CN110693920A - 蝉花活性物质及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种制备蝉花活性物质的方法。该方法包括以下步骤：(a)获取蝉花菌丝体；(b)对所述蝉花菌丝体依次进行纯化培养和活化培养；(c)将活化后的蝉花菌丝体接种于发酵罐内，进行发酵，获得发酵液；(d)将所述发酵液进行冷冻干燥，获得冻干粉；(e)将所述冻干粉进行溶解，之后进行萃取，获得含有所述蝉花活性物质的萃取液。

Description

蝉花活性物质及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种蝉花活性物质及其制备方法和应用。
背景技术
过敏反应是指已产生免疫的机体在再次接受相同抗原刺激时所发生的组织损伤或功能紊乱的反应。过敏反应的特点是发作迅速、反应强烈、消退较快；一般不会破坏组织细胞，也不会引起组织严重损伤，有明显的遗传倾向和个体差异。
当过敏体质的人发生过敏反应时，通常会用抗组胺等药物来舒缓过敏症状，但组胺药物一般具有一定的副作用。然而，利用植物或由植物中萃取出的具有抑制过敏功能的天然成分来抑制过敏反应。
蝉花又称胡婵、蝉蛹草或者金蝉花。蝉花是一种菌虫复合体，属于虫生真菌，蝉花是珍贵的中药材，具有散风热、镇惊和明目等功效。
因此，需要一种制备蝉花活性物质的方法，以获得大量的蝉花活性物质抑制过敏反应。
发明内容
本发明的目的是提供一种蝉花活性物质及其制备方法和应用，以获得大量的蝉花活性物质抑制过敏反应。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种制备蝉花活性物质的方法，该方法包括以下步骤：
(a)获取蝉花菌丝体；
(b)对所述蝉花菌丝体依次进行纯化培养和活化培养；
(c)将活化后的蝉花菌丝体接种于发酵罐内，进行发酵，获得发酵液；
(d)将所述发酵液进行冷冻干燥，获得冻干粉；
(e)将所述冻干粉进行溶解，之后进行萃取，获得含有所述蝉花活性物质的萃取液。
进一步地，该方法还包括：对所述萃取液进行冷冻干燥，获得所述蝉花活性物质。
具体地，步骤(b)对所述蝉花菌丝体依次进行纯化培养和活化培养包括以下步骤：
(b1)将所述蝉花菌丝体接种于平板培养基上，在23-28℃条件下，培养15-20天；
(b2)将步骤(b1)培养获得的蝉花菌丝体接种于液体培养基中，在23-28℃条件下，培养15-20天。
优选地，在步骤(c)中，所述发酵罐内的压力为0.7-0.9kg/cm2，通气速率为0.8-1.5VVM。
优选地，在步骤(c)中，所述发酵的温度为23-28℃，所述发酵的时间为15-20天。
优选地，在步骤(e)中，所述萃取使用的溶剂为水或醇类。
更优选地，所述醇类为乙醇。
本发明第二方面提供由上述方法制得的蝉花活性物质。
本发明第三方面提供上述蝉花活性物质在制备抗皮肤过敏的药物和/或护肤品中的应用。
具体地，所述护肤品包括：沐浴乳、乳液、化妆水、精华液、防晒乳、隔离霜、以及面膜。
本发明提供的制备蝉花活性物质的方法能够快速获得大量的蝉花活性物质。
利用本发明的制备蝉花活性物质的方法获得蝉花活性物质能够抑制过敏反应，从而可以用于制备抗过敏的药物。
利用本发明的制备蝉花活性物质的方法获得蝉花活性物质能够作为护肤品使用。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
实施例1获取蝉花活性物质
1、子实体采集蝉花菌种来源于野外采集并经过分离纯化获取。
2、平板培养将蝉花子座切开，取蝉花菌丝体接种到马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，25℃培养18天。马铃薯葡萄糖琼脂培养基的配方详见表1。
表1马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基组成
Figure BDA0002226973060000031
3、三角瓶培养将上一步培养的蝉花菌丝体接种至三角瓶内的改良马铃薯葡萄糖液体培养基中，25℃培养7天。改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基的配方详见表2。
表2改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基组成
Figure BDA0002226973060000041
4、发酵培养将上一步培养的蝉花菌丝体接种至发酵罐内，罐压为0.8kg/cm2，通气速率为1VVM，25℃培养3天，最终获得含有蝉花菌丝体的发酵液。
5、冻干粉的制备将蝉花菌丝体发酵液，冷冻干燥后磨粉形成含有蝉花活性物质的蝉花菌丝体冻干粉。
6、萃取将蝉花菌丝体冻干粉分成两份，分别加入20倍体积蒸馏水和乙醇进行溶解，以蒸馏水为溶剂的萃取液100℃加热30min，冷却后离心取上清，经冷冻干燥法进行干燥，得到蝉花萃取物。以乙醇为溶剂的萃取液在40℃下，60rpm，搅拌24h，冷却后离心取上清，经减压浓缩，得到蝉花萃取物。蝉花水萃物或醇萃物均含有蝉花活性物质。
测试例1测定蝉花活性物质活性
1、选用肥大细胞株RBL-3H4，调整细胞悬浮液浓度，以50000-100000/ml接种于96孔板内。
2、将上一步获得的肥大细胞，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时，5000rpm/min离心10min后弃上清。
3、将上一步获得的肥大细胞分成三组，用药组分别添加50μl不同浓度的蝉花活性物质和50μl 1μM的去颗粒化促进剂；对照组分别添加50μl不同浓度的蝉花活性物质；空白组只加入100μl PBS。每个浓度进行三个重复。
4、将上一步获得的肥大细胞，在37℃下共同培养30mim，4℃条件下5000rpm离心10min，取上清液100ul转移至一新的离心管中。剩下的细胞加入100ul MTT溶液，37℃反应2h。
5、将上一步中的50μl上清液，转移至新的96孔板中，每孔加入50μl对硝基苯-N-乙酰-β-胺基葡萄糖苷，37℃继续培养2小时后加入50μl 0.4M Na2CO3-NaHCO3缓冲液终止反应，然后测定405nm吸光值，可得到β-己糖胺酶含量。按照以下公式计算β-己糖胺酶含量抑制率：
Figure BDA0002226973060000051
6、将第(4)步中，加入100μl MTT培养的细胞每孔加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，震荡反应2min，测定570nm吸光值。
7、统计分析实验结果，数据以平均值±标准差表示，实验数据统计分析组间差异，p<0.05视为具有统计上的显著差异。
蝉花水萃物405nm吸光值测定
1)、表1显示实施例1制备的蝉花水萃物405nm吸光值测定结果。在不影响细胞存活率的浓度下，去颗粒化促进剂可诱导肥大细胞去颗粒化释放出过敏介质β-己糖胺酶，结果显示，405nm吸光值越高，β-己糖胺酶浓度越高，过敏反应越严重，结果表明，蝉花水萃物浓度的增高可以抑制β-己糖胺酶的释放，从而能够抑制或降低过敏反应。
表1蝉花水萃物405nm吸光值测定结果
Figure BDA0002226973060000052
Figure BDA0002226973060000061
2)、表2显示用药组和对照组的比较，蝉花水萃物对抑制肥大细胞去颗粒化释放出过敏介质β-己糖胺酶效果显著。
表2蝉花水萃物对β-己糖胺酶的抑制率
蝉花水萃物浓度 β-己糖胺酶抑制率(％)
0.50mg/mL 52.87±9.28<sup>*</sup>
1.50mg/mL 77.64±15.47<sup>*</sup>
2.50mg/mL 100±15.92<sup>**</sup>
3.50mg/mL 100±22.78<sup>**</sup>
注：对照组β-己糖胺酶释放率为100％(即抑制率为0％)，各浓度与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01。
蝉花乙醇萃物405nm吸光值测定
1)、表3显示实施例1制备的蝉花乙醇萃物405nm吸光值测定结果。在不影响细胞存活率的浓度下，去颗粒化促进剂可诱导肥大细胞去颗粒化释放出过敏介质β-己糖胺酶，结果显示，405nm吸光值越高，β-己糖胺酶浓度越高，过敏反应越严重，结果表明，蝉花乙醇萃物浓度的增高可以抑制β-己糖胺酶的释放，可以抑制或降低过敏反应。
表3蝉花乙醇萃物405nm吸光值测定结果
Figure BDA0002226973060000062
Figure BDA0002226973060000071
2)、表4显示实施例1中用药组和对照组的比较，蝉花乙醇萃物对抑制肥大细胞去颗粒化释放出过敏介质β-己糖胺酶效果显著。
表4：蝉花乙醇萃物对β-己糖胺酶的抑制率
蝉花乙醇萃物浓度 β-己糖胺酶抑制率(％)
0.50mg/mL 69.45±3.34<sup>*</sup>
1.50mg/mL 78.62±6.95<sup>*</sup>
2.50mg/mL 100±7.24<sup>*</sup>
3.50mg/mL 100±5.18<sup>**</sup>
注：对照组β-己糖胺酶释放率为100％(即抑制率为0％)，各浓度与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

Claims (10)

1.一种制备蝉花活性物质的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(a)获取蝉花菌丝体；
(b)对所述蝉花菌丝体依次进行纯化培养和活化培养；
(c)将活化后的蝉花菌丝体接种于发酵罐内，进行发酵，获得发酵液；
(d)将所述发酵液进行冷冻干燥，获得冻干粉；
(e)将所述冻干粉进行溶解，之后进行萃取，获得含有所述蝉花活性物质的萃取液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括：对所述萃取液进行冷冻干燥，获得所述蝉花活性物质。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)对所述蝉花菌丝体依次进行纯化培养和活化培养包括以下步骤：
(b1)将所述蝉花菌丝体接种于平板培养基上，在23-28℃条件下，培养15-20天；
(b2)将步骤(b1)培养获得的蝉花菌丝体接种于液体培养基中，在23-28℃条件下，培养15-20天。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，所述发酵罐内的压力为0.7-0.9kg/cm2，通气速率为0.8-1.5VVM。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，所述发酵的温度为23-28℃，所述发酵的时间为15-20天。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(e)中，所述萃取使用的溶剂为水或醇类。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述醇类为乙醇。
8.由权利要求1-7任一项所述的方法制得的蝉花活性物质。
9.权利要求8所述的蝉花活性物质在制备抗皮肤过敏的药物和/或护肤品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述护肤品包括：沐浴乳、乳液、化妆水、精华液、防晒乳、隔离霜、以及面膜。
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