JP5913479B2 - ヒト成長ホルモンを有効成分として含む発毛の促進用の組成物 - Google Patents
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Description
<発明の構成>
本発明者らは、ヒト成長ホルモンの新規な用途を探すために、鋭意研究した結果、ヒト成長ホルモンを皮膚に局所的に適用すると、皮膚状態を大いに改善することができることを見出した。ヒト成長ホルモンによる現在の処置は、注射投与方式であって、主に小人症と成人のヒト成長ホルモン欠乏症を治療するためのものである。従来は、ヒト成長ホルモンの大きい分子量と教科書的なヒト成長ホルモンの作用経路に対する先入見のため、正常皮膚に局所的に適用して有効な効能を期待するということは、考えられないことであった。本発明は、このような当業界の通常的な常識または知識から大きく外れたものであって、ヒト成長ホルモンの正常皮膚に対する局所的適用の効能を最初に確認したことにその特徴がある。本発明は、ヒト成長ホルモンを毛孔と表皮の二つの経路を通じて皮膚に適用させる最初の発明である。
<発明の具体的実施例>
以下、具体的実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
<<実施例I:様々な剤形のヒト成長ホルモン−含有リポソーム(Lipo−hGH)の製造方法>>
<<<A型(クリーム型):ヒト成長ホルモン−含有クリーム剤形>>>
A型の製造に利用されたリン脂質は、「lipoidS100(Lipoid GmbH, Germany)」または「lipoid S75(Lipoid GmbH, Germany)」である。
<<<B型(リポソーム型):ヒト成長ホルモン−含有リポソーム剤形>>>
B型の製造に利用されたリン脂質は、大豆レシチン(ShinDongBangCorp.,South Korea)、Metarin P(Degussa Texturant Systems DeutschlandGmbH&Co.KG)、NutripurS(DegussaTexturant Systems Deutschland GmbH&Co.KG)、またはEmultop(Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH&Co.KG)である。
<<実施例II:FPLC分離及びSDS−PAGE分析>>
前記実施例Iの剤形Bのヒト成長ホルモン−含有リポソームの分析のために、常温でFPLC(Actaexplorer,Amersham Bioscience)にsuperdex 200HR/30カラムを装置して、カラムボリュームの二倍の緩衝溶液(20mMNaH2PO4、1mM EDTA及び150mM NaCl)で平衡化させた後、ヒト成長ホルモン−含有リポソームを分離及びその分画を分取し、これをSDS−PAGEで分析した。図3から確認できるように、約22kDa付近で、ヒト成長ホルモンのバンドが見られる。
<<実施例III:リポソーム内のヒト成長ホルモンの定量>>
HPLC(Shimazu)にC18Delta packカラム(Waters、USA)を装着して、溶媒Aは、0.1%TFAアセトニトリル、溶媒Bは、0.1%TFAH2Oを使用し、濃度勾配(B 60−10%:0−25min,B 60%:25.01−30min)方式により、流速1ml/minで逆相−HPLCを行った。蛍光検出器(excitation:295nm、range:270−300nm;emission:350nm、range:300−400nm)を利用して、オーブン温度55℃、ランタイム30分の機器条件で標準試料(Internationalstandardヒト成長ホルモンNIBSC code 98/574)を定量した後、試料前処理過程(ヒト成長ホルモンを含有したリポソーム溶液を、超音波を利用して破砕した後、50mMTris−Cl pH8.0 、1mMEDTA、8Mウレア、2%Tween20溶液を試料と同じ容量で添加後、ピペッティングする)を経て、蛍光検出器を利用してHPLCで定量した(図4参照)。
<<実施例IV:リン脂質含量の分析>>
HPLC(Shimazu)にSpherisorbS5 NH2カラム(Waters)を装着して、溶媒として60%アセトニトリル、30%メタノール及び5%H2Oを使用して、等溶媒濃度勾配(Isocraticgradient)方式により、流速1ml/minでHPLCを行った。紫外線検出器(215nm)を利用して、オーブン温度35℃、ランタイム20分の機器条件でリン脂質を、メタノール:クロロホルム(90%:10%)の溶液に完全に溶解して定量した。同じ方式で本発明のヒト成長ホルモン−含有リポソーム溶液を、メタノール:クロロホルム(90%:10%)の溶液に完全に溶解させた後、HPLCで定量した(図5参照)。
<<実施例V:安定性試験>>
前記実施例Iで製造されたB剤形のヒト成長ホルモン−含有リポソームの安定性試験を次のように行った:0.1%メチルパラベンを含有した本発明のLipo−hGHを褐色瓶に入れて、それぞれ4℃及び15〜30℃に放置し、1週間隔でhGH含量をHPLCで定量して、安定性を調べた。図6から確認できるように、本発明のLIpo−hGHは、貯蔵10ヶ月後、4℃では初期hGH含量の87.5%存在して、室温では、75%存在することを確認した。したがって、本発明のLipo−hGHは、安定性に優れていることが分かる。
<<実施例VI:安定性試験>>
本発明のヒト成長ホルモン含有リポソーム(実施例IのB剤形)の安全性を検査するために、ヒト角質細胞株であるHaCaT(DKFZ,Germany)とヒト胚芽繊維芽細胞であるHEF(giftfrom Prof.Lee,Jaeyong,Department ofBiochemistry,School of Medicine,Hallym University)に対する細胞毒性を調べた。
<<実施例VII:ナノリポソーム剤形のLipo−hGHのNb2細胞増殖の分析>>
Nb2noblerat lymphoma cellline(NIBSC ECACC #97041101)1×105細胞/ml 50μlが入っている96ウェルプレートのウェルに、S−hGH(標準ヒト成長ホルモン、Standardhuman growth hormone、NIBSCcode 98/574)、S−hGHに1000倍希釈された試料前処理溶液(ヒト成長ホルモンを含有していないリポソーム溶液を超音波(sonicator)を利用して破砕後、50mMTris−Cl pH8.0、1mM EDTA、8Murea,2%Tween20溶液を試料と同じ容量で添加後、ピペッティング)が添加された試料、または、試料前処理過程(ヒト成長ホルモンを含有したリポソーム溶液を超音波(sonicator)を利用して破砕後、50mMTris−Cl pH8.0、1mM EDTA、8Murea,2%Tween20溶液を試料と同じ容量で添加後、ピペッティング)を経た実施例IのB剤形Nanolipo−hGH(N−hGH)を1000倍希釈した溶液が添加された試料を添加した。5日間、37℃、5%CO2で培養した後、増殖された細胞の量を、MTTを利用して測定した。hGHが添加されていない対照群の平均吸光度を100%とした時、試料が添加された群の相対的な値を計算した。
<<実施例VIII:粒子大きさ分布の分析>>
前記実施例においてゲル透過クロマトグラフィで分離した剤形BのLipo−hGHを、ParticleSize Analyzer (Mastersizer2000/Malvern Instruments Ltd.)を利用して、屈折率1.52で粒子大きさ分布を分析した(図13参照)。図13から分かるように、本発明のLipo−hGHの粒子大きさは、0.193μm大きさで最大分布を示し、剤形BのLipo−hGHは、ナノ大きさで存在することが分かる。
<<実施例IX:シワ改善効能の分析>>
4週齢の無毛マウス(韓国化学研究院から購入)と実施例IのB剤形Nanolipo−hGH(N−hGH)を利用して実験した。動物飼育室の温度は、22±2℃、湿度は、55〜60%に維持して、明暗循環が12時間サイクルで調節されるようにして、放射線照射で滅菌した固形飼料(中央実験動物、Seoul、Korea)と滅菌した給水を自由に摂取するようにした。2週間ほどの適応期間を経た。このようなヌードマウスの背中部位にシワを誘導するために、UVB−20mJを1週3回照射する方式で8週間照射した。その後、化粧用ブラシを利用して、UVBが照射された背中に試料及び対照群溶液を8週間塗布した。その後、シワ改善効果をDonald方法(Hyun−SeokKim et.al,Mech.Ageing Dev.(2005.8.16 in press))により評価した。
<<実施例X:ニキビ治療効能の分析>>
本発明のヒト成長ホルモン−含有リポソームのニキビ治療効能を次のように調べた:
15〜40歳の女性のうち、顔の肌にニキビを有する60名を、20名ずつランダムに三つのグループに分けて、前記実施例IのhGH含有リポソーム剤形B型(剤形1)、リポソームのみの比較溶液(剤形2)、比較緩衝溶液(剤形3)を、それぞれ3週間、朝/夜の一日2回ずつ、洗顔後最も先に使用するようにした。その他には、普段使用していた化粧品に対する制限はなかった。その後、使用者の意見により、ニキビに対する改善程度を下記の評価基準にしたがって判定した。試験結果は、表1に示した。
<<実施例XI:シミ除去効能の分析>>
本発明のヒト成長ホルモン−含有リポソームのシミ除去効能を次のように調べた:
40〜60歳の女性のうち、顔の肌にシミを有する60名を、20名ずつランダムに三つのグループに分けて、前記実施例IのhGH含有リポソーム剤形B型(剤形1)、リポソームのみの比較溶液(剤形2)、比較緩衝溶液(剤形3)を、それぞれ8週間、朝/夜の一日2回ずつ、洗顔後最も先に使用するようにした。その他には、普段使用していた化粧品に対する制限はなかった。その後、使用者の意見により、シミに対する改善程度を下記の評価基準にしたがって判定した。試験結果は、表2に示した。
<<実施例XII:ナノリポソーム剤形のLipo−hGHのローカリゼーション及び皮膚に及ぼす影響の分析>>
スプラグドーリ(SpragueDawley)ラットの腹部部分を六つの区域(それぞれ半径1cmの円)に分けて、次の試料を処理した。0.1%メチルパラベン緩衝液、0.1%リポソーム、0.001U hGH、0.0001U hGH、0.001ULipo−hGH、及び0.0001U Lipo−hGH。
<<実施例XIII:ナノリポソーム剤形のLipo−hGHがマウス皮膚に及ぼす影響の分析>>
実施例Iで製造した本発明のナノリポソーム剤形のLipo−hGHがICRマウスの皮膚に及ぼす影響をH&E(Hematoxylin & Eosin)染色により分析した。まず、ICRマウスの背中の毛を除去した後、脊椎を中心に分けて、対照群と本発明のLipo−hGHを4時間毎に2週間処理した:グループ1(3匹)、非処理;グループ2(3匹)、リポソーム/0.1U本発明のLipo−hGH処理;グループ3(3匹)、リポソーム/0.01U本発明のLipo−hGH処理;グループ4(3匹)、リポソーム/0.001U本発明のLipo−hGH処理。2週間処理後、マウスから組織を採取した。採取した組織をパラフィンブロックに作って、4μm厚に断片化し、スライドガラス上に載置した。次いで、前記断片から脱パラフィンした後、ヘマトキシリン溶液で室温で10分間処理した後、エオシン溶液で室温で1分間処理した。78%エタノール、85%エタノール、95%エタノール、及び100%エタノールで順に脱水した後、キシレンで5分間処理した。組織を固定化した後、顕微鏡下で染色された組織を観察した。
<<実施例XIV:ナノリポソーム剤形のLipo−hGHが人工皮膚に及ぼす影響の分析>>
Neoderm−EDTM(TegoScience,South Korea)を利用して、本発明のナノリポソーム剤形のLipo−hGHが人工皮膚に及ぼす影響を分析した。Neoderm−EDTMは、インビトロ(Invitro)試験のための人間皮膚モデルであって、表皮と真皮マトリックスから構成されている。実験群は、グループ1は、非処理、グループ2は、緩衝液のみを処理、グループ3と4は、リポソーム処理、グループ5及び6は、それぞれ0.001unit及び0.01unitの本発明のLipo−hGH処理群である。パラフィン包埋及びH&E染色は、前記実施例と同様に行った。最終的に顕微鏡下で染色された組織を観察した。
Claims (6)
- リポソームに包囲されたヒト成長ホルモンを有効成分として含む、発毛の促進用の皮膚塗布組成物。
- 前記リポソームは、ナノリポソームであることを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記ナノリポソームは、50〜250nmの粒子サイズを有することを特徴とする、請求項2に記載の組成物。
- 請求項1から3のいずれか一に記載の組成物を含み、皮膚に塗布する、発毛の促進用の化粧品。
- 前記化粧品は、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション及びスプレーであることを特徴とする、請求項4に記載の化粧品。
- 請求項1から3のいずれか一に記載の組成物を含み、皮膚に塗布することを特徴とする、発毛促進剤。
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