合物，该组合物包含来自羊水的胎儿来源的间充质干细胞的条件培养基作为活性成分。
然而，使用干细胞的上述试剂对毛发生长的作用并不充分，因此，正在进行使用干细胞的各种尝试，以开发用于对脱发进行治疗的有效治疗剂。
在这一方面，本发明人在努力鉴定来源于脐带血的间充质干细胞对毛发生长的作用的同时，发现与先前的看法相反，TGF-β(已知为引起脱发的物质)对脐带血干细胞的处理分泌了对毛发生长有效的蛋白质，并且还确认了通过培养用TGF-β刺激的干细胞而获得的条件培养基表现出比先前已知的案例更优秀的毛发生长促进效果，从而完成了本发明。
现有技术文献
专利文献
1.韩国专利号10-0771171(2007年10月29日)
2.韩国专利号10-1422559(2014年7月17日)
3.韩国专利申请公开号10-2013-0009117(2013年1月23日)
4.韩国专利申请公开号10-2014-0125735(2014年10月29日)
5.韩国专利申请公开号10-2008-0097593(2008年11月6日)
6.韩国专利号10-1218101(2013年1月3日)
非专利文献
1.Dong L，Hao H，Xia L，Liu J，Ti D，Tong C，Hou Q，Han Q，Zhao Y，Liu H，Fu X，Han W，Treatment of MSCs with Wnt1a-conditioned medium activates DP cells andpromotes hair follicle regrowth，Sci Rep.2014Jun 25，4：5432.doi:10.1038/srep05432。
2.Park BS，Kim WS，Choi JS，Kim HK，Won JH，Ohkubo F，Fukuoka H，Hair growthstimulated by conditioned medium of adipose-derived stem cells is enhanced byhypoxia:evidence of increased growth factor secretion，Biomed Res.，2010年2月，31(1)：27-34。
3.Jeong YM，Sung YK，Kim WK，Kim JH，Kwack MH，Yoon I，Kim DD，Sung JH，Ultraviolet B preconditioning enhances the hair growth-promoting effects ofadipose-derived stem cells via generation of reactive oxygen species，StemCells Dev，2013年1月1日，22(1)：158-68.doi:10.1089/scd.2012.0167.Epub 2012Aug13。
在本发明的整个申请文件中，参考了许多参考文献和专利文献，并且适当地指出了其引用。将所引用的参考文献和专利文献的公开内容以其整体作为参考并入本申请文件中，从而对本发明所属的技术领域的水平和本发明的公开内容进行更清楚地解释。
发明内容
技术问题
本发明使用通过特定的毛发退行期诱导物刺激的干细胞的条件培养基，通过刺激干细胞分泌与毛发组织分化相关的信号转导蛋白，并且本发明的主要目的是提供用于预防脱发和促进毛发生长的组合物，该组合物含有通过特定的毛发退行期诱导物刺激的干细胞的条件培养基。
本发明的另一目的是提供使用该组合物用于预防脱发和促进毛发生长的方法。
本发明的进一步的目的是提供有效使用该组合物的方法。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供了通过用特定的毛发退行期诱导物(包括TGF-β)刺激干细胞经由分泌与毛发组织分化相关的信号转导蛋白而利用非常有效的毛发生长功能的各种用途。
在示例性实施方式中，本发明提供了用于预防脱发和促进毛发生长的组合物，该组合物包含通过至少一种毛发退行期诱导物刺激的干细胞的条件培养基作为活性成分，所述毛发退行期诱导物选自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所组成的组。优选地，本发明提供了通过包括TGF-β的至少一种因子刺激的条件培养基。
由于通过毛发退行期诱导物刺激的干细胞产生了分泌Wnt3a、Bcl-2、细胞周期蛋白D-1等(已知为与毛发组织分化相关的信号转导蛋白)的效用，因此实现了预防脱发和促进毛发生长的作用。
具体而言，通过选自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所组成的组中的至少一种毛发退行期诱导物刺激的条件培养基具有以下功能：
(i)缩短毛发周期中的从休止期至生长期的转变时间；
(ii)产生真皮乳头细胞并促进长度方面的生长；
(iii)增加毛囊的数量和大小；以及
(iv)增加头皮皮肤的厚度。
特别地，干细胞可以是选自于由如下所组成的组中的至少一种：来源于骨髓、脐带血、脂肪、血液、肝脏和肠道、皮肤、胃肠道、胎盘、神经、肾上腺、上皮和子宫的人组织成体干细胞；以及胚胎干细胞。优选地，干细胞可以来源于骨髓、脐带血或脂肪；更优选来源于脐带血的成体干细胞，例如，来源于脐带血的间充质细胞。此外，待使用的脐带血优选为来源于人的脐带血。
通过毛发退行期诱导物刺激的干细胞的条件培养基的终浓度优选为10％至30％、终浓度更优选为25％。
另外，待使用的条件培养基可以是适用于动物细胞生长的任何基础培养基，且培养基的非限制性实例可以包括MEM(最低必需培养基)、DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)、RPMI(Roswell Park Memorial Institute培养基)和KM(角质形成细胞培养基)、KBM(角质形成细胞基础培养基)、EpiLife KM(角质形成细胞-EpiLife培养基)等，并且优选KM(角质形成细胞培养基)、KBM(角质形成细胞基础培养基)和EpiLife KM(角质形成细胞-EpiLife培养基)。
特别地，可以通过在将毛发退行期诱导物加入至干细胞后将干细胞刺激22小时至26小时，然后培养选自1至3天的时间段，获得通过选自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4等所组成的组中的毛发退行期诱导物刺激的干细胞的条件培养基。更具体的实例可以参考本发明的实施例。
在本发明中，通过包括TGF-β的毛发退行期诱导物刺激的干细胞分泌已知作为与毛发组织分化相关的信号转导蛋白的Wnt3a、Bcl-2和细胞周期蛋白D-1等，而干细胞的培养、本发明的干细胞的条件培养基的特征在于该条件培养基包含选自于由Wnt3a、Bcl-2和细胞周期蛋白D-1所组成的组中的至少一种蛋白质。
能够以药物组合物或化妆品组合物的形式来制备和提供本发明的组合物。
同时，在另一示例性实施方式中，本发明可以提供使用该组合物用于预防脱发和促进毛发生长的优选方法，如上所解释的，所述组合物含有通过毛发退行期诱导物刺激的干细胞的条件培养基，所述毛发退行期诱导物选自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所组成的组。
另外，本发明可以提供通过促进毛发生长来对脱发进行治疗的方法，所述方法使用含有通过毛发退行期诱导物刺激的干细胞的条件培养基作为活性成分的毛发生长促进组合物。
优选地，在本发明的方法中，可以通过局部涂抹或注射、更优选局部涂抹来使用皮肤外给予。
因此，本发明基于以下事实的发现：使用已知为脱发诱导物质的毛发退行期诱导物(例如TGF-β、BMP等)、更优选包括TGF-β的试剂对来源于脐带血的干细胞进行处理，能够分泌对毛发生长有效的蛋白质。这与常规的看法相反，并且本发明提供了经刺激的干细胞的条件培养基的优异的预防脱发和毛发生长作用及其各种用途。
附图说明
图1是示出了用通过TGF-β刺激的来源于各种来源的干细胞的条件培养基和对照组进行处理的hDPC的细胞增殖的评估结果的图；
图2是确认了在通过TGF-β刺激的干细胞的条件培养基中包含的、与毛发组织分化关联的信号转导系统相关蛋白的表达水平的蛋白质印迹结果；
图3是确认了在用通过TGF-β刺激的干细胞的条件培养基和对照组进行处理后，真皮乳头(DP)细胞长度生长的结果；
图4是关于用通过TGF-β刺激的干细胞的条件培养基和对照组进行处理后，毛囊形成数的图表和立体显微照片；以及
图5是确认了用通过TGF-β刺激的来源于UCB(脐带血)的干细胞的条件培养基和对照组涂覆CH3小鼠3周后的毛发生长特征的图片。
图6是确认了用通过TGF-β刺激的来源于脂肪和骨髓的干细胞的条件培养基和对照组涂覆CH3小鼠4周(28天)后的毛发生长特征的图片。
具体实施方式
本发明中使用的术语可以如下文所述进行定义。
“毛发生长促进”和“脱发预防”是具有相似含义的术语，它们是指本领域中的促进毛发形成和毛发生长以及预防脱发或毛发劣化的所有效果。
本文所使用的术语“干细胞”是指可以发育成任何组织的细胞。干细胞的两个基础特征是能够通过重复分裂产生自我的自我更新以及能够根据环境而分化成具有特定功能的细胞的多分化潜能。
本文所使用的术语“间充质干细胞”是指分离自人或哺乳动物且可来源于各种组织的一类未分化的成体干细胞。成体干细胞中的造血干细胞主要以非粘附状态存在，但是间充质干细胞通常是粘附细胞。特别地，间充质干细胞可以是脐带来源的间充质干细胞、脐带血来源的间充质干细胞、骨髓来源的间充质干细胞、脂肪来源的间充质干细胞、肌肉来源的间充质干细胞、神经元来源的间充质干细胞、皮肤来源的间充质干细胞、羊膜来源的间充质干细胞、胎盘来源的间充质干细胞，并且优选脐带血来源的间充质干细胞。从各组织中分离干细胞的技术是本领域已知的。
本文所使用的术语“条件培养基”是指包含在通过培养干细胞获得的培养基中含有的构成成分的物质，并且用于制备上述条件培养基的干细胞在其种类方面不受限制。例如，用于制备条件培养基的干细胞可以是胚胎干细胞或成体干细胞。此外，成体干细胞可以来源于所有组织的成体干细胞。在本发明的示例性实施方式中，使用脐带血来源的成体干细胞来制备条件培养基。优选地，通过将TGF-β向其中加入22小时至26小时进行刺激，随后培养选自1至3天的时间段而获得干细胞。
本文所使用的术语“分化”是指细胞中的现象，其中，细胞的结构或功能在通过细胞分裂的细胞生长期间特化，即，生物体的组织或细胞的形状或功能方面的渐进性变化，使得它们可以执行分配给它们的工作。通常，该术语是指将相对简单的系统分化为两个以上的不同性质的部分系统的现象。
本文所使用的术语细胞的“增殖”或“生长”是指通过细胞分裂使具有相同性质的细胞增加，并且通常是指多细胞生物体的躯体中的细胞数目的增加。当增殖(扩增)后的细胞的数量达到一定时期时，细胞的特征在其变化(分化)时受到调整。
本文所使用的术语“培养基”是指细胞的体外生长和增殖所必需的混合物，包含细胞生长和增殖所必需的元素，例如氨基酸、各种营养物质、血清、生长因子、无机物质等。特别地，本发明的培养基是用于干细胞的生长和增殖的培养基。
本文所使用的术语“基础培养基”是指含有细胞存活所需的糖、氨基酸和水等而不包含血清、营养物质和各种生长因子的混合物。可以通过人工合成加以制备或通过购买可商购的培养基来使用本发明所述的基础培养基。商业上制备的培养基可以包括例如DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)、EDM(内皮分化培养基)、MEM(最低必需培养基)、BME(基础培养基Eagle)、RPMI 1640、F-10、F-12、α-MEM(α-最低必需培养基)、G-MEM(Glasgow最低必需培养基)和Iscove改良的Dulbecco培养基，但不限于此。
本文所使用的术语“治疗”是指为了获得有利或优选的临床结果的手段(access)。对于本发明的益处，有利或优选的临床结果作为非限制性实例可包括症状缓解、疾病范围缩小、疾病状态稳定(即不恶化)、疾病进程延迟或减弱、疾病状态(部分或全部地)改善或暂时缓解和变好、以及存在物的可检测或不可检测。术语“治疗”同时指治疗性处理和预防性或防治性治疗方法。治疗不仅包括可预防伤残，而且还包括在已经发生的伤残中所需的治疗。术语“缓和(palliating)”是指相对于未进行治疗的情况而言的不期望的临床征象和/或疾病状态范围的减小和/或进展时程的延长或延伸。
本文所使用的术语“有效量”是指能够影响有利或期望的临床结果或生化结果的合适的量。有效量可以一次给予或多次给予。有效量是适于暂时缓解、改善、稳定、逆转、减缓或延缓疾病状态进展的量。在本发明中，有效量是指缓解或延缓脱发进展或促进毛发生长所需的量。如果待获得益处的动物可以耐受组合物的给予，或者该给予适合于动物，则该组合物被认为是“药学上或生理上可接受的”。当给予的量在生理学上重要时，可以认为制剂以“治疗学上有效量”给予。当制剂本身的存在引起有益患者数量方面的生理学上可检测的变化时，该制剂被认为是生理上有意义的。
本文所使用的术语“约”是指相对于参比的量、水平、值、数量、频次、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度而言，变化程度为30％、25％、20％、25％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的量、水平、值、数量、频次、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。
在本发明的申请文件中，除非在上下文中另有需要，否则术语“包括/包含(include/including)”应当解释为包括/包含所表明的步骤或成分或者步骤或成分的组，但并不排除其它可选的步骤或成分或者步骤或成分的组。
下面将对本发明进行详细描述。
本发明涉及用特定因子处理的干细胞的条件培养基的特定功能(即，预防脱发和促进毛发生长的功能)及其用途。
可用作用来显著预防脱发和促进毛发生长的毛发退行期诱导物的因子为选自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF、BMP2/4等所组成的组中的至少一种，最优选包括TGF-β的因子。
干细胞是能够自我复制并分化成两种以上细胞的细胞，并且根据其来源可以使用胚胎干细胞或成体干细胞。在本发明中，待使用的干细胞可以是来源于各种组织来源的成体干细胞，例如来源于脂肪、子宫、骨髓、肌肉、胎盘、脐带血或皮肤(上皮)的组织。特别地，优选间充质干细胞(MSC)。间充质干细胞通常是有助于血细胞生成的基质，并且可以分化成各种中胚层细胞，并且容易增殖且同时保持未分化状态。在示例性实施方式中，使用来源于脂肪、骨髓和脐带血的间充质干细胞(MSC)。最优选使用来源于脐带血的间充质干细胞。
脐带血是指来自脐带的血液，并且含有大量的产生白细胞、红细胞和血小板等的造血干细胞以及内皮祖细胞，而且还含有产生软骨、骨骼、肌肉、神经等的间充质干细胞，因此，其具有高的药用价值。脐带血的特征不仅在于造血干细胞的数量以高于骨髓或外周血液中的浓度存在于脐带血中，而且还在于脐带血具有比起骨髓中发现的造血干细胞而言显著更高的增殖能力、自我复制能力和分化能力。另外，脐带血可以通过简单的外科手术从待丢弃的脐带中获得，并且相对于其量而言还有相对大量的造血干细胞和干细胞。因此，在优选的实施方式中，本发明使用人脐带血来源的间充质干细胞(hUCB-MSC)。
特别地，脐带血来源的间充质干细胞：(i)当作为细胞治疗剂使用时，与来源于其它组织的干细胞不同，其几乎没有免疫排斥；(ii)由于它们是从待丢弃的胎盘和脐带中收集的，因而并不会伴有从中获取干细胞的受试者的病痛；以及(iii)当施用时，可以直接施用至患有疾病的区域。特别地，其优点在于，当将该间充质干细胞移植入实际靶区域中时，旁分泌效应被激活，并因此分泌能够治疗、复原或恢复患有疾病的区域的因子(蛋白质、细胞因子)，从而治愈疾病。
待用于分离和培养从脐带血收集的间充质干细胞的方法可以为本领域已知的任何方法(Pittinger MF，Mackay AM等，Science，284：143-7，1999；Lazarus HM，HaynesworthSE等，Bone Marrow Transplant，16：557-64，1995)，例如，可以使用包括韩国专利号10-0494265中公开的方法在内的所有常规方法。在本发明的实施方式中，可以使用以下方法。
通过离心将单核细胞从收集的脐带血中分离，并洗涤数次以除去杂质。将所得到的单核细胞通过以适当的密度接种在培养容器中进行培养，从而使细胞能够增殖，并同时形成单层。本文中，当在相差显微镜下观察时，以具有长的均匀的纺锤形状的集落的形式增殖的细胞为间充质干细胞。然后当细胞生长至融合时，将细胞进行传代培养和增殖直至获得适当数量的细胞。
特别地，本发明的特征在于优选通过用特定的毛发退行期诱导物进行处理来刺激干细胞。退行期诱导物包括选自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所组成的组中的至少一种因子，并且最优选TGF-β。
相对于细胞体积，用于处理的毛发退行期诱导物的浓度为8-15ng/mL、优选8-12ng/mL、最优选9-11ng/mL。在本发明的示例性实施方式中，当细胞融合被确定为80％以上时，用约10ng/mL的毛发退行期诱导物对细胞进行处理。
TGF-β是具有各种功能的细胞因子，并且是已知通过经由Smads调节TGF-β相关基因的表达而与细胞生长和分化、炎症反应、细胞凋亡和细胞的基质合成密切相关的物质，其是存在于细胞质中的转录因子并且据报道参与毛囊细胞的坏死。
脱发的最大原因是作为激素的二氢睾酮(DHT)缀合至作为还原剂的5-α-还原酶和睾酮，并且进入正常毛发细胞的DHT递送了破坏细胞核信号的DNA细胞，从而导致减小毛囊尺寸或损坏以及脱发。特别地，毛囊细胞凋亡因子通过毛发细胞的DNA破坏信号来攻击邻近的毛囊细胞，从而导致脱发，毛囊的坏死因子的实例包括BMP、DKK-1和TGF-β(J Cell.Sci，2006，J.Anat.，2003)。也就是说，TGF-β或BMP等是已知的诱导脱发的物质。
因此，为了预防脱发和促进毛发生长的效果而用这些物质对干细胞进行处理是本领域普通技术人员不容易想到的技术，并且它也是构成了本发明的重要特征的特点。
本发明人首次确认了通过用选自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所组成的组中的至少一种毛发退行期诱导物进行处理来刺激干细胞分泌出了有效用于毛发生长的物质。
用这些因子刺激的干细胞分泌出了已知为与毛发组织分化相关的信号转导蛋白的Wnt3a、Bcl-2和细胞周期蛋白D-1等，并且通过这些蛋白质可以进一步改善预防脱发和促进毛发生长的功能。
因此，在本发明中，通过选自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所组成的组中的至少一种毛发退行期诱导物刺激的干细胞的条件培养基包含选自于由Wnt3a、Bcl-2和细胞周期蛋白D-1所组成的组中的至少一种蛋白质。
在优选的实施方式中，可以通过向干细胞添加TGF-β而将干细胞刺激22小时至26小时、最优选约24小时，获得经毛发退行期诱导物刺激、例如经TGF-β刺激的干细胞的条件培养基。优选地，将经刺激的干细胞培养选自1至3天的时间段。代表性的制备方法可以参考本发明的实施例。
因此，在另一示例性实施方式中，本发明包括通过用毛发退行期诱导物刺激干细胞来制备用于预防脱发和促进毛发生长的干细胞的条件培养基的方法。
干细胞的条件培养基的终浓度优选为约10％至50％、更优选约10％至30％、甚至更优选20％至30％、并且最优选约25％。
特别地，本发明的干细胞可通过本领域已知的方法进行增殖和培养。
作为合适的培养基，可以使用可在实验室中制备的伴随有用于培养动物细胞(特别是哺乳动物细胞)所必需或所开发的合适组分(例如合成代谢碳、氮和/或痕量营养物)的任何可用的培养基。
作为非限制性实例，培养基是适合于动物细胞生长的任何基础培养基，并且通常用于培养的基础培养基可以包括MEM(最低必需培养基)、DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)、RPMI(Roswell Park Memorial Institute培养基)和KM(角质形成细胞培养基)，以及可以不受限地使用的本领域中使用的任何培养基。优选地，培养基可以选自于由如下所组成的组：α-MEM培养基(GIBCO)、KM(角质形成细胞培养基)、KBM(角质形成细胞基础培养基)、EpiLife KM培养基(角质形成细胞-EpiLife培养基)、DMEM培养基(Welgene)、MCDB 131培养基(Welgene)、IMEM培养基(GIBCO)、DMEM/F12培养基、PCM培养基、M199/F12(混合物)(GIBCO)和MSC扩增培养基(Chemicon)。
可以向基础培养基中加入痕量营养物、氮和碳的合成代谢供应源，并且作为非限制性实例，可以加入血清供应源、生长因子、氨基酸、抗生素、维生素、还原剂和/或糖供给源。然而，显而易见的是，本领域普通技术人员可以选择用于来源于各种组织来源的干细胞的最合适的培养基，或者根据已知的方法组合并适当地培养。在本发明的实施方式中，使用α-MEM培养基和K-SFM培养基等。
另外，显然可以基于本领域的常识，在调节例如培养环境、时间、温度等条件的同时对干细胞进行培养。
在示例性的实施方式中，将间充质干细胞培养在α-MEM培养基中，直至细胞融合为约80％-90％、优选约90％，并且例如，使用PBS等对间充质干细胞进行洗涤，然后进一步在K-SFM培养基中培养约20小时至25小时、优选24小时。
本文所使用的术语“融合(％)”是表示本领域常规使用的每面积的细胞浓度(饱和程度)的术语，以及本领域普通技术人员在实验中频繁使用的相对地表示每单位面积的细胞数(细胞浓度)的单位。本发明还包括制备这些尺寸为8μm以下的干细胞及用于该干细胞的条件培养基的方法。
同时，该方法可以进一步包括用胰蛋白酶对在根据本发明的培养基中培养的干细胞进行处理的步骤。当用胰蛋白酶对经培养的干细胞进行处理时，可以获得处于单核细胞形状的干细胞。特别地，胰蛋白酶进行处理以抑制细胞之间的积聚，从而获得单细胞形状，并且可以使用能够抑制细胞之间形成积聚的任何物质。
可以使用本领域中常规已知的容器进行干细胞的培养。例如，可以使用三维生物反应器或旋转器、或者在普通的粘附容器中培养干细胞。
本发明涉及通过选自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所组成的组中的至少一种毛发退行期诱导物刺激的条件培养基的用途，所述条件培养基具有极其出色的预防脱发和促进毛发生长的作用。
特别地，通过这些因子刺激的干细胞的条件培养基包含已知为与毛发组织分化相关的信号转导蛋白的Wnt3a、Bcl-2和细胞周期蛋白D-1等，因此，通过真正的真皮乳头细胞的产生、长度生长的促进、毛囊数量和大小的增加、头皮厚度的增加等作用，它们不仅具有简单的延缓脱发症状的作用，而且还具有毛发生长的作用(即，毛发形成和生长的作用)。
用于减少DHT(其为脱发的原因)的药物(迄今为止所使用的)的实例包括使用非那雄胺制备的
Figure BDA0001162074280000141
然而，该药物的主要机理是该药物抑制5-α还原酶的作用以减少DHT，从而矫正脱发。
Figure BDA0001162074280000142
仅具有阻断5-α还原酶以抑制DHT形成的作用，从而最大程度地延缓男性类型脱发的进展。因此，
Figure BDA0001162074280000143
是用于男性的治疗剂，并因此具有如下局限：它不是用于促进毛发生长的试剂，而仅仅是用于预防脱发的试剂。
然而，通过选自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所组成的组中的至少一种毛发退行期诱导物(最优选包括TGF-β的诱导物)刺激的干细胞的条件培养基的优点在于其是用于预防脱发的药剂，同时也是用于促进毛发生长的出色的试剂。
在下文中，将对如下的条件培养基的脱发预防和毛发生长特性进行描述，所述条件培养基是通过选自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所组成的组中的至少一种毛发退行期诱导物刺激的干细胞的条件培养基。
(i)减少毛发周期中的从休止期至生长期的转变时间。
人毛发丧失，同时周期性地重复生长期、退行期和休止期，然后再次形成，并且毛发周期通过激素调节或多种生长因子的调节来建立。真皮乳头细胞具有生长期(其中生长变得活跃)、退行期(其中开始退化)和休止期的周期。在休止期后，当接收到来自相邻细胞的信号时，真皮乳头细胞进入生长期，并且建立细胞更新，并最终引起新的毛发的形成。
通过诱导物刺激的本发明的条件培养基并不具有归因于激素等的暂时性作用，而是通过使毛发周期调节正常化而具有永久性毛发生长效应的作用。
(ii)产生真皮乳头(DP)细胞，促进长度生长并显著增加毛囊的数量和大小。
毛囊是仅由哺乳动物拥有的皮肤的附属器官，从胎儿期产生，并且通过上皮和间充质之间的相互作用而形成。
胎儿期的毛囊的产生通过来自真皮的信号触发，其结果是上皮变厚并形成平板。来自厚的上皮平板的真皮信号诱导了来源于间充质的真皮细胞的凝集，并且从由此形成的凝集体再次发出真皮信号。该信号促进了真皮细胞的增殖，并同时诱导向上皮细胞的真皮侵袭，从而包围在凝集体的周围，并随后形成真皮乳头。因此，形成了第一毛囊结构，并且随着上皮细胞继续增殖和分化，它们发育成形成毛发的成熟毛囊。毛囊的基质细胞和真皮乳头细胞之间的相互作用通过成熟的毛囊中的基底膜引起毛囊的基质细胞的特定分化，其结果是形成毛发并使其生长。此外，该相互作用产生了毛囊的周期、维持了器官、并确定了生物特性(例如毛发的厚度和形状)。
在毛囊中，决定生物特性的两个重要因素是外根鞘(ORS)(其为毛囊上皮)和间充质来源的真皮乳头(DP)，并且毛发通过重复毛发周期而生长和丧失。
在本发明的实施方式中，确认了使用hDPC、ORS、hKC和HaCaT细胞的通过TGF-β刺激的干细胞的条件培养基有效地增殖了真皮乳头(DP)细胞。
此外，通过动物实验确认了，原始DP细胞的毛囊长度的助长作用、毛囊形成的促进作用、毛发生长的速度和量极其出色。
(iii)增加头皮皮肤的厚度。
此外，通过上述因子刺激的干细胞的条件培养基还可以有效地增加皮肤的厚度和长度，从而改善与毛发生长相关的整体环境。
因此，基于如下的新事实，毛发退行期诱导物、特别是TGF-β和BMP等(尽管它们已知为脱发诱导物质)对干细胞进行处理，可以分泌对毛发生长而有效的蛋白质，本发明展示出改善毛发生长所需的整体环境的作用。
在本发明的实施方式中，通过使用小鼠的体内实验以及体外和离体实验，确认了用TGF-β处理的脐带血来源的干细胞的条件培养基展示出极其优异的毛发生长作用。
能够观察毛发生长可能性的体内实验的实例可以确认在具有正常的毛发生长周期和快速诱导的生长期的小鼠中缩短休止期的作用。特别地，可以常规地使用C57/BL6小鼠或C3H小鼠，因为这些小鼠能够观察具有黑色素颜色的毛发。使用使毛发生长和毛囊增殖的能够观察到DP增殖的裸鼠。在本发明中，可以使用本领域已知的用于确认毛发生长作用的任何小鼠。
然而，优选使用C3H小鼠。与具有约两周的休止期的普通小鼠不同，C3H小鼠可以保持至少4周的休止期，并因此作为斑秃小鼠模型更有用。也就是说，可以通过确认诱导C3H小鼠的毛发周期进入生长期的作用来对毛发生长作用的优越性进行评价。
因此，一方面，本发明涉及用于促进毛发生长的组合物、其制备方法以及使用该组合物预防脱发和促进毛发生长的方法，所述组合物含有用选自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所组成的组的至少一种毛发退行期诱导物(最优选包括TGF-β的诱导物)刺激的干细胞的条件培养基作为活性成分。
该组合物能够以不显示任何细胞毒性的10％至50％(v/v)、优选约10％至30％(v/v)、优选20％至30％(v/v)、最优选25％(v/v)的有效浓度而被包含，但不限于此。
在本发明的实施方式中，本发明的组合物可以包括药物组合物和/或化妆品组合物。
药物组合物
在另一方面，本发明可以提供用于促进毛发生长的药物组合物，所述药物组合物含有用选自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所组成的组中的至少一种毛发退行期诱导物(最优选包括TGF-β的诱导物)刺激的干细胞的条件培养基作为活性成分。
脱发主要分为瘢痕性脱发和非瘢痕性脱发，非瘢痕性脱发包括先天性脱发、男性类型脱发和斑秃等。在本发明中，脱发包括上述所有的脱发，并且不限于此。
待包含在本发明的药物组合物中的药学上可接受的载体为在制造中常规使用的载体，并且可以包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、海藻酸盐/酯、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油等，但不限于此。除了上述成分之外，本发明的药物组合物还可以含有润滑剂、保湿剂、甜味剂、矫味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂等。
本发明的药物组合物的剂量的适当量可以根据各种因素而变化，所述因素包括配制方法、给予方法、患者年龄、体重、性别、疾病严重程度、饮食、给予持续时间、给予途径、释放速率和反应灵敏度，并且经验丰富的医生可以容易地确定和开出用于预期治疗的有效剂量。同时，本发明的药物组合物的剂量不限于此，并且可以是每天0.01mg/kg(体重)至2000mg/kg(体重)。
本发明的药物组合物可以口服给予或肠胃外给予。当肠胃外给予时，可以通过静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、腹膜内注射、皮肤外给予来给予药物组合物。优选地，药物组合物经肠胃外给予。优选地，本发明的药物组合物的给予途径可以根据疾病的类型来确定。
例如，本发明的药物组合物可更优选地局部(locally或topically)给予以施用于皮肤上。用于施用本发明的药物组合物的区域不仅包括头皮，还包括需要毛发生长的躯体的任何部分。例如，可将其用于改善其中的毛发或其它体毛由于损伤造成的疤痕而损坏的区域，或用于改善需要美容护理作用的区域，例如宽前额或M型前额、睫毛或眉毛，以及用于改善无毛症
Figure BDA0001162074280000171
优选地，可经由涂抹或注射、更优选经由涂抹的皮肤外给予来给予本发明的组合物。
在使用涂抹给予的情况下，通过简单地将组合物以一次至三次涂抹在头皮上，本发明示出了预防脱发和促进毛发生长的显著的作用。
特别地，在经由注射给予的情况下，推荐将该组合物注射至真皮层中，同时注射器的针的端部的孔朝上，从而使组合物在充分扩散入皮肤的真皮层之后递送至毛细血管中，即，为了防止组合物在真皮层上短暂保留后立即进入真皮层。
化妆品组合物
在另一方面，本发明涉及用于促进毛发生长的化妆品组合物，所述化妆品组合物含有通过选自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所组成的组中的至少一种毛发退行期诱导物(最优选包括TGF-β的诱导物)刺激的干细胞的条件培养基作为活性成分。
本发明的化妆品组合物能够以本领域中常规制造的任何制剂制备。例如，化妆品组合物可以配制成乳液、面霜、化妆水、面膜、粉底、洗液、美容液、发用化妆品，但不限于此。
优选地，可以通过加入常规添加剂将化妆品组合物制备为组合物，例如洗发香波、润发剂、生发油、发胶、洗发剂、发膜、喷发剂、发用摩丝、焗油膏、染发剂、护发素、用于促进毛发生长的它们的混合类型(例如洗发香波和润发剂的混合类型、润发剂和焗油膏的混合类型)和用于毛发生长的液态试剂等，并且可以包括其气溶胶类型。
当制剂类型为膏剂、面霜或凝胶时，载体的组分可以为动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌等。当制剂类型为粉剂或喷雾剂时，载体的组分可以为乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末，特别地，在喷雾剂的情况下，可以包含推进剂，例如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚。当制剂类型为液体或乳剂时，载体的组分可以为溶剂、增溶剂或乳化剂，例如水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁基乙二醇油、甘油脂肪族酯、聚乙二醇或脱水山梨糖醇的脂肪酸酯。当制剂类型为悬浮剂时，载体的组分可以为液相稀释剂，例如水、乙醇或丙二醇；悬浮液，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯和聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯；微晶纤维素；偏氢氧化铝；膨润土；琼脂或黄蓍胶等。当制剂类型为含表面活性剂的清洁剂时，载体的组分可以为脂族醇硫酸酯/盐、脂族醇醚硫酸盐/酯、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉衍生物、牛磺酸甲酯、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐/酯、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等。
除了活性成分以外，待包含在本发明的化妆品组合物中的成分可包括在化妆品组合物中常用的组分和载体，所述组分例如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、常规助剂(如色素和矫味剂)。
可以通过任何常用的方法来制备化妆品组合物。
优选地，用于预防脱发和促进毛发生长的化妆品组合物可以通过直接将其施用在头皮或毛发上或者将其注射在头皮或毛发上的皮肤施用来使用。
基于成人体重，本发明的组合物中包含的作为活性成分的混合提取物的施用量为40mg/kg以下、优选20mg/kg-40mg/kg。
将组合物施用在皮肤上的方法可以包括本领域公开的任何方法。本发明的化妆品组合物可以单次使用或重复使用，或者可以与其它化妆品组合物组合使用。另外，可以根据常规使用方法来使用具有出色的皮肤保护作用的本发明的化妆品组合物，并且其施用频率可以根据使用者的皮肤状况或品味而变化。
脱发治疗的方法
此外，另一方面，本发明涉及通过使用促进毛发生长的组合物促进毛发生长来治疗脱发的方法、制备该组合物的方法以及使用该组合物预防脱发和促进毛发生长的方法，所述化妆品组合物含有用选自于由TGF-β、IFN-γ、FGF-5、IL-1β、TNF-α、K17、NT-3、NT-4、BDNF和BMP2/4所组成的组中的至少一种毛发退行期诱导物(最优选包括TGF-β的诱导物)刺激的干细胞的条件培养基作为活性成分。
在上述的治疗脱发的方法中，干细胞的条件培养基或组合物的细节与上文的描述相同。
在上述的治疗脱发的方法中，特别优选使用利用涂抹或注射方法的皮肤外给予方法。特别地，优选将该组合物的活性成分注射入真皮层中，同时注射器的针的端部的孔朝上，从而使得组合物在充分扩散至皮肤的真皮层之后递送至毛细血管中，即，为了防止组合物在真皮层上短暂保留后立即进入真皮层。
如上所述，参考药物组合物和化妆品组合物，对通过前述解释的毛发退行期诱导物刺激的干细胞的条件培养基的功能进行了解释。然而，对于本发明所属领域的普通技术人员来说显而易见的是，本发明涉及用于预防脱发和促进毛发生长的各种形式的组合物以及使用具有各种应用的组合物的方法，所述组合物含有通过毛发退行期诱导物刺激的干细胞的条件培养基作为活性成分。
实施例
在下文中，将参照所附的示例性实施方式对本发明进行详细描述。这些实施方式仅出于说明目的而公开，并且对于本领域技术人员来说应当显而易见的是它们不应被解释为限制本发明的范围。
尽管本发明人使用了脐带血来源的干细胞和TGF-β，但是对于本领域技术人员显而易见的是，也可以使用其它来源的干细胞和其它毛发退行期诱导物(Current Biology，19，R132-R142，2009年2月10日；J Invest Dermatol，124：675-685，2005年)。
材料和方法
1.干细胞的条件培养基的制备
(1)干细胞的分离和培养
在本发明中，使用通过Medipost Co.,Ltd.(韩国)提供的人脐带血来源的间充质干细胞。可以从收集脐带血的步骤和从脐带血分离间充质干细胞并进行培养的步骤获得所述细胞。下面将对各个步骤的细节进行描述。
在收集脐带血的步骤中，在正常的自然阴道分娩(NSVD)的情况下，在婴儿分娩之后，从排出的脐带静脉中收集脐带血，而胎盘仍保留在子宫中；或者在剖宫产的情况下，在婴儿分娩后胎盘也从子宫中排出的状态下，从脐带静脉中收集脐带血。
在本发明中，当从分娩后自子宫排出的脐带静脉中收集脐带血时，在新生儿诞生之后，通过无菌操作从与胎盘和胎儿相连接的脐带静脉中收集脐带血。一旦获得脐带静脉，使用收集针将脐带血收集到含有抗凝血剂的脐带血收集袋(储袋)中。
关于从由此收集的脐带血中分离干细胞并进行培养的方法，可以使用包括韩国专利号10-0494265中公开的方法在内的任何常规方法(Pittinger MF，Mackay AM等，Science，284：143-7，1999；Lazarus HM，Haynesworth SE等，Bone Marrow Transplant，16：557-64，1995)。
本发明人通过离心从由此收集的脐带血中分离出单核细胞，漂洗数次以除去杂质，并将单核细胞以适当的浓度接种在培养容器中并进行培养。本文中，当在相差显微镜下观察时，确认以具有长的均匀的纺锤体形状的集落形式增殖的细胞为间充质干细胞。然后当细胞生长至融合时，将细胞进行传代培养和增殖直至获得适当数量的细胞。
另外，将来源于骨髓(LONZA，USA)和脂肪细胞(ATCC，USA)的间充质干细胞(MSC)进行培养，并用于进一步的实验。下文中将该细胞分别描述为BM-MSC和AD-MSC。
(2)样品条件培养基的制备
分别从hUCB-MSC、AD-MSC和BM-MSC制备样品条件培养基。在保持于37℃和5％CO2下的培养箱中，将储存的细胞(储存在LN2槽中)解冻并进行培养，特别地，将细胞在含有2％FBS的α-MEM(GIBCO)培养基中进行培养，直至细胞融合达到约90％。
然后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)将细胞洗涤3次，在不添加酚红的角质形成细胞培养基(KM)中培养24小时，收集培养基，并将整个过程重复3天。然后，将收集的培养基分别过滤(Top Filer System，Nunc)并冷藏保存及冷冻待用。
(3)经刺激的CM的制备
CM制备方法与前述方法几乎相同，但当对来源于骨髓、脐带血和脂肪的干细胞进行培养时，将所述细胞在不含酚红的培养基中用TGF-β(10ng/ml)进行处理，并将干细胞刺激24小时。
用PBS对用TGF-β处理的培养基漂洗3次，并用不含酚红的新鲜K-SFM培养基替换，重复所述24小时培养至3天并收集。将由此收集的用TGF-β处理的条件培养基分别过滤，并用于实验用途，在不含酚红的K-SFM培养基中稀释至待使用的10％、25％和50％的终浓度。
2.用于观察毛发生长的C3H小鼠的制备
实验地点为Medipost(IRB批准编号：131021-1)和Gyeongi Biocenter(IACUC项目编号：IACUC2014-4-10)，C3H小鼠购自Saeronbio Inc.(韩国)，并在Jackson实验室制备。
特别地，在本发明的实验中使用的C3H小鼠(Jackson lab，日本)当它们的毛发被除去时开始休止期。不同于其它物种，C3H小鼠需要极长的时间才能转变至生长期，因此将它们用作用于研究毛发生长作用的动物模型。也就是说，不同于其它小鼠物种，在不用诱导物药物进行处理时，它们具有非常长的休止期，因此它们是用于确认毛发生长作用的出色的动物模型(Journal of Investigative Dermatology(2005)124，288-289)。
在作为毛发生长的一个时期的生长期期间，C3H小鼠皮肤表面的颜色变成黑色，而在退行期期间，它们的皮肤表面变成粉红色，因此可以通过观察它们的皮肤颜色来确认毛发生长的时期。
本发明人获得了7周龄C3H小鼠，并使它们能够通过1周的适应期来适应新环境。此外，本发明人用来源于脐带血的间充质干细胞的条件培养基对小鼠进行接种，以观察毛发生长周期的休止期(退行期)和进入生长期的转变时间。在该实例中，将用PBS注射的小鼠用作阴性对照。
同时，对小鼠进行麻醉以除去毛发。通过将3.36ml甲苯噻嗪(Bayer Korea Ltd.，2094L，韩国)与5ml舒泰(zoletil)(条形码#3UHC，韩国)混合并加入7.47ml盐水(JW-Pharma，REG#10055，韩国)来制备量为15.83ml的麻醉剂，并使用胰岛素注射器(BD Ultra-FineTM II，韩国)用20μl所述麻醉剂对小鼠进行麻醉。
然后，在确认小鼠被麻醉后，使用毛发修剪器除去小鼠的毛发。将小鼠置于干净的纸上，以与毛发生长方向相反的方向进行首次毛发去除，将小鼠放置24小时，观察任何剩余毛发的存在，然后将剩余毛发除去。
3.本发明的干细胞的条件培养基的局部施用
作为局部方法，将本发明的条件培养基以100μl的量以12小时的间隔施用于小鼠皮肤的外层上，并以相同方向擦洗8次，从而使它们可以被涂抹至皮肤中，同时注意不要污染邻近区域。在4个点处以100μl的量施用条件培养基，并通过裸眼每天观察毛发生长量、毛发厚度和局部颜色等。
4.MTT分析
为了测试细胞的增殖和毒性，在保持于37℃、5％CO2下的培养箱中，将细胞在各自的培养基中培养24小时，置于饥饿下24小时，并在各自的实验条件下培养24小时、48小时、72小时和96小时。
此外，使所完成的各自的实验组通过MTT分析接受关于细胞毒性和细胞增殖使率的测定。实验重复至少3次以确保实验的可靠性。
用5mg/ml MTT试剂对各相应的实验组(其以用于建立MTT分析实验方法的培养而完成)进行处理至终浓度为1mg/ml，再培养另外的4个小时。然后，弃去上清液，将所得物溶解在DMSO中，将所得到的溶液以200μl/孔的量转移至96孔板中，通过ELISA读数器对570nm处的吸光度进行测量。
5.作为原始细胞的原始hDPC和原始ORS的分离
在盐水中准备枕骨区的尸检组织，并使用刀片将其分割成单个毛囊单位，以切割毛球，并去除毛干。将两个注射器中的一个固定在毛球的下部(DP的下部)，而将另一注射器用于轻微接触毛球的上部(DP的上部)，从而使真皮乳头(DP)可以出来。
将真皮乳头细胞放置在注射器的末端，并将混合物(DMEM+20％FBS+1％抗生素+1％两性霉素B)和约10个真皮乳头细胞加入至35mm的I型胶原涂布培养皿中，并当以不足的量添加而不更换培养基时培养10天。在确认真皮乳头细胞粘附至培养皿后，3天更换一次培养基，当达到细胞融合时或当其变为第4周时进行传代培养，以供使用。
6.斑片(patch)分析法
当C57BL/6小鼠出生时，将它们的皮肤剥离，洗掉血迹，用聚乙烯吡啶酮灭菌，并再次用盐水洗涤以除去聚乙烯吡啶酮。
在从剥离的皮肤中除去脂肪层后，用胶原/分散酶对小鼠进行处理，并在4℃下培养过夜。使用钳状骨针(forcep)将真皮和表皮分离，涡旋15分钟，用过滤器筛分组织，并通过离心进行分离(细胞下沉)。对细胞数进行计数，分开为1×106个细胞，分别添加100μl培养基，并重悬浮以释放细胞。使用胰岛素注射器以在裸鼠背部上的4个部分进行皮下注射。注射2周后，对皮肤进行解剖，并确认内部形成的毛囊数。
7.初始毛发器官的培养
通过在枕骨区进行解剖来收集毛发器官，并在盐水中制备，以毛囊单位进行修剪，并切割皮脂腺正下方的点。3天更换一次培养基，并对长度进行测量。
实施例1：经TGF-β激活的干细胞培养基的毛发生长作用的确认
由于在增殖和真皮乳头(DP)的形成期间可能起始毛发生长，通过观察经hUCB-MSC-CM增加DP生长的特征来检查毛发生长的可能性。
对通过TGF-β刺激的干细胞的条件培养基和未刺激的条件培养基针对毛发生长的作用进行评价，从而使条件培养基的终浓度变成10％、25％和50％，并将它们用于体内和离体实验。
1-1体外实验
使用原始人真皮乳头细胞(DPC)通过体外实验对条件培养基的作用进行检查。
首先，为了测试细胞的增殖和毒性，在保持于37℃、5％CO2下的培养箱中，将细胞在各自的培养基中培养24小时，置于饥饿下24小时，并在各自的实验条件下培养24小时、48小时、72小时和96小时，并通过MTT分析对细胞的增殖和毒性进行测量。
结果，如图1所示，通过TGF-β刺激的脐带血来源的干细胞的条件培养基显示出最高的细胞存活率。
此外，还对AD-MSC和BM-MSC的增殖进行了测量(图1和表1)。
[表1]
Figure BDA0001162074280000251
由这些结果，我们可以确认通过TGF-β刺激的干细胞比起未经刺激的培养基具有更优秀的增殖。
1-2蛋白免疫印迹
同时，为了确认与通过TGF-β刺激的干细胞的条件培养基进行的毛发组织分化相关的信号转导系统，用条件培养基候选物对hDPC进行处理，并通过蛋白免疫印迹确认与毛发组织分化相关的蛋白质水平，结果示于图2中。
结果，通过TGF-β刺激的干细胞的条件培养基显示出Wnt3a、Bcl-2和细胞周期蛋白D-1等(已知为毛发组织分化相关的信号转导蛋白)的高表达。这些结果表明，本发明的TGF-β对与毛发组织分化相关的干细胞具有作用。
也就是说，通过TGF-β刺激的本发明的脐带血来源的干细胞有效地分泌了Wnt3a、Bcl-2和细胞周期蛋白D-1等(其为与毛发组织分化相关的信号转导蛋白)，因此，根据毛发生长，含有该干细胞的条件培养基显示出最优异的毛发生长作用(图2)。
1-3离体实验
本发明人还通过培养原始毛发器官进行了针对毛发生长作用的离体实验。
为这一目的，作为能够观察毛发生长可能性的离体模型，制备了来自从人头皮组织收集的毛囊的人原始真皮乳头(DP)，并在实验培养板中进行培养。通过观察，对就处理物质而言的DP长度生长的促进作用进行比较。也就是说，通过对实验组和对照组进行处理，观察原始DP长度的生长，并选择有效的CM，或通过观察比较CM对毛发生长的作用。
结果如图3所示，与未处理的对照组相比，未经刺激的CM和用TGF-β刺激的CM均诱导了毛发增殖，特别地，通过TGF-β刺激的CM显示出比未经刺激的CM更高的毛发生长作用(图3A)。
此外，在毛囊生长长度的四重复实验中，与未经刺激的条件培养基相比，通过TGF-β刺激的条件培养基显示出更高的毛囊平均生长长度(图3B)。
实施例2：斑片分析法
通过斑片分析模型对基于脐带干细胞引发的条件培养基针对毛囊形成的作用进行检查。
作为经由斑片分析模型进行的离体实验的结果，与对照培养基或用未经刺激的条件培养基处理的组相比，通过TGF-β刺激的干细胞的条件培养基显示出显著更高的形成原始毛囊的作用。特别地，通过TGF-β刺激的干细胞的条件培养基在形成原始毛囊方面显示出最高的数量(图4A)。
此外，在通过立体显微镜进行的观察中，与对照培养基或用未经刺激的条件培养基处理的组相比，通过TGF-β刺激的条件培养基显示出显著更高的形成原始毛囊的作用(图4B)。
实施例3：针对小鼠的局部施用
通过将本发明的条件培养基局部施用于处于休止期的C3H/HeJ小鼠上对毛发生长作用进行评价。
为了对预防脱发和促进毛发生长的作用进行评价，使用通过各种因子刺激的条件培养基对动物实验进行比较和评价。将条件培养基施用至各小鼠的背部上的四处位置，每天施用两次，并且在约3周时对毛发生长特征进行检查。
结果，与对照培养基或用未经刺激的条件培养基处理的组相比，确认了通过TGF-β刺激的干细胞的条件培养基显示出更高的毛发生长作用，其中，甚至与已报道的研究结果相比，通过TGF-β刺激的干细胞的条件培养基在毛发生长的各个领域(例如毛发生长速度、毛发生长量和毛发厚度等)均显示出最优异的作用(图5)。
此外，在用AD-MSC和BM-MSC对CM和通过TGF-β刺激的CM进行约28天后，对C3H/HeJ小鼠的毛发生长特征进行检查，在其中局部施用通过TGF-β刺激的CM的小鼠也显示出优异的毛发生长作用(图6)。
因此，经由体内模型可以确认通过TGF-β刺激的本发明的干细胞的条件培养基的毛发生长作用在毛发生长速率、量和厚度等方面均非常优异。
从这些结果确认了用已知为脱发诱导材料的TGF-β对脐带血来源的干细胞进行处理，可以出乎预料地分泌对毛发生长有效的蛋白质。
特别地，本发明的用TGF-β刺激的脐带血来源的间充质干细胞的条件培养基显示出远比现有的基于干细胞的物质更优异的毛发生长作用，并因此预期其非常有用地用于预防脱发和促进毛发生长。
工业实用性
通过包括TGF-β的毛发退行期诱导物刺激的干细胞的条件培养基含有已知为与毛发组织分化相关的信号转导蛋白的Wnt3a、Bcl-2和细胞周期蛋白D-1等。因此，干细胞的条件培养基缩短了毛发周期中的从休止期至生长期的转变时间，促进了真皮乳头细胞的长度增长、增加了毛囊的数量和大小以及头皮的厚度，从而表现出优异的预防脱发和促进毛发生长作用，并因此预期在可以利用该培养基的领域中非常有用。

Claims (5)

1.通过毛发退行期诱导物刺激的干细胞的条件培养基在制备用于预防脱发和促进毛发生长的组合物中的用途，其中，所述毛发退行期诱导物为TGF-β；其中，所述干细胞为来源于脐带血的间充质干细胞；并且其中，所述干细胞的条件培养基的终浓度为10％至25％。
2.如权利要求1所述的用途，其中，通过所述毛发退行期诱导物刺激的所述条件培养基包含选自于由Wnt3a、Bcl-2和细胞周期蛋白D-1所组成的组中的至少两种蛋白质。
3.如权利要求1所述的用途，其中，通过所述毛发退行期诱导物刺激的所述条件培养基具有以下功能：
(i)缩短毛发周期中的从休止期至生长期的转变时间；
(ii)产生真皮乳头细胞并促进长度方面的生长；以及
(iii)增加毛囊的数量和大小。
4.如权利要求1所述的用途，其中，所述组合物为化妆品组合物。
5.如权利要求1所述的用途，其中，将所述组合物制备成用于通过局部涂敷或注射来经皮给予的试剂。
CN201580027898.4A 2014-07-07 2015-07-06 经刺激的干细胞的培养基的毛发生长促进功能及其用途 Active CN106456676B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462021366P 2014-07-07 2014-07-07
US62/021,366 2014-07-07
PCT/KR2015/006919 WO2016006885A1 (ko) 2014-07-07 2015-07-06 자극된 줄기세포 배양액의 발모 촉진능 및 이의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106456676A CN106456676A (zh) 2017-02-22
CN106456676B true CN106456676B (zh) 2021-07-23

Family

ID=55016219

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580027898.4A Active CN106456676B (zh) 2014-07-07 2015-07-06 经刺激的干细胞的培养基的毛发生长促进功能及其用途

Country Status (5)

Country Link
US (2) US20160000699A1 (zh)
JP (1) JP6538081B2 (zh)
KR (1) KR101836029B1 (zh)
CN (1) CN106456676B (zh)
WO (1) WO2016006885A1 (zh)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2629697T3 (es) * 2013-09-16 2017-08-14 Ameria Gmbh Sistema de retroproyección controlado por gestos
CA3010916A1 (en) * 2016-02-12 2017-08-17 Cell Care Therapeutics Adipose tissue derived mesenchymal stromal cell conditioned media and methods of making and using the same
US10920133B2 (en) 2017-06-09 2021-02-16 Nextier Completion Solutions Inc. Compositions for dust control and methods making and using same
CN107488626A (zh) * 2017-08-10 2017-12-19 河南省银丰生物工程技术有限公司 一种脐带间充质干细胞提取物及其在美容方面的应用
EP3692998A4 (en) * 2017-10-02 2021-05-26 Hirotaro Fukuoka PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR USE TO MODIFY THE SCALP OR SKIN, TO Heal WOUNDS OR MODIFY HAIR
CN108324993B (zh) * 2018-01-15 2020-11-03 朱剑虹 一种诱导毛发再生的干细胞复合体、其制备方法及应用
WO2019215557A1 (en) * 2018-05-07 2019-11-14 Reelabs Pvt. Ltd. The method of autologous primary hair follicles preparation in 3d culture
CN108721602A (zh) * 2018-06-28 2018-11-02 天津市康婷生物工程有限公司 一种联合ha促进毛发再生的干细胞新型生发剂
CN109331172A (zh) * 2018-06-28 2019-02-15 天津市康婷生物工程有限公司 一种促进毛发再生的干细胞新型生发剂
KR20200020438A (ko) * 2018-08-17 2020-02-26 고려대학교 산학협력단 태반유래 세포 조건화 배지에서의 모낭세포 기능강화 및 대량생산 방법
CN108992466B (zh) * 2018-09-30 2021-07-16 浙江卫未生物医药科技有限公司 一种利用毛乳头细胞外泌体治疗雄激素源性脱发的注射液的制备方法
KR102111964B1 (ko) 2018-10-02 2020-05-18 주식회사 스템온 유도된 엑소좀을 포함하는 모발 재생 조성물
KR102242840B1 (ko) * 2019-04-04 2021-04-23 주식회사 비알팜 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물
US20220202899A1 (en) * 2019-04-30 2022-06-30 Haplnscience inc. Composition for prevention or treatment of hair loss including hapln1
KR102141641B1 (ko) * 2020-01-31 2020-08-06 주식회사 래디안 인간지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 모유두세포로의 분화방법
KR20210114646A (ko) * 2020-03-11 2021-09-24 (주)메디코스바이오텍 성장인자를 함유하는 탈모 치료 또는 모발 성장 촉진용 조성물
KR102435454B1 (ko) * 2020-03-26 2022-08-23 이엔셀 주식회사 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포 배양액을 유효성분으로 하는 섬모 발생 촉진용 조성물
JP2021195366A (ja) * 2020-06-09 2021-12-27 株式会社ピュアコード 美容液
CN111956787A (zh) * 2020-07-06 2020-11-20 沃森克里克（北京）生物科技有限公司 一种毛发增长剂和育毛剂及其应用
CN111821318A (zh) * 2020-08-28 2020-10-27 上海圣特佳健康科技发展有限公司 用于治疗或预防白发的外泌体及其用途和使用方法
CN112538513B (zh) * 2020-12-11 2022-12-06 湖南美柏生物医药有限公司 细胞外基质mb生物蛋白及其制备试剂盒与方法
WO2024107102A1 (en) * 2022-11-17 2024-05-23 Cellresearch Corporation Pte. Ltd. Use of conditioned medium derived from cultivation of mesenchymal stem cells of the umbilical cord for inducing, stimulating and promoting hair growth and regeneration

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102676452A (zh) * 2012-04-26 2012-09-19 天津美德太平洋科技有限公司 一种含人脐带间充质干细胞分泌液的培养基及其制备方法和应用
CN102712899A (zh) * 2009-09-18 2012-10-03 富士胶片戴奥辛思生物技术英国有限公司 干细胞条件培养基组合物
CN102711798A (zh) * 2009-12-02 2012-10-03 卡迪欧参生物科技有限公司 刺激干细胞的药物组合物

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060182724A1 (en) * 2005-02-15 2006-08-17 Riordan Neil H Method for expansion of stem cells
KR20100097574A (ko) * 2009-02-26 2010-09-03 김민 발모 유도 세포 조성물
KR101202997B1 (ko) * 2010-06-15 2012-11-20 부산대학교 산학협력단 창상 치료용 조성물 및 이의 제조방법
KR101061464B1 (ko) * 2010-12-30 2011-09-01 김영실 지방줄기세포의 배양액을 이용한 모발증식제재 및 이의 제조방법
WO2012121695A1 (en) * 2011-03-04 2012-09-13 Al-Qahtani Ahmed H Skin cream
KR101422559B1 (ko) * 2012-03-09 2014-07-24 창원대학교 산학협력단 지방유래 줄기세포 배양액, 이의 제조방법, 및 이를 포함하는 발모촉진용 조성물

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102712899A (zh) * 2009-09-18 2012-10-03 富士胶片戴奥辛思生物技术英国有限公司 干细胞条件培养基组合物
CN102711798A (zh) * 2009-12-02 2012-10-03 卡迪欧参生物科技有限公司 刺激干细胞的药物组合物
CN102676452A (zh) * 2012-04-26 2012-09-19 天津美德太平洋科技有限公司 一种含人脐带间充质干细胞分泌液的培养基及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Keith D. Salazar et al..Mesenchymal stem cells produce Wnt isoforms and TGF-β1 that mediate proliferation and procollagen expression by lung fibroblasts.《Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol》.2009,第297卷 *
Mesenchymal stem cells produce Wnt isoforms and TGF-β1 that mediate proliferation and procollagen expression by lung fibroblasts;Keith D. Salazar et al.;《Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol》;20091231;第297卷;摘要，第L1002页右栏，第L1003页左栏，第L1004-L1005页 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2017521363A (ja) 2017-08-03
WO2016006885A1 (ko) 2016-01-14
US20210220256A1 (en) 2021-07-22
JP6538081B2 (ja) 2019-07-03
KR20160143837A (ko) 2016-12-14
CN106456676A (zh) 2017-02-22
US20160000699A1 (en) 2016-01-07
KR101836029B1 (ko) 2018-03-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106456676B (zh) 经刺激的干细胞的培养基的毛发生长促进功能及其用途
CN106659741B (zh) 小尺寸干细胞的毛发生长促进功能及其用途
US8586540B2 (en) Composition for improving skin conditions using fetal mesenchymal stem cells from amniotic fluid
CN105246494B (zh) 刺激毛发生长或防止毛发脱落的包括神经干细胞的提取物的组合物及其制造方法
US20130071363A1 (en) Amnion-derived cells, methods of making and uses thereof
EP2460875A1 (en) Amnion-derived cell compositions, methods of making and uses thereof
US20100028306A1 (en) Amnion-Derived Cell Compositions, Methods of Making and Uses Thereof
KR101425653B1 (ko) 인간 지방조직 유래 다분화능 줄기세포 및 모낭세포를함유하는 세포치료제
KR101779932B1 (ko) 나노그(Nanog)를 도입한 양수 내 태아 유래 중간엽 줄기세포를 이용한 육모 촉진용 조성물의 제조방법
KR101218101B1 (ko) 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포를 이용한 발모촉진용 조성물
KR101656511B1 (ko) 육모 및 탈모방지능이 개선된 지방줄기세포 배양액 및 그의 제조방법
KR20130008293A (ko) 저산소 조건에서 배양한 양수 내 태아 유래 중간엽 줄기세포를 이용한 성장인자의 대량생산 방법 및 피부 재생용 조성물
KR101334243B1 (ko) 상처자극을 이용한 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포의 배양액의 제조방법
EP4257674A1 (en) Method for isolating and culturing cord blood stem cells expressing gdf-3 at high level, and use of gdf-3
KR102218833B1 (ko) 에피레귤린 또는 이의 단편을 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물
CN106456529A (zh) 小尺寸干细胞的美白能力及其用途
KR20130003159A (ko) 셀레늄 함유 배지를 이용한 양수 내 태아 유래 중간엽줄기세포의 제조방법
Tarini Nawamalie Stimulation of hair growth using conditioned media derived from dental pulp stem cells expanded in serum free media/Tarini Nawamalie Abeysinghe Gunawardena
Gunawardena Stimulation of Hair Growth Using Conditioned Media Derived from Dental Pulp Stem Cells Expanded in Serum Free Media
CN110721197A (zh) 促进毛发生长的组合物

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1232470

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant