CN117778441A

CN117778441A - 一种抗衰舒缓酵母发酵提取物及其制备方法和应用

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Publication number: CN117778441A
Application number: CN202311644348.XA
Authority: CN
Inventors: 赵俊; 许高涛; 李增; 朱何龙; 刘家炉; 孙同同; 夏兵兵; 吴博; 张勇
Original assignee: Wuhu Yingtefeier Biological Products Industry Research Institute Co ltd
Current assignee: Wuhu Yingtefeier Biological Products Industry Research Institute Co ltd
Priority date: 2023-12-04
Filing date: 2023-12-04
Publication date: 2024-03-29

Abstract

本发明公开了一种抗衰舒缓酵母发酵提取物及其制备方法和应用，以酿酒酵母作为载体，将SOD‑ELP₄₅基因导入酿酒酵母，构建重组酿酒酵母工程菌，并经诱导培养后收集酵母菌体，再经破碎、离心、浓缩、除菌过滤后得到酵母提取物，通过体外细胞试验，验证了本发明制备的酵母提取物可以有效抑制LPS诱导的巨噬细胞分泌TNF‑α和IL‑6水平，在细胞学水平证明了对皮肤抗过敏、抗炎起到良好效果，通过融合ELPs后可以有效提高SOD蛋白稳定性；其具有有效修复皮肤屏障，增加角质层含水量，降低经皮水分流失，能改善肤色，降低眼角皱纹数量的效果，连续使用有祛痘、抑炎、修复痤疮的效果。

Description

一种抗衰舒缓酵母发酵提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种抗衰舒缓酵母发酵提取物及其制备方法和应用。

背景技术

随着生活水平的提高，人们对化妆品的需求也越来越多，对化妆品的要求也越来越高。近年来，化妆品配方趋势逐渐走向少添加化工合成原料，尤其在延缓衰老、美白抗皱和抗过敏等方面。化妆品销售市场显示，含生物活性物的化妆品具有广阔的发展空间，加之中国酵母资源丰富，因此利用酵母工程菌得到酵母多肽产物应用在化妆品中具有较大的经济和现实意义。

酿酒酵母菌是一种革兰氏阳性单细胞真菌，属于兼性厌氧菌。酿酒酵母中含有丰富的蛋白质，一般超过40％，甚至高达60％。酿酒酵母含有完整的氨基酸群，包括人体必需的8种氨基酸，特别是在谷物蛋白中含量较少的赖氨酸，在酿酒酵母中含量较高。多肽和皮肤细胞间存在比较好的亲和性，相比于核酸、蛋白质等高分子天然生活性物质，多肽类易溶于水，分子质量小，易被吸收利用，在美白、抗氧化和修复肌肤等功效方面，活性多肽的性能远优于分子较大的蛋白质，且其具有相对的安全稳定性。

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)是一种重要的抗氧化酶，能够清除生物体内产生的过量自由基，包括超氧阴离子(O^2-)和氢过氧化物(H₂O₂)。SOD蛋白能够催化超氧阴离子和氢过氧化物的歧化反应，将其转化为氧气和水，从而清除生物体内产生的过量自由基。由于自由基具有高度活性，它们可以与细胞内的脂质、蛋白质和DNA等分子发生反应，导致细胞损伤甚至死亡。通过清除自由基，SOD蛋白可以保护细胞免受氧化损伤。这些自由基在炎症反应中扮演着重要的角色，如诱导炎症细胞的活化、增加炎症介质的释放等。

类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptides，ELPs)是一种人工基因工程化多肽聚合物，是基于哺乳动物弹性蛋白原中发现的结构基序为模板，经人造基因工程技术合成的一类温敏生物聚合物。其结构主要由五肽重复序列单元构成，来源于弹性蛋白的疏水区域。ELPs具有良好的生物相容性、无毒、优良的药动学行为、可生物降解性等。因此，ELPs在生物医药领域中的应用前景非常广阔。

但是单一的SOD、ELPs的应用方向均较为有限。

酵母提取物又称酵母抽提物，它是通过内源酶自溶法、外源酶处理法、化学处理法等技术将酵母细胞的蛋白质降解成氨基酸和多肽。酵母经破壁后将其中蛋白质、核酸、维生素等抽提，再经生物酶解的富含小分子的氨基酸、肽、核苷酸、维生素等天然活性成分的淡黄色粉末。其中氨基酸含量30％以上，总蛋白50％以上，核苷酸10％以上，在化妆品中具有保湿等功效。应用于化妆品领域的酵母提取物标准更高，制备工艺最复杂，成本也高，且护肤效果较为单一，未能解决护肤品中抗过敏和抗氧化的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗衰舒缓酵母发酵提取物的制备方法和应用。本发明将酿酒酵母作为载体，将SOD-ELP₄₅基因导入酿酒酵母，构建重组酿酒酵母工程菌，并经诱导培养后收集酵母菌体，再经破碎、离心、浓缩、除菌过滤后得到酵母提取物，通过体外细胞试验，验证了本发明制备的酵母提取物可以有效抑制LPS诱导的巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6水平，其抑制LPS诱导的巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6水平明显优于激素类药物地塞米松，在细胞学水平证明了对皮肤抗过敏、抗炎起到良好效果。同时，炎症因子检测结果显示，酵母提取物的体外半衰期大于24h，具有较长的体外半衰期；其具有有效修复皮肤屏障，增加角质层含水量，降低经皮水分流失，能改善肤色，降低眼角皱纹数量的效果，连续使用有祛痘、抑炎、修复痤疮的效果。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

本发明提供的一种抗衰舒缓酵母发酵提取物的制备方法的制备方法，包括以下步骤：

(1)通过柔性linker将SOD与ELPs的目的基因连接起来，得到SOD-ELP45基因；

(2)将连接后的目的基因连接到pYES2质粒上获得表达载体；

(3)将表达载体电转化至酿酒酵母INVScl感受态细胞中，培养，即可得到基因工程菌INVSc1/pYES2-SOD-ELPs；

(4)基因工程菌经诱导培养后离心收集酵母菌体，再经破碎、离心、纯化得到SOD-ELPs融合蛋白。

步骤(1)中，所述SOD-ELP₄₅基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

步骤(1)中，所述SOD-ELP₄₅的基因编码的SOD-ELP₄₅融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。

所述SOD的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其根据pYES2载体的性质和酿酒酵母宿主密码子偏爱性设计得到。

所述ELPs为ELP₄₅；所述ELP₄₅的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

所述柔性linker的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

步骤(4)中，诱导的时间为70～72h。

步骤(4)中，酵母菌体经均质破碎后，离心收集上清液，上清液再经浓缩、0.22μm微孔滤膜过滤。

本发明还提供了含有所述抗衰舒缓酵母发酵提取物的化妆品或护肤品。

本发明还提供了所述抗衰舒缓酵母发酵提取物在制备抗炎、抗氧化药物，化妆品或护肤品中中的应用。

本发明根据pYES2载体的性质和酿酒酵母宿主密码子偏爱性设计得到了SOD基因，并通过柔性linker将其与ELP₄₅连接得到SOD-ELP₄₅基因，并将其与pYES2质粒连接构建表达载体，然后将表达载体电转化至酿酒酵母INVScl感受态细胞中，培养后获得基因工程菌，基因工程菌经诱导培养后收集酵母菌体，再经均质破碎、离心、浓缩、过滤，得到酵母提取物，此酵母提取物通过LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞促炎分化模型试验，其能长时间抑制LPS诱导的巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6水平，从而发挥炎症调节作用。其抑制LPS诱导的巨噬细胞分泌TNF-α和IL-6水平明显优于激素类药物地塞米松，在细胞学水平证明了对皮肤抗过敏、抗炎起到良好效果。通过志愿者试用反馈可知，其可以有效修复皮肤屏障，增加角质层含水量，降低经皮水分流失，能改善肤色，降低眼角皱纹数量的效果，连续使用有祛痘、抑炎、修复痤疮的效果。

附图说明

图1为pYES2-SOD-ELP₄₅载体图谱；

图2为pYES2质粒、pUC57-SOD-ELP₄₅质粒双酶切电泳结果，其中，M-DL5000 DNAMarker、1-pYES2质粒；2-3-pUC57-SOD-ELP₄₅质粒；

图3为重组质粒pYES2-SOD-ELP₄₅的菌液的PCR鉴定结果，其中，M-DL2000 DNAMarker；1-空载对照；2-阳性质粒对照；3-阴性对照；4-9-菌液PCR结果；

图4为重组酿酒酿酒酵母工程菌提取物SOD-ELP₄₅融合蛋白的免疫印迹结果，其中，M-预染蛋白Marker；1-空载对照酵母裂解产物；2-重组酿酒酿酒酵母工程菌提取物。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

各实施例中所涉及到的各材料的来源或组成如下：

(1)YPD完全培养基，其成分如表1所示：

表1

成分	含量
		酵母提取物	10g
蛋白胨(Peptone)	20g
		纯化水	至900ml

121℃高压灭菌20min，冷却至60℃以下，超净台中加入无菌100ml 10×葡萄糖。固体培养基另加琼脂粉2.0％。

(2)SC-U选择型培养基，其成分如表2所示：

表2

成分	含量
		YNB无氨基酸氮源	6.7g
0.01％氨基酸混合物I	1g
		0.005％氨基酸混合物II	0.5g
蒸馏水	至900ml

0.01％氨基酸混合物I为精氨酸、亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸、色氨酸、半胱氨酸和腺嘌呤，0.005％氨基酸混合物II为天冬氨酸、丝氨酸、组氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、撷氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸。121℃高压灭菌20min，冷却至60℃以下，超净台中加入无菌100ml 20％葡萄糖。固体培养基另加琼脂粉2.0％。

(3)SC-U诱导培养基，其成分如表3所示：

表3

成分	含量
		蛋白胨(Peptone)	20g
酵母提取物	10g
		纯化水	700ml

121℃高压灭菌20min，冷却至60℃以下，超净台中加入无菌100ml 20％半乳糖。固体培养基另加琼脂粉2.0％。

(4)PBS缓冲液，其成分如表4所示：

表4

成分	含量
		NaCl	8g
KCl	0.2g
		Na₂HPO₄	1.44g
KH₂PO₄	0.24

称上述成分加纯化水溶解，调pH至8.0，定容至1L。

(5)含500mM咪唑PBS缓冲液，其成分如表5所示：

表5

成分	含量
		NaCl	8g
KCl	0.2g
		Na₂HPO₄	1.44g
KH₂PO₄	0.24
		咪唑	34.04g

称上述成分加纯化水溶解，调pH至8.0，定容至1L。

(6)小鼠巨噬细胞RAW264.7，ATCC号：TIB-71，购自中国医学科学院细胞培养中心。

(7)羟自由基清除能力检测试剂盒，购自索莱宝生物公司，货号：BC1320。

(8)DPPH，购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，货号：M8GZJ-ET；。

实施例1

抗衰舒缓酵母发酵提取物SOD-ELP₄₅融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)目的基因序列设计

根据pYES2载体的性质(图1)和酿酒酵母宿主密码子偏爱性，设计SOD基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；通过柔性linker将其与如SEQ ID NO:4所示ELP₄₅基因连接起来，连接后的SOD-ELP₄₅基因如下：ATGCCAGTACATAAATTACAGCCAAGAGACCACTTGAAGCCTTCCAACCTTAATGGCATCTCTAATGAACAGATAGAACCTCATTTTGAGGCTCACTATAAAGGTTACGTGGCAAAGTACAATGAAATACAAGAAAAGTTAGCTGATTTGTCCTTCTCAGATAGATCCAAGGCTAACCAAAACTACTCAGAATATCGTGAGTTGAAGGTTGAAGAGACTTTTAATTATATGGGTGTAGTGCTGCATGAATTGTATTTTGGCCACCTGGGTCCTAAAGGACAACCATCAGATGCTCTTAAGAAGAAAGTTGAAGAAGACTTTGGATCTTGGGATGCTTGCATTCAGGAAATTAAGGCCGCCGGAATTGCCTTTAGAGGATGGGCCATTCTTGGATTGGACATCTTCTCTGGTCGATTGGTCGTAAACGGTTTAGATGCCCATAATGTGTATAATTACACAGGTTTGATACCCTTGATTGTGCTTGACACATACGAGCACGCCTATTACGTTGATCAAAAGAATAAGCGTCCCCCTTATATCGATGCTTTTCTACAAAGTCTGAATTGGGATGTTATCAACGAAAGATTTGAAAAGGCTATGAAGGCCGGTGGCGGTGGATCAGGAGGTGGTGGTTCCGGTGGAGGCGGTAGTGTGGCACCTGGAGTGGGTGTGGCTCCAGGAGTTGGAGTCGCCCCTGGTGTGGGTGTTGCTCCTGGTGTCGGAGTCGCTCCAGGTGTCGGTGTAGCACCAGGAGTTGGTGTTGCTCCCGGAGTCGGTGTCGCTCCAGGAGTCGGAGTTGCTCCAGGAGTTGGCGTGGCCCCAGGAGTCGGCGTTGCTCCCGGAGTGGGCGTAGCACCTGGTGTGGGTGTAGCTCCTGGTGTAGGAGTCGCCCCAGGTGTCGGTGTTGCTCCTGGCGTTGGTGTCGCCCCTGGTGTAGGAGTCGCACCAGGTGTTGGTGTCGCACCTGGTGTGGGTGTGGCACCTGGTGTTGGTGTCGCACCAGGAGTCGGAGTCGCTCCTGGCGTTGGAGTTGCTCCTGGAGTCGGTGTTGCTCCCGGAGTTGGCGTGGCTCCAGGTGTTGGAGTTGCACCCGGCGTTGGCGTGGCTCCTGGAGTCGGAGTCGCACCTGGTGTGGGCGTCGCTCCAGGTGTGGGCGTTGCACCAGGTGTCGGTGTTGCCCCTGGAGTAGGTGTAGCTCCAGGAGTTGGTGTTGCACCAGGAGTGGGTGTGGCTCCTGGAGTCGGCGTAGCTCCAGGTGTCGGAGTCGCCCCTGGAGTAGGAGTTGCACCAGGTGTGGGTGTTGCTCCAGGAGTTGGAGTTGCCCCCGGAGTTGGAGTCGCCCCCGGAGTTGGAGTTGCTCCTGGTGTTGGTGTTGCACCTGGTGTGGGAGTTGCACCTGGAGTTGGAGTCGCCCCAGGTGTTGGTGTGGCTCCCGGAGTGGGTGTCGCTCCAGGAGTGGGT

上述基因编码的SOD-ELP₄₅融合蛋白的氨基酸序列如下，：

MPVHKLQPRDHLKPSNLNGISNEQIEPHFEAHYKGYVAKYNEIQEKLADLSFSDRSKANQNYSEYRELKVEETFNYMGVVLHELYFGHLGPKGQPSDALKKKVEEDFGSWDACIQEIKAAGIAFRGWAILGLDIFSGRLVVNGLDAHNVYNYTGLIPLIVLDTYEHAYYVDQKNKRPPYIDAFLQSLNWDVINERFEKAMKAGGGGSGGGGSGGGGS(VAPGVG)₄₅，如SEQ ID NO:2所示。

(2)载体构建

根据NCBI数据库信息(GenBank:AJ421518.1)，将SOD-ELP₄₅基因序列发送通用生物公司进行优化并人工合成，同时合成检测引物：

T7：5'TAATACGACTCACTATAGGG 3'

CYC1 Terminator：5'GTGACATAACTAATTACATGATG 3'

提取DH5α/pYES2中的pYES2质粒。将质粒pYES2和人工合成pUC57-SOD-ELP₄₅质粒分别用HindⅢ和EcoR I进行双酶切。酶切体系(50μl)：QuickCut HindⅢ、QuickCut EcoR I和10×QuickCut Green Buffer各5μl、pYES2或PCR产物35μl。在37℃金属浴中酶切3h。酶切后以1.2％琼脂糖凝胶进行电泳，结果如图2所示，并胶回收双酶切的PCR产物和质粒。

将双酶切回收的目的基因产物与pYES2质粒用T4 DNA连接酶在16℃中连接1-5h。连接体系(10μl)：目的基因5μl、载体片段3μl、T4 DNA ligase和10×ligase buffer各1μl。将重组质粒转化到E.coli DH5α感受态细胞中，经抗性筛选后挑取阳性转化子进行培养，PCR鉴定后送公司进行测序。

PCR体系：95℃预变性5min；95℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸2.5min，共29个循环；72℃最终延伸10min。配制1％琼脂糖凝胶，电泳分离PCR扩增产物，结果如图3所示，紫外灯下快速切下目的条带。用DNA凝胶回收试剂盒回收目的基因PCR扩增产物。

(3)pYES2-SOD-ELP₄₅电转化至酿酒酵母INVSc1感受态细胞

将10μl pYES2-SOD-ELP₄₅质粒加到80μl酿酒酵母INVScl感受态细胞中，吹吸使其混合均匀，然后转移到预冷的电击杯中。冰浴5min，擦干电击杯外壁。将Bio-Rad电转化仪调至真菌档，电击杯置于Bio-Rad电转化仪上电击。迅速向电击杯中加入500μl预冷的1M山梨醇溶液，混合均匀，涂SC-U固体平板。30℃恒温倒置培养，直至长出单克隆。挑取转化子接种到SC-U液体培养基中，30℃、200rpm恒温培养。以菌液为模板进行PCR反应，鉴定筛选阳性克隆。选取鉴定无误的转化子进行下一步试验，由此获得工程菌INVSc1/pYES2-SOD-ELP₄₅。

(4)重组酿酒酵母工程菌的诱导表达

挑取INVSc1/pYES2-SOD-ELP₄₅单菌落接种于20ml SC-U选择培养基，经30℃、220rpm振荡培养过夜。测定其OD_600nm吸光值，计算好相应体积的菌液转接至于100ml SC-U诱导培养基中，使得初始OD_600nm达到0.4，诱导时间为72h。离心收集酵母菌体，备用。

(5)重组酿酒酵母工程菌提取物的制备

酵母溶解产物(Yeast cell lysate)是指实施伴有细胞壁破坏的处理而得到的酵母处理物。酵母溶解产物可通过对酵母进行裂解处理而制备。具体操作方法如下：

1)洗涤：收获的酵母泥，去离子水洗涤三次。

2)均质：在酵母泥中加水调至含干酵母10％～15％，高压均质破碎，1000bar高压均质8～10次，离心收集上清液，上清液再经浓缩、0.22μm微孔滤膜过滤，制得重组酿酒酿酒酵母工程菌提取物。

(6)重组酿酒酿酒酵母工程菌提取物的Western bolt的鉴定

用抗SOD单克隆抗体进行Western blot分析，重组酿酒酿酒酵母工程菌提取物表达目的蛋白(第2-3泳道)可见印迹条带(SOD-ELP₄₅≈50kDa)，而对照组(泳道1)无条带出现。如图4所示。

实验例1

重组酿酒酿酒酵母工程菌提取物在体外抑制炎症的作用效果试验

试验方法

1.1小鼠巨噬细胞RAW264.7的传代培养

1.1.1细胞复苏

在超净台准备15ml离心管，并加入含10％小牛血清和100IU/ml双抗的DMEM培养液备用，从液氮中将冻存的RAW264.7细胞冻存管迅速取出，置于37℃水浴中，轻轻摇晃快速融化。将融化的细胞悬液加入离心管中，轻柔吹打混匀，800r/min离心3min，弃去上清液，加入DMEM营养液，轻柔重悬细胞，接种于10cm培养皿中。放置于37℃，5％ CO₂培养箱培养。

1.1.2细胞传代

细胞以新鲜配制的含10％小牛血清和100IU/ml双抗的DMEM培养基正常培养，当细胞生长至融合率达70％～80％时，吸弃培养基，用PBS洗两次，然后加入新鲜的培养基，用细胞刮沿同一个方向将细胞刮下来收集在无菌离心管中，于室温水平离心机800r/min离心3min收集细胞，轻轻吹匀后计数细胞，将细胞浓度调整至适当浓度(1：3～1：6传代)接种至培养皿中，轻轻震匀后于细胞培养箱中培养，生长过程中每两天更换一次培养液(换液时不用PBS冲洗，保证培养过程培养液不变黄为宜)，待生长至融合率达70％～80％时，进行下一次传代。经过2～3次传代后，可用于后续试验操作。

1.1.3细胞冻存

弃去生长至融合率达80％～90％的细胞培养液，用PBS洗两次，弃去PBS加入DMEM营养液，用细胞刮沿同一个方向将细胞刮下来收集在无菌离心管中，于室温水平离心机800r/min离心3min收集细胞，弃去上清后加入适量冻存液，混匀后分装冻存，细胞密度以10⁶cells/ml为宜。

1.2酿酒酵母工程菌提取物对RAW264.7细胞的毒性作用

1.2.1LPS工作液配制

LPS母液：用无菌PBS溶解LPS，浓度为100μg/ml，0.22μm滤膜过滤，分装后-80℃保存。

LPS工作液：将LPS母液用DMEM基础培养基稀释至1μg/ml备用。

1.2.2细胞铺板

将处于对数生长期的RAW264.7细胞重悬后稀释至1×10⁵cells/ml，向96孔板内每孔加入100μl细胞悬液，四周每孔加入200μl PBS作为保湿孔，放置于37℃5％CO₂培养箱培养24h。观察RAW264.7细胞的形态、密度以及分布是否均匀，以确定是否满足后续试验的需求。

1.2.3酿酒酵母工程菌提取物处理细胞

吸弃培养液后使用的培养液均为不含FBS的DMEM培养液。针对不同组别加入含不同成分的DMEM培养液各100μl，每组6个复孔，放置于37℃5％ CO₂培养箱继续培养24h。具体分组为：原液、10倍稀释液、100倍稀释液、1000倍稀释液、地塞米松处理组、LPS处理组和空白对照组。

1.2.4MTT法检测细胞毒性

每孔加入20μl MTT液(0.5mg/m1)，置于37℃5％CO₂培养箱培养5h，以上操作在无菌条件下进行。弃去培养板中的液体后，向每孔加入DMSO 100μl，混匀后在酶标仪上，以630nm为参比波长，570nm为试验波长测定吸光度，记录测定结果。选取酿酒酿酒酵母工程菌提取物对细胞无毒性的最高剂量用于后续的验证模型试验操作。

1.3酿酒酵母工程菌提取物对LPS致RAW264.7细胞炎症模型的影响

1.3.1酿酒酵母工程菌提取物对TNF-α的影响

1)细胞铺板：取处于对数生长期的RAW264.7细胞重悬后稀释至1×10⁵cells/ml，每孔1ml细胞混悬液，培养液为DMEM营养液，放置于37℃5％CO₂培养箱继续培养24h待其贴壁恢复至静息状态。观察RAW264.7细胞的形态、密度以及分布是否均匀，以确定是否满足后续试验的需求。

2)酿酒酵母工程菌提取物处理细胞

吸弃培养液，后续使用的培养液均为不含FBS的DMEM基础培养基。针对不同组别加入含不同成分的DMEM培养液0.9ml，具体分组见表1，每组3个复孔，37℃，5％ CO₂培养箱培养6h。预处理后空白对照组加入0.1ml DMEM培养液，LPS模型组及各用药组加入0.1ml含10μg/ml LPS的DMEM培养液，37℃5％CO₂培养箱培养24h。分别于刺激后18h和24h收集细胞培养上清液。

表6酿酒酵母工程菌提取物对LPS致RAW264.7细胞炎症模型的影响试验分组

3)RAW264.7细胞分泌TNF-α水平检测

通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒检测细胞因子TNF-α的水平。操作步骤参照试剂盒公司提供的产品说明书进行。

1.3.2酿酒酵母工程菌提取物对IL-6的影响

细胞分组及处理同2.3.1。分别于LPS作用18h和24h，收集细胞培养上清液，通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒检测细胞因子TNF-α、IL-6的水平。操作步骤参照试剂盒公司提供的产品说明书进行。

1.4数据处理和分析

所有实验结果均重复3次，且表示为平均值±标准差，采用SPSS22.0对抗炎活性数据进行单因素方差分析(S-N-K检测)和多重比较。

2试验结果

2.1酿酒酵母工程菌提取物对细胞毒性

MTT法检测结果表明，酿酒酵母工程菌提取物添加浓度介于100倍和1000倍稀释倍数之间时对RAW264.7巨噬细胞无毒性(见表1)。因此，根据试验结果选择100倍稀释液添加量处理细胞进行后续试验。

表7酿酒酵母工程菌提取物对RAW264.7巨噬细胞毒性作用

3.2酿酒酵母工程菌提取物抑制炎症因子水平

研究表明，LPS能够引发RAW264.7巨噬细胞较强烈的炎症反应，表现为炎性因子TNF-α和IL-6mRNA水平的表达上调及细胞因子分泌水平的升高。ELISA检测结果显示，当重组酿酒酿酒酵母工程菌提取物与LPS共同作用于细胞时，重组酿酒酿酒酵母工程菌提取物能抑制LPS对RAW264.7巨噬细胞TNF-α与IL-6的上调作用。同时，重组酿酒酿酒酵母工程菌提取物处理组抑制炎症效果显著优于地塞米松组，且持续时间更长。

表8.RAW264.7巨噬细胞TNF-α、IL-6的分泌水平

注：与对照组比较，^aP＜0.01，与LPS组比较，^bP＜0.01。

实验例2

酿酒酵母工程菌提取物的抗氧化活性测试

1试验方法

1.1羟自由基去除实验原理

H₂O₂/Fe²⁺通过Fenton反应产生羟自由基，将邻二氮菲-Fe²⁺水溶液中的Fe²⁺氧化为Fe³⁺，导致536nm的吸光度下降，样本536nm吸光度下降速率的抑制程度，反应样本清除羟自由基的能力。

1.1.1羟自由基检测试验方法

按照试剂盒说明书操作，具体操作见表9。

表9操作表

其中，羟自由基清除率D(％)＝(A测-A对)÷(A空-A对)×100％；

1.2DPPH原理

DPPH自由基是一种人工合成的、稳定的有机自由基，其结构中含有3个苯环，1个N原子上有一个孤对电子。其甲醇或乙醇溶液呈深紫红色，并在515～520nm范围有最大吸收峰。当向DPPH自由基溶液中加入自由基清除剂，孤对电子被配对，深紫色的DPPH自由基被还原成黄色DPPH-H非自由基形式，其褪色程度与所接受的电子数量成定量关系，因而可以通过吸光度的变化进行定量分析。

1.2.1DPPH试验方法

取50μl待测液与1.45mL 2.0×10^-4mol/L的DPPH溶液混匀(A_X)；取50μl的待测液与1.45mL的50％乙醇(A₁)；取50μl 50％乙醇与1.45mL的2.0×10^-4mol/L的DPPH溶液混匀(A₀)；避光反应20min后，517nm下测A_X、A₀、A₁管吸光度值。

清除率计算公式：DPPH自由基清除率(％)＝1－(A_X－A₁)/A₀×100％。

2试验结果

2.1羟自由基去除能力试验

将酿酒酵母工程菌提取物进行2倍梯度稀释，共稀释5个梯度，然后测试不同浓度上清液的羟自由基清除率，结果见表10。

表10抗氧化自由基清除率试验

羟自由基是一种氧化能力很强的自由基，它能够很容易地氧化各种生物大分子，氧化效率高，反应速率快，是造成组织脂质过氧化、核酸断裂、蛋白质和多糖分解的一种活性氧自由基，与机体的衰老、肿瘤发生发展、辐射损伤和细胞吞噬有关。

对照组酿酒酵母提取物羟自由基清除率和DPPH清除率分别25.40％和38.23％，证明酿酒酵母裂解物本身具有一定的抗氧化能力。重组酵母工程菌提取物具有97％的羟自由基清除能力和87.76％的DPPH清除率，显著高于对照组。梯度稀释结果表明，32倍稀释后酵母工程菌几乎失去抗氧化自由基清除能力。试验结果表明，本发明的重组酵母工程菌提取物具有强力的清除自由基能力，用于化妆品中可以抵消自由基对皮肤的氧化攻击，从而达到更好的护肤效果。

应用例1

酿酒酵母提取物在化妆品中的应用

随着现代生活节奏变快及环境污染等问题，导致人们皮肤出现越来越多的问题。例如皮肤的微生态环境遭到破坏，皮肤皮脂大量分解成游离酸，从而导致皮肤出现红、肿、痛及过敏等炎症反应。在炎症反应过程中巨噬细胞起着介导作用，活化的促炎因子如TNF-α会诱导和加强局部炎症反应。经重组构建的酿酒酵母提取物具有良好的抗炎功效，可以显著降低巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6水平，从而对皮肤抗过敏、抗炎起到良好效果。

参照《化妆品安全技术规范》要求，本研究向下游客户志愿者提供本发明制备的重组酿酒酵母提取物作为试用品(抗炎修复组)、提供未改造的酿酒酵母破碎提取物为对照品(对照组)，共计30人，每组试用人数为15人，直接涂抹于面部，每天两次。其中未改造的酿酒酵母破碎提取物的制备方法为：将未经重组的宿主酵母菌体经均质破碎后，离心收集上清液，上清液再经浓缩、0.22μm微孔滤膜过滤制得。

志愿者标准为：1)年龄在15～60周岁之间，男女均可；2)无严重疾病，无免疫缺陷或自身免疫性疾病，受试部位未曾接受皮肤治疗、美容；3)无活动性过敏疾病；4)近两个月内受试部位未应用任何抗炎药物者。排除标准：1)妊娠或哺乳期妇女；2)合并有心、肺、脑血管、肝、肾和造血系统等严重性疾病及精神病患者；3)正在接受治疗的哮喘或其他慢性呼吸系统疾病患者。中止及退出标准：在试验期间未按测试要求进行涂抹受试样品或未按要求进行回访记录。

志愿者反馈效果如下：

1.对照组：人体功效测试报告证明，连续使用对照品14天以后能有效修复皮肤屏障，有着较强的锁水保湿效果。同时能促进皮肤角质细胞新陈代谢，对改善色素沉着、提亮肤色有一定效果。但是对于过敏性炎症引起的皮肤痤疮未能起到明显改善。

2.抗炎修复组：对于过敏炎症引起的皮肤瘙痒红肿，本发明制备的重组酿酒酵母提取物试品涂抹后能在10分钟内止痒，2小时内祛红。同时对于炎症导致的痘痘、痤疮，涂抹本产品后6-8小时内出现明显改善，连续使用有祛痘、抑炎、修复痤疮的效果。

本发明利用酿酒酵母表达系统，成功构建了表达SOD-ELP₄₅融合蛋白的重组酿酒酵母工程菌，经破碎自溶得到的酵母提取物具有良好保湿、抗炎以及抗皱效果。同时相较于临床上的使用的激素抑制炎症，体外试验证明重组酿酒酵母工程菌提取物能显著抑制RAW264.7巨噬细胞IL-6和TNF-α分泌水平，且在体外作用时间更长，显著优于地塞米松处理效果。自由基清除试验也证明本酿酒酵母提取物有很好的抗氧化能力，从而起到抗皱修复效果。经志愿者试用反馈效果也优于单一效果产品。

上述参照实施例对一种抗衰舒缓酵母发酵提取物及其制备方法和应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种抗衰舒缓酵母发酵提取物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)通过柔性linker将SOD与ELPs的目的基因连接起来，得到SOD-ELP₄₅基因；

(2)将连接后的目的基因连接到pYES2质粒上获得表达载体；

(4)基因工程菌经诱导培养后收集酵母菌体，再经均质破碎、离心、浓缩、过滤，得到所述酵母提取物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述SOD-ELP₄₅基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述SOD-ELP₄₅的基因编码的SOD-ELP₄₅融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述SOD的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述ELPs为ELP₄₅；所述ELP₄₅的核苷酸序列如SEQID NO:4所示。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述柔性linker的核苷酸序列如SEQID NO:5所示。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，诱导的时间为70～72h。

8.如权利要求1-7任意一项所述的制备方法制备得到的抗衰舒缓酵母发酵提取物。

9.一种含如权利要求8所述的抗衰舒缓酵母发酵提取物的化妆品或护肤品。

10.如权利要求8所述的抗衰舒缓酵母发酵提取物在制备抗炎、抗氧化药物，化妆品或护肤品中的应用。