JP2001512475A

JP2001512475A - 抗病原性合成ペプチドおよびこれらを含む組成物

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Publication number: JP2001512475A
Application number: JP53645398A
Authority: JP
Inventors: シャイ，イエチエル; オーレン，ジブ
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1997-02-20
Filing date: 1998-02-19
Publication date: 2001-08-21
Also published as: BR9807456A; WO1998037090A1; EA199900752A1; EP0977774A1; CA2281204A1; CN1252808A; US7001983B1; AU6005698A; IL131368A0

Abstract

(57)【要約】ペプチド、束になったペプチドの複合体、ペプチドまたはランダムペプチドコポリマーの混合物から選択される非溶血性細胞溶解性物質は、病原性細胞（体内では自然に存在せず、かつ病原性生物および悪性細胞を含む細胞）に対する細胞溶解活性を有すること；および非溶血性であること、すなわち、赤血球に対する細胞溶解作用がないこと、により表される選択的細胞溶解活性を有する。ペプチドは、パーダキシンやメリチンのような天然のペプチドおよびこれらの断片の環状誘導体（ここで、Ｌ−アミノ酸残基は対応するＤ−アミノ酸残基により置換されるか、または種々の比の、少なくとも１つの正に荷電したアミノ酸と少なくとも１つの疎水性アミノ酸からなる線状ペプチドのジアステレオ異性体よりなり、そして、少なくとも１つのアミノ酸残基がＤ−アミノ酸である）でもよい。非溶血性細胞溶解性物質を含む薬剤組成物は、細菌、真菌、ウイルス、マイコプラズマおよび原生動物感染症を含む病原体により引き起こされるいくつかの疾患の治療、および癌の治療のために使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】抗病原性合成ペプチドおよびこれらを含む組成物発明の分野本発明は、新規な非溶血性細胞溶解性ペプチド、これらを含む組成物、および疾患または障害の治療および農業におけるこれらの使用に関する。発明の背景以下の本文において、先行技術資料が参照されるが、その完全な詳細は、請求の範囲の前の明細書の最後の「引用文献」の項に見いだすことができる。利用可能な抗微生物薬に対する微生物の耐性の増大により、代替抗微生物化合物の開発に多くの研究が集中することになった。高度に特異的な細胞介在性免疫応答に加えて、またはこれと相補的に、脊椎動物および他の生物は、別個の群の広域スペクトル細胞溶解性（例えば、抗菌性）ペプチドから構成される防御系を有する。細胞溶解素としても知られている、このような細胞溶解性ペプチドの脂質−ペプチド相互作用に関する研究では、その細胞溶解活性に対する両親媒性αらせん構造の重要性を強調しがちである。この結論は主として、哺乳動物細胞または細菌単独のいずれか、または両方の型の細胞に対して作用する細胞溶解素による研究に基づいている。このファミリーの細胞溶解性ペプチドの主要な群は、宿主防御の短い線状ペプチド（≦４０アミノ酸）であり、これらにはジスルフィド架橋が全くない（ボーマン（Boman）、１９９５）。これらのペプチドでは、鎖の長さ、疎水性および電荷の全体的な分布は、相当に多様であるが、脂質二重層と会合した共通構造、すなわち、両親媒性αらせん構造を共有している（セグレスト（Segrest）ら、１９９０）。既知の細胞溶解素の例としては、（ｉ）細菌のみに細胞溶解性である抗菌性ペプチド、例えば、アカスジシンジュサン（cecropia moth）から単離されたケクロピン（cecropins）（スタイナー（Steiner）ら、１９８１）、カエルの皮膚から単離されたマゲイニン（magainins）（ザスロフ（Zasloff）、１９８７）およびダーマセプチン（dermaseptins）（モーア（Mor）ら、１９９１）；（ii）黄色ブドウ状球菌（Staphylococcus aureus）から単離されたδ −溶血素（ドープル（Dhople）とナガラジ（Nagaraj）、１９９３）；および（i ii）哺乳動物細胞と細菌の両方を溶解する、ハチ毒のメリチン（ハーバーマン（ Habermann）とジェンシュ（Jentsch）、１９６７）および神経毒のパーダキシン（pardaxin）（シャイ（Shai）ら、１９８８）のような、細胞選択的でない細胞溶解素を含む。抗菌性ペプチドは、最初に無脊椎動物において、そして次にヒトを含む脊椎動物において発見された。相補的または追加的な防御系として、この二次的な化学的免疫系は、誘導により迅速に合成されるあるレパートリーの小さいペプチドを生物に供給するが、このペプチドは、時折の偏性病原体による侵入に対して、さらには片利共生微生物の抑制されない増殖に対して作用する（ボーマン（Boman ）、１９９５）。これまで、１００を超える異なる抗菌性ペプチドが単離され性状解析されている。最も大きなファミリー、そして恐らく最も研究されているファミリーは、正に荷電し、かつ両親媒性αらせん構造を採っているペプチドを含む。種々の未変性抗菌性ペプチドで行われた多くの研究は、細胞溶解活性に関して、両親媒性αらせん構造および正味の正電荷の重要性を強調しがちである。正電荷は、正常真核細胞に比較して病原性細胞膜に高濃度で見い出される負に荷電した膜とのペプチドの相互作用を促進し（アンドルー（Andreu）ら、１９８５）、そして両親媒性αらせん構造は、溶解活性に必須である（チェン（Chen）ら、１９８８）。このような相互作用は、エネルギー変換膜の透過性を増大させることにより、標的生物のエネルギー代謝を破壊すると唱えられている（オカダ（Ok ada）とナトリ（Natori）、１９８４）。これらの両親媒性構造のため、これらの抗菌性ペプチドは、「樽−樽板（barrel-stave）」機構によりイオンチャネル／孔を形成することにより、膜を透過することが示唆されている（リッツォ（Rizzo）ら、１９８７）。このモデルにより、膜貫通型両親媒性αらせんは、外向きの疎水性表面が膜の脂質成分と相互作用し、同時に内側に面した親水性表面が孔を生成する束を形成する。あるいは、ペプチドは、膜の表面に平行に結合し、「カーペット」様に膜の表面を覆って界面活性剤のように膜を溶解する（シャイ（Shai）、１９９５）。広範な研究にもかかわらず、短い線状非細胞選択性ペプチド（例えば、パーダキシンおよびメリチン）の作用の正確な様式は、未だ知られておらず、そして同様な構造的特徴が、哺乳動物細胞および細菌に対するその細胞毒性に必要であるかどうかは明白でない。パーダキシン（３３量体ペプチド）は、紅海モーセソール（Red Sea MosesSol e）のパーダキルス・マーモラツス（Pardachirus marmoratus）（シャイ（Shai ）ら、１９８８）および西太平洋の孔雀ソール（PeacocSole）のパーダキルス・パヴォニヌス（Pardachirus pavoninus）（トンプソン（Thompson）ら、１９８６）から精製された興奮性神経毒である。パーダキシンは、その濃度に応じて種々の生物学的活性を有する（シャイ（Shai）の総説、１９９４）。１０^-7Ｍ未満の濃度では、パーダキシンは、カルシウム依存的に神経伝達物質の放出を誘導する。１０^-7Ｍ〜１０^-5Ｍのより高い濃度では、このプロセスはカルシウム非依存性であり、１０^-5Ｍ以上で細胞溶解が誘導される。パーダキシンはまた、インビトロで種々の生理学的調製物の活性に影響を及ぼす。その生物学的役割は、上皮の浸透度調節系のイオン輸送の妨害、および電位差依存的でわずかにカチオンに選択的なイオンチャネルを形成することによるシナプス前活性にある。その構造および種々の生物物理学的研究に基づき、膜へのパーダキシンの挿入に関する「樽−樽板」機構が提案された（シャイ（Shai）の総説、１９９４）。パーダキシンは、らせん−ヒンジ−らせん構造を有する：Ｎ−らせんは残基１〜１１を含み、そしてＣ−らせんは残基１４〜２６を含む。このらせんは、１３位に位置するプロリン残基により分離している。この構造モチーフは、細菌に対して特異的に作用しうる抗菌性ペプチド（例えば、ケクロピン）、および種々の細胞を溶解しうる細胞毒性ペプチド（例えば、メリチン）の両方において見い出されている。メリチン（２６量体両親媒性ペプチド）は、ミツバチのアピス・メリフェラ（ Apis mellifera）の毒の主要な成分であり（ハーバーマン（Habermann）とジェンシュ（Jentsch）、１９６７）、そして最も研究された膜要求ペプチドの１つである（デンプセイ（Dempsey）、１９９０）。メリチンは、哺乳動物細胞にとって非常に細胞毒性であるが、同時に非常に強力な抗菌性物質である（スタイナー（Steiner）ら、１９８１）。メリチン誘導性溶血の分子機構を理解するため、および膜タンパク質の構造およびリン脂質膜とのこのようなタンパク質の相互作用の一般特性を研究するためのモデルとして、膜とのメリチンの相互作用の性質を決定するための多くの研究が行われてきた。目下の記述された証拠の多くは、メリチンの異なる作用には異なる分子機構が根底にあることを示している。それにもかかわらず、両親媒性αらせん構造は、その種々の活性の必要条件であることが証明されている（ペレス（Perez）ら、１９９４）。メリチンの構造は、種々の方法を用いて調査されている。Ｘ線結晶学およびメタノール溶液中のＮＭＲの結果は、この分子が、１２０°の角度で交差する２つのαらせんセグメント（残基１〜１０および１３〜２６）からなることを示している。これらのセグメントは、ヒンジ（１１〜１２）により結合して、親水性側と疎水性側が反対方向に向かっている屈曲αらせんロッドを形成する。４つのこのようなモノマーのメリチン分子が、疎水性相互作用により集合して、四量体を形成している（アンダーソン（Anderson）ら、１９８０；バッゾ（Bazzo）ら、１９８８；ターウィリガー（Terwilliger）とアイセンバーグ（Eisenberg）、１９８２；ターウィリガー（Terwilliger）とアイセンバーグ（Eisenberg）、１９８２）。膜表面との最初の相互作用により、四量体がモノマーに解離し、これらは、膜への挿入前にはαらせんコンホメーションを保持していることが見い出された（オルテンバッハ（Altenbach）とハッベル（Hubbell）、１９８８）。メリチンは、パーダキシンとの幾つかの類似点を共有する。パーダキシンもメリチンも、間にプロリンヒンジを有する２つのらせんからなっている。さらには、これらは、そのＮ−らせんに著しい相同性を示しており、そこは大部分疎水性である（トンプソン（Thompson）ら、１９８６）。しかしパーダキシン（正味電荷＋１）は、−２の電荷を有するそのＣ末端側に、さらに７個のアミノ酸残基を含有するが、一方メリチン（正味電荷＋６）は、アミド基で終わり、かつ正に荷電したテトラペプチド配列Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇを含有する。パーダキシンとメリチンの間には幾つかの機能的な相違がある。パーダキシンは、双性イオン性リン脂質と負に荷電したリン脂質の両方に同様に結合する（ラパポート（Rapaport）とシャイ（Shai）、１９９１）が、一方メリチンは、双性イオン性リン脂質よりも負に荷電したリン脂質に良好に結合する（バテンバーグ（Batenb urg）ら、１９８７；バテンバーグ（Batenburg）ら、１９８７）。また、パーダキシンは、正の協同性でリン脂質に結合する（ラパポート（Rapaport）とシャイ（Shai）、１９９１）が、一方メリチンは、負の協同性で結合する（バテンバーグ（Batenburg）ら、１９８７；バテンバーグ（Batenburg）ら、１９８７）。パーダキシンもメリチンもグラム陽性細菌とグラム陰性細菌に対する強力な抗菌性ペプチドであるが、パーダキシンは、ヒト赤血球に対してメリチンよりも４０〜１００倍溶血性が弱い（オレン（Oren）とシャイ（Shai）、１９９６）。Ｌ−置換からＤ−置換にしたパーダキシンの類似体は、ヒト赤血球を溶解しうることが証明された（ポウニー（Pouny）とシャイ（Shai）、１９９２）。後になって（以下に報告される結果を参照のこと）、ポウニー（Pouny）とシャイ（S hai）、１９９２に開示されたペプチドの２つ、すなわち、Ｄ−Ｐｒｏ⁷−パーダキシンとＤ−Ｌｅｕ¹⁸Ｌｅｕ¹⁹−パーダキシンは、溶血性ではあったが、抗菌活性が非常に低いことが証明された。Ｌ−置換からＤ−置換にしたマゲイニンの類似体もまた、抗菌活性が欠けていることが発見された（チェン（Chen）ら、１９８８）。用語解説以下において、本文を能率的に読むため、および本発明のよりよい理解を促進するために、造り出された幾つかの用語を使用する。しかし、これらの用語の完全な理解のためには、以下の完全な説明を時々参照すべきであることに注意されたい。本明細書におけるこれらの用語とその意味は以下の通りである：本明細書で使用される「異種ペプチド」とは、Ｄ−およびＬ−アミノ酸残基の両方を含むペプチドを意味する。本明細書で使用される「同種ペプチド」とは、自然のＬ−アミノ酸残基のみ、またはＤ−アミノ酸残基のみのいずれかを含むペプチドを意味する。本明細書で使用される「同種Ｌ−ペプチド」および「同種Ｄ−ペプチド」とは、それぞれ専ら、Ｌ−アミノ酸残基またはＤ−アミノ酸残基のいずれかからなる同種ポリペプチドを意味する。本明細書で使用される「異種Ｌベースのペプチド」および「異種Ｄベースのペプチド」とは、それぞれ、主としてＬ−アミノ酸残基を含む異種ペプチド（例えば、１つまたはそれ以上のＬ−アミノ酸残基が、対のＤ−エナンチオマーにより置換されている同種Ｌ−ペプチドから誘導されたペプチド）、および１つまたはそれ以上のＤ−アミノ酸残基が、対のＬ−エナンチオマーにより置換されているＤ−アミノ酸残基を主として含む異種ペプチドを意味する。本明細書で使用される「らせんペプチド」とは、その長さの大部分にわたって連続したαらせんストレッチを有するペプチドを意味する。らせんペプチドのらせん部分は、専らＬ−アミノ酸残基またはＤ−アミノ酸残基のいずれかから構成される。本明細書で使用される「非らせんペプチド」とは、αらせん構造がないか、またはその長さに沿って分散している非連続的αらせん構造を有するペプチドを意味する。本発明の非らせんペプチドには、αらせんストレッチがあってもよく、それが末端にある場合には細胞の膜の半幅より短い長さ、例えば、約１０〜１５未満のアミノ酸残基を有し、そして非末端αらせんであるならば、細胞の膜の全幅より短い長さ、例えば、約２０〜２５未満のアミノ酸残基を有する。非らせんペプチドは、αらせん破壊部分（以下を参照のこと）を有する同種ペプチドであっても、または異種ペプチドであってもよい。本明細書で使用される「αらせん破壊部分」とは、αらせん構造中に挿入されるとその連続性を中断する部分を意味する。このような部分は、例えば、アミノ酸残基のプロリンまたはグリシン、α−メチル置換α−アミノ酸、環状および非環状の両方の非αアミノ酸（例えば、６−アミノ−ヘキサン酸、３−アミノ−１ −シクロヘキサン酸、４−アミノ−１−シクロヘキサン酸）であっても、または反対のエナンチオマーのアミノ酸残基のストレッチからなるαらせんストレッチに挿入されたＬ−またはＤ−エナンチオマーであってもよい。本明細書で使用される「病原性細胞」とは、癌細胞および細菌、真菌、原生動物、ウイルスおよびマイコプラズマのような病原性生物、さらには寄生原生動物（例えば、リーシュマニア（Leishmania）およびマラリア原虫（Plasmodium））のような病原性生物に感染した哺乳動物細胞を含む、体内では自然に存在しない細胞を意味する。本明細書で使用される「選択的細胞溶解活性」とは、病原性細胞の細胞溶解の誘導におけるある物質の活性を意味し、この選択性は、この物質が、赤血球のような正常非病原性細胞の細胞溶解に必要な濃度よりもはるかに低濃度で病原性細胞の細胞溶解を誘導することにより表される。本明細書で使用される「非溶血性」とは、病原性細胞（例えば、微生物細胞、癌細胞など）のような他の細胞の細胞溶解を引き起こすのに必要な濃度よりも、はるかに高濃度で赤血球の溶血を引き起こす物質を意味する。「ジアステレオマー」は、本明細書では「異種ペプチド」の同義語として使用される。発明の要約本発明は、ペプチド、束になったペプチドの複合体、ペプチドもしくはランダムペプチドコポリマーの混合物から選択される非溶血性細胞溶解性物質を提供し、この物質は、病原性細胞（体内では自然に存在せず、かつ病原性生物および悪性細胞を含む細胞）に対する細胞溶解活性を有すること；および非溶血性であること、すなわち、赤血球に対する細胞溶解作用がないか、または該細胞溶解活性を表す濃度よりも実質的に高い濃度で赤血球に対する細胞溶解作用を有すること、により表される選択的細胞溶解活性を有し、該非溶血性細胞溶解性物質は：（１）＋１より大きな正味の正電荷を有し、Ｌ−アミノ酸残基とＤ−アミノ酸残基の両方を有するか、またはＬ−アミノ酸残基とＤ−アミノ酸残基の１つまたは両方を有し、αらせん破壊部分を含むペプチドの環状誘導体；（２）＋１より大きな正味の正電荷を有する、Ｌ−アミノ酸残基とＤ−アミノ酸残基の両方を有し、Ｌ−アミノ酸残基のみを有する対応するアミノ酸配列は自然には存在しないようなアミノ酸の配列を有するペプチド、およびその環状誘導体；（３）各ペプチドが、＋１より大きな正味の正電荷を有し、Ｌ−アミノ酸残基とＤ−アミノ酸残基の両方を有するか、またはＬ−アミノ酸残基とＤ−アミノ酸残基の１つまたは両方を有し、αらせん破壊部分を含む、複数の２つまたはそれ以上の非溶血性細胞溶解性ペプチド、またはこれらの環状誘導体（該ペプチドは、各ペプチドに共有結合したリンカー分子を使用して束になっている）、からなる複合体；（４）各ペプチドが、＋１より大きな正味の正電荷を有し、Ｌ−アミノ酸残基とＤ−アミノ酸残基の両方を有するか、またはＬ−アミノ酸残基とＤ−アミノ酸残基の１つまたは両方を有し、αらせん破壊部分を含む、複数の２つまたはそれ以上の非溶血性細胞溶解性ペプチド、またはこれらの環状誘導体、からなる混合物；および（５）異なる比の疎水性、正に荷電した、およびＤ−アミノ酸からなるランダムコポリマー、よりなる群から選択される。１つの実施態様において、上記（１）の環状誘導体は、例えばパーダキシンおよびメリチンまたはこれらの断片のような非選択的細胞溶解性の天然のペプチドから誘導される。これらの環状ジアステレオ異性体は、ペプチドの通常の環化法により得られる。１つの実施態様において環状ジアステレオ異性体は、環化のためにＮ−末端に１〜３個のＬｙｓ残基が付加され、Ｎ−末端およびＣ−末端の両方にシステイン残基が付加されたパーダキシンの１〜２２断片から誘導される。ペプチドの正味の正の電荷は、本来のアミノ酸組成、遊離のカルボキシル基の中和、および／または正に荷電したアミノ酸残基または正に荷電した化学的基の付加による。別の実施態様において、本発明は上記（２）で定義したような非溶血性細胞溶解性ペプチドおよびその環状誘導体であって、（ａ）種々の比の、少なくとも１つの疎水性アミノ酸と少なくとも１つの正に荷電したアミノ酸よりなり、そしてその配列において、少なくとも１つのアミノ酸残基が、Ｄ−アミノ酸である、非天然合成ペプチドであること；（ｂ）このペプチドが、＋１より大きな正味の正電荷を有すること；および（ｃ）正に荷電したアミノ酸に対する疎水性アミノ酸の比は、このペプチドが病原性細胞に対して細胞溶解性ではあるが、赤血球の細胞溶解は引き起こさないような比であること、という特徴を有する、上記ペプチドを提供する。正に荷電したアミノ酸の例は、リジン、アルギニンおよびヒスチジンであり、疎水性アミノ酸の例は、ロイシン、イソロイシン、グリシン、アラニン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、チロシンおよびトリプトファンである。正味の正電荷は、アミノ酸組成によるが、正に荷電した化学基の付加も考慮することができる。加えて、セリン、トレオニン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンおよびシステインのような極性アミノ酸を付加して、分子の疎水性および／または毒性を低下させることができる。１つの好ましい実施態様において、このペプチドは、ロイシン、アラニンまたはバリンのような１つの疎水性アミノ酸、およびリジンまたはアルギニンのような１つの正に荷電したアミノ酸からなる。この合成の非天然のペプチドは、少なくとも６個、特に１０個またはそれ以上のアミノ酸残基を有する。１つの好ましい実施態様において、この合成ジアステレオマーは、ロイシン、アラニンまたはバリンおよびリジンからなる１２量体ペプチドであり、配列の少なくとも３分の１は、Ｄ−アミノ酸よりなる。また別の実施態様において、本発明は、例えば、各ペプチドに共有結合したリンカーまたは「鋳型」分子の使用により、複合したか、または「束になった」、本発明の複数の２つまたはそれ以上の非溶血性細胞溶解性ペプチドからなる、上記（３）で定義したような非溶血性細胞溶解性複合体を提供する。この束は、２つまたはそれ以上、好ましくは５つの、同じペプチドまたは異なるペプチドの分子よりなる。リンカー／鋳型は、本発明のペプチドまたは通常使用されるリンカー、例えば、ＯＨ、ＳＨ、ＣＯＯＨ、ＮＨ₂、ＣＨ₂Ｂｒのような活性基を有する、ポリエステル、ポリアミド、ポリペプチド、ポリアミノ酸（例えば、ポリリジン）のようなポリマーであってよい。さらに別の実施態様において、本発明は、各１当量の目的の疎水性アミノ酸、正に荷電したアミノ酸およびＤ−アミノ酸よりなる混合物を、ペプチド合成のための固相法の各カップリング工程で加えることにより得られる、上記（４）で定義した非溶血性細胞溶解性混合物を提供する。こうして、リジン、ロイシンおよびＤ−ロイシンの混合物で３１２個の異なるペプチドの混合物が得られ、そして混合物は、ＨＦ切断、水による抽出および凍結乾燥後ここから得られた。さらなる実施態様において、本発明は、異なる比の疎水性アミノ酸、正に荷電したアミノ酸およびＤ−アミノ酸（例えば、Ｌｙｓ：Ｌｅｕ：Ｄ−Ｌｅｕの１：１：１、２：１：１および３：１：１（モル）コポリマー）からなる、上記（５）で定義した非溶血性細胞溶解性ランダムコポリマーを提供する。好ましくは、非溶血性細胞溶解性ペプチドは、αらせん構造がないか、または細胞膜の幅にまたがるには長さが不足のαらせん構造を有するかのいずれかである。したがつて本発明のペプチドは、膜貫通孔の一部を形成することができる長さの、全Ｄ−または全Ｌ−アミノ酸残基の連続したストレッチを含有しない。このような長さは、典型的には約２０〜２２個のアミノ酸（ストレッチが、ペプチドの非末端部分にある場合）、および約半分、すなわち、１０〜１１個のアミノ酸（ストレッチが、ペプチドの末端にある場合）である（このような場合に、２つのペプチドはその末端どうしを連結して、細胞膜にまたがることができるためである）。Ｄ−またはＬ−アミノ酸残基のストレッチの中断は、反対のエナンチオマーのアミノ酸によるストレッチ中の１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換により、または連続するストレッチにプロリン、グリシン、α−メチル−α−アミノ酸または非α−アミノ酸のようなαらせん破壊部分を入れることにより行われる。本発明のペプチドおよび本発明の複合体、混合物およびコポリマー内に含まれるペプチドは、＋１より大きな正味の正電荷を有する。正味の正電荷は、本発明の元のアミノ酸組成、遊離ＣＯＯＨ基の中和（例えば、アミド化による）によるか、または正に荷電したアミノ酸または化学基の付加によることもある。選択的細胞溶解活性は、正味の正電荷を増大させる（例えば、分子の任意の位置に、正に荷電したアミノ酸および／または正に荷電した基を付加する）ことにより時には増強しうることが見い出された。例えば、ポリアミン基、アルキルアミノ基またはアミノアルキルアミノ基などは、その末端の一方に、典型的にはそのカルボキシル末端に付加できる。好ましいこのような基は、アミノエチルアミノ基−ＮＨ−ＣＨ₂−ＮＨ₂（以降「ＴＡ」と称する）である。非選択的細胞溶解性天然ペプチド（例えば、パーダキシンおよびメリチン）から誘導されるペプチドは、両親媒性であり、このことは、これらが主に疎水性アミノ酸残基からなる一方の表面と、主に親水性アミノ酸残基からなる反対の表面を有することを意味している。ペプチドの両親媒性は、当該分野で公知の方法により立証することができる。このような方法の一例は、シッファー（Shiffer）とエドモンドソン（Edmondson）の輪投影法（wheel projection）（ここで、配列内の各アミノ酸がその隣接するアミノ酸残基から１００°の角度で転置される（一周当たり３．６アミノ酸）ように、その配列にしたがい円形にアミノ酸残基を書く）の使用である。多くの親水性のアミノ酸がその輪の一方の側に集中し、かつ疎水性アミノ酸がその輪の反対側に集中すると、このペプチドは両親媒性であると考えられる。非選択的細胞溶解性天然ペプチドから誘導されていない本発明のペプチド（例えば、疎水性アミノ酸、正に荷電したアミノ酸およびＤ−アミノ酸からなる合成ジアステレオマー）は、両親媒性ではない。これらは、＋１より大きな正味の正電荷を有し、かつ生じるペプチドが病原性細胞には細胞溶解性であるが溶血性ではないような、正に荷電したアミノ酸に対する疎水性アミノ酸の適切な比を有する。これらのペプチドは、本明細書に記載される抗菌性および溶血性試験を使用して、本発明により非常に容易にスクリーニングすることができる。１つの実施態様において、ロイシンとリジンからなるペプチドでは、適切なＬｅｕ：Ｌｙｓ比は、６アミノ酸残基のジアステレオマーについては６４％：３６％であり、そして１２アミノ酸残基のジアステレオマーについては６６％：３４％であろう。理論に束縛されるわけではないが、しかし細胞溶解活性は、膜の表面上での多くのペプチドの凝集の結果であり、そしてこのようなペプチドと共に細胞膜の障害を引き起こすと考えられる。したがって、上述のように、本発明では、例えば、混合物としてまたは各ペプチドに共有結合したリンカー分子の使用により、複合した（または束になった）複数のペプチドを使用することもまた企図される。個々のペプチドは、典型的には少なくとも６個、好ましくは１０個またはそれ以上のアミノ酸残基からなる。本発明の複合体では、各個別のペプチドは、典型的には５個以上のアミノ酸残基の長さを有する。本発明はまた、活性物質として本発明の非溶血性細胞溶解性ペプチド、および薬剤学的に許容しうる担体を含む薬剤組成物を提供する。本組成物は、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌、ウイルス、真菌、マイコプラズマ、および寄生原生動物（例えば、リーシュマニア症を引き起こすリーシュマニア（Leishmania）およびマラリアを引き起こすマラリア原虫（Plasmodium））のような異なる病原性生物により引き起こされる疾患または障害の治療に使用される。好ましい実施態様において、抗病原性組成物は、抗微生物性、特に抗菌性組成物である。加えて、本発明の組成物は、悪性細胞に対して有用であり、癌の治療に使用することができる。また、該溶血性非細胞溶解性ペプチドを、必要とする対象に投与することを含む治療方法が、本発明により提供される。本発明の方法および上記組成物は、ヒトと獣医学の両方に適用可能である。さらに、ヒトまたはヒト以外の動物における疾患または障害の治療のための薬剤組成物、特に抗菌性組成物の調製における、該非溶血性細胞溶解性ペプチドの使用も、本発明により提供される。さらに別の実施態様において、本発明の選択的ペプチドは、微生物の駆除用の殺菌剤として、すなわち、コンタクトレンズの湿潤用の溶液中で使用することができ、例えば、化粧品または食品業界において保存料として、および農業において農薬（例えば、殺真菌剤、殺菌剤）として、または農業産物（例えば、果実および豆）の保存のために使用してもよい。図面の簡単な説明図１は、アミノエチルアミノパーダキシン（ＴＡｐａｒ）由来ペプチドの円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを示す。スペクトルは、４０％０×１０^-5Ｍのペプチド濃度でとった。記号：ＴＡｐａｒ（）；［Ｄ］Ｐ⁷ −ＴＡｐａｒ（・・・）；ｐａｒ（・−・−）；図２は、ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）に対するＴＡｐａｒ由来ペプチドの溶血活性の用量作用曲線を図示している。この挿入図は、低濃度での測定結果を示す。記号：黒四角、メリチン；黒三角、ＴＡｐａｒ；黒丸、［Ｄ］Ｐ⁷−ＴＡｐａｒ；白丸、［Ｄ］Ｌ¹⁸Ｌ¹⁹−ＴＡｐａｒ；白四角、［Ｄ］Ｐ⁷Ｌ¹⁸Ｌ¹⁹−ＴＡｐａｒ；白三角、ダーマセプチン。図３Ａ〜Ｂは、ＴＡｐａｒ由来ペプチドにより誘導された、小胞の拡散ポテンシャルの最大消失を示す。ペプチドは、蛍光染料のｄｉＳ−Ｃ₂−５およびバリノマイシンで前もって平衡化した、卵ホスファチジルコリン／ホスファチジルセリン（ＰＣ／ＰＳ）（図３Ａ）またはＰＣ（図３Ｂ）よりなる単層小胞（smallu nilamellar vesicles）（ＳＵＶ）を含有する等張性Ｋ⁺不含緩衝液に加えた。蛍光回収は、ペプチドを小胞と混合して１０〜２０分後に測定した。記号：黒三角、ＴＡｐａｒ；黒丸、［Ｄ］Ｐ⁷−ＴＡｐａｒ；白丸、［Ｄ］Ｌ¹⁸Ｌ¹⁹−ＴＡｐａｒ；白四角、［Ｄ］Ｐ⁷Ｌ¹⁸Ｌ¹⁹−ＴＡｐａｒ；図４Ａ〜Ｃは、未処理（図４Ａ）、または最小阻止濃度（ＭＩＣ）より低濃度（４Ｂ）またはＭＩＣ濃度（４Ｃ）の［Ｄ］Ｐ⁷Ｌ¹⁸Ｌ¹⁹−ＴＡｐａｒで処理して、ネガティブ染色した大腸菌（E．coli）細胞の電子顕微鏡写真を示す；図５は、メリチンとメリチン由来ジアステレオマーのＣＤスペクトルを示す。スペクトルは、４０％ＴＦＥ／水中の０．８〜２．０×１０^-5Ｍのペプチド濃度−メリチン、（・・・・）；［Ｄ］−Ｖ^5,8，Ｉ¹⁷，Ｋ²¹−メリチン−ＣＯＯＨ、（−−−−）。図６は、ｈＲＢＣに対するメリチン由来ジアステレオマーの溶血活性の用量作用曲線を図示している。記号：黒丸、メリチン；白丸、［Ｄ］−Ｖ^5,8，Ｉ¹⁷，Ｋ²¹−メリチン−ＣＯＯＨ；黒三角、［Ｄ］−Ｖ^5,8，Ｉ¹⁷，Ｋ²¹−メリチン。図７Ａ〜Ｃは、未処理（図７Ａ）、またはＭＩＣより低濃度（７Ｂ）またはＭＩＣ濃度（７Ｃ）の［Ｄ］−Ｖ^5,8，Ｉ¹⁷，Ｋ²¹−メリチンで処理して、ネガティブ染色した大腸菌（E．coli）の電子顕微鏡写真を示す。図８Ａ〜Ｂは、メリチンとメリチン由来ジアステレオマーにより誘導された、小胞の拡散ポテンシャルの最大消失を示す。ペプチドは、蛍光染料のｄｉＳ−Ｃ₂ −５およびバリノマイシンで前もって平衡化した、ＰＣ（８Ａ）またはＰＣ／ＰＳ（８Ｂ）よりなるＳＵＶを含有する等張性Ｋ⁺不含緩衝液に加えた。蛍光回収は、ペプチドを小胞と混合して１０〜２０分後に測定した。記号：黒丸、メリチン；黒三角、［Ｄ］−Ｖ^5,8，Ｉ¹⁷，Ｋ²¹−メリチン。図９Ａ〜Ｂは、励起波長を２８０nmに、発光波長を３４０nmに設定した、ＰＣ／ＰＳ小胞（黒三角）またはＰＣ小胞（白三角）での滴定による［Ｄ］−Ｖ^5,8 ，Ｉ¹⁷，Ｋ²¹−メリチン（全濃度０．５μＭ）の蛍光の増大を示す。実験は、５０mM Ｎａ₂ＳＯ₄、２５mM ＨＥＰＥＳ−ＳＯ₄ ^-2（ｐＨ６．８）中で２５℃で実施した（図９Ａ）；そして結合等温線は、図９ＡからＣ_f（溶液中の遊離ペプチドの平衡濃度）に対するＸ_b ^*（６０％の脂質当たりの結合ペプチドのモル比）をプロットすることにより誘導した（図９Ｂ）。図１０Ａ〜Ｂは、臭素化リン脂質による環境感受性トリプトファンのクエンチングを示す。メリチン（図１０Ａ）および［Ｄ］−Ｖ^5,8，Ｉ¹⁷，Ｋ²¹−メリチン（１０Ｂ）は、ＰＣ／ＰＳ（１：１、ｗ／ｗ）ＳＵＶを含有する緩衝液に加えた。ＳＵＶは、２５％の６，７Ｂｒ−ＰＣ（−・−・−）、または９，１０Ｂｒ −ＰＣ（−−−−）、または１１，１２Ｂｒ−ＰＣ（・・・・）を含有した。２分間インキュベーション後、トリプトファンの発光スペクトルを、２８０nmで励起を設定した分光蛍光計を用いて記録した。比較のため、Ｂｒ−ＰＣを含図１１は、ＲＰ−ＨＰＬＣ保持時間に及ぼすＬｅｕ／Ｌｙｓジアステレオマーの疎水性の作用を示す。図１２は、ｈＲＢＣに対するＬｅｕ／Ｌｙｓジアステレオマーの溶血活性の用量作用曲線を示す。挿入図は、低濃度での測定結果を示す。記号：白四角、メリチン；黒四角、［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₃Ｌ₉；黒丸、［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₄ Ｌ₈；白三角、［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₅Ｌ₇；黒三角［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₇Ｌ₅ 。図１３Ａ〜Ｂは、Ｌｅｕ／Ｌｙｓジアステレオマーにより誘導された、小胞の拡散ポテンシャルの最大消失を示す。ペプチドは、蛍光染料のｄｉＳ−Ｃ₂−５およびバリノマイシンで前もって平衡化した、ＰＣ（図１３Ａ）またはＰＥ／ＰＧ（１３Ｂ）よりなるＳＵＶを含有する等張性Ｋ⁺不含緩衝液に加えた。蛍光回収は、ペプチドを小胞と混合して３〜１０分後に測定した。記号：黒四角、［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₃Ｌ₉；黒丸、［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₄Ｌ₈；黒三角、［Ｄ］ −Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₅Ｌ₇；十字入り丸、［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₇Ｌ₅。図１４Ａ〜Ｈは、未処理、およびＭＩＣの８０％の種々のＬｅｕ／Ｌｙｓジアステレオマーで処理して、ネガティブ染色した大腸菌（E．coli）の電子顕微鏡写真を示す。図１４Ａ、対照；図１４Ｂ、［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₃Ｌ₉で処理した大腸菌；図１４Ｃ、［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₄Ｌ₈で処理した大腸菌；図１４Ｄ、［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₅Ｌ₇で処理した大腸菌；図１４Ｅ、［Ｄ］−Ｌ^3,4,8, ¹⁰ −Ｋ₇Ｌ₅で処理した大腸菌；図１４Ｆ、対照；図１４Ｇ、［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10 −Ｋ₄Ｌ₈で処理した大腸菌；図１４Ｈ、［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₅Ｌ₇で処理した大腸菌。発明の詳細な説明異種Ｌベースのペプチドは、非病原性細胞（すなわち、赤血球）にはほとんどまたは全く作用せずに、病原性細胞（例えば、細菌）を選択的に破壊することにより表される、選択的細胞溶解活性を有することが、本発明者により見い出された。この知見は、細胞（細菌のような病原性細胞であろうと正常哺乳動物細胞であろうと）中の細胞溶解性ペプチドの細胞溶解活性は、αらせん立体配置に関連した単一の基礎となる機構から生じるという当該分野において優勢な説から考えて、非常に驚くべきことである。細胞選択性の基となる分子機構を理解するために行なったパーダキシンとメリチン（２つの既知の非細胞選択的細胞溶解素）のＤ−アミノ酸を組み込んだ類似体（ジアステレオマー）による機能的および構造的研究から、生じたジアステレオマーは、αらせん構造を保持せず、このため、哺乳動物細胞に及ぼす細胞溶解作用を失ったことが判った。しかしこのジアステレオマーは、高い抗菌活性を保持しており、これは、グラム陽性およびグラム陰性細菌の両方の完全な細胞溶解により明示された。すなわち、パーダキシンとメリチンのαらせん構造は、哺乳動物細胞に対する細胞毒性には重要であるが、抗菌活性には必要条件ではないことが判った。しかし別の研究において、単一のＤ−アミノ酸を非溶血性抗菌性ペプチドのマゲイニンに組み込んだところ、ほぼ全体としてその抗菌活性は失われた（チェン（Chen）ら、１９８８）。本発明においてパーダキシンおよびメリチンのジアステレオマーで得られた結果では、疎水性および正味の正電荷が、非選択的細胞溶解性ペプチドに選択的抗菌活性を与え、両親媒性αらせん構造は必要ではないことが示唆される。しかしパーダキシンとメリチンのジアステレオマーは、Ｌ−アミノ酸の長いストレッチ（１４〜１７ａａ長）を含んでおり、このことにより、残った低いらせん性でも膜結合と不安定化には充分である可能性が生じる。線状細胞毒性ペプチドの疎水性と正味の正電荷の調節が、選択的抗菌活性を与えるのに充分であるかどうかを調査するために、我々は、種々の比のロイシンとリジンからなり、かつその配列の３分の１がＤ−アミノ酸からなる、短いモデルペプチド（１２ａａ長）のジアステレオマーを検討することにした。ペプチド長とＤ−アミノ酸の位置は、αらせん構造を形成することができない１〜３個のＬ−アミノ酸の非常に短い連続ストレッチを有する短いペプチドが作成されるようにした。このジアステレオマーは、（１）細菌およびヒト赤血球に対するその細胞毒性、（２）その構造、および（３）細菌の細胞壁の形態およびモデルのリン脂質膜と相互作用して動揺させるその能力に関して評価した。データは、疎水性と正電荷の調節が、抗菌活性と細胞溶解選択性を与えるのに充分であることを示している。さらには、生じた抗菌性ペプチドは、非致死濃度でテトラサイクリンのような利用可能な抗菌性薬剤と相乗的に作用し、そして、未変性抗菌性ペプチドの活性を劇的に低下させるヒト血清の不活化に対して全く抵抗性である。さらに短いジアステレオマー（６ａａおよび８ａａ長）を調製して試験し、非溶血性で細胞溶解性であることが判った。ある種の細胞溶解性非らせんペプチドが、抗病原活性を有するという知見は、このような非らせんポリペプチドを含む抗病原性薬剤の調製への道を開く。非らせんペプチドが、Ｌ−アミノ酸とＤ−アミノ酸の両方からなる異種ペプチドである場合、抗病原性薬剤は、一方で分解（例えば、プロテアーゼによる）に対して同種Ｌ−ペプチドよりも抵抗性が大きく、そして他方で全同種Ｄ−ペプチドのように完全に分解抵抗性ではないというさらなる利点を有する。分解に対する抵抗性は、毒性副作用を伴う可能性のある身体からの緩慢なクリアランスという点からは不都合であるかもしれない。非αらせん抗病原性ペプチドは、種々の治療法に使用することができる。同種Ｄ−ペプチドは、対応する同種Ｌ−ペプチドと本質的に同一の細胞溶解活性を有することが知られているため（ベッサレ（Bessalle）ら、１９９０）、異種Ｄベースのペプチドが、異種Ｌベースのペプチドと同じ抗病原性を有することは明らかである。ある種の非αらせんペプチドが、赤血球に対する細胞溶解活性なしに細菌に対する細胞溶解活性を有するという知見は、その細胞膜の組成において細菌細胞が赤血球とは異なるという事実の結果である。細胞膜の組成の相違はまた、種々の病原性細胞（癌細胞など）と正常細胞の間にも見い出すことができる。すなわち、この知見に基づき、本発明の物質は、非病原性の正常体細胞に対してほとんどまたは全く活性がなく、体内の１つの分類の細胞（例えば、細菌細胞、寄生体の細胞、真菌細胞、原生動物細胞、または癌細胞）に対する選択的細胞溶解活性を有する種々の薬剤の開発への道を開く。病原性細胞に対して選択的細胞溶解活性を有するが、正常非病原性細胞に対してははるかに低い細胞溶解活性を有するか、または全く細胞溶解活性を持たない本発明の非溶血性細胞溶解性ペプチドは、全くまたはほとんど毒性副作用なしに、種々の治療応用に使用することができる。１つの群の本発明のペプチドは、広範な細胞溶解活性を有するαらせん構造の同種ペプチドから誘導された、非αらせん異種ペプチドから誘導される。したがって本発明は、１つの実施態様により、ある配列を有するＤ−およびＬ−アミノ酸残基の両方を含む異種ペプチド環状誘導体を提供するが、ここで、Ｌ−アミノ酸残基のみまたはＤ−アミノ酸残基のみを含み、該異種ペプチドと同じアミノ酸配列を有する同種非環化ペプチドは、αらせん立体配置を有し、かつ種々の細胞で表される広域スペクトル細胞溶解活性を有するものである；該異種環状ペプチドは、該同種ペプチドが細胞溶解活性である細胞の内の少数のみに細胞溶解活性を有する。例えば、異種環状ペプチドの細胞溶解活性は、病原性細胞のみで表され、一方赤血球のような正常細胞に対する細胞溶解活性は持たない。本発明の非溶血性細胞溶解性環状ペプチドの例は、αらせん構造を含みかつ細胞溶解活性を有する天然ペプチドから誘導されるペプチドである。本発明の非らせんペプチドは、Ｄ−アミノ酸が、分子のＮ−およびＣ−らせんに沿って組み込まれ、かつ正味の正電荷が、正に荷電したアミノ酸残基（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）（例えば、Ｎ末端で）、および／または正に荷電した基（例えば、アミノエチルアミノのようなアミノアルキルアミノ基）（例えば、分子のＣ末端で）の付加によるか、または遊離カルボキシル基の中和（例えば、これらをアミド基に変換することによる）により達成される、天然ペプチドの全配列または部分配列に本質的に対応する配列を有する。このような天然ペプチドの例は、メリチンとパーダキシン、およびその断片である。例えば、非αらせん環状ペプチドは、３３量体ペプチドであるパーダキシンから、または２６量体ペプチドであるメリチンから誘導することができ、非αらせん環状ペプチドは、それぞれ、パーダキシンまたはメリチンの全配列に対応する配列を含む、３３量体または２６量体ペプチドであってもよく、あるいはパーダキシンまたはメリチンの部分配列（例えば、８〜２３量体メリチン配列）に対応する配列を有する非らせん環状ペプチドであってもよい。パーダキシンから誘導される異種環状ペプチドの場合に、本発明の異種環状ペプチドは、わずか１０アミノ酸残基および１０〜２４の間のアミノ酸残基を含むパーダキシンの部分配列に対応する部分配列を含んでもよい。別の群の本発明のペプチドは、天然相同体を持たない配列を有し、少なくとも１つの疎水性アミノ酸および少なくとも１つの正に荷電したアミノ酸よりなり、そして配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基がＤ−アミノ酸である、非らせんペプチドである。抗菌性ペプチドの構造−機能研究を解明するために使用されるモデルペプチドによる以前の研究では、３つのパラメーターに焦点を当てた；らせん構造、疎水性および電荷（アンザイ（Anzai）ら、１９９１；アガワ（Agawa）ら、１９９１）。これらのパラメーターの１つの各変化は、同時に他の２つの変化を引き起こすため、全体の抗菌活性に対する各パラメーター単独の寄与を明らかにすることが困難になった。本発明では、らせん構造の影響を除外したため、ロイシンとリジンの比を変えることにより２つのパラメーターだけ、すなわち、疎水性と正味の正電荷の検討が可能になった。この目的のため、わずか１〜３個の連続Ｌ− アミノ酸のストレッチ（短すぎてαらせん構造を形成できない）を含有する短いモデルペプチド（１２ａａ長）のジアステレオマーを検討のために選択した。ＣＤ分光学により、低度のα構造を保持している本発明のメリチンとパーダキシンのジアステレオマーとは異なり、これらのＬｅｕ／Ｌｙｓジアステレオマーはαらせん構造が全く欠けていることが判った（データは示していない）。それにもかかわらず、Ｌｅｕ／Ｌｙｓジアステレオマーは、未変性の抗菌性ペプチド（例えば、ダーマセプチンＳ）、または抗生物質のテトラサイクリンと同様か、またはそれより大きい強力な抗菌活性を示す。さらに、最も強力なペプチドの［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ４Ｌ８および［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ５Ｌ７（本発明の例３の、それぞれ、ペプチド２３および２４）は、非常に細胞溶解に感受性のヒト赤血球に対して溶血活性がなかった。［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ３Ｌ９（ペプチド２２）はαらせん構造を欠いているが、未変性細胞溶解性ペプチドのパーダキシンに迫る相当な溶血活性を有することに注意されたい。これは、疎水性と正電荷の間の均衡が、両親媒性αらせん構造を埋め合わせることを示すものであろう。しかし正電荷の増大が、溶血活性を激烈に低下させ、一方抗菌活性は保存されるということは、両親媒性αらせん構造が、抗菌活性には必要でないことを証明している。負に荷電したリン脂質膜および双性イオン性リン脂質膜の両方とのＬｅｕ／Ｌｙｓジアステレオマーの相互作用を検討して、細菌に対するその選択的細胞毒性の根拠を解明しようとした。負に荷電したＰＥ／ＰＧ小胞を使用して、大腸菌（ E．coli）の脂質組成を模倣し（ショー（Shaw）、１９７４）、双性イオン性ＰＣ小胞でヒト赤血球の外側リーフレットを模倣した（バークレイジ（Verkleij）ら、１９７３）。赤血球（図１２）および大腸菌（E．coli）（表５）に及ぼすＬｅｕ／Ｌｙｓペプチドの生物学的活性は、モデル膜を透過するその能力とよく相関する。ＰＣ小胞を透過した唯一のペプチドが、顕著な溶血活性を有する唯一のペプチドであった。これらの結果は、細菌の膜のリン脂質組成が、このファミリーの抗菌性ペプチドによる透過においてある役割を果たすことを示唆している。負に荷電しているが双性イオン性ではないリン脂質小胞に結合して透過する、抗菌性で非溶血性ペプチドの能力は、未変性抗菌性ペプチドの特徴であり（ガジット（Gazit）ら、１９９４）、そしてこの能力は、細菌表面が、リポ多糖類（グラム陰性細菌のＬＰＳ）および多糖類（グラム陽性細菌のテイコ酸）を含み、そしてその内膜が、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）を含んでいる（これら全ては、負に荷電している）が、一方、赤血球のような正常真核生物細胞は、その外側リーフレット上に双性イオン性リン脂質ＰＣを主に発現するという事実に帰される。抗菌性ペプチドのマゲイニンは、非溶血性ペプチドであるが、一方メリチン、パーダキシン、および［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ４Ｌ８の配列と類似しているが専らＬ−アミノ酸からなる配列のモデルペプチドは、主としてこれらの高い疎水性により、溶血性である。マゲイニンのαらせん構造が、３つのＤ−アミノ酸の導入により中断されると、生じるジアステレオマーは、その正味の正電荷が未変性マゲイニンの電荷と同様であっても、抗菌活性はなかった（チェン（Chen）ら、１９８８）。したがって、未変性マゲイニンのαらせん構造、疎水性および正味の正電荷の間に既に存在する最適な均衡が、選択的抗菌活性を可能にしており、そしてこれらの性質の１つのどのような変化によっても、マゲイニンの抗菌活性は喪失してしまうのであろう。これとは対照的に、疎水性は、メリチン、パーダキシンおよび本発明のＬｅｕ／Ｌｙｓジアステレオマーにおけるαらせんの消失を埋め合わせるのに主要な役割を果たすと考えられる。本発明の結果は、短く単純で容易に操作される抗菌性ペプチドのレパートリーの設計のための新規な方策を示唆している。ジアステレオマーモデルのＬｅｕ／Ｌｙｓペプチドのそれぞれは、独特のスペクトルの活性を有する（表５）。ジアステレオマー抗菌性ペプチドのレパートリーの存在により、標的細胞にとって最も有効なペプチドを選択することができる。さらに、別々にまたは一斉に作用する、多様な形態のジアステレオマーペプチドの同時投与もまた、選択的生存価を有し、そしてより広い範囲の感染性微生物に対する良好な遮蔽物を提供する。全てのＬｅｕ／Ｌｙｓジアステレオマーは、グラム陰性細菌に比較してグラム陽性細菌に対する抗菌活性の上昇を示した。従来の抗生物質に対する黄色ブドウ状球菌（Staphylococcus aureus）、腸球菌（enterococci ）、および肺炎双球菌（pneumococci）のようなグラム陽性細菌の耐性の上昇を考えるとき、これらの結果は重要である（ラッセル（Russel）ら、１９９５）。加えて、未変性抗菌性ペプチドのダーマセプチンＳとは異なり、［Ｄ］−Ｌ^3,4, ^8,10 −Ｋ５Ｌ７（ペプチド２４）は、プールされたヒト血清の存在下でその抗菌活性を保持していた。ジアステレオマーペプチドは、既知の抗菌性ペプチドにまさる幾つかの利点を有するであろう：（１）このペプチドには、αらせん分解性の細胞溶解素により誘導される多様な病理学的および薬理学的作用がないであろう。例えば、ブドウ球菌のδ毒素、抗菌性ペプチドのアラメチシン（alamethicin）、コブラの直接分解性因子（direct lytic factor）およびパーダキシンは、孔形成およびアラキドン酸カスケードの活性化により、種々の細胞に幾つかの組織病理学的作用を及ぼす。しかし、パーダキシンのジアステレオマーは、これらの活性を発揮しない。加えて、多くの両親媒性αらせんペプチドは、カルモジュリンに結合して幾つかの細胞応答を導き出し、そしてメリチンを含め全Ｄ−アミノ酸のαらせんは同様な活性を有する（フィッシャー（Fisher）ら、１９９４）。中断したαらせん構造を有するジアステレオマーは、カルモジュリンに結合すると予想されない；（２）局所のＤ−アミノ酸置換により、完全なＤ−アミノ酸置換により獲得される全体的保護とは反対に、タンパク分解性酵素による抗菌性ペプチドの制御されたクリアランスが起こる（ウェード（Wade）ら、１９９０）。分解に対する細胞溶解性ペプチドの全体的抵抗は、治療用途にとって不都合である。さらに、Ｄ，Ｌ−アミノ酸を含有する短い断片の抗原性は、その全体がＬまたはＤ−アミノ酸の親分子に比較して、劇的に変化する（ベンキラン（ Benkirane）ら、１９９３）；（３）ジアステレオマーにより誘導される細菌増殖の全体的阻害は、電子顕微鏡検査（図１４）により示されるように、細菌の細胞壁の全体的溶解を伴う。したがって、細菌は、このような破壊機構を引き起こす薬剤に対する耐性を容易にはつくり出せない；（４）［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ５Ｌ７（ペプチド２４）は、電子顕微鏡検査（図１４）により示されるように、そのＭＩＣより低濃度で細菌の細胞壁を動揺させる能力を有する。細菌の細胞壁に浸透する能力がないため活性がない臨床的に使用される抗生物質の、ペプチド２４との同時投与は、細菌のこの抵抗機構に対する解決策を与えるかもしれない。本発明はここで、幾つかの非限定的な図面および例を参照して説明される。実験方法（ｉ）材料。ブチルオキシカルボニル−（アミノ酸）−（フェニルアセトアミド）メチル樹脂は、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）（フォスターシティー、カリホルニア州）から購入し、ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）アミノ酸は、ペニンシュララボラトリーズ（Peninsula Laboratories）（ベルモント、カリホルニア州）から入手した。ペプチド合成のために使用した他の試薬は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、シグマ（Sigma））、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、アルドリッチ（Aldrich）、ニンヒドリンで蒸留）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、フルカ（Fluka））、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、ピアース（Pierce））およびジメチルホルムアミド（ペプチド合成等級、バイオラブ（Biolab））を含むものであった。卵ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびウシ脊髄からのホスファチジルセリン（ＰＳ）（ナトリウム塩−Ｉ等級）は、リピッドプロダクツ（Lipid Products）（サウスナットフィールド（South Nutfield）、英国）から購入した。卵ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）（Ｖ型、大腸菌（Eschrichia coli）から）は、シグマ（Sigma）から購入した。コレステロール（純度特級）は、メルク（Merck）（ダームシュタット（Damstad t）、ドイツ）から供給され、エタノールから２回再結晶した。３，３’−ジエチルチオジカルボシアニンヨウ化物［ｄｉＳ−Ｃ₂−５］は、モレキュラープローブス（Molecular Probes）（ユージーン、オレゴン州）から入手した。未変性メリチンはシグマ（Sigma）から購入した。市販のメリチンは、通常痕跡量のホスホリパーゼＡ₂を含み、これが、リン脂質の急速な加水分解を引き起こす。したがって、特に注意を払って、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用してメリチンから全てのホスホリパーゼＡ₂を除去した。他の全ての試薬は分析用等級のものとした。緩衝液は、二回ガラス蒸留水で調製した。（ii）ペプチド合成および精製。ペプチドは、ブチルオキシカルボニル−（アミノ酸）−（フェニルアセトアミド）メチル樹脂（０．０５ｍ当量）で固相法により合成した（メリフィールド（Merrifield）ら、１９８２）。樹脂結合ペプチドは、フッ化水素（ＨＦ）により樹脂から切断し、ＨＦ留去後に無水エーテルで抽出した。これらの粗ペプチド調製物は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより示されるように、１つの主要ピークを含んでいたが、これは、５０〜７０重量％純粋なペプチドであった。合成したペプチドは、Ｃ₁₈逆相バイオラッド（Bio-Rad）準分取用カラム（孔サイズ３００Å）でＲＰ−ＨＰＬＣによりさらに精製した。１．８ml／分の流速で、両者とも０．０５％のＴＦＡ（ｖ／ｖ）を含有する水中の１０〜６０％アセトニトリルの線形勾配を使用して、カラムを４０分で溶出した。分析用ＨＰＬＣにより均質（〜９５％）であることが示された精製ペプチドは、アミノ酸分析に付し、そして質量分析法に付してこれらの配列を確認した。（iii）ペプチドのアミノ基転移。上記（ii）のように樹脂結合したペプチドは、ＤＭＦ中の３０％エチレンジアミンにより３日間でアミノ基転移させて、次に樹脂を濾過し、保護ペプチド（すなわち、アミノエチルアミノ（ＴＡ）ペプチド）をエーテルで沈殿させ、ＨＦで保護基を脱離した。合成ＴＡペプチドは、０．１％ＴＦＡ中の２５〜８０％アセトニトリルの線形勾配を使用して、４０分でＣ₁₈カラムの逆相ＨＰＬＣにより精製し（均質性＞９５％）、次にアミノ酸分析に付してその組成を確認した。（iv）ペプチドのアミド化。樹脂結合ペプチド（２０mg）は、メタノール中の飽和アンモニウム溶液（３０％）とＤＭＳＯ（１：１、ｖ／ｖ）の１：１、ｖ／ｖよりなる混合物で３日間処理することにより、［Ｄ］−Ｖ^5,8，Ｉ¹⁷，Ｋ²¹− メリチンのＣ末端に位置するグルタミン残基のカルボン酸基のアミド化を行った。すなわち、全ての保護基が結合したままであるが、そのＣ末端残基が１つのアミド基により修飾されたペプチドが得られた。メタノールとアンモニアは、窒素流下で留去し、そして保護ペプチドは、ＤＭＳＯで樹脂から抽出し、無水エーテルで沈殿させた。次に生成物をＨＦ切断に付し、上述のようにＲＰ−ＨＰＬＣを使用してさらに精製に付した。（ｖ）脂質小胞の調製。ＰＣ／コレステロール（１０：１、ｗ／ｗ）またはＰＣ／ＰＳ（１：１、ｗ／ｗ）分散液の音波破砕により、単層小胞（ＳＵＶ）を調製した。簡単に述べると、乾燥脂質とコレステロール（１０：１、ｗ／ｗ）をＣＨＣｌ₃／ＭｅＯＨ混合物（２：１、ｗ／ｗ）に溶解した。次に溶媒を窒素流下で留去し、脂質（７．２mg/mlの濃度）を１時間真空にして、次に渦流を起こして適切な緩衝液に再懸濁した。次に生じた脂質分散液を、清澄になるまで浴型音波破砕機（Ｇ１１２５ＳＰ１音波破砕機、ラボラトリーサプライズカンパニー社（Laboratory Supplies Company Inc.）、ニューヨーク州）で５〜１５分間音波破砕した。生じた調製物の脂質濃度は、リン分析により測定した（バートレット（Bartlett）、１９５９）。小胞は、以下のようにＪＥＯＬＪＥＭ１００Ｂ電子顕微鏡（ジャパンエレクトロンオプティクスラボラトリー社（JapanElectron Optics Laboratory Co.）、東京、日本）を使用して視覚化した。一滴の小胞を、炭素コーティングした格子に沈積させ、酢酸ウラニルでネガティブ染色した。この格子の検討により、小胞が２０〜５０nmの平均直径を有する単層であることが証明された（パパハドジョポウロス（Papahadjop oulos）とミラー（Miller）、１９６７）。（vi）血清の調製。５名の志願者から採血し、室温で４時間凝固させた。次に血液を１５００ｇで１５分間遠心分離し、血清を取り出してプールした。５６℃ で３０分間加熱することにより血清補体を不活化した。（vii）ＣＤ分光学。ペプチドのＣＤスペクトルは、（＋）−１０−ショウノウスルホン酸で装置を較正後、ジャスコ（Jasco）Ｊ−５００Ａ分光偏光計で測定した。スペクトルは、０．５mmの経路長の蓋付き石英光学セルで２３℃で走査した。スペクトルは、２５０〜１９０ｎｍの波長で得られた。各ペプチドについて２０nm/分の走査速度で８回の走査を行った。ペプチドは、４０％トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）（αらせん構造を強力に促進する溶媒）中の１．５×１０^-5〜２．０×１０^-5Ｍの濃度で走査した。らせん率（グリーンフィールド（Gr eenfield）とファスマン（Fasman）、１９６９；ウー（Wu）ら、１９８１）は、以下：［ここで、［θ］₂₂₂は、２２２nmでの実験的に観察された平均残基楕円率であり、そして［θ］⁰ ₂₂₂と［θ］¹⁰⁰ ₂₂₂の値（２２２nmでの０％および１００％らせん含量に対応する）は、それぞれ、２０００および３２０００度・cm²/dmolと見積もった］のように計算した（ウー（Wu）ら、１９８１）。（viii）ペプチドの抗菌活性。ジアステレオマーの抗菌活性は、以下のように１００μＬの最終容量で滅菌９６ウェルプレート（ヌンク（Nun c）Ｆ９６マイクロタイタープレート）中で検討した：１０⁶コロニー形成単位（ＣＦＵ）／mlＬＢ（ローリア（Lauria）ブロス）培地の濃度で細菌を含有する懸濁液のアリコート（５０μｌ）を、２倍連続希釈でペプチドを含有する、５０μ Ｌの水またはＰＢＳ中の６６％正常ヒトプール血清に加えた。増殖阻害は、マイクロプレート（Microplate）自動リーダーＥ１３０９（バイオテックインストラメンツ（Bio-tek Instruments））で４９２nmの吸光度を測定することにより求め、次に１８〜２０時間３７℃でインキュベートした。抗菌活性は、最小阻止濃度（ＭＩＣ）（１８〜２０時間のインキュベーション後に１００％増殖の阻害が観察された濃度）として表される。使用した細菌は、大腸菌（Escherichia coli ）Ｄ２１、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３、アシネトバクターカルコアセティクス（Acinetobacter calcoaceticus）Ａｃ１１、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）ＬＴ２、巨大菌（Bacillus megaterium）Ｂｍ１１、ミクロコッカスルテウス（Micrococcus luteus）ＡＴＣＣ９３４１、枯草菌（Bacillus subtilis）ＡＴＣＣ６０５１であった。（ix）ヒト赤血球の溶血。ペプチドは、ヒト赤血球（ｈＲＢＣ）に対するその溶血活性について試験した。ＥＤＴＡを加えた新鮮ｈＲＢＣは、８００ｇで１０分間の遠心分離によりＰＢＳ（３５mMリン酸緩衝液／０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．３）で３回濯ぎ、ＰＢＳに再懸濁した。次にＰＢＳに溶解したペプチドは、５０μＬのＰＢＳ中のストックｈＲＢＣの溶液に加えて、１００μＬの最終容量とした（最終赤血球濃度、５％、ｖ／ｖ）。生じた懸濁液を３７℃で３０分間撹拌下でインキュベートした。次に試料を８００ｇで１０分間遠心分離した。ヘモグロビンの放出は、５４０nmで上清の吸光度を測定することによりモニターした。ゼロ溶血（ブランク）および１００％溶血の対照は、それぞれ、ＰＢＳおよびトリトン１％に懸濁したｈＲＢＣとした。（ｘ）電子顕微鏡による細菌に及ぼすペプチドの作用の視覚化。ＬＢ培地中に大腸菌（E．coli）（１０⁶ＣＦＵ/ml）を含有する試料を、ＭＩＣ、およびＭＩＣ未満の１つの希釈の種々のペプチドと共に１６時間インキュベートし、次に３０００ｇで１０分間遠心分離した。ペレットを再懸濁して、細菌を含有する１滴を、炭素コーティングした格子に沈積させ、次に２％リンタングステン酸（ＰＴＡ）（ｐＨ６．８）でネガティブ染色した。格子はＪＥＯＬＪＥＭ１００Ｂ電子顕微鏡を使用して検査した。（xi）ペプチドにより誘導される膜透過。膜透過は、以前に報告された（シャイ（Shai）ら、１９９１）ように、拡散ポテンシャル測定法（ロエ（Loew）ら、１９８３；シムズ（Sims）ら、１９７４）を利用して評価した。典型的な実験において、ガラス管で、Ｋ⁺含有緩衝液（５０mM Ｋ₂ＳＯ₄、２５mM ＨＥＰＥＳ −ＳＯ₄ ^-2、ｐＨ６．８）中の４μｌのリポソーム懸濁液（３３μＭの最終リン脂質濃度）を、１mlの等張性Ｋ⁺不含緩衝液（５０mM Ｎａ₂ＳＯ₄、２５mM ＨＥＰＥＳ−ＳＯ₄ ^-2、ｐＨ６．８）に希釈し、次に蛍光性ポテンシャル感受性染料のｄｉＳ−Ｃ₂−５を加えた。バリノマイシン（１μｌの１０^-7Ｍ）を懸濁液に加えて、小胞内の負の拡散ポテンシャルを徐々に引き起こすようにし、これが染料の蛍光のクエンチングをもたらした。一旦蛍光が安定化したら（３〜１０分間かかった）、ペプチドを加えた。蛍光の上昇により反映される、ひき続いて起こる拡散ポテンシャルの消失は、励起を６２０nmに、発光を６７０nmに設定したパーキンエルマー（Perkin Elmer）ＬＳ−５０Ｂ分光蛍光計でモニターして、利得を１００％に調整した。蛍光回収の百分率Ｆ_tは、以下：Ｆ_t＝（Ｉ_t−Ｉ_o／Ｉ_f−Ｉ_o）×１００（ここで、Ｉ_o＝初期蛍光、Ｉ_f＝バリノマイシンの添加前に観察された全蛍光、そしてＩ_t＝時間ｔでペプチド添加後に観察された蛍光）のように定義された。（xii）小胞へのペプチドの結合。双性イオン性（ＰＣ）または負に荷電したリン脂質（ＰＣ／ＰＳ）からなる小胞との［Ｄ］−Ｖ^5,8，Ｉ¹⁷，Ｋ²¹−メリチンの相互作用は、ＳＵＶ滴定実験でペプチドの内部トリプトファンの発光強度の変化を測定することにより性状解析した。簡単に述べると、ＳＵＶを、５０mMＮａ₂ＳＯ₄、２５mM ＨＥＰＥＳ−ＳＯ₄ ^-2（ｐＨ６．８）を含有する緩衝液に溶解した固定量のペプチド（０．５μＭ）に２４℃で加えた。２mlの最終反応容量を含有する１cmの経路長の石英キュベットを全ての実験に使用した。蛍光強度は、５nmスリットを使用して励起を２８０nmに設定し、２．５nmスリットを使用して発光を３４０nmに設定したパーキンエルマー（Perkin-E lmer）ＬＳ−５分光蛍光計で脂質／ペプチドモル比の関数として測定（４回の別の実験）した。結合等温線は、下記式：Ｘ_b＝Ｋ_PＣ_f （ここで、Ｘ_bは、全脂質（Ｃ_L）当たりの結合ペプチド（Ｃ_b）のモル比として定義され、Ｋ_Pは、分配係数に対応し、そしてＣ_fは、溶液中の遊離ペプチドの平衡濃度を表す）を使用して、分配平衡として分析した。実用的な目的のため、ペプチドは当初ＳＵＶの外側リーフレットのみに分配している（６０％）と仮定した。したがって、分配等式は、以下：Ｘ_b ^*＝Ｋ_P ^*Ｃ_f （ここで、Ｘ_b ^*は、全脂質の６０％当たりの結合ペプチドのモル比として定義され、そしてＫ_P ^*は、推定表面分配係数である）となる。遊離ペプチドＣ_fに対するＸ_b ^*のプロットから生じた曲線は、通常の結合等温線として参照される。（xiii）トリプトファンクエンチング実験。周囲環境に感受性のトリプトファンは、膜におけるペプチドの局在を評価するために、以前から臭素化リン脂質（Ｂｒ−ＰＣ）と組合せて使用されてきた（ボーレン（Bolen）とホロウェイ（Hol loway）、１９９０；デクルーン（De Kroon）ら、１９９０）。トリプトファン蛍光のクエンチャーとして使用したＢｒ−ＰＣは、短距離で作用し、膜を激烈には動揺させないため、ペプチドの膜挿入のプロービングに適している。それぞれ１つのトリプトフアン残基を含有するメリチンとそのジアステレオマーは、２０ μｌ（５０μＭ）のＢｒ−ＰＣ／ＰＳ（１：１、ｗ／ｗ）ＳＵＶを含有する２mlの緩衝液（５０mM Ｎａ₂ＳＯ₄、２５mM ＨＥＰＥＳ−ＳＯ₄ ^-2、ｐＨ６．８）に加える（０．５μＭの最終濃度）ことにより、１００：１の脂質／ペプチド比を確立した。室温で２分インキュベーション後、トリプトファンの発光スペクトルは、励起を２８０nm（８nmスリット）に設定したパーキンエルマー（Perk in-Elmer）ＬＳ−５０Ｂ分光蛍光計を使用して記録した。ＰＣ／ＰＳ（１：１、ｗ／ｗ）からなり、２５％の６，７Ｂｒ−ＰＣ、または９，１０Ｂｒ−ＰＣ、または１１，１２Ｂｒ−ＰＣのいずれかを含有するＳＵＶを使用した。各ペプチドに関して３回の別の実験を実施した。対照実験において、Ｂｒ−ＰＣを含まないＰＣ／ＰＳ（１：１、ｗ／ｗ）ＳＵＶを使用した。例１．パーダキシン由来ジアステレオマーの合成および生物学的活性１．１合成。哺乳動物細胞および細菌に対するその細胞毒性におけるポリカチオン性細胞溶解素のαらせん構造の役割を試験するために、実験方法のセクション（ii）および（iii）に記載されるように、一連のパーダキシン由来ペプチドを合成し、そしてその構造、ｈＲＢＣに対する溶血活性、抗菌活性および細菌の形態に及ぼす効果について性状解析した。パーダキシン（ｐａｒ）は、以下の配列：の３３量体ペプチドである。正電荷を導入するためのパーダキシン分子の修飾は、パーダキシンの酸性Ｃ末端を削除するか、またはエチレンジアミン（ＴＡ）とのＣ末端のＧｌｕ残基の両方のカルボキシル基の反応によりパーダキシンまたはその断片の酸性Ｃ末端を正の末端に変換することにより、および／またはＬｙｓのような正に荷電したアミノ酸残基をＮ末端に付加することにより行った［パーダキシンジアステレオマーでは、ＴＡｐａｒまたはパーダキシン断片の７位のＰｒｏ残基をＤ−Ｐｒｏにより置換（本明細書では［Ｄ］Ｐ⁷で示される）することにより、ＴＡｐａｒまたはパーダキシン断片の１８および１９位の２つのＬｅｕ残基をＤ−Ｌｅｕにより置換（本明細書では［Ｄ］Ｌ¹⁸Ｌ¹⁹）することにより、または両方の置換（本明細書では［Ｄ］Ｐ⁷ Ｌ¹⁸Ｌ¹⁹）により、Ｎ−らせんおよび／またはＣ−らせんが改変されている］。Ｄ−アミノ酸は、Ｎ−およびＣ−らせんの中央に導入した。以下のパーダキシン由来ジアステレオマーは、非溶血性であり、選択的細胞溶解活性を示すことが判った（太字および下線の残基はＤ−アミノ酸である）。ペプチドは、以降本明細書では太字の数字により表される。以下のパーダキシン誘導体を合成したが、これらは本明細書に後述の表１に示されるように溶血性であることが判った。１．２ペプチドの二次構造の決定。ペプチド１、８、１２、１４の二次構造は、実験方法、セクション（vii）に記載されたように、４０％ＴＦＥ（αらせん構造を強力に促進する溶媒）、およびＰＢＳ（３５mMリン酸緩衝液／０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中のＣＤスペクトルから評価した。パーダキシン由来ジアステレオマーのＣＤスペクトルを図１に示す（図中、および［１］（−・−・））。予想されるように、４０％ＴＦＥ中での２０８および２２２nmでの最小値により示されるように、多くのＤ−アミノ酸が組み込まれるほどペプチドのαらせん含量の劇的な低下が観察された。８（ＴＡｐａｒ）（５０％αらせん）と１（［Ｄ］Ｐ⁷Ｌ¹⁸Ｌ¹⁹−ＴＡｐａｒ）（４％）の間では９０％を超えるαらせん含量の低下があった。１２（［Ｄ］Ｐ７−ＴＡｐａｒ）と１４（［Ｄ］Ｌ¹⁸Ｌ¹⁹−ＴＡｐａｒ）のαらせん含量は、それぞれ２５％と１５％であった。７位のプロリンは、構造にねじれを導入しないが、ＮＭＲ分光学により明らかにされるようにむしろＮ− らせんの形成に関与していることに注意されたい（ザゴースキー（Zagorski）ら、１９９１）。ＰＢＳでは、パーダキシンは、〜１２％αらせん含量の低い値を与え、一方Ｄ−アミノ酸残基を含む全ての類似体で、特異的な構造に帰すことのできない非常に低いシグナルを与えた（データは示していない）。１．３溶血活性および抗菌活性。次にパーダキシン由来ペプチド１〜１７は、それぞれ、実験方法、セクション（ix）および（xviii）に記載されたように、非常に感受性の高いヒト赤血球に対する溶血活性、および異なる種の細菌の増殖を阻害するその能力について試験した。加えて、細胞毒性ハチ毒のメリチン、抗菌性ペプチドのダーマセプチンＳ、および抗生物質のテトラサイクリンを対照として使用した。図２は、ペプチド１、８、１２、１４の溶血活性の用量作用曲線を示す。ＴＡｐａｒに導入されたＤ−アミノ酸が、その溶血活性を劇的に低下（対応する類似体のαらせん含量の低下分と相関する）させていることが判る。αらせん含量が最も高いペプチド８のＴＡｐａｒは、最も溶血性であり、一方αらせん含量が最も低いペプチド１の［Ｄ］Ｐ⁷Ｌ¹⁸Ｌ¹⁹−ＴＡｐａｒは、試験した最高濃度（５０μＭ）まででは事実上溶血活性が欠けている。ＲＢＣを溶解する能力のないことは、ダーマセプチン（図２を参照のこと）、マゲイニンおよびケクロピンのような多くの天然抗菌性ペプチドの特徴である。表１は、代表的なセットの試験細菌（グラム陰性細菌２種、大腸菌（Escheric hia coli）とアシネトバクターカルコアセティクス（Acinetobactercalcoacetic us）、およびグラム陽性細菌２種、巨大菌（Bacillus megaterium）と枯草菌（B acillus subtilis）を含む）に対するペプチド１〜１７のＭＩＣ（μＭ）、さらに５０μＭペプチドでの溶血％を与える。表２は、幾つかの細菌種に対する、ペプチド１、８、１２、１４、およびメリチン、ダーマセプチンＳおよびテトラサイクリンのＭＩＣ（μＭ）を与える。データにより、ジアステレオマー類似体１〜７のαらせん含量と溶血活性の劇的低下にもかかわらず、これらは全て、親ペプチドのパーダキシンの強力な抗菌活性をほぼ保持しており、この活性は、既知の未変性抗菌性ペプチドに匹敵することが明らかになった。１．４パーダキシン由来ペプチドにより誘導される膜不安定化。これまで研究された全てのαらせんの正に荷電した天然の抗菌性ペプチドに共通の性質は、双性イオン性リン脂質とよりも、負に荷電したリン脂質と大きく相互作用して透過するこれらの能力である。これらの知見のその生物学的標的膜への関連は、細菌の表面が、リポ多糖類（グラム陰性細菌のＬＰＳ）、および多糖類（グラム陽性細菌のテイコ酸）（両方とも酸性である）を含有し、一方正常哺乳動物細胞（例えば、赤血球）は、その外側リーフレット上に主として双性イオン性リン脂質のＰＣを発現するという事実にある。ＰＣおよびＰＣ／ＰＳリン脂質小胞（実験方法、セクションｖにより調製）の両方に及ぼすペプチドの膜透過活性を評価するための拡散ポテンシャルの消失は、実験方法、セクションxiに記載されたように測定した。ペプチド１、８、１２、１４に関する図３に示される結果は、パーダキシン中に導入されたＤ−アミノ酸が、リン脂質膜を透過するペプチドの能力に有意に影響しなかったことを示している。しかし、溶血活性は全くないが抗菌活性を保持している唯一のジアステレオマーであるペプチド１は、双性イオン性リン脂質よりも、負に荷電したリン脂質を有意に透過しやすい。ペプチド１は、 αらせん構造を欠いているが、それ自体未変性抗菌性ペプチドと同様にふるまう。ペプチド１２および１４で顕著な中間的な活性がなかったことは、これら両方ともが、疎水性相互作用による両方の型の小胞への強力な結合を促進するのに充分な、疎水性Ｎ−らせんまたは未処理の両親媒性Ｃ−らせんのいずれかを有するという事実により説明することができよう。１．５電子顕微鏡を使用する細菌の細胞溶解の視覚化。未処理の細菌および処理細菌の形態に及ぼすパーダキシン由来ペプチドの作用は、実験方法、セクションxxに記載されたように、ネガティブ染色電子顕微鏡を使用して視覚化した。ペプチドは、抗菌性測定法（上記例１．３を参照のこと）に使用されたのと同じ条件下で、これらのＭＩＣ濃度またはそれ以下で細菌に加えた。１８時間インキュベーション後に試料を取り出し、直ちに固定して透過型電子顕微鏡により検査した。図４は、一例として非溶血性類似体の１（［Ｄ］Ｐ⁷Ｌ¹⁸Ｌ¹⁹−ＴＡｐａｒ）により得られた写真を示す。ＭＩＣではペプチド１は細菌を完全に溶解することが見い出され、小断片のみが観察できた（図４Ｃ）。しかしＭＩＣより低い濃度では、細菌の細胞壁にパッチが観察された（図４Ｂ）。これらのパッチは、細胞分解過程に関与する初期工程を示しているかもしれない。例２．メリチン由来ジアステレオマーの合成および生物学的活性２．１合成。哺乳動物細胞および細菌に対するその細胞毒性におけるαらせん構造の役割をさらに試験するため、およびこの効果の基になる機構への洞察を得るため、メリチン（ｍｅｌ）の４つのジアステレオマーを合成した。メリチンは、以下の配列：の２６量体ペプチドである。正電荷を導入するためのメリチン分子の修飾は、エチレンジアミンとのＣ末端のカルボキシル基の反応により、メリチンまたはその断片の酸性Ｃ末端を正の末端に変換することにより行った［メリチンジアステレオマーでは、メリチンの５および８位の２つのＶａｌ残基、１７位のＩｌｅ残基および２１位のＬｙｓ残基を、それぞれＤ−Ｖａｌ、Ｄ−１１ｅおよびＤ−Ｌｙｓで置換することにより、Ｎ−らせんおよびＣ−らせんが改変されている（本明細書では［Ｄ］−Ｖ⁵Ｖ⁸Ｉ¹⁷ Ｋ²¹）］。以下のメリチン由来ジアステレオマーは、非溶血性であり、選択的細胞溶解活性を示すことが判った（太字および下線の残基はＤ−アミノ酸である）：ペプチド１８〜２１は次に、その構造、生物学的機能、および細菌および双性イオン性リン脂質または負に荷電したリン脂質のいずれかからなるモデル膜との相互作用に関して性状解析した。２．２ＣＤ分光学。ペプチド１８および１９のαらせん構造の含量は、４０％ＴＦＥ（αらせん構造を強力に促進する溶媒）中のこれらのＣＤスペクトルから求めた。予想されるように、２０８および２２２nmでの最小値により示されるように、ジアステレオマーのαらせん含量はメリチンの含量よりもはるかに低かった（８０％低下）（図５）。メリチンのαらせん含量は、７３％であり、これに対してジアステレオマーの１８および１９では、それぞれ１５％および７％であった。２．３メリチンジアステレオマー１８〜２１の抗菌活性および溶血活性。ｈＲＢＣに対するペプチド１８〜２１の溶血活性、および異なる種の細菌の増殖を阻害するこれらの能力を検討した。抗菌性測定法では抗生物質のテトラサイクリンを対照とした。ペプチドの溶血活性についての用量作用曲線が得られた（図６）。表３は、代表的なセットの試験細菌に対するＭＩＣを与える。メリチンへのＤ−アミノ酸の導入は、その溶血活性を劇的に低下させ、そしてその低下は、対応する類似体のαらせん含量の低下分に平行したことが判る。αらせん含量が最も高いメリチンは、最も溶血性であり、一方試験した最高濃度（５０μＭ）までで、αらせん含量が最も低いペプチド１８および１９は、事実上溶血活性がなかった。しかし、メリチンジアステレオマー１８および１９の溶血活性の劇的な低下にもかかわらず、これらは親ペプチドの強力な抗菌活性をほぼ保持していた。さらには、ペプチド１９の抗菌活性は、１８の活性よりもわずかに低いのみであり、このことは、メリチンのＣ末端のアミド基が、抗菌活性に顕著に寄与していないことを示している。これとは対照的に、遊離カルボン酸Ｃ末端を有するケクロピンは、アミド化Ｃ末端を有する未変性ケクロピンよりも著しく低い抗菌活性を有することが知られている（リー（Li）ら、１９８８）。２．４細菌の溶解の電子顕微鏡による検討。未処理の細菌および処理細菌の形態に及ぼすペプチド１８の作用は、透過型電子顕微鏡を使用して視覚化した。図７に示されるように、ＭＩＣでペプチド１８は細菌の完全な溶解を引き起こした（図７Ｃ）。しかしＭＩＣより低い濃度では、細菌の細胞壁にパッチが観察された（図７Ｂ）。これらのパッチは、細胞溶解過程における最初の工程を表すものであろう。２．５リン脂質膜との相互作用の様式。ペプチド１８および１９の生物学的活性は同様であるため、モデルリン脂質膜とのペプチド１８の相互作用の様式のみをメリチンと比較して、観察される膜選択性の根本原理を解明しようとした。この目的のために、ＰＣおよびＰＣ／ＰＳ小胞の両方で造り出される拡散ポテンシャルを消失させるペプチドの能力を測定し、両方の型の小胞とのペプチドの分配係数、および膜に結合しているときにはペプチドの局在を求めた。２．５．１ペプチドにより誘導される膜透過性。種々の濃度のメリチンおよびペプチド１８を、蛍光染料のｄｉＳ−Ｃ₂−５とバリノマイシンで前処理した小胞と混合した。蛍光回収の動態を経時的にモニターして、ペプチド濃度の関数として到達した最大レベルを求めた。図８に示されるように、メリチンもペプチド１８もＰＣ／ＰＳ小胞では同様な膜透過活性であり、このことは、メリチンへのＤ−アミノ酸の導入が、負に荷電したリン脂質（ＰＳ／ＰＣ）膜に透過する生じたジアステレオマーの能力に影響しないことを証明した。しかし、メリチンはＰＣ小胞でも非常に活性であったが、ジアステレオマーはＰＣ小胞での膜透過活性は（試験した最高濃度までで）全くなかった。２．５．２結合試験。ジアステレオマー１８がＰＣ小胞に透過できないのは、これがＰＣに結合することができないためか、あるいはＰＣ小胞には結合するが、一旦結合したら、膜の漏出を誘導する構造に組織化することができないためである。これら２つの可能性を区別するために、結合試験を行った。ペプチド１８の１９位の１つのＴｒｐ残基を内部蛍光プローブとして使用して、ＰＣおよびＰＣ／ＰＳ小胞へのその結合を追跡した。固定濃度（〜０．５μＭ）のペプチドを目的の小胞（ＰＣまたはＰＣ／ＰＳ）で滴定し、結合が起これば蛍光強度の増大が観察された。脂質：ペプチドモル比の関数として、生じるＴｒｐの蛍光強度の増大をプロットすると、通常の結合曲線が得られた（図９Ａ）。ＰＣ／ＰＳとのペプチド１８の結合曲線は、ほぼ全てのペプチド分子が、１００：１の脂質：ペプチドモル比で小胞に結合したことを明らかにしている。しかしＰＣ小胞では、試験した最大の脂質：ペプチドモル比でさえも、Ｔｒｐの蛍光の正味の増大は観察されなかったが、このことは、ペプチドがＰＣ小胞に結合しないことを示している。結合等温線は、Ｃ_f（溶液中の遊離ペプチドの平衡濃度）に対してＸ^* _b（６０％の全脂質当たりの結合ペプチドのモル比）をプロットすることにより作製した（図５Ｂ）。表面分配係数は、ゼロのＣ_f値に対する曲線の最初の傾きを外挿することにより推定した。ペプチド１８の推定表面分配係数Ｋ_P ^*は、１．１±０．２×１０⁴Ｍ^-1であった（４回の測定から得られた）。この値は、ホスファチジルグリセロール／ホスファチジルコリンへのメリチンの結合について報告された値（４．５±０．６×１０⁴Ｍ^-1）と類似している（ベシアスクビリ（Beschiaschvili）とシーリグ（Seelig）、１９９０）。ペプチドの結合等温線の形は、膜内のペプチドの組織化に関する情報を提供しうる（シュバルツ（Schwarz）ら、１９８７）。ペプチド１８の結合等温線は、下降しているが、これは、負の協同性を示している。この負の協同性の可能な説明は、低濃度ではＰＳ／ＰＣへのペプチド１８の結合が、電荷作用なしの分配平衡に比較して、リン脂質の頭部の基の負電荷により増強されることである。加えて、膜への結合により、ペプチドは負の膜表面電荷を部分的に中和する。しかし、一旦膜表面電荷が中和されると、同類電荷の反発が優勢な因子になるため、さらなるペプチド１８の結合は困難になる。負に荷電したリン脂質膜へのメリチンの結合の試験において同様な結果が得られた（バテンバーグ（Batenburg）ら、１９８７；ベシアスクビリ（Beschiaschvili）とシーリグ（Seelig）、１９９０）。興味深いことに、ＰＣ小胞にも強力に結合する（クチンカ（Kuchinka）とシーリグ（Seelig）、１９８９）メリチンとは異なり、ペプチド１８は、ＰＣ小胞には結合しなかった。２．６トリプトファンのクエンチング実験。タンパク質またはペプチドの配列に元々存在するトリプトファン残基は、膜内のペプチドの局在についての内部プローブとして作用させることができる。メリチンは、Ｃ−らせんのＮ末端側の１９位にトリプトファン残基を含有する。メリチンとペプチド１８の両方により、トリプトファン蛍光の最大クエンチングは、６，７−Ｂｒ−ＰＣ／ＰＳ小胞で観察された（図１０）。次に大きなクエンチングは、９，１０−Ｂｒ−ＰＣ／ＰＳで観察され、最も少ないクエンチングは、１１，１２−Ｂｒ−ＰＣ／ＰＳで観察された。これらの結果は、小胞への結合によりペプチドがリン脂質の頭部の基の近くに配置されることを示している。例３．モデルＬｙｓ／Ｌｅｕジアステレオマーの合成および生物学的活性３．１Ｌｙｓ／Ｌｅｕジアステレオマーの設計。リジンとロイシンの種々の比よりなる短い線状モデルの１２量体ペプチドの６つのジアステレオマーを合成して、（１）疎水性と正味の正電荷の間の均衡が、選択的な細菌の溶解に必要な充分な基準であるかどうかを試験し、そして（２）この作用の基になる機構への洞察を得ようとした。第１シリーズのモデルＬｙｓ／Ｌｅｕ１２量体ペプチド２２〜２５において、これらの配列の３分の１は、Ｄ−アミノ酸残基からなる。Ｄ−アミノ酸の位置は、αらせん構造の最大の分裂のために作成された全てのペプチドにおいて不変のままであった。Ｄ−アミノ酸は、ペプチドにそって配置され、１〜３個の連続Ｌ−アミノ酸の非常に短いストレッチのみが残った。下記ペプチドを合成した：第２シリーズのモデルＬｙｓ／Ｌｅｕ１２量体ペプチド２６〜２７では、以下のように、これらの配列の３分の２がＤ−アミノ酸残基からなり、その位置はペプチド２３および２４のちょうどＬ−アミノ酸残基の位置である：第３シリーズのモデルＬｙｓ／Ｌｅｕペプチドでは、６量体および８量体ジアステレオマーを合成した（それぞれ、ペプチド２８および２９）：合成した本発明のさらなるＬｙｓ／Ｌｅｕジアステレオマー：３．２Ｌｙｓ／Ｌｅｕジアステレオマーの合成。実験方法、セクション（ii ）に記載されたように、ペプチドを合成した。次にその構造、生物学的機能、および細菌および双性イオン性リン脂質または負に荷電したリン脂質のいずれかからなるモデル膜との相互作用に関してペプチドを性状解析した。３．３疎水性。ペプチド２２〜２５の疎水性と正味の正電荷は、表４にリストされる。疎水性の平均値は、疎水性スケールのコンセンサス値を使用して計算した（アイゼンバーグ（Eisenberg）ら、１９８４）。図１１に示されるように、ペプチドの疎水性と保持時間の間には正の相関が見い出され、このことは、この構造が、固定相との全体的な疎水性相互作用に顕著に寄与しないことを示唆している。３．４ＣＤ分光学。ジアステレオマー２２〜２５のαらせん構造の含量は、４０％ＴＦＥ中のそのＣＤスペクトルから求めた。予想されるように、Ｄ−アミノ酸の組み込み後には、全てのジアステレオマーでシグナルが観察されなかったが、このことは、どんな特異的な二次構造も存在しないことを証明している（データは示していない）。最近の研究において、ペプチド２３の配列と同一の配列を有するが、Ｌ−アミノ酸だけからなるペプチドは、メタノール中およびＤＭＰＣ小胞中で約４０％のαらせん構造を有することが見い出されたことに注意されたい（コーナット（Cornut）ら、１９９４）。３．５ペプチド２２〜２９の抗菌活性および溶血活性。ｈＲＢＣに対するペプチド２２〜２９の溶血活性を試験した。ペプチド２２〜２５の溶血活性についての用量作用曲線を図１２に示すが、ここで、メリチンの溶血活性を対照とした。ジアステレオマーの疎水性（表４）と溶血活性の間に正の相関が見い出された。疎水性の最も高いペプチド２２（［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₃Ｌ₉）は、最も溶血性のペプチドであった。しかしその溶血活性は、メリチンに比較して非常に低い（＞６０倍弱い活性）。他の全てのペプチドは、試験した最高濃度（１００μＭ）まで著しい溶血活性は示さなかった。ペプチド２２〜２９の溶血活性は、表５に示される。ペプチド２３（［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₄Ｌ₈）は、メリチンによる顕著な溶血に必要な濃度の＞１００倍の濃度で溶血性でないが、その全部がＬ−アミノ酸である型は、最近の研究でメリチンと同様な溶血活性（〜５倍弱い）を有することが証明されたことに注意されたい（コーナット（Cornut）ら、１９９４）。ペプチド２２〜２９は、代表的なセットの細菌に対する抗菌活性についても試験したが、ここで、テトラサイクリン、ダーマセプチンＳ、およびメリチンを対照として使用した。結果のＭＩＣは、表５に示される。データは、ジアステレオマー２２〜２９の抗菌活性が、疎水性と正に荷電したアミノ酸の間の均衡により調節されることを示している。最も疎水性のペプチド２２と最も親水性のペプチド２５の両方とも、最も低い範囲の抗菌活性を示した（表５）。しかし、ペプチド２３および２４は、試験した細菌の大部分に対して高い抗菌活性を示したが、前者の方がわずかに強力であった。さらに、各ペプチドは、抗菌活性の独特のスペクトルを持ち、そしてそれぞれがグラム陰性細菌に比べてグラム陽性細菌に対して活性が高かった。３．６血清中のテトラサイクリンとＬｙｓ／Ｌｅｕジアステレオマーの間の相乗作用。抗生物質のテトラサイクリンとジアステレオマーの間の相乗作用的関係の可能性を調査するために、一定の等モル濃度（１μＭ）のペプチド２４（［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₅Ｌ₇）の存在下で、緑膿菌（Pseudomonasaerugin osa）（ＡＴＣＣ２７８５３）に対して２倍連続希釈でテトラサイクリンを試験した。この混合物の抗菌活性は、実験方法、セクション（xii）に記載されたように測定した。テトラサイクリンとジアステレオマー２４の間に相乗作用が観察された。テトラサイクリンは、緑膿菌（P．aeruginosa）に対してほとんど活性を示さない。しかしペプチド２４の１μＭ溶液（緑膿菌（P．aeruginosa）に対する溶解活性に必要な濃度の１０倍低い濃度）と混合すると、テトラサイクリンの活性の８倍上昇が観察された（表６）。相乗作用の可能な説明は、ペプチドが細菌の細胞壁を僅かに破壊し、これにより細菌中へのテトラサイクリンの分配が改善されたということである。この説は、そのＭＩＣ未満でペプチド２４が細菌の細胞壁の形態的な変化を引き起こすことを示す電子顕微鏡検査により支持される（図１４）。加えて、ペプチド２４および未変性抗菌性ペプチドのダーマセプチンの、緑膿菌（P．aeruginosa）と大腸菌（E．coli）に対する抗菌活性に及ぼすプールしたヒト血清の作用は相当異なることが見い出された（表６）。ダーマセプチンは血清の存在下では８〜１０倍活性が弱かったが、ペプチド２４は、その抗菌活性を保持した。３．７ペプチド誘導性膜透過。種々の濃度のペプチドは、蛍光染料のｄｉＳ −Ｃ₂−５およびバリノマイシンで前処理した小胞と混合した。蛍光回収の動態をモニターして、ペプチド濃度の関数として最大蛍光レベルを求めた（図１３）。ＰＣ／コレステロール小胞（１０：１）は赤血球外側リーフレットのリン脂質組成のモデルとし（バークレイジ（Verkleij）ら、１９７３）、そしてＰＥ／ＰＧ小胞（７：３）は、大腸菌（E．coli）のリン脂質組成を模倣するために使用した（ショー（Shaw）、１９７４）。モデルリン脂質膜を透過するペプチドのポテンシャルと、赤血球と大腸菌（E．coli）に対するその溶解活性との間に正の相関が見い出された。溶血性ペプチド２２だけが、双性イオン性リン脂質小胞を透過した。さらに、ＰＥ／ＰＧ小胞を透過するペプチドの能力は、大腸菌（E.coli ）に対するペプチドの抗菌活性と相関する（表５）。抗菌活性が最も低いペプチド２５はまた、他の３つのペプチド２２〜２４に比較してＰＥ／ＰＧ小胞を透過する能力も著しく低くなっていた。３．８細菌の細胞溶解の電子顕微鏡試験。処理大腸菌（E．coli）の形態に及ぼすジアステレオマー２２〜２５の作用は、透過型電子顕微鏡を使用して視覚化した。全てのペプチドが、ＭＩＣで細菌の細胞溶解を引き起こした（データは示していない）。しかしそのＭＩＣの８０％に相当する濃度でペプチドを使用すると、使用したペプチドに応じて処理細菌の形態に幾らかの相違が観察された。最も疎水性のペプチド２２は、細胞壁と細胞膜に最も大きな損傷を引き起こし、一方最も疎水性の小さいペプチド２５は、局所的な動揺を引き起こしただけだった（図１４）。例４．モデルＬｙｓ／ＡｌａおよびＬｙｓ／Ｖａｌジアステレオマーの合成および生物学的活性。４．１ジアステレオマーの設計。線状細胞毒性ペプチドの疎水性と正味の正電荷の調節が、選択的抗菌活性を付与するのに充分であるかどうかをさらに試験するために、それぞれ、Ｌｙｓ／ＡｌａまたはＬｙｓ／Ｖａｌ残基からなる、２つのさらに別のモデルの１２量体ペプチドの３３および３４〜３７（これらの配列の少なくとも３分の１は、Ｄ−ＡｌａまたはＤ−Ｖａｌ残基である）を合成した：４．２合成。Ｌｙｓ／ＡｌａおよびＬｙｓ／Ｖａｌジアステレオマーは、実験方法、セクション（ii）に記載されたように合成した。４．３抗菌活性および溶血活性。ペプチド３３および３４は、大腸菌（E.co li）と巨大菌（B．megaterium）、およびｈＲＢＣに対して試験した。表７の結果は、両方のモデルジアステレオマーが抗菌性で非溶血性であることを示している：例５．さらなるモデルジアステレオマーの合成２つ、３つまたはそれ以上の異なるアミノ酸の６、８、１２、１４、１６、１９、２５、２６および３０残基の配列からなる、本発明の下記のモデルジアステレオマーを合成した：例６．環状ジアステレオマーの合成および生物学的活性。６．１設計。Ｎ−およびＣ末端の両方にシステイン残基を有するパーダキシン断片のジアステレオマーの下記の環状誘導体を合成した：Ｎ−およびＣ末端の両方にシステイン残基を有する異なるアミノ酸残基のジアステレオマーの下記の環状誘導体を合成した：６．２環状ジアステレオマーの合成。ペプチドのＮおよびＣ末端の両方にシステイン残基を有する、環状ペプチドは、実験方法、セクション（ii）に記載されたように固相法により合成した。ＨＦ切断およびＲＰ−ＨＰＬＣ精製後、ＰＢＳ（ｐＨ７．３）中に低濃度でペプチドを可溶化して、１２時間後に環化を終了した。この環状ペプチドは、ＲＰ−ＨＰＬＣでさらに精製して、アミノ酸分析に付してその組成を確認し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりそのモノマー状態を確認した。６．３抗菌活性および溶血活性。ペプチド８６〜８８は、大腸菌（E．coli ）と巨大菌（B．megaterium）、およびｈＲＢＣに対して試験した。表８の結果は、３つ全ての環状パーダキシン由来ジアステレオマーが抗菌性で非溶血性であることを示している：例７．束になったＬｙｓ／Ｌｅｕペプチドジアステレオマーの合成および生物学的活性。７．１設計。鋳型としてペプチド２３を、そしてモノマーとしてＣ末端に追加のシステイン残基を有するペプチド２３または２４（それぞれ、２３Ｃおよび２４Ｃ）を使用して、下記の束配列を生成した：７．２合成。鋳型結合ジアステレオマーを生成するために、１：１モル比のＤＣＣとブロモ酢酸をＤＭＳＯ中で２５℃で１時間反応させた。鋳型（ペプチド２３）を反応混合物に加えて、１２時間撹拌し、次にＤＭＳＯを凍結乾燥した。残ったブロモ酢酸を無水エーテルで抽出した。次に、過剰のＣ末端にシステイン残基を有するジアステレオマー２３Ｃおよび２４Ｃと鋳型をＰＢＳ（ｐＨ７．３）中で２５℃で１時間反応させた。鋳型結合ジアステレオマー９２および９３は、ＲＰ−ＨＰＬＣでさらに精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで試験してその凝集状態を確認した。７．３抗菌活性および溶血活性。鋳型結合ジアステレオマー９２および９３は、大腸菌（E．coli）と巨大菌（B．megaterium）、およびｈＲＢＣに対して試験した。表９の結果は、両方の束配列が抗菌性で非溶血性であることを示している：例８．親水性Ｌｙｓ／Ｌｅｕ１２量体ペプチドジアステレオマーの混合物の合成および生物学的活性。ペプチドは、上記実験方法、セクション（ii）に記載されたように、固相法により合成した。各カップリング工程で、各１当量のリジン、ロイシンおよびＤ−ロイシンからなる混合物を反応物に加えた。合成により、３¹²個の異なるペプチドの混合物が生じた。ＨＦ切断後、親水性ペプチドを２回蒸留水（ｄｄｗ）で抽出して凍結乾燥した。Ｌｙｓ／Ｌｅｕ１２量体ペプチドジアステレオマーの親水性混合物は、大腸菌（E．coli）Ｄ２１（ＭＩＣ：１５μg/ml）と巨大菌（B．megaterium）Ｂｍ１１Ｄ２１（ＭＩＣ：３μg/ml）、およびｈＲＢＣ（１００μＭで溶血０％）に対して試験した。予想されるように、この親水性混合物は、抗菌活性があるが、非溶血性であった。例９．Ｌｙｓ／Ｌｅｕ／Ｄ−Ｌｅｕランダムコポリマーの合成および生物学的活性。異なるサイズのポリマーのジアステレオマーを生成するために、開始剤の遊離アミノ酸よりも過剰のＮ−カルボキシ無水物残基をＤＭＦ中で２５℃で４時間重合させた（カッチャルスキー（Katchalski）とセーラ（Sela）、１９５８）。異なる比のリジン、ロイシンおよびＤ−ロイシンからなるポリマーは、異なる比のリジン−Ｎ−カルボキシ無水物、ロイシン−Ｎ−カルボキシ無水物およびＤ −ロイシン−Ｎ−カルボキシ無水物を使用して生成した。このような３種のポリマーおよびその抗菌活性と溶血活性は、表１０に示される。例１０．ジアステレオマーの抗真菌活性以下のように、１００μＬの最終容量にして、滅菌９６ウェルプレート（ヌンク（Nunc）Ｆ９６マイクロタイタープレート）中でパーダキシン由来ペプチド１および１６（上記例１を参照のこと）の抗真菌活性を試験した：培地（サブロー（S abouraud's）グルコースブロス培地）中に１×１０⁶コロニー形成単位（ＣＦＵ）/mlの濃度で真菌を含有する５０マイクロリットルの懸濁液を、水に連続２倍希釈したペプチドを含有する５０μＬの水に加えた。増殖の阻害は、３０℃で４８時間のインキュベーション時間の後に、マイクロプレート（Microplate）自動リーダーＥ１３０９（バイオテックインストラメンツ（Bio-tek Instruments））で４９２nmの吸光度を測定することにより求めた。抗真菌活性は、最小阻止濃度（ＭＩＣ）（４８時間のインキュベーション後、増殖の１００％阻害が観察された濃度）として表した。使用した真菌は、カンジダアルビカンス（Candida al bicans）（ＩＰ８８６−６５）とクリプトコッカスネオフォルマンス（Cryptoco ccus neoformans）（ＩＰ９６０−６７）とした。表１１に示されるように、ペプチド１および１６の両方とも抗真菌活性を示した。例１１．ジアステレオマーの抗癌活性。Ｌｙｓ／Ｌｅｕジアステレオマー２３および２４（上記例３を参照のこと）の抗癌活性は、マウス腺癌に対して試験した。ダルベッコー修飾イーグル培地で９６ウェルマイクロタイタープレートに５〜１００００個／ウェルで細胞を接種した。細胞の付着後、２０μｌの標準生理食塩水中の希釈ペプチド溶液をウェルに移して、２０〜１５０μＭの最終濃度範囲とした。ペプチドと共に１時間のインキュベーション後、癌細胞の生存力は、トリパンブルー（Trypan blue）（０．１％、ｗ／ｖ）生命染色測定法により測定した。対照実験では、ペプチド溶媒を単独で細胞に加えた。抗癌活性は、最小阻止濃度（ＭＩＣ）（１時間のインキュベーション後に増殖の１００％阻害が観察された濃度）として表した。表１２の結果は、両方のペプチドが、悪性細胞に対して活性であることを示している。例１２．リーシュマニアメキシカーナ（Leishmania mexicana）に対するジアステレオマーの活性。メリチン由来ジアステレオマーペプチド２０（上記例２を参照のこと）およびＬｅｕ／Ｌｙｓジアステレオマーペプチド２３（上記例３を参照のこと）はリーシュマニア（Leishmania）に対して試験した。測定されるリーシュマニアメキシカーナ（Leishmania mexicana）ＮＲ株のプロマスティゴート（promastigotes）は、１０％ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地で２７℃で培養した。寄生体は、１２００×ｇで４℃で１０分間の遠心分離により回収して、ＰＢＳ（５０mMリン酸ナトリウム、１５０mM ＮａＣｌ、ｐＨ７）で２回洗浄した。洗浄したプロマスティゴートは、血球計で計測し、１×１０⁶ 寄生体/mlに調整した。この懸濁液のアリコートは、１００μｌの最終容量で、種々の濃度のジアステレオマーの非存在下または存在下で２６℃で２４時間のインキュベーション後に生存（運動）細胞を計測することにより測定した。抗リーシュマニア（Leishmania）活性は、最小阻止濃度（ＭＩＣ）（２４時間のインキュベーション後１００％死滅が観察された濃度）として表した。ペプチド２３ではＭＩＣは１７μＭであり、ペプチド２０ではＭＩＣは３２μＭであることが判った。例１３．ジアステレオマー２３の抗ウイルス活性センダイウイルス（Ｚ株）は、１０〜１１日齢の孵化鶏卵の尿膜包で増殖させ、注入の４８時間後に回収して精製した。このウイルスは、１６０mM ＮａＣｌ、２０mM トリシン（ｐＨ７．４）からなる緩衝液に再懸濁して、−７０℃で保存した。ウイルスの血球凝集活性は、血球凝集単位（ＨＡＵ）で測定した。１マイクロリットルは、〜６００００ＨＡＵを含んでいた。新鮮ヒト血液を血液銀行から入手して、４℃ で１ヶ月まで保存した。使用前に、赤血球をＰＢＳ（ｐＨ７．２）で２回洗浄し、同じ緩衝液で目的濃度（％、ｖ／ｖ）まで希釈した。ビリオン、赤血球およびペプチドを異なる順の添加および種々の量で混合した。最終インキュベーションは、常に３７℃で６０分とし、次いで５７００ｇで１０分間遠心分離して無傷の細胞を取り出した。全ての場合に二重測定試料を使用して、各試料の上清から２つのアリコートをとって９６ウェルプレートの２つのウェルに入れた。ヘモグロビン放出の量を、５４０nmのＥＬＩＳＡプレートリーダーでウェルの吸光度を測定することによりモニターした。抗ウイルス活性は、最小阻止濃度（ＭＩＣ）（インキュベーション後、ヘモグロビンの放出が観察されなかった濃度）として表した。Ｌｙｓ／Ｌｅｕジアステレオマーペプチド２３ではＭＩＣは８０μＭであることが判った。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 33/02 Ｃ０７Ｋ 7/52 Ｃ０７Ｋ 7/52 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．病原性細胞（体内では自然に存在せず、かつ病原性生物および悪性細胞を含む細胞）に対する細胞溶解活性を有すること；および非溶血性であること、すなわち、赤血球に対する細胞溶解作用がないか、または該細胞溶解活性を表す濃度よりも実質的に高い濃度で赤血球に対する細胞溶解作用を有すること、により表される選択的細胞溶解活性を有する、ペプチド、束になったペプチドの複合体、ペプチドもしくはランダムペプチドコポリマーの混合物から選択される非溶血性細胞溶解性物質であって、該非溶血性細胞溶解性物質は：（１）＋１より大きな正味の正電荷を有し、Ｌ−アミノ酸残基とＤ−アミノ酸残基の両方を有するか、またはＬ−アミノ酸残基とＤ−アミノ酸残基の１つまたは両方を有し、αらせん破壊部分を含むペプチドの環状誘導体；（２）＋１より大きな正味の正電荷を有する、Ｌ−アミノ酸残基とＤ−アミノ酸残基の両方を有し、Ｌ−アミノ酸残基のみを有する対応するアミノ酸配列は自然には存在しないようなアミノ酸の配列を有するペプチド、およびその環状誘導体；（３）各ペプチドが、＋１より大きな正味の正電荷を有し、Ｌ−アミノ酸残基とＤ−アミノ酸残基の両方を有するか、またはＬ−アミノ酸残基とＤ−アミノ酸残基の１つまたは両方を有し、αらせん破壊部分を含む、複数の２つまたはそれ以上の非溶血性細胞溶解性ペプチド、またはこれらの環状誘導体（該ペプチドは、各ペプチドに共有結合したリンカー分子を使用して束になっている）、からなる複合体；（４）各ペプチドが、＋１より大きな正味の正電荷を有し、Ｌ−アミノ酸残基とＤ−アミノ酸残基の両方を有するか、またはＬ−アミノ酸残基とＤ−アミノ酸残基の１つまたは両方を有し、αらせん破壊部分を含む、複数の２つまたはそれ以上の非溶血性細胞溶解性ペプチド、またはこれらの環状誘導体、からなる混合物；および（５）異なる比の疎水性、正に荷電した、およびＤ−アミノ酸からなるランダムコポリマー、よりなる群から選択される、上記物質。２．請求の範囲第１項（１）記載の環状ペプチドであって、Ｄ−アミノ酸残基とＬ−アミノ酸残基は、Ｌ−アミノ酸残基のみまたはＤ−アミノ酸残基のみからなりかつ該ペプチドと同じアミノ酸配列を有する均一な非環式ペプチドが、αらせん配置を有しかつ種々の細胞に対して広い細胞溶解活性スペクトルを有するような配列を有する、上記ペプチド。３．パーダキシンもしくはメリチンまたはこれらの断片から誘導される環状ジアステレオ異性体である、請求の範囲第２項に記載の環状ペプチド。４．＋１より大きい正味の正電荷は、本来のアミノ酸組成によるか、または遊離カルボキシル基の中和、または正に荷電したアミノ酸残基および／または正に荷電した化学基の付加による、請求の範囲第３項に記載の環状ペプチド。５．Ｎ−末端にＬｙｓ残基が付加されているかおよび／またはＣ−末端にアミノエチルアミノ基が付加されている、パーダキシンまたはその断片の環状ジアステレオ異性体から選択される、請求の範囲第４項に記載の環状ペプチド。６．配列：８６．以下の配列の環状Ｋ¹［Ｄ］Ｐ⁷Ｌ¹⁸Ｌ¹⁹［１−２２］−ｐａｒ：８７．以下の配列の環状Ｋ¹Ｋ²［Ｄ］Ｐ⁷Ｌ¹⁸Ｌ¹⁹［１−２２］−ｐａｒ：８８．以下の配列の環状Ｋ¹Ｋ²Ｋ³［Ｄ］Ｐ⁷Ｌ¹⁸Ｌ¹⁹［１−２２］−ｐａｒ^・を有する、本明細書においてペプチド８６〜８８と呼ぶ環状パーダキシン由来ペプチドから選択される、請求の範囲第５項に記載の環状ペプチド。７．Ｌ−アミノ酸残基とＤ−アミノ酸残基の両方を有し、Ｌ−アミノ酸残基のみを有する対応するアミノ酸配列は自然には存在しないようなアミノ酸の配列を有する、請求の範囲第１項（２）に記載のペプチド。８．請求の範囲第７項に記載のペプチドであって、（ａ）種々の比の、少なくとも１つの疎水性アミノ酸と少なくとも１つの正に荷電したアミノ酸よりなり、そしてその配列において、少なくとも１つのアミノ酸残基がＤ−アミノ酸である、非天然合成ペプチドであること；（ｂ）このペプチドが、＋１より大きな正味の正電荷を有すること；および（ｃ）正に荷電したアミノ酸に対する疎水性アミノ酸の比は、このペプチドが病原性細胞に対して細胞溶解性ではあるが、赤血球の細胞溶解は引き起こさないような比であること、という特徴を有する、上記ペプチド９．正に荷電したアミノ酸は、リジン、アルギニンおよびヒスチジンから選択され、疎水性アミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、グリシン、アラニン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、チロシンおよびトリプトファンから選択される、請求の範囲第８項に記載のペプチド。１０．請求の範囲第９項に記載のペプチドであって、＋１より大きい正味の正電荷は、アミノ酸組成によるかまたは正に荷電した化学基の付加により、または疎水性がセリン、トレオニン、メチオニン、アスパラギン、グルタミンおよびシステインのような極性アミノ酸の付加により、低下している上記ペプチド。１１．疎水性アミノ酸は、ロイシン、アラニンまたはバリンであり、正に荷電したアミノ酸はリジンである、少なくとも６個のアミノ酸残基を有する、請求の範囲第１０項に記載のペプチド。１２．ロイシンとリジンからなる６量体、８量体または１２量体のジアステレオ異性体であり、その配列の少なくとも３分の１はＤ−アミノ酸からなるが、本明細書において２３と呼ぶペプチド：は除く、請求の範囲第１１項に記載のペプチド。１３．配列：の本明細書において２４〜２９（それぞれ、配列番号２４〜２９）と呼ぶペプチドから選択される、請求の範囲第１２項記載のＬｅｕ／Ｌｙｓジアステレオ異性体。１４．配列：の本明細書において９２〜９５と呼ぶペプチドから選択される、請求の範囲第７項〜第１３項までのいずれか１項に記載の非天然の合成ペプチドの環状誘導体。１５．各ペプチドに共有結合したリンカー分子を介して束になった、請求の範囲第１〜第１４項までのいずれか１項に記載の複数の２つまたはそれ以上の非溶血性細胞溶解性ペプチドからなる、請求の範囲第１項（３）に記載の束になったペプチドの複合体。１６．束は２つまたはそれ以上（好ましくは５個）の分子の同じペプチドまたは異なるペプチドからなり、リンカーは前記請求の範囲のいずれか１項に記載のペプチドまたは常用されるリンカーである、請求の範囲第１５項記載の複合体。１７．本明細書において９６および９７と呼ぶ束になったＬｙｓ／Ｌｅｕジアステレオ異性体：９６．以下の配列の（［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₄Ｌ₈Ｃ）₅［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10− Ｋ₄Ｌ₈：９７．以下の配列の（［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10−Ｋ₅Ｌ₇Ｃ）₅［Ｄ］−Ｌ^3,4,8,10− Ｋ₄Ｌ₉：から選択される、請求の範囲第１６項に記載の複合体。１８．ペプチドは請求の範囲第１項〜第１４項までのいずれか１項で定義されるものである、複数の２つまたはそれ以上の非溶血性細胞溶解性ペプチドからなる、請求の範囲第１項（４）に記載の混合物。１９．Ｌｙｓ／Ｌｅｕの１２量体ペプチドジアステレオ異性体の混合物を含む、請求の範囲第１８項に記載の混合物。２０．異なる比の疎水性、正に荷電した、およびＤ−アミノ酸からなる、請求の範囲第１項（５）に記載の非溶血性細胞溶解性ランダムコポリマー。２１．１：１：１、２：１：１または３：１：１（モル）の比のリジン、ロイシンおよびＤ−ロイシンからなる、請求の範囲第２０項に記載の非溶血性細胞溶解性ランダムコポリマー。２２．請求の範囲第１項〜第２１項までのいずれか１項に記載の非溶血性細胞溶解性物質と薬剤学的に許容される担体とを含む薬剤組成物。２３．病原性生物により引き起こされる感染症の治療のための、請求の範囲第２２項に記載の薬剤組成物。２４．病原性生物は、細菌、真菌、原生動物、マイコプラズマおよびウイルスから選択される、請求の範囲第２３項に記載の薬剤組成物。２５．病原性生物は、細菌である、請求の範囲第２４項に記載の薬剤組成物。２６．癌の治療のための、請求の範囲第２２項に記載の薬剤組成物。