KR20070102677A - 용혈현상이 감소된 항균성 펩티드 및 그들의 사용방법 - Google Patents

용혈현상이 감소된 항균성 펩티드 및 그들의 사용방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다음의 아미노산 서열 중 하나를 함유하는 시클릭 및 선형 단펩티드를 제공하고:K(2Nal)RR(2-Nal)(SEQ ID NO:1), K(2-Nal)RR(2-Nal)V(SEQ ID NO:2), K(2-Nal)IK(2-Nal)R(SEQ ID NO:3), K(2-Nal)RR(2-Nal)VR(2-Nal)(SEQ ID NO:4), I(2-Nal)RV(2-Nal)RR(2-Nal)K(SQE ID NO:5), K(1-Nal)RR(1-Nal)VR(1-Nal)I(SEQ ID NO:6) 및 K(Bip)RR(Bip)VR(Bip)I(SEQ ID NO:7), 여기서 1-Nal은 (나프타-1-일)알라닌을 나타내고, 2-Nal은 (나프타-2-일) 알라닌을 나타내고 그리고 Bip는 (4,4'-바이페-닐)알라닌을 나타낸다. 상기 펩티드들은 혈청 양립성의 증가와 그리고 용혈의 감소를 갖는, 그람-양성 및 그람-음성 박테리아와 균류에 대해 넓은 범위의 스펙트럼 항생 활성을 나타낸다.
용혈 감소, 항균성 펩티드, 항균성 펩티드 조성물

Description

용혈현상이 감소된 항균성 펩티드 및 그들의 사용방법{ANTIMICROBIAL PEPTIDES WITH REDUCED HEMOLYSIS AND METHODS OF THEIR USE}
본 출원은 2002년 9월 20일자로 출원된 미국 특허출원 제10/247,476의 일부연속출원인 2004년 12월 2일자로 출원된 미국특허출원 제11/000,970호를 우선권으로 주장한다.
본 발명은 항균성 펩티드 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 방향족 및 양이온성 아미노산 잔기를 갖는 다른 펩티드와 비교하여, 매우 높은 항생성 효율 및 낮은 용혈 활성을 나타내는 방향족 및 양이온성 잔기의 독특한 패턴으로 배열된 천연 및/또는 비천연 아미노산 잔기를 갖는 환형 및 비-환형 펩티드에 관한 것이다.
종래의 항생제에 내성을 갖는 세균성 균주의 출현은 동물 기원의 항균성 펩티드를 포함하여, 새로운 치료제의 연구를 촉진하였다. 항균성 펩티드는 식물, 곤충, 양서류 및 포유동물의 유기체를 포함하여 대부분의 살아있는 유기체의 고유의 숙주 방어 메카니즘에서 중요한 역할을 한다는 것이 인식되어 있고, 세균, 균류 및 특정 바이러스에 대한 잠재적인 항균 활성을 소유한다고 알려져 있다.
항균성 펩티드는 넓은-스펙트럼 활성을 소유하고 미생물 감염에 대한 숙주 방어의 중요한 일부를 구성하는 5 킬로달톤 미만의 저분자량 분자로서, 이들은 저 분자 중량 항균성 화합물을 고안하기 위한 출발점을 제공한다.
대부분의 항균성 펩티드는 병원체의 특이 분자 수용체를 표적으로 하지 않고 오히려 영향을 미치고 미생물 막을 투과한다. 이들은 그들의 맴브라놀리틱 활성에 기여하는 특성인 소수성과 하전 영역의 클러스터를 갖는 양쪽친매성 구조로 접힐 수 있는 경향을 갖는다고 알려진다. 항균성 펩티드는 막 완전성을 타협하기 위해 지질에 병합하는 펩티드의 95% 초과를 인지질 이중층으로 쉽게 구분한다. 세균에서, 항균성 펩티드는 평면 지질 이중층에서 작은 임시의 전도성 증가를 가져올 수 있고, 그것에 의해 부분적으로 세포질 막 포텐셜 구배의 극성을 없앤다. 세균이 항생제 내성을 크게 개발함에 따라, 항생제 내성의 문제를 극복할 수 있는 신규한 치료제로서, 항균성 펩티드의 개발에 대한 가능성이 명백해진다.
고유의 숙주 방어 메카니즘에서 항균성 펩티드의 보호 기능은 Drosophilia에서 증명되어 왔고, 여기서 이와 같은 펩티드의 감소된 발현은 미생물 공격 후 생존률을 극적으로 감소시켰다. 포유동물에서, 유사한 기능은 낭포성 섬유증 환자의 폐와 작은 마이스에서 불완전한 세균 사살에 의한 것으로 제안된다.
현재, 수백개의 항균성 펩티드의 특성이 기술되었다. 일반적으로, 천연적으로 유래된 항균성 펩티드는 12~50 아미노산 길이이고 α-나선, β-시트, 연장된 펩티드 및 루프된 펩티드를 포함하여 여러 구조적 군으로 나뉜다. 비록 이들 펩티드는 현저한 다양성을 나타내지만, 이들은 2가지 일반적이고 기능적으로 중요한 요건을 갖는다: 음으로 하전된 미생물 표면과 상호작용을 용이하게 하는 순 양이온성, 및 미생물 막으로의 병합을 허용하는 양쪽친매성 구조를 가정할 수 있는 능력.
포유동물에서 발견되는 항균성 펩티드는 시스테인-풍부 디펜신(defensin)(α- 및 β-디펜신) 및 카세리시딘(cathelicidin) 류로 분류된다. 아미노산 조성물과 구조를 기준으로, 카세리시딘 류는 3개의 군으로 분류된다. 첫번째 군은 LL-37, CRAMP, SMAP-29, PMAP-37, BMAP-27 및 BMAP-28과 같은 양쪽친매성 α-나선 펩티드를 포함한다. 두번째 군은 Bac5, Bac7, PR-39 및 인돌리시딘을 포함하는 Arg/Pro-풍부 또는 Trp-풍부 펩티드를 함유한다. 세번째 군은 프로테그린과 같은 Cys-함유 펩티드를 포함한다. 카세리시딘 류는 카세린 영역으로 알려진 고도로-보존된 단일 서열과 프로리진과 C-말단 영역의 가변적인 항균성 서열을 함유한다. 많은 카세리시딘은 음이온성 카세린 영역과 양이온성 C-말단 펩티드 영역 사이에 특징적인 엘라스타제 분열부위를 함유한다. 이 부위에서의 단백질분해 공정은 소와 돼지의 친핵체에서 관찰되고 미생물 활성에 필수적이다.
트립토판은 막으로 삽입되고 Tri-풍부 펩티드를 지질 다형증에 영향을 미치는 막으로 구분하도록 하는 높은 경향을 갖는다. 항균성 및 용혈 활성에서 Trp 잔기의 이들 중요한 특성은 여러 Trp-풍부 양이온성 항균성 펩티드의 구조와 작용 메카니즘을 결정하게 한다. Trp-풍부 양이온성 펩티드의 잘-연구된 예는 인돌리시딘이다. 아미노산 서열 Ac-ILPWKWPWWPWRR-NH2를 갖는 인돌리시딘은 소 호중구의 세포질 미소체로부터 단리된 짧은 Trp-풍부 펩티드이다. 인돌리시딘은 연장된, 보트-모양 구조이고 그람-양성 및 그람-음성 세균, 원생생물, 균류 및 외피바이러스 HIV-1 에 대한 광-스펙트럼 항균 활성을 갖는다. 작용의 유사한 메카니즘이 트리트립티신, 퓨로A, 락토페리신 및 PW2와 같은 다른 Trp-풍부 펩티드에 대해 제안되어져 있다.
발명의 요약
본 발명은 펩티드의 일차 구조의 합성적 변형에 의한, 임상적으로 중요한 그람-양성 및 그람-음성 세균 및 균류에 대한 광-스펙트럼 항균 활성을 갖는 항생작용 펩티트에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 개선된 혈청 양립성과 감소된 용혈 활성을 갖는 환형 및 짧은 펩티드의 고안에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 그람-양성 및 그람-음성 세균과 다중-약물-내성 병원균에 대한 광-스펙트럼 항균활성과 낮은 용혈 활성을 나타낸다.
본 발명의 한 면에서, 본 발명은 일반적으로 천연 및/또는 비천연 아미노산 잔기로 이루어지고 적어도 하나의 다음의 아미노산 서열을 함유하는 항균성 펩티드를 포함한다:
Xa1-Naa-Xa1-Xa1-Naa-Xa2
또는
Xa1-Naa-Xa2-Xa1-Naa-Xa1
여기서,
Xa1은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 친수성 염기성 아미노산 모이어티이고;
Naa는 트립토판, 페닐알라닌, 프롤린, (나프타-1-일)알라닌 (1-Nal), (나프타-2-일)알라닌 (2-Nal), (벤조티엔-3-일)알라닌 (Bal), 디페닐알라닌 (Dip). (4,4'-바이펜-일)알라닌 (Bip), (안트라센-9-일)알라닌 (Ath) 및 (2,5,7-트리-tert-부틸-인돌-3-일)알라닌(Tbt)로 이루어진 군으로부터 선택되는 천연 및/또는 비천연 소수성 아미노산 모이어티를 나타내고; 그리고
Xa2는 발린, 로이신 및 이소로이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 소수성 아미노산 모이어티를 나타낸다.
또 다른 면에서, 본 발명은 청구항 1의 펩티드기로부터 선택되는 단리되고 정제된 선형 또는 환형 펩티드를 포함하고, 이들은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:
K(2-Nal)RR(2-Nal)I (SEQ ID NO:1)
K(2-Nal)RR(2-Nal)V (SEQ ID NO:2)
K(2-Nal)IK(2-Nal)R (SEQ ID NO:3)
K(2-Nal)RR(2-Nal)VR(2-Nal)I (SEQ ID NO:4)
I(2-Nal)RV(2-Nal)RR(2-Nal)K (SEQ ID NO:5)
K(1-Nal)RR(1-Nal)VR(1-Nal)I (SEQ ID NO:6)
K(Bip)RR(Bip)VR(Bip)I (SEQ ID NO:7)
KWRRWVRWI (SEQ ID NO:8)
또 다른 면에서, 청구항 1의 단리되고 정제된 펩티드는 C-말단 아미노산에서 아미드화되거나, N-말단 아미노산에서 아세틸화되거나 또는 C-말단 아미노산에서 에스테르화될 수 있고, 또는 적어도 하나의 아미노산은 대응하는 D-아미노산으로 변형될 수 있다.
또 다른 면에서, 본 발명은 청구항 1에 따른 단리되고 정제된 펩티드를 운반체 또는 부형제와의 혼합물로 포함하는 조성물을 포함한다.
또 추가의 다른 면에서, 본 발명은 청구항 1에 따른 단리되고 정제된 항균성 펩티드를, 그것을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 그람-음성 세균의 내독소를 불활성화하는 방법, 청구항 1에 따른 단리되고 정제된 항균성 펩티드를 그것을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 미생물 또는 바이러스 감염을 치료하는 방법, 및 청구항 1에 따른 단리되고 정제된 항균성 펩티드를 그것을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 미생물 성장을 억제하는 방법을 포함한다.
또 다른 면에서, 본 발명은 청구항 1의 펩티드와 약제학적 운반체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 면에서, 본 발명은 청구항 1의 펩티드의 역-방향(retro-oriented) 아미노산 서열인 펩티드를 포함한다.
또 다른 면에서, 본 발명은 식 Lys-(2-Nal)-Arg-Arg-(2-Nal)-Val-Arg-(2-Nal)-Ile의 청구항 1의 펩티드와, 식 Lys-(2-Nal)-Arg-Arg-(2-Nal)-Val-Arg-(2-Nal)-Ile의 펩티드를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다.
본 발명은 여러 이점을 제공한다. 우선, 본 발명의 펩티드는 아미노산 잔기가 10 미만이고, 비교적 작은 아미노산으로 세포 막에 도달하기에 효율적이도록 극히 컴팩트하다. 두번째, 본 발명의 최고의 펩티드는 의학적으로 중요한 균류에 대한 활성과 결합된, 항생물질 내성 세균에 대해 강한 광-스펙트럼 활성을 나타낸다. 이에 더하여, 이들 펩티드는 항-내독성 활성과 통상의 항생물질과의 시너지적 작업을 소유한다. 가장 중요하기는, 본 발명은 개선된 혈청 양립성을 제공하고, 천연적으로 발생하는 프로테그린과 인돌리시딘 동족체와 비교하여 인간 적혈구 세포에 대한 극히 낮은 용혈을 나타낸다.
한 면에서, 본 발명은 10 미만의 아미노산 잔기를 갖고 항균활성을 나타내는 펩티드에 관한 것으로, 여기서 상기 펩티드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다:
Xa1-Naa-Xa1-Xa1-Naa-Xa2
또는
Xa1-Naa-Xa2-Xa1-Naa-Xa1
여기서,
Xa1은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 친수성 염기성 아미노산 모이어티이고;
Naa는 트립토판, 페닐알라닌, 프롤린, (나프타-1-일)알라닌 (1-Nal), (나프타-2-일)알라닌 (2-Nal), (벤조티엔-3-일)알라닌 (Bal), 디페닐알라닌 (Dip). (4,4'-바이펜-일)알라닌 (Bip), (안트라센-9-일)알라닌 (Ath) 및 (2,5,7-트리-tert-부틸-인돌-3-일)알라닌(Tbt)로 이루어진 군으로부터 선택되는 천연 및/또는 비천연 소수성 아미노산 모이어티를 나타내고; 그리고
Xa2는 발린, 로이신 및 이소로이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 소수성 아미노산 모이어티를 나타낸다.
본 발명은 바람직한 구현예 및 도면에 나타낸 실험적 자료를 참조로 하여 기재될 것이다.
도 1은 SDS에 결합된 Pac-525의 최종 정제된 NMR 평균 구조를 나타낸다.
도 2(A)는 Pac-625(검은색 원)와 Pac-626(흰색 원)으로 처리한 Bacillus subtillis ATCC6633에 대한 생존 곡선이다.
도 2(B)는 Pac-625(검은색 원)와 Pac-626(흰색 원)으로 처리한 Staphylococcus aureus ATCC9144에 대한 생존 곡선이다.
도 2(C)는 Pac-625(검은색 원)와 Pac-626(흰색 원)으로 처리한 Escherichia coli ATCC25922에 대한 생존 곡선이다.
도 2(D)는 Pac-625(검은색 원)와 Pac-626(흰색 원)으로 처리한 Pseudomonas aeruginosa ATCC9144에 대한 생존 곡선이다.
도 3은 NPN 섭취 (0μg/ml)(검은색 사각형); 1μg/ml(흰색 원); 2μg/ml(흰색 사각형); 및 3μg/ml(흰색 삼각형)에 의해 평가된 Pac-625 유도 내막 투과성을 나타낸다.
도 4(A)는 25mM SDS(검은색 원)과 완충액(흰색 원)에 결합된 1.5㎛ Pac-625에 대한 형광방출 스펙트럼을 나타낸다.
도 4(B)는 25mM SDS(검은색 원)과 완충액(흰색 원)에 결합된 1.5㎛ Pac-625에 대한 스테른-발머 플롯(Stern-Volmer plot)을 나타낸다.
도 5는 10mM SDS, 10mM DPC, 1mM LPC12, 50% TFE 및 완충액에 25℃에서 결합된 100 ㎛ Pac-625에 대한 원편광 이색성 스펙트럼을 나타낸다.
도 6은 멜리틴(검은색 원), Pac-625(흰색원) 및 Pac-626(검은색 삼각형)의 인간 적혈구 세포에 대한 용혈 활성을 나타낸다.
미국특허 제 6,303,575호, 미국특허 제6,180,604호, 미국특허 제 5,821,224호, 미국특허 제5,547,939호, 미국특허 제5,534,939호 , 미국특허 제5,459,325호, 미국특허 제 5,324,716호 및 WO93/14115에 기재된 Trp-풍부 펩티드를 사용함에 의해 천연 아미노산 잔기를 갖는 모든 항균성 펩티드는 인비보에서 신속한 용혈을 겪었다. 인돌리시딘 동족체는 일반적 아미노산 서열 Ac-I-L-P-W-K-W-P-W-W-P-W-X를 가지고, 여기서 X는 1 또는 2 선택된 아미노산이다. 이들 이미 기재된 Trp-풍부 펩티드들은 본 발명의 것들과 구별할 수 있는데, 본 발명의 항균성 펩티드의 디자인은 특정 서열 위치의 천연 및/또는 비천연 아미노산 잔기를, 아미노산이 10개 미만이고, 광-스펙트럼 미생물 활성, 개선된 선택성 및 낮은 용혈성을 갖는 환형 또는 선형 펩티드로 도입하는 것을 지향한다.
Trp-풍부 펩티드의 항세균성 활성이 Trp 잔기 자체의 존재에 의존하지 않고, 오히려 아미노산의 방향족 모이어티의 크기와 형태에 의존한다는 것이 발견되었다(Haug et al., Journal of Peptide Science, vol. 7, pp.425-432, 2001). 락토페리신 유도체의 Trp에 대한 대체물로서 큰 천연 및/또는 비천연 방향족 아미노산의 도입은 항균 활성의 증가를 가져온다(Haug et al., Journal of Peptide Science, vol 7, pp.425-432, 2001). 더우기 항균성 펩티드의 소수성은 그들의 용혈활성과 관계가 있다는 것이 발견되었다. 인돌리시딘의 경우, 모든 5개의 Trp 잔기가 Phe로 치환된 결과 용혈이 감소되는 반면, 항균활성은 유지된다(Subbalakshmi et al., FEBS Letters, vol.395, pp.48~52, 1996). 그러므로, Trp과 유사한 또는 큰 부피를 갖는 천연 및/또는 비천연 방향족 아미노산을 항균성 펩티드에 도입하는 것은 그들의 항균 할성을 증가시키고 따라서 그들의 용혈활성을 감소시킨다.
WO99/21879A1과 WO01/68675A3에 기재된 환형 항균성 펩티드를 사용함과 같이, 선형 항균성 펩티드의 환형화는 선택성과 안정성에 관하여 여러 이점을 가질 것이다. 우선, 펼친(unfolded) 펩티드는 소수성 상호작용에 의해 응집물을 형성하여, 정상 포유동물 세포에 비-특이적 흡수 및 낮은 용해도를 가져온다. 그들의 펼친 형태에 제약을 놓음으로써, 아미노산의 소수성 신장의 노출이 제한되어 그들의 소수성 상호작용이 제한될 수 있다. 더우기, 이들 제약은 음으로-하전된 표적 막과의 초기 결합에서 정전기적 상호작용의 역할을 강화시킬 수 있고, 그러므로 실질적으로 포유동물 세포에 대한 세균의 선택성을 증가시킨다. 두번째, 프로테아제에 의해 결합되고 분열되어질 펩티드는 연장된, 펼친 구조물의 분열 부위에 존재하여야 한다. 그러므로, 단 펩티드의 환형화는 그들의 경직성과 제약된 구조로 인해 프로테아제 활성에 대한 접근성을 제한할 수 있다. 환형화는 그람-음성 세균에 대해서만 활성에 영향을 미치는 것으로 보이므로, 세균-특이 세균용해 펩티드의 고안을 위한 추가의 연구가 필요하다.
대부분의 막-세포용해 펩티드의 경우, 순(net) 전하의 분포와 양은 그들의 생리적 기능과 관련이 있다. 예를 들면, 그들의 나선형 백본을 따라 분포된 낮은 순 음전하 또는 낮은 순 양전하를 갖는 대부분의 펩티드는 포유동물 세포에 대해 또는 포유동물과 세균 세포 모두에 대해 세포용해된다. 한편, 낮은-용혈성 항균성 펩티드는 양쪽친매성 α-나선의 친수성 면을 따라 분포되어 있는 다수의 염기성 아미노산에 의한 높은 순 양전하를 함유하는 경향이 있다.
인돌리시딘의 NMR 구조는 DPC와 SDS 미셀 모두에서 측정되었다. 두 미셀 모두에서, 인돌리시딘은 구조물 말단에 위치한 양으로 하전된 잔기 Arg와 Lys와 소수성 핵을 형성하는 Trp 잔기를 갖는 연장된 구조물을 채택한다. 다른 아미노산 서열 VRRFPWWWPFLRR을 갖는 다른 Trp-풍부 항균성 펩티드, 트리트립티신의 NMR 구조는 함께 클러스트되고 SDS 미셀의 소수성 핵에 삽입된 Trp 잔기를 갖는 양쪽친매성턴-턴(turn-turn) 구조를 나타낸다. 서열 RRWQWR-NH2를 갖는 락토페리신 펩티드(LfcinB4-9)의 잔기 4~9는 LfcinB 보다 나은 항균 활성을 나타내는 것으로 보인다. LfcinB4 -9는 Arg와 Gln 잔기보다 미셀 내에 더 깊게 위치한 Trp 측면사슬을 갖고, SDS 미셀에서 안정한 양쪽친매성 구조를 형성하는 것으로 발견되었다.
더욱 효과적이고 낮은 분자량을 갖는 항균성 펩티드를 개발하고자 하는 본 발명자들의 노력으로, 여러 위치에서 주형으로서 3~9 잔기의 아미노산 길이를 갖는 선형 펩티드 라이브러리를 고안하고 합성하였다. Pac-525로 명칭된, 새롭게 고안된 펩티드, 9개 아미노산 잔기 펩티드인, Ac-KWRRWVRWI-NH2는 그람-양성 및 그람-음성 세균 모두에 대해 개선된 활성 뿐 아니라 감소된 용혈 활성을 나타내었다. 막-유사체 SDS와 DPC 미셀에 결합된 Pac-525의 용액 구조는 2-차원 NMR 방법으로 측정되었다. Pac-525의 SDS 미셀-결합 구조는 잔기 Trp2, Arg3 및 Arg4에서 310 α-나선으로 채택되었다(도 1). 독특하게 배열된 양으로 하전된 잔기들이 함께 응집하여 친수성 패치를 형성하였다(도 1). Trp2, Val6 및 Ile9를 포함하는 3개의 소수성 잔기가 소수성 핵을 형성한다(도 1). 표면 정전기적 포텐셜 맵은 3개의 트립토판 인돌 고리들이 펩티드 백본에 대해 팩되어 양쪽친매성 구조를 형성한다는 것을 나타낸다. 양이온성 양쪽친핵성 구조는 막과의 정전기적 및 소수성 상호작용 모두를 최대화하는데 가장 알맞을 것이다.
Pac-525의 아미노산 서열과 용액 구조를 검토하면서, Pac-525rev로 명명된Pac-525의 역서열, Ac-IWRVWRRWK-NH2는 동일한 아미노산을 갖고 Pac-525와 유사한 항균활성을 갖는다는 것이 관찰되었다. 이에 더하여, Pac-525rev의 용혈활성은 Pac-525의 용혈활성과 매우 유사하였다. NMR에 의한 측정에 따르면, Pac-525와 Pac-525rev 모두 유사한 α-나선구조를 채택한다. 더우기, 둘 다 한 측면에 염기성 아미 노산과 다른 측면에 소수성 아미노산을 갖는 양쪽친매성 구조를 나타낸다. 이들 구조는 Pac-525와 Pac-525rev의 항균활성의 높은 경향과 낮은 용혈활성에 대해 설명을 제공한다. E. coli 균주(ATCC 25922 및 ATCC 10536), S. aureus 균주(ATCC29213 및 ATCC 33591, Methicillin Resistant) 및 Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) 을 사용하여 Pac-525의 항균활성을 측정하였다. MIC는 E. coli 및 Pseudomonas aeuruginosa에 대해서는 2μM이었고, S.aureus 에 대해서는 4μM이었다. 이들 MIC는 Pac-525이 그람-양성, 그람-음성 및 무기성 박테리아에 대해 항균 활성을 나타낸다는 것을 나타낸다. MIC(2~4μM)과 비교하여, Pac-525의 용혈 활성은 매우 낮다. 이것은 350μM 펩티드 농도에서 인간 적혈구 세포의 50% 용해를 제공한다. E. coli 및 S. aureus에 대한 Pac-525rev의 MIC값은 각각 4μM 과 8μM 일 것이라는 것이 발견되었다. Pac-525rev의 용혈활성은 매우 낮았고 Pac-525의 것과 유사하였다(880μM 에서 인간 적혈구 세포에 대해 50% 용해).
본 발명은, 천연 및/또는 비천연 아미노산 잔기를 도입함에 의해 Pac-525의항균 활성을 증가시키고 용혈 활성을 감소시키기 위한, 그리고 환형화에 의해 및 천연적으로 발생하는 L-형 아미노산을 D-형 아미노산으로 대체함에 의해 프로테아제에 대한 안정성을 증가시키기 위한 Pac-525의 추가의 변형을 제공한다.
실시예 1: 펩티드의 고안, 합성, 정제 및 평가
선형 펩티드를 PAL 수지(5-(4-Fmoc-아미노메틸-3,5-디메톡시페녹시-발레인 산-MBHA)에 대해 수동적으로 표준 Fmoc(N-(9-플루오로에닐)메톡시옥시카르보닐) 프 로토콜 고체상 펩티드 합성법을 이용하여 고체상 펩티드 합성에 의해 합성하였다. 커플링 반응을 약 1 내지 1.5 시간에 동안 수행하였고 닌히드린 시험에 의해 체크하였다. N-말단 Fmoc 보호기를 실온에서 2시간동안 디메틸포름아미드에서 20% 피페리딘으로 부드럽게 교반하면서 제거하였다. 펩티드의 아세틸화반응을 디메틸포름아미드 중에 10-배 아세트산 무수물과 20-배 DIPEA를 첨가하고 2시간 동안 실온에서 교반시켜 달성하였다. 수지로부터 펩티드의 분열은 1~1.5 시간 동안 95% TFA 분열 혼합물과 혼합하는 것으로 수행하였다. 본 발명의 환형 펩티드는 환형 펩티드의 제조를 위해 알려진 본 분야의 어느 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 고체-상 펩티드 합성에 의해 제조된 선형 펩티드를 표준화학을 사용하여 환형화할 수 있다. 바람직하기는, 선형 펩티드를 환형화하기 위해 사용되는 화학은 실질적으로 펩티드의 열화를 피할 수 있도록 충분히 순한 것일 것이다. 펩티드의 환형화를 위한 적절한 화학뿐 아니라 여기에 기재된 펩티드의 합성에 알맞는 방법은 본 분야에 잘 알려져 있고 Dong et al., 1995, J.Am. Chem. Soc. 117, pp.2726-2731, Ishida et al., 1995, J. Org. Chem., 60, pp.5374-5375, Toniolo, 1990, Int. J. Peptide Protein Res., 35, pp.287-300 및 WO99/21879A1의 참고문헌에서 발견할 수 있다. 그리고 나서, 조(crude) 펩티드는 Vydac C18 역상 칼럼을 사용하는 역상-고압 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 정제될 수 있다. 용출을 위한 이동상은 빌트인 구배를 사용한 다양한 비율로 혼합된 아세토니트릴과 탈이온수의 혼합물이다. 검출을 위한 파장은 225nm와 280nm로 맞추었고, 용출을 위한 흐름속도는 4㎖/분이었다. 주 펩티드 산물을 신속 원자공격 질량 분광광도계에 의해 각 펩티드의 분자량을 측정하여 평가하였다. 각 펩티드의 순도를 분석 RP-HPLC에 의해 분석하였다. 펩티드의 동정은 전자분무 질량 분석 RP-HPLC로 확인하였다.
본 발명의 펩티드는 다음 식 중 하나로 기재될 수 있다.
Xa1-Naa-Xa1-Xa1-Naa-Xa2
또는
Xa1-Naa-Xa2-Xa1-Naa-Xa1
여기서,
Xa1은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 친수성 염기성 아미노산 모이어티이고;
Naa는 트립토판, 페닐알라닌, 프롤린, (나프타-1-일)알라닌 (1-Nal), (나프타-2-일)알라닌 (2-Nal), (벤조티엔-3-일)알라닌 (Bal), 디페닐알라닌 (Dip). (4,4'-바이펜-일)알라닌 (Bip), (안트라센-9-일)알라닌 (Ath) 및 (2,5,7-트리-tert-부틸-인돌-3-일)알라닌(Tbt)로 이루어진 군으로부터 선택되는 천연 및/또는 비천연 소수성 아미노산 모이어티를 나타내고; 그리고
Xa2는 발린, 로이신 및 이소로이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 소수성 아미노산 모이어티를 나타낸다.
본 발명의 펩티드의 위상은 환형 또는 선형일 수 있다.
본 발명의 대표적인 펩티드 동족체 및 그들의 할당된 이름을 표 1에 기재하 였다. 비천연 아미노산을 제외한 모든 아미노산은 한 글자의 아미노산 코드로 표시하였다.
표 1. 본 발명의 펩티드 동족체
Figure 112007048301388-PCT00001
주해: C는 환형 위상을 나타내고 L은 선형 위상을 나타낸다.
본 발명의 펩티드는 N-말단에서 아세틸화되고, C-말단에서 아미드화 또는 에스테르화되거나 또는 그들의 D-아미노산 동족체로 합성될 수 있다. 최종 펩티드를 수지로부터 분할 전에 아세트산 무수물과 반응시킴에 의해 펩티드의 N-말단을 아세틸화하는것 또는 Boc(부톡시카르보닐)을 사용한 메틸벤즈히드릴아민 수지와 같은 적절한 수지를 이용하여 펩티드의 C-말단을 아미드화하는 것은 펩티드 합성 분야에 잘 알려져 있다. 또한, 펩티드의 C-말단 아미노산을 에스테르화하는 것도 본 분야 에 잘 알려져 있다. D-아미노산을 함유하는 펩티드를 펩티드 합성중 L-아미노산을 D-아미노산으로 대체함에 의해 합성할 수 있다는 것은 본 분야에 잘 알려져 있다. 모든 수지와 아미노산은 NovabiochemTM 또는 SynpepTM으로부터 시판된다.
실시예 2. 인 비트로 펩티드 활성의 측정
항균제의 인 비트로 항균 활성을 표준 NCCLS 세균 및 균류 억제 분석법 또는 최소억제 농도(MIC) 시험을 사용하여 시험하였다. MIC 값은 시험 유기물의 가시적 성장이 억제되고 감소된 펩티드의 최저 온도이다. MIC 분석에 사용된 시험 유기물을 표 2에 기재하였다.
표 2: MIC 측정에 사용된 시험 균주
Figure 112007048301388-PCT00002
시험 유기물의 밤샘 배양물을 희석하여 Meuller-Hinton 액체배지(MHB) 중에 약 105 콜로니를 함유하는 접종물을 생성하였다. 펩티드 원액으로부터, 5㎕ 부피의 펩티드 계열 희석물을 제조하였고 96-웰 미세역가 플레이트의 모든 웰을 순차적으 로 시험 유기물의 희석된 배지로 접종시켰다. 37℃에서 18시간 배양 후, 세포 성장의 지시자로서 혼탁도에 대해 결과를 분석하였다. 펩티드에 대한 MIC 값을 표 3과 표 4에 나타내었고 도2(A), 2(B), 2(C) 및 2(D)는 Pac-625와 Pac-626에 대한 생존률을 나타낸다.
표 3: E. coli 및 S. aureus에 대한 합성 펩티드의 MIC(μg/ml)값
Figure 112007048301388-PCT00003
주해: C는 환형 위상을 나타내고 L은 선형 위상을 나타낸다.
표 3은 3개의 개별적인 MIC 시험을 기준으로 평균 MIC 값을 나타낸다. Pac-625, Pac-626, Pac-627 및 Pac-628은 그람-양성 및 그람-음성 세균에 대한 최대 항균활성을 나타내었고 Pac-401, Pac-402 또는 Pac-403보다 큰 미생물 항균 활성을 나타내었다. 표 4는 여러 세균들과 균류 균주에 대한 Pac-625와 Pac-626의 MIC(μ g/ml)값을 나타낸다.
표 4: 여러 세균들과 균류 균주에 대한 Pac-625와 Pac-626의 MIC(μg/ml)값
Figure 112007048301388-PCT00004
실시예 3: 막 투과성 분석
펩티드 변이체의 외부막 투과 활성을, E. coli의 고유 세포를 사용하여, 1-N-페닐아크릴아미드(NPN) 섭취 분석에 의해 측정하였다. NPN은 수성환경에서 약한 형광을 나타내었지만, 소수성 환경에서는 강한 형광을 나타내었다. NPN은 소수성이므로, 이것은 외부막 투과성의 정도에 대한 직접 측정을 제공한다. E. coli는 일반 조건에서 NPN을 거의 또는 전혀 취하지 않는다. 투과성 화합물(EDTA, 폴리믹신 B, 네오마이신, 또는 항균성 펩티드)의 존재에서, 세균성 외막으로 분배된 NPN는 형광의 증가를 가져온다. 형광은 펩티드의 농도에 따라 변할 것이다.
밤샘 배양물 1ml를 매질 50ml를 접종하는데 사용하였고 37℃에서 흔들면서 배양하였다. 배양물을 0.4~0.6의 OD600으로 성장되도록 하였고, 세포를 10분 동안 3500rpm으로 회전시키고, 세척하고, 그리고 완충액에서 0.5의 OD600으로 재현탁시 켰다. OD600을 기록하고, 세포 1ml(OD600=0.5)을 큐벳에 첨가하고 2~5초 후 측정하였다. 혼합하기 위해 흔들고, 0.5mM NPN 20㎕를 첨가하고 2~5초 후 측정하였다. 10㎕ 항생물질 100× 원하는 최종 농도를 첨가하고, 혼합을 위해 흔들고, 1~5분 내에 최대값에 도달할 때까지 측정하였다. NPN 섭취에서 최대 증가의 50%를 가져오는 펩티드의 농도를 P50으로 기록하였다. 모든 펩티드는, 표 5에 나타낸 NPN 섭취 분석 결과에 의해 설명되는 바와 같이, 막과 상호작용을 할 수 있었다. 도 3은 여러 NPN 농도에서 Pac-625의 막 투과성을 나타낸다.
표 5: E. coli의 외막을 가로지른 NPN 섭취를 투과하고 촉진하는 능력
Figure 112007048301388-PCT00005
주해: L은 선형 위상을 나타낸다.
실시예 4: 나프틸알라닌 잔기의 환경 평가
트립토판의 극성에 대한 민감성 때문에, 트립토판을 극성과 결합연구에 사용하여왔다. 펩티드의 환경을 측정하는 실험의 첫번째 세트에서, 트립토판의 형광방출 스펙트럼을 pH 7.4에서 PBS 중에서, 그리고, PE/PG(7:3, w/w), 전형적인 E. coli의 인지질 조성물이나, 또는 PC/콜레스테롤(10:1, w/w), 인간 적혈구의 외부 소엽을 모방하기 위해 사용되는 인지질 조성물로 이루어진 비히클의 존재하에서 모니터하였다. 형광 스펙트럼과 방출강도를, 큐벳을 유지하는 챔버를 25℃로 유지하기 위해 순환 수조가 장착된 Perkin-Elmer 55S 형광스펙트럼으로 측정하였다. 형광측정 연구에서, 지질/펩티드 몰비를 1000:1로 유지하여 유리 펩티드의 스펙트럼 기여를 무시할 수 있도록 하였다. 이 연구의 결과를 표 6에 요약하였다. 완충액에서, Pac 625, Pac 626 및 Pac 627의 2-Na1과 1-Nal 잔기는 349±2nm 근처에서 최대의 형광 방출을 나타내었고, 이것은 Nal에 대한 친수성 환경을 반영한다. PE/PG 비히클이 펩티드를 함유하는 수용액에 첨가되었을 때, 방출 최대의 블루 시프트가 모든 펩티드에 대해 관찰되었다. 본 발명자들의 실험 조건에서, 펩티드는 334±2nm 근처에서 최대 형광방출을 나타낸다. Nal 잔기의 스펙트럼의 변화는 더욱 소수성 환경으로의 재배치를 반영한다. PC/콜레스테롤 비히클의 존재하에, 펩티드에 대해 블루 시프트가 관찰되지 않았고, 이것은 이들 펩티드가 PC/콜레스테롤 비히클에 결합하지 않거나 또는 선택적으로 매우 약하게 결합된다는 것을 나타낸다.
표 6: 완충액 및 다양한 인지질 조성물의 존재에서 펩티드의 Nal 방출 최대(nm)
Figure 112007048301388-PCT00006
주해: L은 선형 위상을 나타낸다.
실험의 두번째 세트에서, 형광 방출 스펙트럼을 LS55 스펙트로플루오로메 터(Perkin-Elmer)에서 기록하였다. 측정은 300~450nm에서 0.5nm의 증가로 4×10-mm 석영 셀을 사용하여 25℃에서 수행되었다. 여기와 방출 슬릿 폭을 모두 5nm로 하면서 여기 파장을 295nm로 맞추었다. 펩티드 샘플의 농도는 25mM SDS의 존재 또는 부재하에, 20mM 인산염 나트륨 완충액(pH 4.5)중 1.5μM이었다. 스펙트럼을 펩티드가 없는 대응 용액의 기준 스펙트럼을 제하여 기준선 보정을 하였다. 형광 급랭 실험에서, 급랭물질(quencher)로서 아크릴아미드를 사용하였다. 아크릴아미드를, 최종농도가 2~116.5mM이 확실하도록 첨가하였다. 급랭된 샘플을 295mM에서 여기시키고, 방출을 급랭물질의 부재하에 파장 스캔으로부터 결정된 최대 피크에서 모니터하였다. 펩티드의 형광에 대한 아크릴아미드의 효과를 변형된 Stern-Volmer 식을 사용하여 분석하였다:
F0/F = 1+ KSV[Q]
여기서, KSV는 Stern-Volmer 급랭 상수이고 [Q]는 급랭물질 농도이다.
그 환경의 극성에 대한 Nal의 민감도로 인해, 형광 스펙트럼은 방향족-풍부 항균성 펩티드의 극성과 미셀 결합 연구에 대해 사용되었다. 인산 완충액에서, Pac-625의 형광 스펙트럼은 356.5nm에서 방출 최대를 나타낸다(도 4A). 반면, SDS를 첨가함에 의해, 그것의 형광 스펙트럼은 강도의 증가를 수반하는 5.0nm 블루 시프트를 나타내었다. 이 블루 시프트는 Pac-625의 Nal 잔기가 더욱 소수성 환경에 위치한다는 것을 나타낸다. 형광 강도의 증가는 트립토판 잔기가 더욱 입체적으로 한정된다는 것을 제안한다. 일반적으로, 형광 강도는 환경의 극성이 감소됨에 따라 증가한다.
Nal 잔기가 미셀의 소수성 핵에서 격리된 정도를 측정하기 위해, 아크릴아미드를 사용하여 형광 급랭 실험을 수행하였다. Pac-625에 대한 효과적인 Stern-Volmer 상수(KSV(eff))를 SDS 미셀의 부재와 존재하에서 20.06±0.023 및 14.97±0.023M-1로 산출하였다. 아실아미드로부터 미셀에 의한 Nal 잔기의 보호는 이들이 부분적으로 미셀의 소수성 핵에 묻힌다는 것을 제안한다.
실시예 5: CD 분광법으로 측정한 펩티드의 2차 구조
첫번째 실험에서, CD 스펙트럼을 d-10-캄포술폰산으로 교정한 후 AVIV 62DS 분광편광계에서 기록하였다. 모든 측정을 pH 7.2의 10mM 인산나트륨 완충액 중의 펩티드 농도 30μM에서 1-mm 경로-길이 큐벳을 사용하여 실시하였다. 극-UV 스펙트럼을 190~260nm의 범위에서 스텝사이즈 0.5nm 및 평균시간 1초를 이용하여 수집하였다. 인지질이 없을 때, Pac-401, Pac-403, Pac-625 및 Pac-626을 표 7에 나타낸 바와 같이, 무질서 구조로 평가하였다.
표 7: SDS중의 인산염 완충액 형태에서의 펩티드의 형태
Figure 112007048301388-PCT00007
주해: C는 환형 위상을 나타내고 L은 선형 위상을 나타낸다.
이에 더하여, Pac-625에 대한 CD 스펙트럼을 물 또는 수성 SDS, DPC, LPC12(리소포스파티딜콜린), 및 TFE에서 pH 4.5 및 25℃에서 경로길이 1mm 큐벳을 사용하여 실시하였다. 10mM 원액의 정량적인 연속 희석에 의해 펩티드 농도 10μM를 얻었다. 222nm에서 평균 잔기 타원률은 deg.cm2/dmol의 단위로, [θ]222=θ/lcn으로부터 산출되었고, 여기서 θ는 222에서 관찰된 타원률이고, l은 셀의 경로길이이고, c는 샘플의 농도이고, n은 서열에서 펩티드 결합의 수이다. 나선의 분획을 관계식 f=[θ]obs/[θ]max로부터 얻었다. [θ]obs는 222nm에서 관찰된 평균 잔기 타원률이고, [θ]max=((n-4)/n)[θ]∞ = 사슬 길이 n에서 최대 평균 잔기 타원률 값이고, 여기서 [θ]∞= -40,000deg.cm2/dmol이다.
SDS, DPC, LPC12(리소포스파디틸콜린), 및 TFE와 또는 없이 기록된 Pac-625 의 CD 스펙트럼을 도 5에 나타내었다. 수용액 중에서, 스펙트럼은 200nm에서 통상의 랜덤 코일 형태를 나타내는 음(negative)의 밴드를 나타낸다. TFE 뿐 아니라, SDS, DPC 및 LPC12의 미셀의 추가는 더욱 규칙적인 구조를 가져오는 극적인 구조 변화를 일으킨다. 이것은 200nm에서의 음의 밴드가 덜 음이고, 220nm에서의 증가된 음의 밴드는 미셀과 TFE의 존재에서 관찰되었다는 사실에 의해 지지된다.
표 8은 Pac-625과 그것의 유도체의 구조-활성 관계를 나타낸다. 양으로 하전된 아미노산(Pac-621 및Pac-629)에서의 감소는 그들의 항균 활성을 감소시킨다는 것을 발견하였다. 선택적으로, Pac-625의 2-Nal 잔기의 대체는 그들의 항균 활성(Pac-627 및Pac-628)에 대한 영향이 최소 또는 없었다. 그러므로, 항균성 펩티드의 순 양전하는 세균막을 향한 그들의 동요 활성을 촉진한다. 반대로, 인간 적혈구의 외막은 유세하기는 양쪽성 이온성 포스파디틸콜린과 스핑고미엘린 인지질로 이루어져 있다. Pac-625의 경우, 9개의 잔기 중에서 4개는 양으로 하전된 아미노산이다. 이것은 Pac-625의 광범위한 항균활성과 낮은 용혈활성을 설명할 것이다.
표 8: E. coli 및 S. aureus에 대한 Pac-625와 그것의 유도체에 대한 MIC(μg/ml) 값
Figure 112007048301388-PCT00008
실시예 8: 적혈구 용해
Pac-401, Pac-403, Pac-625 및 Pac-626을 인간 적혈구 세포(RBC)에 대한 용혈에 대해 조사하였다. EDTA를 갖는 RBC를 PBS(800g, 10분)으로 3회 린스하였고 PBS 중에 재현탁시켰다. RBC를 인산염-완충 살린으로 10% 희석시키고 각 에펜돌프에 50㎕씩 놓았다. 그리고 나서, PBS에 용해된 펩티드를 RBC의 10% 용액 50㎕에 첨가하고 1시간 동안 37℃에서 배양시켰다(최종 RBC 농도, 5% v/v). 샘플을 800g에서 10분동안 OD540에서 원심분리하였다. 여러 농도의 펩티드를 예열된 RBC와 함께 배양하고 용혈 백분률을 측정하였다. 결과는 시험된 모든 펩티드가 멜리틴과 같은 다른 항균성 펩티드보다 RBC에 대해 덜 용혈성이라는 것을 나타낸다.
표 9: 여러 펩티드 농도에서 적혈구 용해
Figure 112007048301388-PCT00009
주해: L은 선형 위상을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> Pacgen Biopharmaceuticals Corporation Cheng, Jya-Wei Tzeng, Shiou-Ru <120> Antimicrobial Peptides With Reduced Hemolysis And Methods Of Their Use <130> P550 0009 <140> PCT/CA2005/001840 <141> 2005-12-02 <150> US 11/000,970 <151> 2004-12-02 <150> US 10/247,476 <151> 2002-09-20 <160> 8 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> Xaa is (naphtha-2-yl)alanine . <400> 1 Lys Xaa Arg Arg Xaa Ile 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(6) <223> Xaa is (naphtha-2-yl)alanine <400> 2 Lys Xaa Arg Arg Xaa Val 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(6) <223> Xaa is (naphtha-2-yl)alanine <400> 3 Lys Xaa Ile Lys Xaa Arg 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> Xaa is (naphtha-2-yl)alanine <400> 4 Lys Xaa Arg Arg Xaa Val Arg Xaa Ile 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> Xaa is (naphtha-2-yl)alanine <400> 5 Ile Xaa Arg Val Xaa Arg Arg Xaa Lys 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> Xaa is (naphtha-1-yl)alanine <400> 6 Lys Xaa Arg Arg Xaa Val Arg Xaa Ile 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(9) <223> Xaa is (4,4'-biphen-yl)alanine <400> 7 Lys Xaa Arg Arg Xaa Val Arg Xaa Ile 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Peptide <400> 8 Lys Trp Arg Arg Trp Val Arg Trp Ile 1 5

Claims (33)

  1. 하기식 중 하나로 기재되고, 항균활성을 갖는, 단리되고 정제된 환형 또는 선형 펩티드:
    Xa1-Naa-Xa1-Xa1-Naa-Xa2
    또는
    Xa1-Naa-Xa2-Xa1-Naa-Xa1
    여기서,
    Xa1은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 친수성 염기성 아미노산 모이어티이고;
    Naa는 트립토판, 페닐알라닌, 프롤린, (나프타-1-일)알라닌 (1-Nal), (나프타-2-일)알라닌 (2-Nal), (벤조티엔-3-일)알라닌 (Bal), 디페닐알라닌 (Dip). (4,4'-바이펜-일)알라닌 (Bip), (안트라센-9-일)알라닌 (Ath) 및 (2,5,7-트리-tert-부틸-인돌-3-일)알라닌(Tbt)로 이루어진 군으로부터 선택되는 천연 및/또는 비천연 소수성 아미노산 모이어티를 나타내고; 그리고
    Xa2는 발린, 로이신 및 이소로이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 소수성 아미노산 모이어티를 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서, 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 펩티드:
    K(2-Nal)RR(2-Nal)I (SEQ ID NO:1)
    K(2-Nal)RR(2-Nal)V (SEQ ID NO:2)
    K(2-Nal)IK(2-Nal)R (SEQ ID NO:3)
    K(2-Nal)RR(2-Nal)VR(2-Nal)I (SEQ ID NO:4)
    I(2-Nal)RV(2-Nal)RR(2-Nal)K (SEQ ID NO:5)
    K(1-Nal)RR(1-Nal)VR(1-Nal)I (SEQ ID NO:6)
    K(Bip)RR(Bip)VR(Bip)I (SEQ ID NO:7)
    KWRRWVRWI (SEQ ID NO:8)
  3. 제1항에 있어서, 상기 단리되고 정제된 펩티드는 선형 위상인 펩티드
  4. 제1항에 있어서, 상기 단리되고 정제된 펩티드는 환형 위상인 펩티드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단리되고 정제된 펩티드는 C-말단 아미노산에서 아미드화된 것인 펩티드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 N-말단 아미노산에서 아세틸화된 것인 펩티드.
  7. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 C-말단 아미노산에서 에스테르화된 것인 펩 티드.
  8. 제1항에 있어서, 상응하는 D-아미노산으로 변형된 하나 이상의 아미노산을 갖는 펩티드.
  9. 제1항에 따른 단리되고 정제된 펩티드를 운반체 또는 부형제와의 혼합물로 포함하는 조성물.
  10. 제1항에 따른 펩티드와 약제학적 운반체를 포함하는 약제학적 조성물.
  11. 제1항의 펩티드의 역-방향(retro-oriented) 아미노산 서열인 펩티드.
  12. 제1항에 따른 단리되고 정제된 항균성 펩티드의 유효량을 그것을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 그람-음성 세균의 내독소를 불활성화하는 방법.
  13. 제1항에 따른 단리되고 정제된 항균성 펩티드의 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 미생물 또는 바이러스 감염을 치료하는 방법.
  14. 제1항에 따른 단리되고 정제된 항균성 펩티드의 유효량을 그것을 필요로 하 는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 미생물의 성장을 억제하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 식 Lys-(2-Nal)-Arg-Arg-(2-Nal)-Val-Arg-(2-Nal)-Ile의 펩티드.
  16. 제15항의 펩티드와 약제학적 운반체를 포함하는 약제학적 조성물.
  17. 10개 미만의 아미노산 잔기를 갖고 항균활성을 나타내는 펩티드로, 상기 펩티드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고:
    Xa1-Naa-Xa1-Xa1-Naa-Xa2
    또는
    Xa1-Naa-Xa2-Xa1-Naa-Xa1
    여기서,
    Xa1은 라이신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 친수성 염기성 아미노산 모이어티이고;
    Naa는 트립토판, 페닐알라닌, 프롤린, (나프타-1-일)알라닌 (1-Nal), (나프타-2-일)알라닌 (2-Nal), (벤조티엔-3-일)알라닌 (Bal), 디페닐알라닌 (Dip). (4,4'-바이펜-일)알라닌 (Bip), (안트라센-9-일)알라닌 (Ath) 및 (2,5,7-트리-tert-부틸-인돌-3-일)알라닌(Tbt)로 이루어진 군으로부터 선택되는 천연 및/또는 비천연 소수성 아미노산 모이어티를 나타내고; 그리고
    Xa2는 발린, 로이신 및 이소로이신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 소수성 아미노산 모이어티를 나타낸다.
  18. SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:8로 표현되는 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티드.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 펩티드는 선형 위상인 펩티드.
  20. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 펩티드는 환형 위상인 펩티드.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드는 C-말단 아미노산에서 아미드화된 것인 펩티드.
  22. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드는 N-말단 아미노산에서 아세틸화된 것인 펩티드.
  23. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드는 C-말단 아미노산에서 에스테르화된 것인 펩티드.
  24. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드는 하나 이상의 D-아미노산을 포함하는 것인 펩티드.
  25. 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항의 펩티드의 역-방향(retro-oriented) 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
  26. SEQ ID NO:5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
  27. 제17항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 펩티드와 운반체 또는 부형제를 포함하는 조성물.
  28. 제17항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 펩티드와 약제학적 운반체를 포함하는 약제학적 조성물.
  29. 제17항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 펩티드의 유효량을 그것을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 그람-음성 세균의 내독소를 불활성화하는 방법.
  30. 제17항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 펩티드의 유효량을 개체에 투여하 는 단계를 포함하는, 개체의 미생물 또는 바이러스 감염을 치료하는 방법.
  31. 제17항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 펩티드의 유효량을 그것을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 미생물의 성장을 억제하는 방법.
  32. SEQ ID NO:4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
  33. 제32항의 펩티드와 약제학적 운반체를 포함하는 약제학적 조성물.
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