CN1252808A - 抗病原合成肽及包含该肽类的组合物 - Google Patents

Abstract

选自肽、成束肽的复合物、肽混合物或无规肽共聚物的非溶血性溶细胞药剂具有选择性的溶细胞活性,表现在它们对病原细胞的溶细胞活性,病原细胞是指非天然发生的在机体内由微生物病原生物体和恶性细胞组成;而其非溶血性,即对血液红细胞没有溶血效应。这些肽可以是天然肽如pardaxin和mellitin或其片段的环形衍生物,其中L－氨基酸残基被相应的D－氨基酸取代,或者是线性肽的非对映体,这些非对映体由不同比例的至少一个正电荷氨基酸和至少一个疏水性氨基酸所组成,在这些肽中至少一个氨基酸残基是D－氨基酸。包括非溶血性溶细胞的药剂的药用组合物能用于治疗由病原体包括抗细菌、真菌、病毒、支原体和原生动物感染引起的几类病症,并且能用于癌症的治疗。

Description

抗病原合成肽及包含该肽类的组合物

                  发明领域

本发明涉及新型非溶血性溶细胞多肽、含有该多肽的组合物、及其在疾病或紊乱的治疗中和在农业中的应用。

                  发明背景

在下文中，对现有技术文献说明了出处，参考文献的完整项目可见权利要求前的说明书结尾部分的“参考文献”一节。

微生物对可用的抗微生物药物的抗性不断增加，促使人们对发展可以替代的抗微生物化合物进行着广泛的研究。

除了高度特异性的细胞介导的免疫应答，或作为其补充，脊椎动物和其他有机体还具有由不同族的广谱溶细胞性如抗菌性肽组成的防御系统。

对这种溶细胞肽(也称为溶细胞素)的脂-肽相互作用研究趋向于强调，两亲性α-螺旋结构对它们的溶细胞活性非常重要。这一结论主要基于对单独作用于哺乳动物细胞或细菌或作用于两种细胞类型的溶细胞素的研究，这个溶细胞性肽家族的一个重要的族是宿主防御性短链线形肽(≤40氨基酸)，这类肽没有二硫键(Boman，1995)。这些肽在链长、疏水性和电荷的整体分布方面各不相同，但都共有与脂双层相关的结构，即两亲性α-螺旋结构(Segrest等，1990)。

已知的溶细胞素的例子包括：(i)仅对细菌溶细胞的抗菌性肽，例如，分离自cecropia moth(Steiner等，1981)的杀菌肽；分离自蛙类皮肤的爪蟾抗菌肽(Zasloff，1987)和dermaseptins(Mor等，1991)；(ii)对哺乳动物有选择性细胞毒的溶细胞素，例如分离自金黄葡萄球菌的δ-溶血素(Dhople和Nagaraj，1993)；以及(iii)没有细胞选择性的溶细胞素，例如能裂解哺乳动物细胞和细菌两者的蜂毒mellitin(Habermann和Jentsch，1967)和神经毒素pardaxin(shai等，1988)。

抗菌肽首先在无脊椎动物中被发现，接着在脊椎动物，包括人中也被发现。作为补充或额外的防御系统，这种二级的化学免疫系统为有机体提供一组全套的小分子肽，这些肽在诱导后迅速产生，抵抗机会或专性病原体的侵入或抵抗共生微生物失去控制地增殖(Boman，1995)。迄今为止，已有100多种不同的抗菌肽获得了分离和特性分析。最大的家族，可能也是研究最多的家族，包括那些带正电荷并为两亲性α-螺旋结构的肽。对各种天然抗菌肽进行的大量研究趋向于强调两亲性α-螺旋结构和净正电荷对溶细胞活性非常重要。带正电荷能促进肽与带负电荷的膜相互作用(Andreu等，1985)，这种带负电荷的膜在病原细胞膜中浓度比在正常真核细胞中要高，而两亲性α-螺旋结构对裂解活性非常重要(Chen等，1988)。据推测这种相互作用能通过增加能量传递膜的通透性来损坏靶机体的能量代谢(Okada和Natori，1984)。由于其两亲性结构，据认为这些抗菌多肽通过形成离子通道/孔，通过“桶-穿孔”机制使膜通透(Rizzo等，1987)。根据此模型，跨膜的两亲性α-螺旋结构组成束，其中指向外面的疏水面与膜的脂成分相互作用，而向内的亲水面形成孔。或者，肽平行结合于膜的表面，以“毯状”方式覆盖在膜的表面，如同去污剂一样使膜溶解(Shai，1995)。

尽管进行了广泛的研究，但短的线性非细胞选择性肽如pardaxin和mellitin作用的精确模式还不清楚，并且也不清楚它们对哺乳动物细胞和细菌的细胞毒作用是否需要相似的结构特征。

Pardaxin是一个33聚体的肽，它是从红海Moses SolePardachirus marmoratus(Shai等，1988)和西太平洋豹鳎Pardachiruspavoninus(Thompson等，1986)中纯化的一种兴奋性神经毒素。Pardaxin依据其浓度，具有多种生物学活性(Shai综述，1994)。在浓度低于10^-7M时，pardaxin以一种钙依赖的方式诱导神经递质的释放。在10^-7M至10^-5M的较高浓度时，此过程不依赖于钙，而在高于10^-5M时，诱导细胞裂解。Pardaxin在体外还影响多种生理制备物的活性。它的生物学作用被归因于它与上皮细胞中渗透调节系统的离子运输相互作用和通过形成离子通道的突触前活性，而后者是电势依赖的并且对阳离子有轻微的选择性。在其结构和多种生物物理研究的基础上，人们提出pardaxin插入膜的“桶-孔”机制(Shai综述，1994)。Pardaxin含有一个螺旋-铰链-螺旋结构：N端螺旋包括1-11位残基，C端螺旋包括14-26位残基，两个螺旋被位于位置13的脯氨酸残基分开。这一结构基元在特异性作用于细菌的抗菌肽(如，杀菌肽)和能裂解多种细胞的细胞毒肽(如mellitin)中都被发现。

Mellitin是一个26聚体的两亲性肽，它是蜜蜂Apis mellifera的蜂毒的主要成分(Harbermann和Jentsch，1967)，并且是研究最多的膜导向肽之一(Dempsey，1990)。Mellitin对哺乳动物细胞有很强的毒性，但同时也是一种很强的抗菌剂(Steiner等，1981)。已经进行了大量的研究来确定mellitin与膜相互作用的本质，其目的是理解mellitin诱导的溶血的分子机制，和作为研究膜蛋白结构的一般特征以及这种蛋白与磷脂膜相互作用的模型。目前已获得的许多证据表明mellitin不同的作用有不同的分子机制。但不管怎样，两亲性α-螺旋结构已显示是其多种活性所必需的(Perez等，1994)。

Mellitin的结构已用多种技术进行了研究。X-射线晶体学和在甲醇溶液中NMR的结果显示，其分子包括两个α-螺旋部分(残基1-10和13-26)，这两个螺旋以120°的角度相交。这两个部分由一个铰链(11-12)连接，形成一个弯曲的α-螺旋杆，其中亲水位点和疏水位点朝向相反的方向。四个这种单体的mellitin分子通过疏水作用聚集成束，形成四体(Anderson等，1980；Bazzo等，1988；Terwilliger和Eisenberg，1982；Terwilliger和Eisenberg，1982)。在膜表面开始作用时，四聚体解离成单体，单体在插入到膜中前仍保留α-螺旋结构(Altenbach和Hubbell，1988)。

Mellitin与pardaxin有一些相似之处，pardaxin和mellitin都由两个螺旋组成，螺旋之间有一个脯氨酸铰链。而且，它们在其N-螺旋中显示明显的同源性，它们的N-螺旋主要是疏水性(Thompsn等，1986)。但是，pardaxin(净电荷为+1)在其C端含有另外七个电荷为-2的氨基酸残基，而mellitin(净电荷为+6)以一个酰胺基团为终端，并含有带正电荷的四肽序列Lys-Arg-Lys-Arg。pardaxin和melittin之间有几个功能上的差别，pardaxin与兼性和带负电荷的磷脂两者的结合相似(Rapaport和Shai，1991)，而mellitin与带负电荷磷脂的结合要优于与兼性磷脂的结合(Batenburg等，1987；Batenburg等，1987)，而且，pardaxin与磷脂的结合是正协同效应(Rapaport和Shai，1991)，而melittin则是负协同效应(Batenburg等，1987；Batenburg等，1987)。虽然pardaxin和mellitin两者都是针对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的强抗菌肽，但pardaxin对人红细胞的溶血性比mellitin低40-100倍(Oren和Shai，1996)。

Pardaxin用L-至D-替换获得的类似物显示能裂解人红细胞(Pouny和Shai，1992)随后的结果显示(见下面报道的结果)，Pouny和Shai，1992公开的两种肽，即D-pro⁷-pardaxin和D-Leu¹⁸-Leu¹⁹-pardaxin具有溶血性，且带有很低的抗菌活性。爪蟾抗菌肽的L至D替代的类似物也被发现缺乏抗菌活性(Chen等，1988)。

                   术语

下面，为了流畅地阅读本文及便于更好地理解本发明，将说明几个新造词的用法。但应当注意，为了完整地理解这些词，将对下面的完整描述不时列出参考文献。这里所说的词及其含义如下：

“不均一型肽”用于此处是指同时含有D-和L-氨基酸残基的肽。

“均一型肽”用于此处是指仅含有天然L-氨基酸残基或仅含有D-氨基酸残基的肽。

“均一型-L-肽”和“均一型-D-肽”用于此处分别是指完全由L-或D-氨基酸残基组成的多肽。

“不均一型-基于L的肽”和“不均一型-基于D的肽”用于此处分别是指主要含有L-氨基酸残基的不均一型肽，如由均一型L-肽衍生的其中一个或多个L-氨基酸残基被对应的D-对映体取代的肽；和主要含有D-氨基酸的不均一型肽，其中一个或多个D-氨基酸残基被对应的L-对映体取代。

“螺旋型肽”用于此处是指含有一个连续的α-螺旋片段的肽，该α-螺旋片段贯穿其长度的大部分。螺旋型肽的螺旋部分完全由L-氨基酸残基或D-氨基酸残基组成。

“非螺旋型肽”用于此处是指不含α-螺旋结构或不含沿其长度伸展的连续α-螺旋结构的肽。根据本发明的非螺旋型肽可以含有一个α-螺旋片段，这个片段在末端时，其长度跨度小于细胞膜宽度的一半，如少于约10～15个氨基酸残基，而如果它不是末端的α-螺旋，其长度小于细胞膜的全宽，如少于约20～25个氨基酸残基。非螺旋型肽可以是一个带有α-螺旋中断组分的均一型肽(见下文)，或者可以是一个非均一型肽。

“α-螺旋中断部分”用于此处是指一个部分，当其插入螺旋结构时，破坏α-螺旋的连续性。这种部分的例子可以是氨基酸残基脯氨酸或甘氨酸、α-甲基-取代-α-氨基酸、环形和非环形的非α-氨基酸如6-氨基-己酸、3-氨基-1-环己酸、4-氨基-1-环己酸，或者可以是一个插入到由其相反的对映体氨基酸残基组成的α-螺旋片段中的L-或D-对映体。

“病原细胞”用于此处是指非天然产生于机体内的细胞，包括癌细胞和病原有机体如细菌、真菌、原生动物、病毒和支原体，以及被病原有机体如寄生性原生动物如利什曼虫和疟原虫感染的哺乳动物细胞。

“选择性溶细胞活性”用于此处是指一种药剂诱导病原细胞裂解的活性，其选择性的表现如下：药剂诱导病原细胞裂解的浓度要远低于裂解正常的非病原细胞如红细胞所需的浓度。

“非溶血性”用于此处是指药剂导致红细胞溶血的浓度要远高于导致其他细胞如病原细胞诸如微生物细胞、癌细胞等裂解所需的浓度。

“非对映体”用于此处是“非均一型肽”的同义词。

                    发明概述

本发明提供一种非溶血性溶细胞药剂，该药剂选自肽，成束肽的复合物，肽混合物或无规肽共聚物，所述的药剂具有选择性的溶细胞活性，表现在溶细胞活性仅针对病原细胞，即非机体内天然产生包括微生物病原性和恶性细胞的细胞，而其非溶血性，即不具有对备注红细胞的溶细胞效应，或其表现为所述的溶细胞活性基本上较高的浓度下对备注红细胞的溶细胞效应，所述的非溶血性溶细胞药剂选自：

(1)净电荷大于+1的肽的环形衍生物，并包括其L-氨基酸残基

   和D-氨基酸残基二者，或包括L-氨基酸残基和D-氨基酸

   残基之一或两者，以及α-螺旋中断部分；

(2)肽及其环状衍生物，包括L-氨基酸残基和D-氨基酸残基，

   该肽净正电荷大于+1并具有一种氨基酸序列其相应仅包括L

   -氨基酸残基的氨基酸序列在天然中找不到；

(3)由许多2或更多非溶血性溶细胞肽组成的复合物，每一种肽

   净正电荷大于+1，包括L-氨基酸残基和D-氨基酸残基，

   或包括L-氨基酸残基和D-氨基酸残基之一或两者并包括

   α-螺旋中断部分或前述的环形衍生物，所述的肽利用与每一

   种肽共价结合的连接分子束定在一起；

(4)一种由2或多种非溶血性溶细胞肽的复合性组成的混合物，

   每种肽净正电荷大于+1，并且包括L-氨基酸残基和D-氨

   基酸残基二者，或包括L-氨基酸残基和D-氨基酸残基之一

   或两者，以及包括α-螺旋中断部分或前述的环形衍生物；和

(5)一种由蔬水性，正电荷和D-氨基酸的不同比例组成的无规共

   聚物。

在一实施方案中，上述(1)的环形衍生物来源于例如pardaxin和mellitin的非选择性溶细胞天然肽或其片段。这些环形非对映通过常规环化肽的方法获得。在一实施方案中，环形非对映体来源于pardaxin的片段1-22，其中1-3个Lys残基被加到N-末端上并为便于环化在N和C末端加上半胱氨酸残基。

肽的净正电荷可能由于天然氨基酸组成，游离羧基的中和作用，和/或添加正电荷氨基酸残基或正电荷化学基团引起。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种非溶血性溶细胞肽和其以上(2)中所定义的环形衍生物，具有如下特征：

(a)它是一个非天然的合成肽，包含不同比例的疏水氨基酸和带正电荷的氨基酸并且二者至少各有一个，在其序列中至少有一个氨基酸残基是D-氨基酸；

(b)该肽带有大于“+1”的净正电荷，并且

(c)疏水氨基酸与带正电荷的氨基酸的比例恰当，使该肽对病原细胞有溶细胞性，但不引起红细胞溶解。

带正电荷的氨基酸的例子有赖氨酸、精氨酸和组氨酸，疏水氨基酸的例子有亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、和色氨酸。净正电荷由氨基酸组成产生，但也可考虑添加带正电荷的化学基团。此外，可以加入极性氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸来降低分子的疏水性和/或毒性。在一个优选的实施方案中，该肽包含一个疏水氨基酸如亮氨酸、丙氨酸或缬氨酸，以及一个带正电荷的氨基酸如赖氨酸或精氨酸。合成的非天然肽至少有6个，优选有10个或更多的氨基酸残基。在一个优选的实施方案中，合成的非对映体是一个12聚体的肽，包含亮氨酸、丙氨酸或缬氨酸和赖氨酸，并且至少三分之一的序列由D-氨基酸组成。

在另一个实施方案中，本发明提供了如上述(3)所定义的非溶血性溶细胞复合体，复合体由2个或更多的非溶血性溶细胞肽复合或“束”在一起，例如通过使用共价结合于每种肽的接头或“模板”分子进行复合。束可含有2个或更多的，优选为5个，相同的或不同的肽分子。接头/模板可以是本发明的肽或一种常用的接头，例如带有活性基团如OH、SH、COOH、NH₂、CH₂Br的聚合物如聚酯、聚酰胺、多肽、聚氨基酸(例如聚赖氨酸)。

在另一个更进一步的实施方案中，本发明提供一种如上述(4)所定义的非溶血性溶细胞混合物，它通过在肽合成的固相法的每一个偶联步骤中加入包含1eq的每种所需疏水、带正电荷和D-氨基酸的混合物来获得。通过这种方法，使用赖氨酸、亮氨酸和D-亮氨酸的混合物获得3¹²种不同肽的混合物，然后经过HF裂解、水抽提和冻干，从中获得了混合物。

在另一个实施方案中，本发明提供一种上述(5)中所定义的非溶血性溶细胞性无规共聚物，该共聚物包含不同比例的疏水氨基酸、带正电荷的氨基酸和D-氨基酸，例如1∶1∶1、2∶1∶1和3∶1∶1(mol)的Lys∶Leu∶D-Leu的共聚物。

优选地，根据本发明的非溶血性溶细胞肽不含α-螺旋结构或所具有的α-螺旋结构的长度不足以横跨细胞膜的宽度。因此本发明并不含有这样一种不被打断的片段，它全部由D或全部由L-氨基酸残基组成，其长度能组成一个跨膜孔道部分。这一长度在该片段不是肽的终端部分时，一般为20～22氨基酸，而在该片段是肽的终端部分时，长度为一半，即10～11氨基酸，因为在这种情况下，两个肽会将其终端相连，并跨过细胞膜。

打断一个D-或L-氨基酸残基的片段可通过将片段中的一个或多个氨基酸用相反的对映体取代来进行，或在连续的片段中置入一个α-螺旋中断组分如脯氨酸、甘氨酸、一种α-甲基-α-氨基酸或非α-氨基酸。

本发明的肽和本发明的复合物、混合物和共聚物中所包含的肽类有大于“+1”的净正电荷，净正电荷可来自本发明的天然氨基酸组成、游离COOH羧基基团的中和如酰胺化、或来自带正电荷的氨基酸或化学基团的加入。已经发现选择性溶细胞活性有时可通过增加其净正电荷来提高，例如，在分子中的任何位置加入一个带正电荷的氨基酸和/或带正电荷的基团。例如聚胺基团、烷氨基基团或氨基烷氨基基团等可以加入至一个终端，一般在其羧基端。一个优选的这种基团是氨基乙基氨基基团(-NH-CH₂-NH₂)，在下文称为“TA”。

由非选择性溶细胞天然肽如pardaxin和meilittin衍生的本发明的肽是两亲性的，其意思是它们的一个面主要由疏水氨基酸残基组成，而另一个面主要由亲水氨基酸组成。本发明范围内的肽的两亲性本质可根据本领域熟知的方法进行证明。这类方法的一个例子是使用Shifferand Edmondson轮式设计，其中氨基酸残基依据其序列写入一个环，使序列中每个氨基酸与其相邻氨基酸呈100°(每个环3.6个氨基酸)。如果大多数亲水氨基酸集中在轮的一面，而疏水氨基酸集中在轮的另一面，这个肽就被认为是两亲性的。

不是衍生于非选择性溶细胞天然肽的本发明的肽，例如包含疏水性的、带正电荷的和D-氨基酸的合成非对映体，不是两亲性的。它们带有大于+1的净正电荷，并且疏水氨基酸与带正电荷的氨基酸比例恰当，使所获得的肽对病原细胞有溶细胞性，但没有溶血活性。根据本发明，通过使用这里介绍的抗菌性和溶血性试验，这些肽可以很容易地进行筛选。在一个实施方案中，对于一个包含亮氨酸和赖氨酸的肽，在含有6个氨基酸残基的非对映体中，Leu∶Lys的合适比例可以是64％∶36％，而在含有12个氨基酸残基的非对映体中，比例为66％∶34％。

抛开理论的束缚，不管怎样都应当理解，溶细胞活性可能是一定数量的肽在膜表面聚集的结果，这样肽聚集导致细胞膜的损伤。因此，如上文的介绍，根据本发明我们还期望使用本发明的肽相互复合(或成束)的混合物或复合物，例如使用共价结合于每种肽的接头分子。

本发明的单个肽一般包含至少6个，优选10个或更多的氨基酸残基。在本发明的复合物中，每种单个的肽一般都有5个氨基酸残基以上的长度。

本发明还提供一种药用组合物，其中含有一种本发明的非溶血性溶细胞肽作为活性试剂，以及一种可药用载剂。该药用组合物用于治疗由各种病原有机体如革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、病毒、真菌、支原体及寄生性原生动物引起的疾病或紊乱，寄生性原生动物的例子有引起利什曼病的利什曼虫和引起疟疾的疟原虫。在一个优选的实施方案中该抗病原性组合物是一种抗微生物优选是抗细菌性的组合物。此外，本发明的组合物对于抵抗恶性细胞也是有用的，能够用于癌症的治疗。

本发明还提供一种治疗方法，包括给予有需要的患者以所说的非溶血性溶细胞肽。本发明的方法及上面的组合物能够在人类和兽类医学中应用。

根据本发明，还进一步提供所说的非溶血性溶细胞肽在制备药用组合物，特别是在抗细菌性组合物中的应用，该药用组合物用于治疗人或非人动物中的疾病。

在一个进一步的实施方案中，本发明的选择性肽可以用作消毒剂，用来清除微生物，即用于浸泡隐形眼镜的溶液中；可以用作防腐剂，例如用在化妆品或食品工业中；以及用作杀虫剂，应用于农业，例如杀真菌剂、杀细菌剂；或用作农产品例如水果和豆类储存的防腐剂。

                     附图简述

图1是氨基乙基氨基pardaxin(TApar)衍生肽的圆二色(CD)谱，图谱是在肽在40％的2，2，2-三氟乙醇(TFE)/水中的浓度为0.8-2.0×10^-5M时测定的。符号：TApar(__)；[D]P⁷-TApar(......)；[D]L¹⁸L¹⁹-TApar(__)；以及[D]P⁷L¹⁸L¹⁹-TApar(__)。

图2描述了TApar衍生肽对人红细胞(hRBC)溶血活性的剂量依赖曲线。插图显示在低浓度时的分析结果。符号：实心方块，melittin；实心三角，TApar；实心圆，[D]P⁷-TApar；空心圆，[D]L¹⁸L¹⁹-TApar；空心方块，[D]P⁷L¹⁸L¹⁹-TApar；空心三角，dermaseptin。

图3A-B显示TApar衍生肽诱导的囊泡中扩散电势的最大离散。这些肽加入至含有由磷脂酰胆碱/磷脂酰丝氨酸(PC/PS)(图3A)或PC(图3B)组成的小的单层囊泡(SUV)的等渗无K⁺缓冲液中，缓冲液预先用荧光染料diS-C₂-5和缬氨霉素平衡。在肽与囊泡混合10-20分钟后测量荧光恢复。符号：实心三角，TApar；实心圆，[D]P⁷-TApar；空心圆，[D]L¹⁸L¹⁹-TApar；空心方块，[D]P⁷L¹⁸L¹⁹-TApar。

图4A-C显示未处理的大肠杆菌(Escherichia coli)(图4A)、或者用低于最小抑制浓度(MIC)(图4B)或用浓度为MIC(图4C)的[D]P⁷L¹⁸L¹⁹-TApar处理的、负染大肠杆菌细胞的电子显微照片。

图5显示melittin和melittin衍生的非对映体的CD谱。图谱在肽浓度为40％TFE/水中0.8-2.0×10^-5M时测得。符号：melittin(__)；[D]-V^5，8-I¹⁷-K²¹-melittin(......)；[D]-V^5，8-I¹⁷-K²¹-melittin-COOH(-----)。

图6描述melittin衍生的非对映体对hRBC的溶血活性的剂量依赖曲线。符号：实心圆，melittin；空心圆，[D]-V^5，8-I¹⁷-K²¹-melittin-COOH；实心三角，[D]-V^5，8-I¹⁷-K²¹-melittin。

图7A-C显示未处理的(图7-A)或用浓度低于MIC(7B)或用浓度为MIC(7C)的[D]-V^5，8-I¹⁷-K²¹-melittin处理的负染大肠杆菌的电子显微照片。

图8A-B显示由melittin和melittin衍生的非对映体诱导的囊泡中扩散电势的最大离散。肽加入至含有由PC(8A)或PC/PS(8B)组成的SUV的等渗无K⁺缓冲液中，缓冲液预先用荧光染料diS-C₂-5和缬氨霉素平衡，在肽与囊泡混合10-20分钟后测量荧光恢复。符号：实心圆，melittin；实心三角，[D]-V^5，8-I¹⁷-K²¹-melittin。

图9A-B显示在用PC/PS囊泡(实心三角)或PC囊泡(空心三角)滴定时[D]-V^5，8-I¹⁷-K²¹-melittin(总浓度0.5μM)的荧光增强，激发波长设置为280nm，发射波长设置为340nm。实验于25℃在50mM Na₂SO₄、25mM HEPES-SO₄ ^-2、pH6.8(图9A)中进行；并通过绘制X_b ^*(每60％脂的结合肽的摩尔比)对C_f(溶液中游离肽的平衡浓度)，而从图9A获得结合等温线(图9B)。

图10A-B显示溴化磷脂对环境敏感的色氨酸的淬灭。Melittin(图10A)和[D]-V^5，8-I¹⁷-K²¹-melittin(10B)加入至含有PC/PS(1∶1w/w)SUV的缓冲液中。SUV含有25％6，7 Br-PC(-.-.-.-.-)或9，10Br-PC(------)或11，12Br-PC(......)。温育2分钟后，用荧光分光光度计在激发波长设置为280nm时记录色氨酸的发射光谱。为比较PC/PS(1∶1w/w)用无Br-PC的SUV(__)。

图11显示Leu/Lys非对映体的疏水性对PR-HPLC保留时间的影响。

图12显示Leu/Lys非对映体对hRBC的溶血活性的剂量依赖曲线。插图显示在低浓度时的分析结果。符号：空心方块，melittin；实心方块，[D]-L^{3，4，8，10}-K₃L₉；实心圆，[D]-L^{3，4，8，10}-K₄L₈；空心三角，[D]-L^{3，4，8，10}-K₅L₇；实心三角，[D]-L^{3，4，8，10}-K₇L₅。

图13A-B显示由Leu/Lys非对映体诱导的囊泡中扩散电势的最大离散，肽加入至含有由PC(图13A)或PE/PG(13B)组成的SUV的等渗无K⁺缓冲液中，缓冲液预先用荧光染料diS-C₂-5和缬氨霉素平衡。在肽与囊泡混合3-10分钟后测量荧光恢复。符号：实心方块，[D]-L^{3，4，8，10}-K₃L₉；实心圆，[D]-L^{3，4，8，10}-K₄L₈；实心三角，[D]-L^{3，4，8，10}-K₅L₇；空心圆，[D]-L^{3，4，8，10}-K₇L₅。

图14A-H显示未处理的和用80％的MIC的各种Leu/Lys非对映体处理的负染的大肠杆菌的电子显微照片。图14A，对照；图14B，用[D]-L^{3，4，8，10}-K₃L₉处理的大肠杆菌；图14C，用[D]-L^{3，4，8，10}-K₄L₈处理的大肠杆菌；图14D，用[D]-L^{3，4，8，10}-K₅L₇处理的大肠杆菌；图14E，用[D]-L^{3，4，8，10}-K₇L₅处理的大肠杆菌；图14F，对照；图14G，用[D]-L^{3，4，8，10}-K₄L₈处理的大肠杆菌；图14H，用[D]-L^{3，4，8，10}-K₅L₇处理的大肠杆菌。

                      发明详述

根据本发明，我们惊奇地发现，非均一型基于L的肽具有选择性溶细胞活性，其表现为对病原细胞如细菌具有选择性损伤作用，而对非病原细胞，即红细胞几乎没有或没有作用。该发现令人惊奇是因为，本领域中流行的观点是溶细胞肽在细胞中的溶细胞活性，不管是在病原细胞例如细菌还是在正常哺乳动物细胞中，是来自与α-螺旋构型有关的单一基本机制。

在这里，用pardaxin和melittin的D-氨基酸整合的类似物(非对映体)进行功能和结构研究的目的，是为了理解细胞选择性的分子机制，pardaxin和melittin是已知的两种非细胞选择性溶细胞素。数据显示，所获得的非对映体并不保留其α-螺旋结构，这导致其对哺乳动物细胞的细胞毒作用丧失。但是，非对映体保留了高的抗菌活性，其表现是对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌都能完全裂解。因此，pardaxin和melittin的α-螺旋结构显示对于针对哺乳动物细胞的细胞毒活性非常重要，但对抗菌活性不是必需的。然而，在另一个研究中，向非溶血性抗菌肽爪蟾抗菌肽中整合一个单一的D-氨基酸丧失了几乎全部的抗菌活性(Chen等，1988)。在此处用pardaxin和melittin非对映体获得的结果提示，疏水性和净正电荷可向非选择性溶细胞肽提供选择性抗菌活性，而两亲性α-螺旋结构不是必需的。但pardaxin和melittin非对映体含有长序列的L-氨基酸(14-17aa长)，这提出了这样一种可能性，即低度的残基螺旋结构对于膜结合和去稳定已经足够。

为了检测调整线性细胞毒肽的疏水性和净正电荷是否足以提供选择性抗菌活性，我们选择短的模型肽(12aa长)的非对映体进行研究，非对映体包含各种比例的亮氨酸和赖氨酸，其中三分之一的序列由D-氨基酸组成。肽的长度和D-氨基酸的位置使短肽有非常短的连续1-3个L氨基酸片段，使其不能构成α-螺旋结构。非对映体用如下方面进行评价：(1)其对细菌和人红细胞的细胞毒作用；(2)其结构；(3)其作用和破坏细菌细胞壁和模型磷脂膜的能力。数据显示，调整疏水性和净正电荷足以提供抗菌活性和溶细胞选择性。而且，所获得的抗菌肽能以非致死浓度与可用抗菌药物如四环素协同作用，并且它们对能显著降低天然抗菌肽活性的人血清灭活作用有完全的抗性。我们制备了更短的非对映体(6aa和8aa长)，经试验发现具有非溶血性溶细胞活性。

特定的溶细胞非螺旋型肽具有抗病原体活性，这一发现为制备含有这种非螺旋型多肽的抗病原体药物开辟了道路。若非螺旋肽是包含L-氨基酸和D-氨基酸两者的非均一肽，该抗病原体药物的额外优点在于，一方面比均一型L肽对降解如由蛋白酶引起的降解有较高的抗性；另一方面，又不象完全均一型D肽有完全的抗降解性。对降解的抗性在考虑到从机体中的缓慢清除时是一个缺点，这可能引起相关的毒副作用。这种非α-螺旋型抗病原体肽可用于多种治疗程序。

由于已知均一型D-肽具有与相应的均一型L-肽基本相同的溶细胞活性(Bessalle等，1990)，因此相应地很清楚，非均一型基于D的肽具有与非均一型基于L的肽相同的抗病原体特性。

本发明的发现，即特定的非α-螺旋型肽具有对细菌的溶细胞活性，而对红细胞没有溶细胞的活性，是如下事实的结果，细菌细胞与红细胞在其细胞膜的组成上不同。细胞膜组成上的差异还可见于多种病原细胞，例如癌细胞与正常细胞之间。因此，基于本发明的发现，即特定的非α-螺旋型肽具有针对一种细胞类型，即细菌细胞的特异性溶细胞活性，为发展各种具有下面特性的药物开辟了道路，即对机体内的一类细胞如细菌细胞、寄生虫细胞、真菌细胞、原生动物细胞或癌细胞具有选择性溶细胞活性，而对非病原的正常机体细胞几乎没有或没有活性。

对病原细胞具有选择性溶细胞活性而对正常的、非病原细胞几乎没有或没有溶细胞活性的本发明的非溶血性溶细胞肽，可以用于多种治疗应用而没有或几乎没有毒副作用。

根据本发明的一族环肽是由具有广谱溶细胞活性的带α-螺旋结构的均一型肽衍生的非α-螺旋型非均一型肽。因此，根据一个实施方案，本发明提供含有D-和L-氨基酸残基的非均一型环肽，该肽含有与具有如下性质的均一型肽同样的序列，该均一型肽仅包含L或D氨基酸残基，含有一个α-螺旋构型，并在多种细胞上显示广谱的溶细胞活性，所说的非均一型肽仅在某些所说均一型肽具有溶细胞活性的细胞上具有溶细胞活性。例如，非均一型的溶细胞活性仅在病原细胞上表现，而在正常细胞如红细胞上没有溶细胞活性。

根据本发明的溶细胞环肽的例子有，衍生于具有α-螺旋结构并拥有溶细胞活性的天然肽的肽。本发明的非α-螺旋环肽具有与天然肽的全部或部分序列基本上相当的序列，其中沿分子的N和C螺旋整合进D氨基酸，并用如下方法获得净正电荷，即通过加入一个带正电荷的氨基酸残基，如赖氨酸、精氨酸、组氨酸，例如在N末端；和/或加入带正电荷的基团，如诸如氨基乙基氨基的氨基烷基氨基基团，例如在分子的C末端；或通过中和游离的羧基基团，例如将它们转为酰胺基团。这种天然肽的例子有melittin和pardaxin及其片段。

例如，非α-螺旋环肽可以是来自pardaxin的33聚体的肽，或是来自melittin的26聚体的肽，非α-螺旋环肽可以是33聚体或26聚体的肽，分别含有一段相当于melittin或pardaxin全序列的序列，或者可以是一个非螺旋环肽，包含相当于melittin或pardaxin的部分序列，例如8-23聚体的melittin序列。在衍生于pardaxin的一个非均一型环肽时，根据本发明的非均一型肽可以包含相当于pardaxin序列的部分序列，至少包含10个氨基酸残基，范围是10-24氨基酸残基之间。

根据本发明的另一族肽是非螺旋型肽，它包含一段没有天然类似物的序列，至少包含一个疏水氨基酸且至少有一个带正电荷的氨基酸，并且在其序列中至少有一个氨基酸残基是D-氨基酸。

原先使用阐明抗菌肽的结构-功能研究的所用的模型肽进行的研究，注意力集中在三个参数：螺旋结构、疏水性和电荷(Anzai等，1991；Agawa等，1991)。这三个参数中任意一个改变都会使另外两个同时改变，这使得确定每个参数对全部抗菌活性的单独贡献非常困难。根据本发明，螺旋结构的影响被排除，因此就可以研究仅有的两个参数，即疏水性和净正电荷，这可通过改变亮氨酸和赖氨酸的比例来进行。为此，我们选择了含有仅为1-3个连续L-氨基酸片段的模型短肽(12aa长)的非对映体来进行研究，1-3个连续L-氨基酸片段太短而不能形成α--螺旋结构。

CD色谱揭示，这些Leu/Lys非对映体确实完全没有α--螺旋结构(未显示数据)，不象本发明的melittin和pardaxin的非对映体，它们还保留较低的α--螺旋结构。不管怎样，Leu/Lys非对映体显示了与天然抗菌肽如dermaseptin S或抗生素药物四环素相似或更高的抗菌活性，而且，最强的肽[D]-L^{3，4，8，10}-K₄L₈和[D]-L^{3，4，8，10}-K₅L₇(分别为23和24肽，见实施例3)，对高度溶细胞敏感的人红细胞没有溶血活性。应当注意，[D]-L^{3，4，8，10}-K₃L₉(22肽)没有α--螺旋结构，但具有相当的溶血活性，接近于天然的溶细胞肽pardaxin。这可暗示，疏水性和正电荷的平衡补偿了两亲性α--螺旋结构的缺乏。但是，提高正电荷显著降低溶血活性，而抗菌活性被保留，这证明两亲性α--螺旋结构不是抗菌活性所必需的。

我们检测了Leu/Lys非对映体与带负电荷和兼性的磷脂膜的相互作用，来说明它们对细菌选择性细胞毒作用的基础。带负电荷的PE/PG囊泡用来模仿大肠杆菌的脂组成(Shaw，1974)，而兼性的PC囊泡用来模仿人红细胞外层小叶(Verkleij等，1973)。Leu/Lys肽在红细胞(图12)和大肠杆菌(表5)上的生物学活性与其透过模型膜的能力完全对应。能够透过PC囊泡的肽正是有显著溶血活性的肽。这些结果显示细菌膜的磷脂组成在这族抗菌肽的透过中起着一种作用，抗菌和非溶血型肽结合并穿透带负电荷的囊泡而不结合和穿透兼性磷脂囊泡的能力是天然抗菌肽的特征(Gazit等，1994)，其原因为这样一个事实，细菌表面含有脂多糖(LPS，在革兰氏阴性菌中)、多糖(磷壁酸，革兰氏阳性菌中)，并且在它们的内膜含有磷脂酰甘油(PG)，它们都是带负电荷的，而正常的真核细胞，例如红细胞，在其外层小叶中主要表达兼性磷脂PC。

抗菌肽爪蟾抗菌肽是非溶血性肽，而melittin、pardaxin和一种序列类似于[D]-L^{3，4，8，10}-K₄L₈但全部由L氨基酸组成的模型肽是溶血性的，这主要是因为它们的高度疏水性。当爪蟾抗菌肽的α--螺旋结构为引入三个D-氨基酸所破坏时，所产生的非对映体没有抗菌活性(Chen等，1988)，即使其净正电荷与爪蟾抗菌肽相同。因此，已经存在于天然爪蟾抗菌肽α--螺旋的疏水性和净正电荷的最佳平衡，使其具有选择性抗菌活性，这些特征中任意一个改变都可能丧失爪蟾抗菌肽的抗菌活性。与此相对，疏水性在补偿本发明的melittin、pardaxin和Leu/Lys非对映体中α--螺旋结构缺失时，似乎起主要作用。

根据本发明的结果提示了一种设计短的、简单的、且容易操作的抗菌肽库的新策略。每一种非对映体的模型Leu/Lys肽都具有独特的活性谱(表5)。存在非对映体抗菌肽库使我们能选择针对靶细胞的最有效的肽。而且，同时用多种形式的非对映体肽进行给药，这些肽可单独或混合起作用，这样也可有选择性的残余值，并且可为抵抗大范围的感染性微生物提供更好的保护。所有的Leu/Lys非对映体都显示对革兰氏阳性菌的抗菌活性比对革兰氏阴性菌的抗菌活性高。考虑到革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌、肠球菌和肺炎球菌对传统抗生素的抵抗力不断提高，这些结果非常重要(Russell等，1995)。此外，不像天然的抗菌肽dermaseptin S，[D]-L^{3，4，8，10}-K₅L₇(24肽)在存在混合的人血清时，仍保留其抗菌活性。

非对映体肽相对已知的抗菌肽具有以下几个优点：(1)这些肽没有由α--螺旋型溶解性溶细胞素诱导的多种病理和药学效应。例如，葡萄球菌δ毒素、抗菌肽丙甲甘肽、眼镜蛇毒素直接裂解因子，和pardaxin由于其形成孔道而对多种细胞产生组织病理影响，并激活花生四烯酸级联反应，但pardaxin非对映体并不具有这些活性。此外，许多两亲性α--螺旋肽与钙调蛋白结合，并引发几种细胞应答，即使是全D-氨基酸的α--螺旋，包括melittin也有相同的活性(Fisher等，1994)。α--螺旋被破坏的非对映体预期不会与钙调蛋白结合；(2)局部的D-氨基酸替换与完全的D-氨基酸替换所获得的全保护相比，将会产生可控制的蛋白水解酶对抗菌肽的清除(Wade等，1990)。裂解型肽对降解有完全的抵抗作用，这在用于治疗时是一个缺陷。而且，含有D、L氨基酸的短片段的抗原性与其全部的D或L型氨基酸亲本分子相比有了很大改变(Benkirane等，1993)；(3)由非对映体诱导的细菌生长的完全抑制作用与细菌细胞壁的完全裂解有关，这一点由电镜照片显示(图14)。因此细菌不可能对以这样的损伤机制起作用的药物容易地产生抗性；(4)[D]-L^{3，4，8，10}-K₅L₇(24肽)能够在低于其MIC的浓度时干扰细菌的细胞壁，见电镜照片(图14)。某些临床用抗生素由于其不能穿透细菌的细胞壁而没有活性，在与24肽同时给药时，将会解决细菌的这种抗性机制。

本发明将参考某些非限制性的附图和实施例进行说明。

 实验方法

(i)材料，叔丁氧羰基-(氨基酸)-(苯乙酰胺)甲基树脂购自Applied Biosystems(Foster City，CA)，叔丁氧羰基(BOC)氨基酸购自Peninsula Laboratories(Belmont，CA)，其它用于肽合成的试剂包括三氟乙酸(TFA，Sigma)、N、N二异丙基乙胺(DIEA，Aldrich，在茚三酮上蒸馏)、二环己基碳二亚胺(DCC，Fluka)、1-羟基苯并三唑(HOBT，Pierce)以及二甲基甲酰胺(肽合成级，Biolab)。来自牛脊髓的卵磷脂(PC)和磷脂酰丝氨酸(PS)(钠盐-I级)购自Lipid Products(South Nutfield.U.K.)。卵磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰乙醇胺(V型，来自大肠杆菌)购自Sigma。胆固醇(超级纯)购自Merk(Darmastadt，德国)，并在乙醇中重结晶两次。3，3’-二乙硫基二碳花青碘化物(diS-C₂-5)获自Molecular Probes(Eugene，OR)。天然melittin购自Sigma。商品化melittin通常含有痕量的磷脂酶A₂，它会引起磷脂的迅速水解。因此我们特别采用RP-HPLC从melittin中去除所有的磷脂酶A₂。其它试剂为分析纯。缓冲液用玻璃双蒸水制备。

(ii)肽合成及纯化

肽在叔丁氧羰基-(氨基酸)-(苯乙酰胺)甲基树脂(0.05meg)上用固相法合成(Merrifield等，1982)。树脂上结合的肽用氢氟酸(HF)从树脂上裂解下来，且在HF挥发后用无水乙醚抽提。这些粗制的肽制备物在RP-HPLC上含有一个主峰，它是50-70wt％纯的肽。这些合成肽在一个C₁₈反相Bio-Rad-半制备柱(300孔径大小)上用RP-HPLC进行进一步纯化。柱洗脱40分钟，使用线性梯度的10-60％乙腈水溶液，均含0.05％TFA(V/V)，流速为1.8ml/min。用分析HPLC显示为均一(～95％)的纯化肽进行氨基酸分析，并用质谱证明其序列。

(iii)肽的转氨基

上述(ii)中树脂结合的肽用DMF中的30％乙二胺转氨基3天，接着过滤树脂，用乙醚沉淀被保护的肽，即氨基乙基氨基(TA)肽，用HF去除保护基团。合成的TA肽在C₁₈柱上用反相HPLC纯化(＞95％均一性)，使用0.01％TFA中线性梯度为25-80％的乙腈40分钟，然后进行氨基酸分析证实其组成。

(iv)肽的酰胺化

树脂结合的肽(20mg)用含有甲醇中1∶1V/V的饱和氨溶液(30％)和DMSO(1∶1V/V)的混合物处理3天，这会导致位于[D]-V^5，8-I¹⁷-K²¹-melittin C末端的谷氨酸残基的羧基基团酰胺化。这样，获得了这样一种肽，其全部的保护基团仍存在，但其C末端残基被一个酰胺基团修饰。甲醇和氨在氮气流中挥发，被保护肽用DMSO从树脂中抽提出来，并用无水乙醚沉淀，然后用HF裂解产物，并如上所述用RP-HPLC进一步纯化。

(v)脂囊泡的制备

小的单层囊泡(SUV)用PC/胆固醇(10∶1，w/w)或PC/PS(1∶1，w/w)分散液的超声进行制备。简而言之，干燥的脂和胆固醇(10∶1，w/w)溶解在CHCl₃/MeOH混合物(2∶1，V/V)中。接着溶剂在氮气流中挥发，脂(浓度为7.2mg/ml)在真空中处理1小时，然后重新剧烈振荡溶解在合适的缓冲液中。所获得的脂分散物在槽式超声仪(G1125SPl超声仪，Laboratory Supplies Company Inc.NY)超声处理5～15分钟直至清亮。所产生的制备物中的脂浓度用磷分析法(Bartlett，1959)进行测定。囊泡按如下方法用JEOL JEM 100B电子显微镜(Japen Electron Optics Laboratory Co.，Tokyo，Japan)进行观察。将一滴囊泡置于碳包被的网上，用乙酸双氧铀负染。对网的检查证明这些囊泡是单层的，平均直径为20～25nm(Papahadjopoulos和Miller，1967)。

(vi)血清制备

从5个志愿者采集血样，在室温下凝集4小时，然后将血在1500g离心15分钟，移取血清并混合，血清补体在56℃加热30分钟进行灭活。

(vii)CD谱

在仪器用(+)-10-樟脑磺酸校对后，用Jasco J-500A旋光分光光度计测量肽的CD谱。光谱在23℃在有盖透明石英杯中用0.5mm的光程长度进行扫描。光谱在250至190nm的波长时获取。对每个肽以以20nm/min的扫描速率扫描8次。肽以在40％的三氟乙醇(TFA)中1.5×10^-5-2.0×10^-5M的浓度进行扫描，TFE是一种能强烈促进α-螺旋结构的溶剂。分级螺旋(Greenfield和Fasman，1969，Wu等，1981)按如下进行计算。 $f_n=\frac{{\left[\mathrm{\θ}\right]}_{222}-{{\left[\mathrm{\θ}\right]}^0}_{222}}{{{\left[\mathrm{\θ}\right]}^{100}}_{222}-{{\left[\mathrm{\θ}\right]}^0}_{222}}$ 其中，[θ]₂₂₂是在实验中观察到的在220nm处的平均残基椭圆度，而[θ]⁰ ₂₂₂和[θ]¹⁰⁰ ₂₂₂相当于222nm时0％和100％的螺旋含量，其值分别估计为2000和32000deg·cm²/dmole(Wu等，1981)。

(viii)肽的抗菌活性

非对映体的抗菌活性在无菌的96孔板(Nunc F96微滴定板)中进行检测，其终体积为含如下物质的100μL：1小份(50μl)含浓度为106集落形成单位(CFU)/ml LB(Lauria broth)培养基的细菌的悬浊液加入至50μl水或PBS中66％混合的正常人血清中，其中含有倍比稀释的肽。生长抑制在37℃温育18-20小时后用Microplateautoreader E1309(Bio-Tek Instruments)通过测量在492nm处的吸收值来测定。抗菌活性以最小抑制浓度(MIC)的方式表示，MIC是在温育18-20小时后能观察到生长被100％抑制的浓度，所使用的细菌为大肠杆菌D21、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC27853、乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter caicoaceticus)Acll、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)LT₂、巨大芽胞杆菌(Bacillus Megaterium)Bmll，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)ATCC 9341、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 6051。

(ix)人红细胞的溶血

我们检测了肽对人红细胞(hRBC)的溶血活性。新鲜的hRBC与EDTA用PBS(35mM的磷酸缓冲液/0.15M NaCL₂，PH7.3)通过在800g离心10分钟洗涤3次并重新悬浮于PBS中，随后将溶解在PBS中的肽加入到50ul PBS中的hRBC贮存液中，使其终体积达到100μL(红细胞终浓度，5％V/V)。所获得的悬液在37℃振荡温育30分钟。样品随后在800g离心10分钟。血红蛋白的释放通过测量上清在540nm的吸收值来监测。0溶血(空白)和100％溶血的hRBC对照分别悬浮于PBS和1％Triton中。

(x)用电镜观察肽对细菌的影响

含在LB培养基中的大肠杆菌样品(10⁶CFU/ml)与不同的肽在它们的MIC浓度和低于MIC的一个稀释度温育16小时，然后在3000g离心10分钟。重新悬浮沉淀，将含有细菌的一小滴置于碳包被的网上，然后用2％的磷钨酸(PTA)pH6.8负染，样品网用JEOL JEM 100B电子显微镜检查。

(xi)肽诱导的膜穿透

膜穿透使用前面介绍(Shai等，1991)的扩散电势实验(Loew等，1983，Sims等，1974)进行估算。在典型的实验中，在一个玻璃试管中，4μl溶于含K⁺缓冲液(50mM K₂SO₄、25mM HEPES-SO₄ ^-2、pH6.8)的脂质体悬液稀释于1mL不含K⁺的等渗缓冲液(50mM Na₂SO₄、25mM HEPES-SO₄ ^-2、pH6.8)中，然后加入荧光标记的电势敏感染料diS-C₂-5。在悬液中加入缬氨霉素(1ul、10^-7M)以在囊泡内部缓慢产生一种负的扩散电势，这会导致染料的荧光淬灭。当荧光稳定后，这需要3-10分钟，加入肽。在一台Perkin Elmer LS-50B荧光分光光度计上监测随后扩散电势的离散，这通过荧光的增强来反映。激发波长设置为620nm，发射波长设置为670nm，放大值设置为100％。荧光恢复的百分比F_t定义为

F_t＝(I_t-I₀/I_f-I₀)×100其中I₀＝初始荧光值，I_f＝在加入缬氨霉素前观察到的总荧光值，I_t＝在t时间加入肽后观察的荧光值。

(xii)肽与囊泡结合

[D]-V^5，8-I¹⁷-K²¹-melittin与包含兼性(PC)或带负电荷磷脂(PC/PS)的囊泡的相互作用，通过测量SUV滴定实验中肽固有的色氨酸的发射强度来确定。简而言之，SUV在24℃加入至溶于含50mMNa₂SO₄、25mM HEPES-SO₄ ^-2、pH6.8缓冲液的固定量的肽(0.5μM)中。在所有实验中均使用含2ml最终反应体积的1cm光程长度的石英小杯，在Perkin-Elmer LS-5荧光分光光度计上测量荧光强度作为脂/肽摩尔比的函数(4个单独的实验)，激发波长设置为280nm，使用5nm狭缝，发射波长设置为340nm，使用2.5nm狭缝。结合等温线以分配平衡的形式进行分析，使用如下公式

X_b＝K_pC_f其中X_b定义为每全脂(C_L)中结合肽(C_b)的摩尔比，K_p相当于分配常数，C_f代表溶液中游离肽的平衡浓度，为实用的目的，假定肽最初仅在SUV的外小叶(60％)分配。所以平衡方程变为

X_b ^*＝K_P ^*C_f其中X_b ^*定义为每60％全脂上结合肽的摩尔比，K_p ^*是估计的表观平衡常数，曲线用X_b ^*对游离肽来绘制，C_f为常规结合等温线。

(xiii)色氨酸淬灭实验

色氨酸对其环境敏感，这一点在前面已用于与溴化的磷脂(Br-PC)来一起评价肽在膜上的定位(Bolen和Holloway，1990；De Kroon等，1990)。Br-PC作为色氨酸荧光淬灭剂适用于探测膜上插入的肽，因为它们在短距离内作用且不明显地破坏膜。melittin及其非对映体都含有一个色氨酸残基，将它们(终浓度为0.5μM)加入至2ml含有20μl(50μM)Br-PC/PS(1∶1w/w)SUV的缓冲液(50mM Na₂SO₄、25mM HEPES-SO₄ ^-2、pH6.8)中，这样建立的脂/肽比例为100∶1。在室温下保温2分钟后，用Perkin-Elmer LS-50B荧光分光光度计记录色氨酸的发射光谱，其中激发波长设置为280nm(8nm狭缝)。使用含有PC/PS(1∶1w/w)的SUV，后者含有25％的6，7Br-PC或9，10Br-PC或11，12Br-PC。对每种肽进行3组单独的实验。在对照实验中，使用不含Br-PC的PC/PS(1∶1w/w)SUV。

实施例1 pardaxin衍生的非对映体的合成和生物活性

1.1合成

为检测聚阳离子溶细胞素中α-螺旋结构在其对哺乳动物细胞和细菌的细胞毒作用中所起的作用，我们按实验方法(ii)和(iii)中介绍的方法合成了一系列pardaxin衍生的肽，并分析了它们的结构、对hRBC的溶血活性、抗菌活性及对细菌形态的影响。

pardaxin(par)是有下列序列的33-聚体肽

Gly-Phe-Phe-Ala-Leu-Ile-Pro-Lys-Ile-Ile-Ser-

Ser-Pro-Leu-Phe-Lys-Thr-Leu-Leu-Ser-Ala-Val-

Gly-Ser-Ala-Leu-Ser-Ser-Ser-Gly-Gly-Gln-Glu

为引入正电荷，pardaxin分子的修饰使用下面方法进行：删除pardaxin的酸性C末端，或将pardaxin或其片段的酸性C末端转变成带正电荷，这通过将C末端上Glu残基的羧基基团与乙二胺(TA)反应实现，和/或在N末端添加带正电荷的氨基酸残基如Lys，在pardaxin非对映体中，N螺旋和/或C螺旋通过将TApar或pardaxin片段的位置7的Pro残基用D-Pro(这里表示为[D]P⁷)替换来转变，或将TApar或pardaxin片段的位置18和19两个Leu残基用D-Leu(这里表示为[D]P⁷L¹⁸L¹⁹)替换来改变，或用二者来改变(这里表示为[D]P⁷L¹⁸L¹⁹)。D-氨基酸被引入到N和C-螺旋的中央。

下面的pardaxin衍生的非对映体被发现无溶血性并显示选择性溶细胞活性(黑体和下面划线的残基为D-氨基酸)，这些肽在此之后用黑体数字来代表：

1.[D]P⁷L¹⁸L¹⁹-TApar的序列

Gly-Phe-Phe-Ala-Leu-Ile-Pro-Lys-Ile-Ile-Ser-

Ser-Pro-Leu-Phe-Lys-Thr-Leu-Leu-Ser-Ala-Val-

Gly-Ser-Ala-Leu-Ser-Ser-Ser-Gly-Gly-Gln-Glu-(NH-CH₂-CH₂-NH₂)₂

2.[D]P⁷L¹⁸L¹⁹[1-22]-TApar的序列

Gly-Phe-Phe-Ala-Leu-Ile-Pro-Lys-Ile-Ile-Ser-

Ser-Pro-Leu-Phe-Lys-Thr-Leu-Leu-Ser-Ala-Val-NH-CH₂-CH₂-NH₂

3.[D]P⁷L¹⁸L¹⁹[1-22]-par的序列

Gly-Phe-Phe-Ala-Leu-Ile-Pro-Lys-Ile-Ile-Ser-

Ser-Pro-Leu-Phe-Lys-Thr-Leu-Leu-Ser-Ala-Val

4.K¹[D]P⁷L¹⁸L¹⁹[1-22]-TApar的序列

Lys-Gly-Phe-Phe-Ala-Leu-Ile-Pro-Lys-Ile-Ile-Ser-

Ser-Pro-Leu-Phe-Lys-Thr-Leu-Leu-Ser-Ala-Val-NH-CH₂-CH₂-NH₂

5.K¹K²[D]P⁷L¹⁸L¹⁹[1-22]-TApar的序列

Lys-Lys-Gly-Phe-Phe-Ala-Leu-Ile-Pro-Lys-Ile-Ile-Ser-

Ser-Pro-Leu-Phe-Lys-Thr-Leu-Leu-Ser-Ala-Val-NH-CH₂-CH₂-NH₂

6.K¹K²[D]P⁷L¹⁸L¹⁹[1-22]-par的序列

Lys-Lys-Gly-Phe-Phe-Ala-Leu-Ile-Pro-Lys-Ile-Ile-Ser-

Ser-Pro-Leu-Phe-Lys-Thr-Leu-Leu-Ser-Ala-Val

7.[D]P⁷[1-11]-TApar的序列

Gly-Phe-Phe-Ala-Leu-Ile-Pro-Lys-Ile-Ile-Ser-NH-CH₂-CH₂-NH₂

下面的pardaxin衍生物是合成的，并被发现有如后面表1显示的溶血活性：

8.TApar                  9.[D]P¹³-TApar

10.[D]L⁵L¹⁹-TApar      11.[D]P⁷L¹⁹-TApar

12.[D]P⁷-TApar          13.[D]p⁷-par

14.[D]L¹⁸L¹⁹-TApar     15.[D]L¹⁸L¹⁹-par

16.[D]P⁷L¹⁸L¹⁹-par    17.[D]P⁷[1-22]-TApar1.2确定肽的二级结构

肽1，8，12，14的二级结构用其在40％TFE和PBS(35mM磷酸缓冲液0.15M NaCL PH7.0)中的CD谱来评价，TFE是一种强烈促进α-螺旋结构的溶剂，方法按实验方法中部分(vii)介绍。

pardaxin衍生的非对映体的CD谱在图1中所示，其中[8](__)、[12](.......)、[14](----)、及[1](-.-.-.-.-).正如所预期的，当较多的D-氨基酸整合时，肽的α-螺旋含量明显下降，这由40％TFE中208和222nm处的最低值反映出来。在8(TApar)(50％α-螺旋)和1([D]P⁷L¹⁸L¹⁹-TApar)(4％)之间有大于90％的α-螺旋含量的降低。12([D]P⁷-TApar)和14([D]L¹⁸L¹⁹-TApar)的α-螺旋含量分别为25％和15％。应当注意，位置7的脯氨酸并非在结构中引入一个结，而是参与N-螺旋的形成，这一点由NMR质谱所揭示(Zagorski等，1991)。在PBS中，pardaxin给出一个非常低值的约12％的α-螺旋含量，而D-氨基酸残基的类似物给出非常低的信号，不能归结为特殊结构(数据未显示)。1.3  溶血性和抗菌活性

我们随后检测了pardaxin衍生肽1-17对高度敏感的人红细胞的溶血活性及其抑制不同种属细菌的潜力，方法分别按照实验方法部分(ix)和(xiii)。此外细胞毒性蜂毒melittin、抗菌肽dermaseptinS和抗生素四环素用作对照。

图2显示了1、8、12、14肽溶血活性的剂量依赖曲线。据显示D-氨基酸引入到TApar明显降低了其溶血活性，这与在相应类似物中α-螺旋含量的丧失相符。具有最大α-螺旋含量的肽8TApaR具有最大的溶血性，而具有最低α-螺旋含量的肽1、[D]P⁷L¹⁸L¹⁹-TApar在最大测试浓度时(50μM)基本上没有溶血活性。不能裂解RBC是大多数天然产生的抗菌肽如dermaseptin(见图2)、爪蟾抗菌肽和杀菌肽的特征。

表1给出了肽1-17对代表性的测试菌的MIC(用μM单位)，代表菌株包括2个革兰氏阴性菌种类大肠杆菌和乙酸钙不动杆菌、两个革兰氏阳性菌种类巨大芽胞杆菌和枯草芽孢杆菌。表1还给出了50μM肽的溶血％。表2给出了肽1、8、12、14和melittin、dermaseptinS和四环素对某些细菌种类的MIC(用μM单位)，数据显示，尽管1-7非对映体类似物的α-螺旋含量和溶血活性明显降低，它们仍保留其亲本肽pardaxin的大部分强效抗菌活性，其活性与已知的天然抗菌肽相当。

                                     表1

              pardaxin类似物非对映体的最小抑制浓度(μM)和溶血活性

                                  最小抑制浓度(μM)肽    大肠杆菌    乙酸钙不动杆菌  巨大芽孢杆菌  藤黄微球菌  伤寒沙门氏菌  铜绿假单胞菌  50μM肽的

  (D21)         (Acll)         (Bmll)       (ATCC 9341)  (LT2)        (ATCC 27853)  溶血％1.     6             6             0.9           12.5         N.D          N.D           52.     12.5          12.5          2.5           N.Da         N.D          N.D           03.     130           ＞130         30            N.D          ＞130        ＞130         04.     7.5           7.5           1.5           N.D          N.D          N.D           05.     3.5           3.5           0.75          N.D          N.D          N.D           06.     15            6             6             N.D          120          60            07.     ＞120         ＞120         30            N.D          ＞120        ＞120         08.     3             3             0.8           5            15           8             1009.     3             N.D           1.5           N.D          N.D          N.D           8310.    3             N.D           1.3           N.D          N.D          N.D           5611.    3             N.D           1.5           N.D          N.D          N.D           8212.    10    5      1.2    5      N.D    N.D    4913.    30    15     3.5    N.D    ＞100  ＞100  2314.    3.5   1.5    0.6    2.5    N.D    N.D    10015.    15    3.5    1.7    N.D    60     60     4416.    100   100    50     N.D    ＞100  ＞100  017.    10    N.D    1      N.D    N.D    N.D    17a-N.D，未测定

                                    表2肽的最小抑制浓度(μM)^a细菌种         菌株      8    12    14    1    Melttin  DermaseptinS  四环素大肠杆菌       D21       3    10    3.5   6     5        6            1.5乙酸钙不动杆菌 Acll      3    5     2.5   6     2        3            1.5巨大芽孢杆菌   Bmll      0.8  1.2   0.6   0.9   0.3      0.5          1.2枯草芽胞杆菌   ATCC-6051 1.5  2     1.5   3     0.6      4            6.5a.结果是3个独立实验的平均值，每个独立试验做两个重复，标准偏差为20％。

1.4 pardaxin衍生肽诱导的膜不稳定

迄今为止研究的所有α-螺旋型、带正电荷的天然抗菌肽的共同特点是它们作用并穿透带负电荷磷脂的能力优于作用并穿透兼性磷脂的能力。这些发现与其生物靶膜的关联在于，细菌表面含有脂多糖(LPS，革兰氏阴性菌中)和多糖(磷壁酸，革兰氏阳性菌中)，这两者都是酸性的，而正常的哺乳动物细胞(如红细胞)在其外层小叶上主要表达兼性磷脂PC。用来评价肽对PC和PC/PS磷脂囊泡(根据实验方法部分v制备)的膜穿透能力的扩散电势的离散按实验方法部分xi的介绍进行分析。图3中所示肽1、8、12、14的结果指出，引入pardaxin的D-氨基酸并不显著影响肽穿透磷脂膜的能力，但肽1穿透带负电荷磷脂明显优于兼性磷脂。肽1是唯一无溶血活性但保留抗菌活性的非对映体。在这方面它的行为类似于天然的抗菌肽，虽然它不含α-螺旋结构。肽12和14没有明显的中间活性，这可用下列事实来解释，即它们都含有完整的疏水N-螺旋或两亲性C-螺旋，这足以促进与两种类型的囊泡经疏水相互作用而强烈结合。

1.5用电子显微镜观察细菌裂解

pardaxin衍生肽对完整和经处理的细菌形态学的影响用负染电子显微技术进行观察，方法按实验程序部分xx的介绍。肽按抗菌实验(见上文实施例1.3)相同条件以MIC或低于MIC的浓度加入至细菌中。样品在18小时温育后取出，立即固定，用透射电子显微镜检查。作为一个例子，图4显示了获自非溶血性类似物1[D]P⁷L¹⁸L¹⁹-TApar的照片。我们发现在MIC时，肽1完全裂解细菌，并且仅能观察到小的片段(图4C)。但是，在低于MIC的浓度时，在细胞壁上观察到斑点(图4B)。这些斑点很可能指明了参与裂解过程的开始步骤。

实施例2  melittin衍生的非对映体的合成和生物学活性

2.1合成

为进一步检测溶细胞素的α-螺旋结构在其对哺乳动物细胞和细菌的细胞毒中的作用，并了解这一作用内在机制，我们合成了4个melittin(mel)的非对映体。

melittin是一个有如下序列的26聚体肽Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-NH₂

为了引入正电荷，melittin的修饰通过将melittin或其片段的酸性C末端转变为带正电荷来进行，这通过对C端羧基基团与乙二胺反应来进行。在melittin非对映体中，N-螺旋和C-螺旋通过分别用D-Val、D-Ile和D-Lys替换melittin的位置5和8的两个Val残基、位置17的Ile残基、位置21的Lys残基来改变(这里表示为[D]-V⁵-V⁸-I¹⁷-K²¹)。

下列melittin衍生的非对映体被发现是非溶血性的，并显示选择性细胞毒活性(黑体和下面划线的残基是D-氨基酸)

18.[D]-V⁵V⁸I¹⁷K²¹-mel的序列

Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu

Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-NH₂

19.[D]-V⁵V⁸I¹⁷K²¹-mel-COOH的序列

Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-

Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-COOH

20.[D]-V⁶V⁸I¹⁷K²¹-[1-22]-TAmel的序列

Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-

Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-NH-CH₂-CH₂-NH₂

21.[D]-V⁵V⁸I¹⁷K²¹-[4-22]-TAmel的序列

Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-

Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-NH-CH₂-CH₂-NH₂

随后对肽18-21分析其结构、生物学功能以及与细菌和由兼性或带负电荷磷脂组成的模型膜的相互作用。

2.2 CD光谱学

肽18和19的α-螺旋结构的程度是由其在40％TFE的CD谱来确定，TFE是一种强烈促进α-螺旋结构的溶剂。正如所预期的，与melittin相比，非对映体的α-螺旋含量非常低(降低80％)，这由在208和222nm(图5)的最低值反映。melittin的α-螺旋含量为73％。与之相比，其非对映体18和19分别为15％和7％。

2.3 melittin非对映体18-21的抗菌和溶血活性

我们研究了肽18-21对hRBC的溶血活性及其抑制不同细菌种生长的能力。抗生素四环素在抗菌实验中用作对照。我们获得了肽溶血活性的剂量反应曲线(图6)。表3是对代表性测试细菌的MIC。我们发现将D-氨基酸引入melittin显著降低了其溶血活性。这与在相应类似物中α-螺旋含量的丧失平行。具有最高α-螺旋含量的melittin溶血性最大，而直到最大测试浓度(50μM)，具有最低α-螺旋含量的肽18和19实际上无溶血活性。但是，尽管melittin非对映体18和19的溶血性显著降低，它们仍都保留亲本肽的强烈抗菌活性。而且，肽19的抗菌活性仅略低于肽18，这表明melittin C末端的酰胺基团对抗菌活性没有显著贡献。相反，已知带有一个游离羧基C末端的杀菌肽的抗菌活性明显低于带有一个酰胺化C末端的天然杀菌肽(Li等，1988)。

                                 表3melittin类似物非对映体的最小抑制浓度(μM)和溶血活性

                                    最小抑制浓度(μM)肽名称：      大肠杆菌  乙酸钙不动杆菌  巨大芽孢杆菌  藤黄微球菌  枯草芽胞杆菌  50μM 肽的

           (D21)      (Acll)           (Bmll)     (ATCC 9341)   (ATCC 6051)  溶血％Melittin        5         20              0.3          0.4          0.4          10018              12        12              0.8          25           3.5          019              18        18              1.2          50           8            020              8         7               0.8          29           N.D          021              21        14              1.2          28           N.D          0Dermaseptin-S   6         3               0.5          N.D          4            9四环素          1.5       1.5             1.2          N.D          6.5          -

2.4细菌裂解的电子显微镜研究

肽18对完整和经处理细菌的形态学影响用透射电子显微镜来观察。如图7所示，在MIC时，肽18引起细菌的完全裂解(图7C)，但在低于MIC的浓度时，在细胞壁上观察到斑点(图7B)。这些斑点可能代表裂解过程的初始步骤。

2.5与磷脂膜作用的模式

因为肽18和19的生物学活性相似，我们仅用肽18与模型磷脂膜的相互作用模式与melittin比较，来解释所观察到的膜选择性基础。为此，我们测量了肽在PC和PC/PS两种囊泡中离散扩散电势的能力，同时还测定了肽与两种类型囊泡的分配系数，以及当肽与膜结合时的定位。

2.5.1肽诱导的膜穿透

不同浓度的melittin和肽18与预先用荧光染料diS-C₂-5和缬氨霉素处理的囊泡混合。荧光恢复的动力学按时间进行监测，并测定所达到的最高水平作为肽浓度的函数。如图8所示，melittin和肽18具有相似的对PC/PS囊泡的膜穿透活性，这证明将D-氨基酸引入melittin并不影响所产生的非对映体穿透带负电荷磷脂(PC/PS)膜的能力。但是，melittin还对PC囊泡有高活性，而非对映体完全没有对PC囊泡的膜穿透活性(直至最大测试值)。

2.5.2结合研究

非对映体18不能穿透PC囊泡可能是因为它不能与PC结合，或也可能是它能与PC结合，但一旦结合却不能组成能诱导膜渗漏的结构。为区别这两种可能性，我们进行了结合实验。位于肽18的位置19的单一Trp用作内在的荧光探针来追寻其与PC和PC/PS囊泡的结合。一个固定浓度(～0.5μM)的肽用所需囊泡(PC或PC/PS)滴定，如果结合发生，就会观察到荧光强度的增加。将产生的Trp荧光强度增加作为脂∶肽摩尔比例的函数作图，产生了传统的结合曲线(图9A)。肽18与PC/PS的结合曲线显示，在脂∶肽摩尔比为100∶1时，几乎所有的肽分子都与囊泡结合。但对PC囊泡，即使在测试的最大脂∶肽摩尔比时也没有观察的Trp荧光的净增加这表明该肽不能与PC囊泡结合。结合等温线用X_b ^*(每60％全脂的结合肽的摩尔比)对C_f(溶液中游离肽的平衡浓度)作图(图5B)。表面分配系数通过将曲线初始斜率外延至C_f为0来估算。所估算的表面分配系数K_p ^*，对于肽18为1.1±0.2×10⁴M^-1(获自4个测量)。这一数值与报道的melittin与磷脂酰甘油/卵磷脂的结合值相似(4.5±0.6×10⁴M^-1(Beschiaschvili和Seelig，1990)。

肽结合等温线的形状可以提供肽在膜内组织的信息(Schwarz等，1987)。肽18的结合等温线向下弯曲表明负协同。这种负协同的一个可能的解释是，在低浓度时，与无电荷作用分配平衡相比，肽18与PC/PS的结合被磷脂头部的负电荷增强。此外，在与膜结合时，肽部分中和了膜表面的负电荷。但是一旦膜表面的电荷被中和，进一步的肽18结合很困难，因为相同电荷的排斥作用变成了优势因素。相同的结果也在melittin与带负电荷的磷脂膜的结合研究中获得(Batenburg等，1987；Beschiachyili和Seelig，1990)。有趣的是，不象meilittin还能与PC囊泡强烈结合(Kuchinka和Seelig，1989)，肽18不与PC囊泡结合。

2.6色氨酸淬灭实验

天然存在于蛋白或肽的色氨酸残基可以用作肽在膜中定位的固有探针。melittin含有一个位于位置19、C螺旋的N端的一个色氨酸。在melittin和肽18两者中，用6、7-Br-PC/PS囊泡(图10)都观察到了最大的色氨酸荧光淬灭。用9、10-Br-PC/PS观察到了较小的淬灭，用11、12-Br-PC/PS最小。这些结果表明，在与囊泡结合时肽定位于磷脂的头部基团附近。

实施例3模型Lys/Leu非对映体的合成和生物学活性

3.1 Lys/Leu非对映体的设计

为如下目的，我们合成了6个包含不同比例的赖氨酸和亮氨酸的短的线性模型12聚体肽的非对映体：(1)分析疏水性和净正电荷的平衡是否是选择性细菌裂解必需的足够标准，和(2)获得这种作用的潜在机制。

在模型Lys/Leu 12聚体肽的第一个系列22-25中，它们三分之一序列由D-氨基酸残基组成。D-氨基酸的位置在所有肽中都是恒定的。这被构建来最大限度地破坏α-螺旋结构。D-氨基酸沿肽分布，仅留下极短的1-3个连续L-氨基酸序列。我们合成下列肽：

22.[D]-L^{3，4，8，10}-K₃L₉的序列：

Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-NH₂

23.[D]-L^{3，4，8，10}-K₄L₈的序列：

Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-NH₂

24.[D]-L^{3，4，8，10}-K₅L₇的序列：

Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Lys-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-NH₂

25.[D]-L^{3，4，8，10}-K₇L₅的序列：

Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Leu-Lys-Leu-Lys-Leu-Lys-Lys-NH₂

在模型Lys/Leu 12聚体肽的第二个系列26-27中，它们三分之一序列由D-氨基酸残基组成。这些D-氨基酸残基位于肽23和24的L氨基酸残基的准确位置，其序列如下：

26.[D]-K^{1，5，9，12}L^{2，6，7，11}K₄L₈的序列：

Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-NH₂

27.[D]-K^{1，5，7，9，12}L^2，6，11K₅L₇的序列：

Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Lys-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-NH₂

在模型Lys/Leu肽的第三个系列中我们合成了一个6聚体和一个8聚体的非对映体(分别为肽28和29)

28.[D]-L^2，4-K₂L₄的序列

Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys

29.[D]-L^2，4，6-K₃L₅的序列

Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys

我们进一步合成了根据本发明的Lys/Leu非对映体：

30.Lys Leu Leu Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Leu Lys

31.Lys Leu Leu Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Leu Lys

32.Lys Leu Leu Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Leu Lys

3.2Lys/Leu非对映体的合成

肽按照实验方法部分(ii)的介绍进行合成。然后分析这些肽的结构、生物学功能以及与细菌和由兼性或带负电磷脂组成的模型膜的相互作用。

3.3疏水性

肽22-25的疏水性和净正电荷列于表4，疏水性的平均值用疏水计的一致值进行计算(Eisenberg等，1984)。如图11所示，肽的疏水性和保留时间之间发现了直接的关联，这提示结构并不显著影响与固定相的全部疏水相互作用。

                 表4

Leu/Lys非对映体的疏水性和净电荷

  肽名称       净电荷      疏水性

    22.          +4         0.12

    23.          +5        -0.01

    24.          +6        -0.15

    25.          +8        -0.42

3.4 CD光谱学

非对映体22-25的α-螺旋结构的含量由它们在40％TFE中的CD谱来确定。正如所预期的，在D-氨基酸整合后，对所有非对映体都没有发现信号，这证明缺乏任何特殊的二级结构(数据未显示)。应当注意，在最近的研究中，一个具有与肽23相同的序列，但仅包含L-氨基酸的肽被发现在甲醇中和在DMPC囊泡中有大约40％的α-螺旋结构(Cornut等，1994)。

3.5肽22-29的抗菌和溶血活性

我们检测了肽22-29对hRBC的溶血活性。一个肽22-25溶血活性的剂量依赖曲线显示于图12中，其中melittin的溶血活性用作对照。非对映体的疏水性(表4)和溶血活性之间发现了直接的关联。具有最高疏水性的肽22[D]-L^{3，4，8，10}-K₃L₉具有最大的溶血活性。但是其溶血活性与melittin的相比非常低(少＞60倍的活性)。其它肽直到最大测试浓度(100μM)也没有显示溶血活性。肽22-29的溶血活性显示于表5，应当注意即使肽23[D]-L^{3，4，8，10}-K₄L₈在浓度大于melittin溶血所需浓度100倍时，仍无溶血活性。但其全L-氨基酸型在最近的研究中显示具有与melittin相似的溶血活性(～少5倍)(Cornut等，1994)。

我们还检测了肽22-29对代表细菌的抗菌活性，其中四环素、dermaseptin和melittin用作对照。所获得的MIC示于表5。数据显示非对映体22-29的抗菌活性被疏水性和带正电荷氨基酸的平衡调节。具有最大疏水性的肽22和具有最大亲水性的肽25都显示最小的抗菌活性范围(表5)。但是，肽23和24都对大多数测试细菌显示较高的抗菌活性，而前者略强一些。而且，每种肽都有独特的抗菌活性谱，并且每种都对革兰氏阳性菌比对革兰氏阴性菌有更高的活性。

3.6血清中四环素和Lys/Leu非对映体的协同作用

为研究抗生素四环素与非对映体之间可能的协同作用，我们检测了在存在恒定的等摩尔浓度(1μM)的肽24[D]-L^{3，4，8，10}-K₅L₇时倍比稀释的四环素对铜绿假单胞菌(ATCC 27853)的抗性。混合物的抗菌活性按实验方法部分(xii)介绍的方法测定。

我们在四环素与非对映体24之间观察到了协同作用。四环素对铜绿假单胞菌活性极低。但是，当与1μM的肽24溶液混合时，我们观察到了8倍的四环素活性增加(表6)，1μM的肽24浓度比裂解铜绿假单胞菌所需的浓度低10倍。对这种协同作用的一个可能的解释是，肽轻微破坏了细菌细胞壁，促进了四环素分配进细菌。这一点为电子显微镜研究支持，在电子显微镜研究中，在低于其MIC时，肽24在细菌细胞壁上引起形态学改变(图14)。此外，混合的人血清对肽24抗铜绿假单胞菌和大肠杆菌的抗菌活性的影响和对天然抗菌肽dermaseptin的影响被发现有相当的不同(表6)，dermaseptin在存在血清时，活性降低8-10倍，而肽24保留其抗菌活性。

                                       表5肽的最小抑制浓度(μM)

                                最小抑制浓^a(μM)肽名称     大肠杆菌    乙酸钙不动杆菌  铜绿假单胞菌   巨大芽胞杆菌   枯草芽胞杆菌  100μM时

        (D21)      (Acll)         (ACTT-27853)    (Bmll)      (ATCC 6051)        溶血％22          9          20            125             0.7          1.1              5823          3.5        4             10              0.4          0.5              024          7          20            10              0.25         2                025          80         200           ＞200           1            100              026          4          N.D           N.D             0.5          N.D              027          7          N.D           N.D             0.2          N.D              028          200        N.D           N.D             50           N.D              029          3          N.D           N.D             3            N.D              0Dermaseptin S 6          3             25              0.5          4                -Melittin      5          2             25              0.3          0.6              -四环素        1.5        1.5           50              1.2          6.5              -a.结果是3个独立试验的平均值，每个独立实验做两个重复，标准偏差为20％

                           表6

在存在人血清时的最小抑制浓度(μM)^a及肽24的协同活性

                最小抑制浓度(μM)

铜绿假单胞菌(ATCC-27853)             大肠杆菌(D21)肽名称      0％血清    33％血清    0％血清    33％血清24            10          10         7          7Dermaseptin S 25          200        6          50Tc^b          50Tc+24(1μM)   6

a.结果是2个独立实验的均值，每个独立实验做两个重复。标准

偏差为20％

b.Tc-四环素

3.7肽诱导的膜穿透

不同浓度的肽与预先用荧光染料diS-C₂-5和缬氨霉素处理的囊泡混合。监测荧光恢复的动力学，并测定最大荧光水平作为肽浓度的函数(图13)。PC/胆固醇囊泡(10∶1)用作构成红细胞外小叶的磷脂组成的模型(Verkleij等，1973)，PE/PG的囊泡(7∶3)用来模仿大肠杆菌的用来模仿大肠杆菌的磷脂组成(Shaw，1974)，我们发现了肽穿透模型磷脂膜的能力与其针对红细胞和细菌的裂解活性之间的直接联系。仅有溶血性肽22穿透了兼性磷脂囊泡，而且，肽穿透PE/PG囊泡的能力与肽对大肠杆菌的抗菌活性有关(表5)。具有最低抗菌活性的肽25，其穿透PE/PG囊泡的能力与其它与三个肽22-24相比也有明显降低。

3.8细菌裂解的电子显微镜研究

非对映体22-25对被处理的大肠杆菌的形态学影响用透射电子显微镜进行观察。所有的肽均在MIC时导致细菌的完全裂解(数据未显示)，但是，当肽在相当于其MIC的80％的浓度使用时，我们观察到了被处理的细菌形态学上的一些差别，依所用肽的不同而不同。具有最大疏水性的肽22对细胞壁和细胞膜造成了最大的损伤，而最小疏水性的肽25仅导致局部的破坏(图14)。

实施例4 Lys/Ala和Lys/Val模型非对映体的合成和生物学活性

4.1非对映体设计

为进一步检测调节线性细胞毒肽的疏水性和净正电荷是否足以提供选择性抗菌活性，我们分别合成了更进一步的模型12聚体肽33和34-37，它们分别包含Lys/Ala或Lys/Val残基，它们的序列中至少三分之一是D-Ala或D-Val残基：

33.[D]-A^{3，4，8，10}-K₄A₈的序列

Lys-Ala-Ala-Ala-Lys-Ala-Ala-Ala-Lys-Ala-Ala-Lys-NH₂

34.[D]-V^{3，4，8，10}-K₄V₈的序列

Lys-Val-Val-Val-Lys-Val-Val-Val-Lys-Val-Val-Lys-NH₂

35.Lys Val Val Val Lys Val Lys Val Lys Val Val Lys

36.Lys Val Val Val Lys Val Lys Val Lys Val Val Lys

37.Lys Val Val Val Lys Val Lys Val Lys Val Val Lys

4.2合成

Lys/Ala和Lys/Val非对映体按实验方法部分(ii)的介绍进行合成。

4.3抗菌和溶血活性

我们检测了33和34对大肠杆菌和巨大芽胞杆菌和hRBC的活性，表7中所示的结果显示模型非对映体都是抗菌性和非溶血性的

                  表7

  肽28和29的最小抑制浓度(μM)和溶血活性

                 最小抑制浓度(μM)肽名称    大肠杆菌    巨大芽胞杆菌    100μM时溶血％

      (D21)        (Bmll)33        12            1                034        3.5           0.8              0

实施例5进一步的模型非对映体的合成

我们合成了下列根据本发明的模型非对映体，它们包含2种、3种或更多不同氨基酸的6、8、12、14、16、19、25、26和30个残基的序列38.Lys Leu Ile Leu Lys Leu39.Lys Val Leu His Leu Leu40.Leu Lys Leu Arg Leu Leu41.Lys Pro Leu His Leu Leu42.Lys Leu Ile Leu Lys Leu Val Arg43.Lys Val Phe His Leu Leu His Leu44.His Lys Phe Arg Ile Leu Lys Leu45.Lys Pro Phe His Ile Leu His Leu46.Lys Ile Ile Ile Lys Ile Lys Ile Lys Ile Ile Lys47.Lys Ile Ile Ile Lys Ile Lys Ile Lys Ile Ile Lys48.Lys Ile Ile Ile Lys Ile Lys Ile Lys Ile Ile Lys49.Lys Ile Pro Ile Lys Ile Lys Ile Lys Ile Pro Lys50.Lys Ile Pro Ile Lys Ile Lys Ile Lys Ile Val Lys51.Arg Ile Ile Ile Arg Ile Arg Ile Arg Ile Ile Arg52.Arg Ile Ile Ile Arg Ile Arg Ile Arg Ile Ile Arg53.Arg Ile Ile Ile Arg Ile Arg Ile Arg Ile Ile Arg54.Arg Ile Val Ile Arg Ile Arg Ile Arg Leu Ile Arg55.Arg Ile Ile Val Arg Ile Arg Leu Arg Ile Ile Arg56.Arg Ile Gly Ile Arg Leu Arg Val Arg Ile Ile Arg57.Lys Ile Val Ile Arg Ile Arg Ile Arg Leu Ile Arg58.Arg Ile Ala Val Lys Trp Arg Leu Arg Phe Ile Lys59.Lys Ile Gly Trp Lys Leu Arg Val Arg Ile Ile Arg60.Lys Lys Ile Gly Trp Leu Ile Ile Arg Val Arg Arg61.Arg Ile Val Ile Arg Ile Arg Ile Arg Leu Ile Arg Ile Arg62.Arg Ile Ile Val Arg Ile Arg Leu Arg Ile Ile Arg Val Arg63.Arg Ile Gly Ile Arg Leu Arg Val Arg Ile Ile Arg Arg Val64.Lys Ile Val Ile Arg Ile Arg Ala Arg Leu Ile Arg Ile Arg Ile Arg65.Arg Ile Ile Val Lys Ile Arg Leu Arg Ile Ile Lys Lys Ile Arg Leu66.Lys Ile Gly Ile Lys Ala Arg Val Arg Ile Ile Arg Val Lys Ile Ile67.Arg Ile Ile Val His Ile Arg Leu Arg Ile Ile His His Ile Arg Leu68.His Ile Gly Ile Lys Ala His Val Arg Ile Ile Arg Val His Ile Ile69.Arg Ile Tyr Val Lys Ile His Leu Arg Tyr Ile Lys Lys Ile Arg Leu70.Lys Ile Gly His Lys Ala Arg Val His Ile Ile Arg Tyr Lys Ile Ile71.Arg Ile Tyr Val Lys Pro His Pro Arg Tyr Ile Lys Lys Ile Arg Leu72.Lys Pro GIy His Lys Ala Arg Pro His Ile Ile Arg Tyr Lys Ile Ile73.Lys Ile Val Ile Arg Ile Arg Ile Arg Leu Ile Arg Ile Arg Ile Arg Lys Ile Val74.Arg Ile Ile Val Lys Ile Arg Leu Arg Ile Ile Lys Lys Ile Arg Leu Ile Lys Lys75.Lys Ile Gly Trp Lys Leu Arg Val Arg Ile Ile Arg Val Lys Ile Gly Arg Leu Arg76.Lys Ile Val Ile Arg Ile Arg Ile Arg Leu Ile Arg Ile Arg Ile Arg Lys Ile Val Lys ValLys Arg Ile Arg77.Arg Phe Ala Val Lys Ile Arg Leu Arg Ile Ile Lys Lys Ile Arg Leu Ile Lys Lys IleArg Lys Arg Val Ile Lys78.Lys Ala Gly Trp Lys Leu Arg Val Arg Ile Ile Arg Val Lys Ile Gly Arg Leu Arg LysIle Gly Trp Lys Lys Arg Val Arg Ile Lys79.Arg Ile Tyr Val Lys Pro His Pro Arg Tyr Ile Lys Lys Ile Arg Leu80.Lys Pro Gly His Lys Ala Arg Pro His Ile Ile Arg Tyr Lys Ile Ile81.Lys Ile Val Ile Arg Ile Arg Ile Arg Leu Ile Arg Ile Arg Ile Arg Lys Ile Val82.Arg Ile Ile Val Lys Ile Arg Leu Arg Ile Ile Lys Lys Ile Arg Leu Ile Lys Lys83.Arg Ile Tyr Val Ser Lys Ile Ser Ile Tyr Ile Lys Lys Ile Arg Leu84.Lys Ile Val Ile Phe Thr Arg Ile Arg Leu Thr Ser Ile Arg Ile Arg Ser Ile Val85.Lys Pro Ile His Lys Ala Arg Pro Thr Ile Ile Arg Tyr Lys Met Ile

  实施例6环形非对映体的合成和生物学活性

6.1设计

我们合成了下列在N-和C-末端有半胱氨酸残基的pardaxin片段的非对映体的环形衍生物：

86.环形K¹[D]P⁷L¹⁸L¹⁹[1-22]-par的序列：

87.环形K¹K²[D]P⁷L¹⁸L¹⁹[1-22]-par的序列：

88.环形K¹K²K³[D]P⁷L¹⁸L¹⁹[1-22]-par的序列：

我们合成了下列在N和C末端具有半胱氨酸残基的不同氨基酸残基的非对映体的环形衍生物：

89.环形

   Cys Arg Ile Val Ile Arg Ile Arg Ile Arg Leu Ile Arg Ile Arg Cys

90.环形

   Cys Lys Pro Gly His Lys Ala Arg Pro His Ile Ile Arg Tyr Lys Ile Ile Cys

91.环形

   Cys Arg Phe Ala Val Lys Ile Arg Leu Arg Ile Ile Lys Lys Ile Arg Leu Ile Lys

       Lys Ile Arg Lys Arg Val Ile Lys Cys

92.环形Cys Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Cys93.环形

  Cys Lys Leu Leu Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Leu Lys Cys

我们合成了下列在N和C-末端没有半胱氨酸残基的不同氨基酸残基的非体环形衍生物

6.2环形非对映体的合成

环形肽用固相法按实验方法部分(ii)介绍的固相法合成，在肽的N和C末端均有半胱氨酸残基。没有半胱氨酸的环化按下法进行，保护N-末端，活化C-末端，N-末端去保护，C和N-末端基团发生反应而仍然结合在树脂上。在HF裂解和RP-HPLC纯化后，肽以低浓度溶于PBS(pH7.3)中，经12小时完成环化。环化的肽在RP-HPLC上进一步纯化，并进行氨基酸分析来证实其组成，并用SDS-PAGE证明其单体状态。

6.3抗菌和溶血活性

肽86-88用大肠杆菌、巨大芽胞杆菌和hRBC进行检测。表8的结果显示所有三种环形的pardaxin衍生非对映体是抗菌性和非溶血性的。

                     表8环形pardaxin衍生非对映体的最小抑制浓度(μM)和溶血活性

                最小抑制浓度(μM)肽名称    大肠杆菌    巨大芽胞杆菌    100μM时溶血％

        (D21)      (Bmll)86            30        10                 087            15        6                  088            7.5       2                  0

6.4抗细菌和溶血活性

检测了肽92-95对大肠杆菌、枯草芽胞杆菌和铜绿假单胞菌的作用。表8a中的结果显示所有4种环形非对映体是抗菌性和非溶血性的：

         表8a

   环形非对映体的最小抑制浓度(μM)和溶血活性

                最小抑制浓度(μM)肽名称    大肠杆菌  枯草芽胞杆菌  铜绿假单胞菌   50μM时

                                             溶血％92          12.5       1.2           25            093          15         5             25            094          12.5       1.5           30            095          15         6             20            0

实施例7成束的Lys/Leu肽非对映体的合成和生物学活性

7.1设计

使用肽23为模板，在C末端有一个额外的半胱氨酸残基的肽23或24(分别为23C和24C)为单体，合成了下列成束序列：96.([D]-L^{3，4，8，10}-K₄L₈C)₅[D]-L^{3，4，8，10}-K₄L₈

                         的序列：

(Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-Cys-NH₂)₅ Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-NH₂97.([D]-L^{3，4，8，10}-K₅L₇C)₅[D]-L^{3，4，8，10}-K₄L₉

                   的序列：

(Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Lys-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-Cys-NH₂)₅ Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-NH₂

7.2合成

为制备模板结合的非对映体，1∶1摩尔比的DCC和溴乙酸在25℃于DMSO中反应1小时。将模板(肽23)加入到反应混合物中，并搅拌12小时，然后将DMSO冷冻干燥，剩余的溴乙酸用无水乙醚抽提，然后将模板与过量的、在其C末端带有一个半胱氨酸残基的23C和24C非对映体反应，在PBS pH7.3中、25℃反应1小时。模板结合的非对映体96和97在RP-HPLC上进一步纯化，并在SDS-PAGE上检查，以证明其聚集状态。

7.3抗菌和溶血活性

模板结合的非对映体96和97用大肠杆菌和巨大芽胞杆菌和hRBC进行检测，表9中所示的结果显示，两种成束序列都是抗菌和非溶血性的。

               表9

    束的最小抑制浓度(μM)和溶血活性

           最小抑制浓度(μM)肽名称    大肠杆菌    巨大芽胞杆菌    100μM时溶血％

        (D21)      (Bmll)96           0.2         0.05                097           0.1         0.02                0

实施例8 Lys/Leu 12聚体肽非对映体混合物的合成和生物学活性

肽用固相法按上面实验方法部分(ii)的介绍进行合成。在每一个偶联步骤，将含有赖氨酸、亮氨酸和D-亮氨酸各1eq的混合物加入反应中。合成产生3¹²不同肽的混合物，HF裂解后，亲水性肽用双蒸水(ddw)抽提并冷冻干燥。

Lys/Leu 12聚体肽非对映体的亲水混合物用大肠杆菌D21(MIC：15μg/ml)和巨大芽胞杆菌Bmll D21(MIC：3μg/ml)和hRBC(在100μM溶血性为0)。正如所期望的，混合物具有抗菌活性但不溶血。

实施例9 Lys/Leu/D-Leu无规共聚物的合成和生物学活性

为制备不同大小的聚合物的非对映体，将对起始游离氨基酸过量的N-羧酸酐残基在DMF中在25℃聚合4小时(Katchalski和Sela，1958)。使用不同比例的赖氨酸-N-羧酸酐、亮氨酸-N-羧酸酐和D-亮氨酸-N-羧酸酐制备不同比例的赖氨酸、亮氨酸和D-亮氨酸的聚合物。三种这样的聚合物及其抗菌和溶血活性示于表10。

            表10

Lys/Len/D-Len共聚体的最小抑制浓度(μM)和溶血活性

                最小抑制浓度(μM)氨基酸比例(摩尔)  大肠杆菌    巨大芽胞杆菌  100μM时溶血％Lys∶Leu∶[D]-Leu  (D21)       (Bmll)1∶1∶1              90          15                02∶1∶1              35          8                 03∶1∶1              80          20                0

     实施例10非对映体的抗真菌活性

pardaxin衍生的肽1和16(见上文的实施例1)的抗真菌活性按如下方法在无菌96孔板(Nunc F96微滴定板)以终体积100μl进行检测：将含有在培养基(Sabouraud’s葡萄糖液体培养基)中浓度为1×10⁶集落形成单位(CFU)/ml的50微升真菌悬液加入至50μl含用水倍比稀释的肽的水中。生长抑制用Microplate autoreaderEL309(Bio-tek Instruments)在492nm处测量吸收值来测定，30℃温育48小时后进行，抗真菌活性用最小抑制浓度(MIC)来表示，MIC是48小时温育后观察到100％生长抑制的浓度。所用的真菌为：白色假丝酵母(Candida albicans)(IP886-65)和新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)(IP960-67)。如表11所示，肽1和16都显示抗真菌活性。

                  表11

   非对映体1和16对真菌的最小抑制浓度(μM)

           最小抑制浓度(μM)肽名称    白色假丝酵母    新型隐球菌

      (IP886-65)      (IP960-67)1         35             5016        120            150

实施例11非对映体的抗癌活性

Lys/Leu非对映体23和24(见上文的实施例3)用小鼠腺癌检测其抗癌活性。细胞以5-10000/孔在96孔微滴定板上接种于Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基中。细胞粘附后，将20μl正常盐水中的稀释肽溶液转至孔中，使其终浓度范围为20至150μM。与肽温育1小时后，癌细胞活力用锥虫蓝(0.1％w/v)活体染色实验测定。在对照实验中，将肽的溶剂单独加入细胞中。抗癌活性用最小抑制浓度(MIC)表示，MIC是经1小时温育后观察到100％生长抑制的浓度。表12所示的结果显示两种肽都对恶性细胞有活性。

                表12

  非对映体对小鼠腺瘤的最小抑制浓度(μM)

      最小抑制浓度(μM)

肽名          小鼠腺瘤

 23            50

 24            80

  实施例12非对映体抗墨西哥利什曼虫活性

melittin衍生的非对映体肽20(见上文实施例2)和Leu/Lys非对映体肽23(见上文实施例3)用利什曼虫检测。用于实验的墨西哥利什曼虫NR株的前鞭毛体在27℃用补加了10％胎牛血清的RPMI1640培养基培养。在4℃用1200×g离心10分钟收集寄生虫。并用PBS(50mM磷酸钾、150mM NaCl、pH7)洗涤两次。洗下的寄生虫在血球计数器中计数，并调至1×10⁶寄生虫/ml。在存在或没有不同浓度的非对映体时26℃温育24小时后，通过计算活的(活动的)细胞以100μl终体积分析此悬液。抗利什曼虫活性用最小抑制浓度(MIC)表示，MIC是温育24小时后观察到100％死亡的浓度，我们发现肽23的MIC是17μM，而肽20的MIC是32μM。

  实施例13非对映体23的抗病毒活性

仙台病毒(Z株)生长于10～11天的鸡胚尿囊中，注射48小时后采集并纯化。病毒重新悬浮于含160mM NaCl、20mM tricine pH7.4的缓冲液中，贮存于-70℃。病毒的血凝活性用血凝单位(HAU)测量，每毫升含～60000HAU。新鲜人血获自血库，并在4℃保存1个月。在使用前，红细胞用PBS pH7.2洗两次，并用相同缓冲液稀释至所需浓度(％v/v)。病毒、红细胞和肽按不同次序和不同量进行混合。最后的温育一般是在37℃温育60分钟，然后在5700g离心10分钟除去完整的细胞。对每种情况使用双份的样品，并从每个样品的上清中取两份加至96孔板的两个孔中。血红蛋白的释放量通过用ELISA读板仪在540nm测量孔的吸收值来监测。抗病毒活性用最小抑制浓度(MIC)表示，MIC是在温育后没有观测到血红蛋白释放的浓度。我们发现Lys/Leu非对映体肽23的MIC是80μM。

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32.Papahadjopoulos，D.，and Miller，N.1967.《生物化学和生物物理学报》135卷，624-638页。“磷脂模型膜。水合液晶的结构特征”

33.Perez，P.E.，Houghten，R.A.，and Blondelle，S.E.1994.《生物化学杂志》1994。“具有不同溶血活性的所选melittin类似物的二级结构的确定“

34.Pouny，Y.，and Shai，Y.，1992.《生物化学》39卷，9482-9490。“pardaxin的D-氨基酸整合的类似物与膜的相互作用。

35.Rapaport，D.，and Shai，Y.，1992.《生物与化学杂志》267卷，6502-6509页。“pardaxin在磷脂膜中聚集和组织。一种荧光能量传递研究”

36.Rapaport，D.，and Shai，Y.1991.《生物与化学杂志》266卷23769-23775。“荧光标记的pardaxin及其类似物与脂双层的相互作用”

37.Rizzo，V.，Stankowski，S.，and Schwarz，G.1987.《生物化学》26卷，2751-9。“丙甲甘肽整合到脂双层中：热力学研究”

38.Russell，P.E.，Milling，R，J.，and Wright，K.1995.《抗微生物药物的50年。过去的繁荣和今后的趋势》(Hunter P.A.，DarbyG.K.，and Russell N.J.ed)67-85页，剑桥大学出版社，Cambridge。

39.Schwarz，G.，Gerke，H.，Rizzo，V.，and Stankowski，S.1987.《生物物理杂志》52卷，685-692页。“膜整合的动力学，应用孔道形成肽丙甲甘肽的研究”

40.Segrest，J.P.，De，L.H.，Dohlman，J.G.，Brouillette，C.G.，and Anantharamaiah，G.M.1990.《蛋白质》8卷，103-117页。“两亲性螺旋基元[更正见“蛋白质”1991；9(1)：79]：分类和特性”

41.Shai，Y.1995.《TIBS》待发表。“跨膜螺旋的分子识别”

42.Shai，Y.1994.《毒素学》87卷，109-129页。“pardaxin：来自鱼的鲨鱼驱虫肽的孔道形成”

43.Shai，Y.，Fox，J.，Caratsch，C.，Shih，Y.L.，Edwards，C.，and Lazarovici，P.1988.《FEBS Lett》242卷，161-166。“一种来自红海Moses sole具有离子载体活性的多肽pardaxin，测序与合成”

44.Shai，Y.，Fox，J.，Caratsch，C.，Shih，Y.L.，Edwards，C.，andLazarovici，P.1988.《FEBS Lett》242卷，161-166。“一种来自红海Moses sole具有离子载体活性的多肽pardaxin，测序与合成”

45.Shai，Y.，Hadari，Y.R.，and Finkels，A.1991.《生物与化学杂志》266卷22346-22354页。“pardaxin类似物的pH依赖的孔道形成特性”

46.Shaw，N.1974.《应用微生物进展》17卷，63-108页。“脂组成作为细菌分类的指导”

47.Sims，P.J.，Waggoner，A.S.，Wang，C.H.，and Hoffmann，J.R.1974.《生物化学》13卷，3315-3330页。“花菁染料测量红细胞和磷脂酰胆碱囊泡中的膜电势的机制研究”

48.Steiner，H.，Hultmark，D.，Engstrom，A.，Bennich，H.，andBoman，H.G.1981.《自然》292卷，246-248页。“两种参与昆虫免疫的杀菌蛋白的序列和特异性”

49.Terwilliger，T.C.，and Eisenberg，D.1982.《生物与化学杂志》257卷，6010-6015页。“melittin的结构。I结构测定和部分确定”

50.Terwilliger，T.C.，and Eisenberg，D.1982.《生物与化学杂志》257卷，6016-6022页。“melittin的结构。II结构的解读”

51.Thompson，S.A.，Tachibana，K.，Nakanishi，K.，and Kubota，I.1986.《科学》233卷，341-343。“来自豹鳎Pardachirus pavoninus的鲨鱼排斥性防御分泌物的melittin样肽”

52.Verkleij，A.J.，Zwaal，R.F.，Roelofsen，B.，Comfurius，P.，Kastelijn，D.，and Deenen，L.v.1973.《生物化学和生物物理学报》323卷，178-193页。“磷脂在人红细胞膜中的不对称分布。组合应用磷脂酶和冰冻蚀刻电子显微技术的研究”

53.Wade，D.，Boman，A.，Wahlin，B.，Drain，C.M.，Andreu，D.，Boman，H.G.，and Merrifield，R.B.1990.《美国国家科学院院报》87卷，4761-4765页，1990。

54.Wu，C.S.，Ikeda，K.，and Yang，J.T.1981.《生物化学》20卷，566-570页。“在酸性十二烷基硫酸钠溶液中多肽和蛋白质的有序构象”

55.Zagorski，M.G.，Norman，D.G.，Barrow，C.J.，Iwashita，T.，Tachibana，K.，and Patel，D.J.1991.《生物化学》30卷，8009-8017页。“pardaxin P2的溶液结构”

          序列表(1)一般资料(i)申请人：(A)名称：所述发展和研究Co.LTD(B)街道：Weizmann科学研究所，P.O.Box 95(C)城市：雷霍沃特(E)国家：以色列(F)邮政编码(ZIP)：76100(G)电话：972-08-9470617(H)电传：972-08-9470739(ii)发明题目：抗病原合成肽及包括该肽类的组合物(iii)序列数：95(iv)计算机可读形式：(A)介质类型：软盘(B)计算机：IBM PC兼容(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS(D)软件：Paten+In Release#1.0，Version #1.30(EPO)(V)目前申请数据：申请号：(Vi)在失申请数据：(A)申请号：PCT/IL97/0066(B)申请日期：1997年2月20日(2)SEQ ID NO：1的资料：(i)序列特性：(A)长度：33氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽1

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(7，18，19)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：33

(D)其他资料：/产物＝“其他”

    /注意：“2个氨基乙基氨基基团连接在C-末端”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe Lys1               5                   10                  15Thr Leu Leu Ser Ala Val Gly Ser Ala Leu Ser Ser Ser Gly Gly Gln

        20                  25                  30Glu

(2)SEQ ID NO：2的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：22氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽2

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(7，18，19)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：22

(D)其他资料：/产物＝“其他”

    /注意：“一个氨基乙基氨基基团连接在C-末端”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe Lys1               5                   10                  15Thr Leu Leu Ser Ala Val

        20

(2)SEQ ID NO：3的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：22氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽3

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(7，18，19)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe Lys1               5                   10                  15Thr Leu Leu Ser Ala Val

        20

(2)SEQ ID NO：4的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：23氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽4

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(8，19，20)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：23

(D)其他资料：/产物＝“其他”

    /注意：“一个氨基乙基氨基基团连接在C-末端”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4Lys Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe1               5                   10                  15Lys Thr Leu Leu Ser Ala Val

        20

(2)SEQ ID NO：5的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：24氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽5

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(9，20，21)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：24

(D)其他资料：/产物＝“其他”

    /注意：“一个氨基乙基氨基基团连接在C-末端”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5Lys Lys Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu1               5                   10                  15Phe Lys Thr Leu Leu Ser Ala Val

        20

(2)SEQ ID NO：6的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：24氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽6

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(9，20，21)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6Lys Lys Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu1               5                   10                  15Phe Lys Thr Leu Leu Ser Ala Val

        20

(2)SEQ ID NO：7的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：11氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽7

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：7

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：11

(D)其他资料：/产物＝“其他”

    /注意：“一个氨基乙基氨基基团连接在C-末端”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser1               5                   10

(2)SEQ ID NO：8的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：33氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽8

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：33

(D)其他资料：/产物＝“其他”

    /注意：“2个氨基乙基氨基基团连接在C-末端”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe Lys1               5                   10                  15Thr Leu Leu Ser Ala Val Gly Ser Ala Leu Ser Ser Ser Gly Gly Gln

        20                  25                  30Glu

(2)SEQ ID NO：9的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：33氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽9

    (ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：13

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：13

(D)其他资料：/产物＝“其他”

    /注意：“2个氨基乙基氨基基团连接在C-末端”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe Lys1               5                   10                  15Thr Leu Leu Ser Ala Val Gly Ser Ala Leu Ser Ser Ser Gly Gly Gln

        20                  25                  30Glu

(2)SEQ ID NO：10的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：33氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽10

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(5，19)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：33

(D)其他资料：/产物＝“其他”

    /注意：“2个氨基乙基氨基基团连接在C-末端”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe Lys1               5                   10                  15Thr Leu Leu Ser Ala Val Gly Ser Ala Leu Ser Ser Ser Gly Gly Gln

        20                  25                  30Glu

(2)SEQ ID NO：11的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：33氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：线性

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽11

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(7，19)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：33

(D)其他资料：/产物＝“其他”

    /注意：“2个氨基乙基氨基基团连接在C-末端”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe Lys1               5                   10                  15Thr Leu Leu Ser Ala Val Gly Ser Ala Leu Ser Ser Ser Gly Gly Gln

        20                  25                  30Glu

(2)SEQ ID NO：12的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：33氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽12

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：7

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：33

(D)其他资料：/产物＝“其他”

    /注意：“2个氨基乙基氨基基团连接在C-末端”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe Lys1               5                   10                  15Thr Leu Leu Ser Ala Val Gly Ser Ala Leu Ser Ser Ser Gly Gly Gln

        20                  25                  30Glu

(2)SEQ ID NO：13的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：33氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽13

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：7

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe Lys1               5                   10                  15Thr Leu Leu Ser Ala Val Gly Ser Ala Leu Ser Ser Ser Gly Gly Gln

        20                  25                  30Glu

(2)SEQ ID NO：14的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：33氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽14

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(18，19)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：33

(D)其他资料：/产物＝“其他”

    /注意：“2个氨基乙基氨基基团连接在C-末端”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe Lys1               5                   10                  15Thr Leu Leu Ser Ala Val Gly Ser Ala Leu Ser Ser Ser Gly Gly Gln

        20                  25                  30Glu

(2)SEQ ID NO：15的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：33氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽15

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(18，19)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe Lys1               5                   10                  15Thr Leu Leu Ser Ala Val Gly Ser Ala Leu Ser Ser Ser Gly Gly Gln

        20                  25                  30Glu

(2)SEQ ID NO：16的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：33氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽16

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(7，18，19)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：16Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe Lys1               5                   10                  15Thr Leu Leu Ser Ala Val Gly Ser Ala Leu Ser Ser Ser Gly Gly Gln

        20                  25                  30Glu

(2)SEQ ID NO：17的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：22氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽17

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：7

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：22

(D)其他资料：/产物＝“其他”

    /注意：“1个氨基乙基氨基基团连接在C-末端”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：17Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe Lys1               5                   10                  15Thr Leu Leu Ser Ala Val

        20

(2)SEQ ID NO：18的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：26氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽18

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(5，8，17，21)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：26

(D)其他资料：/产物＝“其他”

    /注意：“在C-末端的羧基被一个氨基取代”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：18Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu1               5                   10                  15Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln

        20                  25

(2)SEQ ID NO：19的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：26氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽19

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(5，8，17，21)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：19Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu1               5                   10                  15Ile ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln

        20                  25

(2)SEQ ID NO：20的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：22氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽20

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(5，8，17，21)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：22

(D)其他资料：/产物＝“其他”

    /注意：“一个氨基乙基氨基基团连接在C-末端”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：20Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu1               5                   10                  15Ile Ser Trp Ile Lys Arg

        20

(2)SEQ ID NO：21的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：19氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽21

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，5，14，18)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：19

(D)其他资料：/产物＝“其他”

    /注意：“一个氨基乙基氨基基团连接在C-末端”(xi)序列描述：SEQ ID NO：21Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp1               5                   10                  15Ile Lys Arg

(2)SEQ ID NO：22的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽22

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(3，4，8，10)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：12

(D)其他资料：/产物＝“其他”

    /注意：“在C-末端的羧基被一个氨基取代”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：22Lys Leu Leu Leu Leu Leu Lys Leu Leu Leu Leu Lys1               5                   10

(2)SEQ ID NO：23的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽23

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(3，4，8，10)

(D)其他资料：/产物＝“D氨基酸残基”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：12

(D)其他资料：/产物＝“其他”

    /注意：“在C-末端的羧基被一个氨基取代”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：23Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys1               5                   10

(2)SEQ ID NO：24的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽24

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(3，4，8，10)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：12

(D)其他资料：/产物＝“其他”

    /注意：“在C-末端的羧基被一个氨基取代”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：24Lys Leu Leu Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Leu Lys1               5                   10

(2)SEQ ID NO：25的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽25

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(3，4，8，10)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：12

(D)其他资料：/产物＝“其他”

    /注意：“在C-末端的羧基被一个氨基取代”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：25Lys Lys Leu Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Lys1               5                   10

(2)SEQ ID NO：26的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽26

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(1，2，5，6，7，9，11，12)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：12

(D)其他资料：/产物＝“其他”

    /注意：“在C-末端的羧基被一个氨基取代”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：26Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys1               5                   10

(2)SEQ ID NO：27的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽27

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(1，2，5，6，7，9，11，12)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：12

(D)其他资料：/产物＝“其他”

    /注意：“在C-末端的羧基被一个氨基取代”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：27Lys Leu Leu Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Leu Lys1               5                   10

(2)SEQ ID NO：28的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：6氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽28

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，4)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：28Lys Leu Leu Leu Leu Lys1               5

(2)SEQ ID NO：29的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：8氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽29

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，4，6)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：29Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys1               5

(2)SEQ ID NO：30的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽30

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，6，8，11)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：30Lys Leu Leu Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Leu Lys1               5                   10

(2)SEQ ID NO：31的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽31

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，3，4，8，10，11)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：31Lys Leu Leu Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Leu Lys1               5                   10

(2)SEQ ID NO：32的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽32

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(3，5，8，9，11)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：32Lys Leu Leu Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Leu Lys1               5                   10

(2)SEQ ID NO：33的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽33

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(3，4，8，10)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：12

(D)其他资料：/产物＝“其他”

    /注意：“在C-末端的羧基被一个氨基取代”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：33Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys1               5                   10

(2)SEQ ID NO：34的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽34

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(3，4，8，10)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：12

(D)其他资料：/产物＝“其他”

    /注意：“在C-末端的羧基被一个氨基取代”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：34Lys Val Val Val Lys Val Val Val Lys Val Val Lys1               5                   10

(2)SEQ ID NO：35的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽35

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，6，8，11)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：35Lys Val Val Val Lys Val Lys Val Lys Val Val Lys1               5                   10

(2)SEQ ID NO：36的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽36

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(1..4，8，10，11)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：36Lys Val Val Val Lys Val Lys Val Lys Val Val Lys1               5                   10

(2)SEQ ID NO：37的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽37

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(3，5，8，9，11)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：37Lys Val Val Val Lys Val Lys Val Lys Val Val Lys1               5                   10

(2)SEQ ID NO：38的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：6氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽38

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，6)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：38Lys Leu Ile Leu Lys Leu1               5

(2)SEQ ID NO：39的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：6氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽39

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，6)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：39Lys Val Leu His Leu Leu1               5

(2)SEQ ID NO：40的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：6氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽40

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，6)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：40Leu Lys Leu Arg Leu Leu1               5

(2)SEQ ID NO：41的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：6氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽41

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：4

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：41Lys Pro Leu His Leu Leu1               5

(2)SEQ ID NO：42的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：8氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽42

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，3，4，6)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：42Lys Leu Ile Leu Lys Leu Val Arg1               5

(2)SEQ ID NO：43的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：8氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽43

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，4，5，6)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：43Lys Val Phe His Leu Leu His Leu1               5

(2)SEQ ID NO：44的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：8氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽44

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(1，2，4，6，7)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：44His Lys Phe Arg Ile Leu Lys Leu1               5

(2)SEQ ID NO：45的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：8氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽45

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：5

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：45Lys Pro Phe His Ile Leu His Leu1               5

(2)SEQ ID NO：46的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽46

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(1，2，6，8，11)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：46Lys Ile Ile Ile Lys Ile Lys Ile Lys Ile Ile Lys1               5                   10

(2)SEQ ID NO：47的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽47

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，3，4，8，10，11)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：47Lys Ile Ile Ile Lys Ile Lys Ile Lys Ile Ile Lys1               5                   10

(2)SEQ ID NO：48的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽48

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(1，3，5，8，9，11)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：48Lys Ile Ile Ile Lys Ile Lys Ile Lys Ile Ile Lys1               5                   10

(2)SEQ ID NO：49的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽49

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：7

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：49Lys Ile Pro Ile Lys Ile Lys Ile Lys Ile Pro Lys1               5                   10

(2)SEQ ID NO：50的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽50

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(6，10)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：50Lys Ile Pro Ile Lys Ile Lys Ile Lys Ile Val Lys1               5                   10

(2)SEQ ID NO：51的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽51

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，4，6，8，11)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：51Arg Ile Ile Ile Arg Ile Arg Ile Arg Ile Ile Arg1               5                   10

(2)SEQ ID NO：52的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽52

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，3，4，6，7，8，10，11)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：52Arg Ile Ile Ile Arg Ile Arg Ile Arg Ile Ile Arg1               5                   10

(2)SEQ ID NO：53的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽53

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(1，3，5，8，9，11)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：53Arg Ile Ile Ile Arg Ile Arg Ile Arg Ile Ile Arg1               5                   10

(2)SEQ ID NO：54的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽54

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，6，8，11)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：54Arg Ile Val Ile Arg Ile Arg Ile Arg Leu Ile Arg1               5                   10

(2)SEQ ID NO：55的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽55

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，3，4，8，10，11)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：55Arg Ile Ile Val Arg Ile Arg Leu Arg Ile Ile Arg1               5                   10

(2)SEQ ID NO：56的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽56

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(3，5，8，9，11)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：56Arg Ile Gly Ile Arg Leu Arg Val Arg Ile Ile Arg1               5                   10

(2)SEQ ID NO：57的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽57

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，6，8，11)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：57Lys Ile Val Ile Arg Ile Arg Ile Arg Leu Ile Arg1               5                   10

(2)SEQ ID NO：58的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽58

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，3，4，8，10，11)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：58Arg Ile Ala Val Lys Trp Arg Leu Arg Phe Ile Lys1               5                   10

(2)SEQ ID NO：59的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽59

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(3，5，8，9，11)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：59Lys Ile Gly Trp Lys Leu Arg Val Arg Ile Ile Arg1               5                   10

(2)SEQ ID NO：60的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：12氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽60

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，4，7，10，11)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：60Lys Lys Ile Gly Trp Leu Ile Ile Arg Val Arg Arg1               5                   10

(2)SEQ ID NO：61的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：14氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽61

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，6，8，11，13)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：61Arg Ile Val Ile Arg Ile Arg Ile Arg Leu Ile Arg Ile Arg1               5                   10

(2)SEQ ID NO：62的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：14氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽62

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(1..4，8，10，11，13，14)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：62Arg Ile Ile Val Arg Ile Arg Leu Arg Ile Ile Arg Val Arg1               5                   10

(2)SEQ ID NO：63的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：14氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽63

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(3，5，8，9，11，14)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：63Arg Ile Gly Ile Arg Leu Arg Val Arg Ile Ile Arg Arg Val1               5                   10

(2)SEQ ID NO：64的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：16氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽64

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(1，2，6，7，11，15，16)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：64Lys Ile Val Ile Arg Ile Arg Ala Arg Leu Ile Arg Ile Arg Ile Arg1               5                   10                  15

(2)SEQ ID NO：65的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：16氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽65

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，3，4，7，8，10，11，13，14，16)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：65Arg Ile Ile Val Lys Ile Arg Leu Arg Ile Ile Lys Lys Ile Arg Leu1               5                   10                  15

(2)SEQ ID NO：66的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：16氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽66

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(1，3，5，8，9，11，13，14，16)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：66：Lys Ile Gly Ile Lys Ala Arg Val Arg Ile Ile Arg Val Lys Ile Ile1               5                   10                  15

(2)SEQ ID NO：67的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：16氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽67

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，3，4，7，8，10，11，13，14，16)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：67：Arg Ile Ile Val His Ile Arg Leu Arg Ile Ile His His Ile Arg Leu1               5                   10                  15

(2)SEQ ID NO：68的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：16氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽68

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(1，3，5，8，9，11，13，14，16)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：68：His Ile Gly Ile Lys Ala His Val Arg Ile Ile Arg Val His Ile Ile1               5                   10                  15

(2)SEQ ID NO：69的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：16氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽69

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，4，7，9，10，11，13，14，16)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：69：Arg Ile Tyr Val Lys Ile His Leu Arg Tyr Ile Lys Lys Ile Arg Leu1               5                   10                  15

(2)SEQ ID NO：70的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：16氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽70

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(1，3，5，8，9，11，13，14，16)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：70：Lys Ile Gly His Lys Ala Arg Val His Ile Ile Arg Tyr Lys Ile Ile1               5                   10                  15

(2)SEQ ID NO：71的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：16氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽71

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，3，4，7，8，10，11，13，14，16)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：71：Arg Ile Tyr Val Lys Pro His Pro Arg Tyr Ile Lys Lys Ile Arg Leu1               5                   10                  15

(2)SEQ ID NO：72的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：16氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽72

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(3，5，8，9，11，13，14，16)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：72：Lys Pro Gly His Lys Ala Arg Pro His Ile Ile Arg Tyr Lys Ile Ile1               5                   10                  15

(2)SEQ ID NO：73的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：19氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽73

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，6，7，11，15，16，18)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：73：Lys Ile Val Ile Arg Ile Arg Ile Arg Leu Ile Arg Ile Arg Ile Arg1               5                   10                  15Lys Ile Val

(2)SEQ ID NO：74的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：19氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽74

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，3，4，6，7，8，10，11，13，14，16，17，19)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：74：Arg Ile Ile Val Lys Ile Arg Leu Arg Ile Ile Lys Lys Ile Arg Leu1               5                   10                  15Ile Lys Lys

(2)SEQ ID NO：75的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：19氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽75

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(3，4，5，8，9，11，13，14，16，17，18)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：75：Lys Ile Gly Trp Lys Leu Arg Val Arg Ile Ile Arg Val Lys Ile Gly1               5                   10                  15Arg Leu Arg

(2)SEQ ID NO：76的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：25氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽76

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，6，7，11，15，16，18，20，24，25)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：76：Lys Ile Val Ile Arg Ile Arg Ile Arg Leu Ile Arg Ile Arg Ile Arg1               5                   10                  15Lys Ile Val Lys Val Lys Arg Ile Arg

        20                  25

(2)SEQ ID NO：77的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：26氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽77

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，3，4，6，7，8，10，11，13，14，16，17，19..22，24，25)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”(xi)序列描述：SEQ ID NO：77：Arg Phe Ala Val Lys Ile Arg Leu Arg Ile Ile Lys Lys Ile Arg Leu1               5                   10                  15Ile Lys Lys Ile Arg Lys Arg Val Ile Lys

        20                  25

(2)SEQ ID NO：78的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：30氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽78

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(3，4，5，8，9，11，13，14，16，17，18，22，23，24，27，28，30)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：78：Lys Ala Gly Trp Lys Leu Arg Val Arg Ile Ile Arg Val Lys Ile Gly1               5                   10                  15Arg Leu Arg Lys Ile Gly Trp Lys Lys Arg Val Arg Ile Lys

        20                  25                  30

(2)SEQ ID NO：79的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：16氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽79

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2..5，7，8，10，11，13，14，16)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：79：Arg Ile Tyr Val Lys Pro His Pro Arg Tyr Ile Lys Lys Ile Arg Leu1               5                   10                  15

(2)SEQ ID NO：80的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：16氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽80

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(1，2，3，5，7..11，13，14，16)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：80：Lys Pro Gly His Lys Ala Arg Pro His Ile Ile Arg Tyr Lys Ile Ile1               5                   10                  15

(2)SEQ ID NO：81的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：19氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽81

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，4..8，10..13，15，16，18)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：81：Lys Ile Val Ile Arg Ile Arg Ile Arg Leu Ile Arg Ile Arg Ile Arg1               5                   10                  15Lys Ile Val

(2)SEQ ID NO：82的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：19氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽82

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，3，4，6..11，13，14，16，17，19)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：82：Arg Ile Ile Val Lys Ile Arg Leu Arg Ile Ile Lys Lys Ile Arg Leu1               5                   10                  15Ile Lys Lys

(2)SEQ ID NO：83的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：16氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽83

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2..5，7，8，10，11，13，14，16)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：83：Arg Ile Tyr Val Ser Lys Ile Ser Ile Tyr Ile Lys Lys Ile Arg Leu1               5                   10                  15

(2)SEQ ID NO：84的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：19氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽84

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，4..8，10..13，15，16，18)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：84：Lys Ile Val Ile Phe Thr Arg Ile Arg Leu Thr Ser Ile Arg Ile Arg1               5                   10                  15Ser Ile Val

(2)SEQ ID NO：85的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：16氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽85

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(1，2，3，5，7..11，13，14，16)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：85：Lys Pro Ile His Lys Ala Arg Pro Thr Ile Ile Arg Tyr Lys Met Ile1               5                   10                  15

(2)SEQ ID NO：86的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：25氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：环状

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽86

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(9，20，21)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：86：Cys Lys Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu1               5                   10                  15Phe Lys Thr Leu Leu Ser Ala Val Cys

        20                  25

(2)SEQ ID NO：87的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：26氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：环状

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽87

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(10，21，22)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：87：Cys Lys Lys Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro1               5                   10                  15Leu Phe Lys Thr Leu Leu Ser Ala Val Cys

        20                  25

(2)SEQ ID NO：88的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：27氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：环状

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽88

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(11，22，23)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：88：Cys Lys Lys Lys Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser1               5                   10                  15Pro Leu Phe Lys Thr Leu Leu Ser Ala Val Cys

        20                  25(2)SEQ ID NO：89的资料：(i)序列特性：(A)长度：16氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：环状(ii)分子类型：肽(Vii)直接来源：(B)克隆：肽89(xi)序列描述：SEQ ID NO：89：Cys Arg Ile Val Ile Arg Ile Arg Ile Arg Leu Ile Arg Ile Arg Cys1               5                   10                  15(2)SEQ ID NO：90的资料：(i)序列特性：(A)长度：18氨基酸(B)类型：氨基酸(C)链型：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：肽(Vii)直接来源：(B)克隆：肽90

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(2，3，4，6，8..12，14，15，17)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：90：Cys Lys Pro Gly His Lys Ala Arg Pro His Ile Ile Arg Tyr Lys Ile1               5                   10                  15Ile Cys

(2)SEQ ID NO：91的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：28氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：环状

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：肽91

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(3，4，5，7，8，9，11，12，14，15，17，18，20..23，25，26)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：91：Cys Arg Phe Ala Val Lys Ile Arg Leu Arg Ile Ile Lys Lys Ile Arg1               5                   10                  15Leu Ile Lys Lys Ile Arg Lys Arg Val Ile Lys Cys

        20                  25

(2)SEQ ID NO：92的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：13氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：23C(肽92的部分)

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(3，4，8，10)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：13

(D)其他资料：/产物＝“其他”

    /注意：“在C-末端的羧基被一个氨基取代”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：92：Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Cys1               5                   10

(2)SEQ ID NO：93的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：13氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：24C(肽93的部分)

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组(3，4，8，10)

(D)其他资料：/产物＝“D-氨基酸残基”

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：13

(D)其他资料：/产物＝“其他”

    /注意：“在C-末端的羧基被一个氨基取代”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：93：Lys Leu Leu Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Leu Lys Cys1               5                   10

(2)SEQ ID NO：94的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：33氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：PARDAXIN

(xi)序列描述：SEQ ID NO：94：Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe Lys1               5                   10                  15Thr Leu Leu Ser Ala Val Gly Ser Ala Leu Ser Ser Ser Gly Gly Gln

        20                  25                  30Glu

(2)SEQ ID NO：95的资料：

(i)序列特性：

(A)长度：26氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(Vii)直接来源：

(B)克隆：Melittin

(ix)特征：

(A)名称/关键词：修饰位点

(B)位置：组26

(D)其他资料：/产物＝“其他”

    /注意＝“C-末端的羧基被一个氨基取代”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：95Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu1               5                   10                  15Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln

        20                  25

Claims (26)

1.一种选自肽、成束肽的复合物、肽混合物或无规肽共聚物的非溶血性溶细胞药剂，所述的药剂具有选择性的溶细胞活性，表现在对病原细胞的溶细胞活性，病原细胞是机体中包含微生物病原生物体和恶性细胞等非天然产生的细胞；而其非溶血性，即不具有对血液红细胞的溶细胞效应，或者在此其表现所述的溶细胞活性时基本上较高的浓度下，对红细胞表现溶细胞效应，所述的非溶血性溶细胞剂选自：

(1)净正电荷大于+1的肽的环形衍生物，并且L-氨基酸残基和D-氨基酸残基二者都包括，或包括L-氨基酸残基和D-氨基酸残基之一或两者，以及包括α-螺旋中断部分；

(2)一种肽，及其环形衍生物，包括L-氨基酸残基和D-氨基酸残基，该肽净正电荷大于+1并且其氨基酸序列是其相应的仅包括L-氨基酸残基的氨基酸序列在自然界中找不到；

(3)一种由许多2或更多非溶血性溶细胞肽组成的复合物，每一种肽的净正电荷大于+1，且L-氨基酸残基和D-氨基酸残基二者都包括，或者包括L-氨基酸残基和D-氨基酸残基之一或两者，并且包括α-螺旋中断部分；或前述复合物的环形衍生物，所述的肽利用与每一种肽共价结合的连接分子束定在一起；

(4)一种由许多2或更多非溶性溶细胞肽组成的混合物，每一种肽的净正电荷大于+1，并且包括L-氨基酸残基和D-氨基酸残基二者，或者包括L-氨基酸残基和D-氨基酸残基之一或两者，以及包括α-螺旋中断部分或前述的混合物的环形衍生物；并且

(5)一种由不同比例的疏水性、正电荷氨基酸和D-氨基酸组成的无规共聚物。

2.根据权利要求1(1)的环形肽，即包括D-氨基酸残基又包括L-氨基酸残基，其序列是均一开链肽，仅包括L-或D-氨基酸残基并且有与所述肽相同的氨基酸序列，其具有α-螺旋构型并对各种细胞有广谱溶细胞活性。

3.根据权利要求2的环形肽，它是一种来源于pardaxin或mellitin或其片段的环形非对映体。

4.根据权利要求3的环形肽，其中净正电荷大于+1是由于天然氨基酸组成引起，或通过游离羧基的中和作用或通过添加正电茶氨基酸残基和/或正电荷化学基团得到。

5.根据权利要求4的环形肽，它选自pardaxin或其片段的环形非对映体，Lys残基被加到该肽的N-末端上和/或氨基乙基氨基基团被加到C-末端上。

6.根据权利要求5的环形肽，它选自衍生于pardaxin的环形肽在此称为肽86-88的序列：

86    环形K¹[D]P⁷L¹⁸L¹⁹[1-22]-par的序列：

87    环形K¹K²[D]P⁷L¹⁸L¹⁹[1-22]-par的序列：

88    环形K¹K²K³[D]P⁷L¹⁸L¹⁹[1-22]-par的序列；

7.根据权利要求1(2)的肽，既包括L-氨基酸残基又包括氨基酸残基并且具有一种氨基酸序列，其相应的仅包括L-氨基酸残基的氨基酸序列在自然界中找不到。

8.根据权利要求7的肽，具有下列特征：

(a)它是一种包括至少一个疏水性氨基酸和至少一个正电荷氨基酸的不同经例组成的非天然合成肽，并且其序列中至少一个氨基酸残基是D-氨基酸；

(b)该肽的净正电荷大于+1；和

(c)疏水性与正电荷氨基酸的比例为该肽对病原细胞有溶细胞性但不引起血液红细胞溶解。

9.根据权利要求8的肽，其中正电荷氨基酸选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸，而疏水性氨基酸选自亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸和色氨酸。

10.根据权利要求9的肽，其中净正电荷大于+1是由于氨基酸组成或添加正电荷化学基团引起，或者其疏水性可通过添加极性氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸而降低。

11.根据权利要求10的肽具有至少6个氨基酸残基，其中疏水性氨基酸是亮氨酸、丙氨酸或缬氨酸而正电荷氨基酸是赖氨酸。

12.根据权利要求11的肽，它是一种由亮氨酸和赖氨酸组成的六聚体，八聚体或十二聚体肽的非对映体，其中至少三分之一的序列由D-氨基酸组成，只有在此称为23的肽例外：23 Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-NH₂

13.根据权利要求12的Leu/Lys非对映体，该非对映体选自在此称为肽24-29(分别是SEQ ID NO：24-29)的序列：24.Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Lys-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-NH₂25.Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Leu-Lys-Leu-Lys-Leu-Lys-Lys-NH₂26.Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-NH₂27.Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Lys-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-NH₂28.Lys-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys29.Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys

14.根据权利要求7-13任一项的非天然合成肽的环形衍生物，该衍生物选自在此称为肽92-95的序列：92.环形

   Cys Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys Cys93.环形

   Cys Lys Leu Leu Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Leu Lys Cys

15.一种根据权利要求1(3)的成束肽的复合体，其由根据权利要求1-14任一项的许多2或更多非溶血性溶细胞肽组成，所述的肽通过与每一种肽其价结合的连接分子成束在一起。

16.根据权利要求15的复合体，其中成束由α或更多，优选为5的相同或不同肽分子所组成，连接子是根据前述权利要求任一项的肽或普通使用的连接子。

17.根据权利要求16的复合体，该复合体选自在此称为96和97的成束Lys/Leu非对映体：

96([D]-L^{3，4，8，10}-K₄L₈C)₅[D]-L^{3，4，8，10}-K₄L₈的序列：(Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-Cys-NH₂)₅Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-NH₂

97([D]-L^{3，4，8，10}-K₄L₇C)₅[D]-L^{3，4，8，10}-K₄L₉的序列：(Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Lys-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-Cys-NH₂)₅ Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-NH₂

18.根据权利要求1(4)由许多α或更多非溶血性溶细胞肽组成的混合物，其中的肽为权利要求1-14任一项所定义的种类。

19.根据权利要求18的混合物，包括一种Lys/Leu十二聚体肽非对映体的混合物。

20.根据权利要求1(5)的非溶血性溶细胞无规其聚物，其由不同比例的疏水性、正电荷氨基酸和D-氨基酸组成。

21.根据权利要求20的非溶血性溶细胞无规共聚物，其组成的赖氨酸、亮氨酸和D-亮氨酸的比例为1∶1∶1，2∶1∶1或3∶1∶1(摩尔)。

22.包括权利要求1-21任一项的非溶血性溶细胞药剂的药用组合物和药用可接受的载体。

23.根据权利要求22的药用组合物，用于治疗由病原生物体引起的感染。

24.根据权利要求23的药用组合物，其中病原生物体选自细菌、真菌、原生动物、支原体和病毒。

25.根据权利要求24的药用组合物，其中病原生物体是细菌。

26.根据权利要求22的药用组合物，用于治疗癌症。

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