KR100902570B1

KR100902570B1 - 단백질을 포위하는 나노리포좀의 제조방법 및 단백질-포위나노리포좀

Info

Publication number: KR100902570B1
Application number: KR1020077024282A
Authority: KR
Inventors: 오달균; 이균영
Original assignee: 주식회사 리제론
Priority date: 2005-03-28
Filing date: 2006-03-28
Publication date: 2009-06-11
Also published as: KR20080000602A; US7951396B2; JP4970424B2; JP2008534580A; WO2006109936A1; US20080213346A1

Abstract

본 발명은 (a) 단백질을 함유한 수용액에 인지질을 분산시켜 분산액을 제조하는 단계; (b) 상기 분산액에 전단력(shearing force)을 부가(applying)하는 단계; (c) 단계 (b)의 결과물에 인지질을 추가적으로 첨가하고 단계 (b) 보다 높은 전단력을 부가하는 단계; 및 (d) 추가적인 인지질과 전 단계보다 높은 전단력을 이용하여 단계 (c)를 반복 실시하여 원하는 입자지름 및 포위효율을 가지는 나노리포좀을 성형하는 단계를 포함하는 단백질이 포위된 나노리포좀의 제조방법, 그리고 단백질-포위 나노리포좀에 관한 것이다.

Description

단백질을 포위하는 나노리포좀의 제조방법 및 단백질-포위 나노리포좀{METHODS FOR PREPARING NANOLIPOSOME ENCAPSULATING PROTEINS AND PROTEIN-ENCAPSULATED NANOLIPOSOME}

본 발명은 단백질-포위 나노리포좀의 제조방법 및 단백질-포위 나노리포좀에 관한 것이다.

인간성장호르몬과 같은 고분자(분자량 약 22 kD)는 피부각질층을 통과하지 못하는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 피부를 통하여 효율적으로 전달될 수 있는 분자량은 약 500 Da 이하로 일반적으로 인식되어 있고 침투보조제(penetration enhancers)의 도움을 받을 경우에도 최대로 분자량 약 2 kD을 넘지 못하는 것으로 보고 되어 있다.

피부전달효율측정 실험은 주로 의약품을 대상으로 실시되는데 in vivo에서는 피부에 약물을 적용한 후 시간 경과에 따른 약물의 혈중농도를 측정하고 in vitro에서는 Frantz cell을 이용하여 약물의 시간경과에 따른 피부 투과량을 측정하거나 인공피부를 이용하여 같은 방식으로 측정한다. 의약품의 경우와는 달리 화장품의 경우에는 유효성분이 피부를 투과하여 혈관에 도달하는 것이 항상 바람직하지만은 않다. 특히 인간성장호르몬과 같은 의약품으로 사용되는 성분일 경우 더욱 그러하 다. 예를 들어, 인간성장호르몬을 화장료로 이용하는 경우에는, 인간성장호르몬을 피부의 모낭까지만 전달하여 피부표피의 줄기세포 또는 줄기세포를 에워 싼 모낭의 상피외모근초(outer root sheath)에 존재하는 인간성장호르몬의 수용체를 자극하여 직접, 간접적으로 피부재생속도를 조절하거나, 모낭기질세포층(hair follicle matrix)에 전달하여 발모나 육모 작용을 촉진 또는 억제하거나 멜라닌의 합성을 조절하거나, 피지샘에 도달하게 하여 피지분비를 조절하거나, 땀샘에 도달하게 하여 땀의 분비를 조절하거나, 모근초(hair root sheath)를 에워 싼 결합조직의 섬유아세포에 간접적으로 작용하여 탄력섬유의 분비를 조절하거나, 피하지방세포에 간접적으로 작용하여 피하지방분해를 조절하는 것이 보다 바람직하다.

한편, 단백질과 같은 고분자를 피부에 도포하여 진피층에 전달하는 방법으로서 나노리포좀을 이용하는 방법이 거론되고 있으나 만약 전달이 된다 하더라도 각질층의 조밀함, 인간성장호르몬의 큰 분자량과 친수성을 감안할 때 인간성장호르몬를 포위한 리포좀이 피부표피의 각질층에 직접 침투하여 전달되기 보다는 우선 리포좀의 도움으로 모낭에 전달된 인간성장호르몬이 각질층이 발달되지 않아 진피층과의 간격이 얇은 모낭의 근초를 둘러 싼 세포조직과 작용하여 간접적으로 진피층에 영향을 미친다고 보는 관점이 더 타당하다.

리포좀을 단백질 전달의 운반체나 단백질을 에워싸는 수단으로서 고려할 때, 다음의 다섯 가지 점에 특히 유의하여야 한다: (a) 리포좀으로 에워싸고자 하는 단백질에 대한 리포좀 내 포위효율(encapsulation efficiency), (b) 단백질을 함유한 리포좀의 크기 범위, (c) 단백질을 함유한 리포좀을 생산하는 방법의 산업적 적용 의 용이성, (d) 리포좀으로 에워싸고 보관하는 과정에서의 리포좀과 단백질의 안정성 여부, (e) 리포좀에 의한 부작용 등이 그것이다.

첫 번째, 약물의 리포좀 내 포위효율을 높이는 방법을 모색할 때 고려해야 할 점들이 있다. 약물이 소수성일 경우는 약물은 리포좀을 구성하는 이중지질막의 내막이나 외막의 어느 한 쪽 막에 속하는 지질의 소수성을 띤 내부(꼬리부분)나 이중막의 내막과 외막 사이에 위치하거나, 내막과 외막의 지질 내부에 걸쳐서 위치하게 된다. 이 경우 약물 상호간의 반발만 없다면 리포좀 내 약물의 포위효율은 리포좀의 크기와는 상관없이 리포좀을 구성하는 지질의 총량에 비례하게 된다. 그러나 일반적으로 수용액 중의 단위 체적 당 용해된 단일층 소포(unilamellar vesicle)인 리포좀을 구성하는 지질의 총량은 리포좀의 크기가 작을수록 증가한다. 따라서 소수성인 약물의 단일층 리포좀 내 포위효율은 리포좀의 크기가 작을수록, 또는 리포좀을 구성하는 지질의 양이 많을수록 더 증가한다. 다만 다중층 소포를 다량 포함하는 리포좀의 경우에는 단위 지질양을 기준으로 하여 리포좀으로 포위된 용액의 양은 감소하고 용액 단위부피당 리포좀을 구성하는 지질의 총량은 증가하므로 소수성인 약물의 포위효율을 극대화시킬 수 있다. 한편 약물이 친수성일 경우는 리포좀의 이중지질막에 의하여 포위되는 수용액 내에 약물이 존재하게 되므로, 리포좀 내에 포위되는 약물의 양은 리포좀으로 에워싸인 용액의 양에 비례한다. 농도가 일정한 친수성인 약물을 함유하는 단일층 리포좀의 포위효율을 고려할 때, 편의상 리포좀을 구성하는 지질의 양이 제한적인 경우와, 그와 달리 리포좀의 크기가 일정하여 단위 리포좀 내에 포위할 수 있는 약물의 양이 제한적인 경우로 나누어 생각해 봐 야 한다. 지질의 양이 한정되어 있는 경우는 단위 리포좀의 크기가 클수록 포위할 수 있는 약물의 양이 더 많아지고, 단위 리포좀 내에 포위할 수 있는 약물의 양이 제한적일 경우, 즉 단위 리포좀의 크기 범위가 정해져 있는 경우에는 단위 리포좀의 수가 많을수록 포위하는 약물의 양이 많아진다. 따라서, 대개는 약물을 함유하는 단일층 리포좀의 크기 범위가 한정적이므로, 리포좀의 수를 늘릴수록 약물에 대한 리포좀 내 포위효율이 증가한다. 일반적으로 리포좀의 크기가 한정적이라면 단일층 리포좀이 다중층 리포좀보다 용액을 더 많이 함유할 수 있다.

두 번째, 수용성 약물을 함유한 리포좀으로는 일반적으로 크기가 균일하고 크기범위가 200 nm 이하인 소형 단일층 소포(SUV; small unilamellar vesicle)를 선호한다. 크기가 작아야 목표조직에의 전달효율을 높일 수 있고, 크기가 균일해야 일관성 있는 약물의 약동학적(pharmacokinetic) 결과를 기대할 수 있고, 단일층 소포라야 상대적으로 많은 양의 약물을 단위 리포좀에 포위할 수 있다. 리포좀의 조성결정과 성질부여는 리포좀에 포위된 약물을 어떤 방식으로 목표조직에 도달시키고자 하는가에 따라 달라진다. 예를 들면, 리포좀의 이중지질막을 구성하는 성분에 콜레스테롤이 포함되어 있을 때, 리포좀의 혈액 내 순환시간이 길어진다. 주사용 리포좀의 경우, 혈액을 따라 순환하는 리포좀은 세망내피계에 의해서 제거되는데, 일반적으로 리포좀의 크기가 클수록, 전하를 많이 띨수록, 더욱 신속히 제거된다. 따라서 주사제로 사용될 리포좀은 크기가 균일하고 크기 범위가 200 nm 이하인 소형 단일층 소포가 선호된다.

세 번째, 통상 실험실 수준에서 rotating evaporator를 이용하여 인지질막을 만들고 난 후 리포좀 안에 넣고자 하는 약물의 수용액을 부어 흔들어서 리포좀을 생산하는 방법은 리포좀내 약물의 포위효율이 높은 장점은 있으나 산업적으로 리포좀을 생산하는 데에는 적합하지 않다. 게다가 이런 방식으로 제조된 리포좀은 대형 다중층 소포(LMV: large multilamellar vesicle)가 대부분으로 이를 소형 단일층 소포로 전환시키려면 액체 질소에 여러 번 얼렸다 녹였다를 반복하는 과정을 거치거나 초음파로 분쇄하거나 아니면 압출기(extruder)를 통과시켜 원하는 크기로 리포좀을 미세입자화 해야 한다. 따라서 소형 단일층 소포를 산업적으로 대량생산하려면 고압균질기를 이용하여 생산하는 것이 효율적이다. 고압균질기의 단점은 리포좀 내 약물의 포위효율이 낮은 점이다. 그러나 최근 리포좀 내 약물의 포위효율을 높이면서 소형 단일층 소포를 대량생산하는 방법이 개발되었다. 다만 이 방법은 포위효율을 높이기 위해서는 겔상의 리포좀 밖에는 만들 수가 없고 그 제조 과정에서 고압균질기가 자주 막혀서 상업적으로 활용하기엔 부적합한 단점이 있다.

네 번째, 리포좀으로 에워싸고 보관하는 과정에서의 리포좀과 약물의 안정성 여부는 리포좀을 GFC(gel filtration chromatography)를 통하여 분리한 다음 리포좀 내에 포위된 약물의 활성을 리포좀을 파괴한 다음, 그 약물의 양을 정량하거나 생물학적 활성을 측정함으로써 측정할 수 있다. 인간성장호르몬과 같은 단백질을 일반적으로 공기 중에 노출시키거나 고압으로 균질기 등을 통과하게 되면 산화나 conformation의 변형이 일어나서 그 활성을 잃을 우려가 많다.

다섯 번째, 리포좀의 부작용 문제인데, 리포좀을 이루는 주성분인 달걀 또는 대두의 인지질 성분은 오랫동안 화장품의 윈료로 사용되어 왔고 피부에 대한 부작 용이 없다는 것은 이미 잘 알려진 사실이다. 따라서 이런 인지질을 이용하여 원하는 특성을 가지는 단백질-포위 리포좀을 제조할 수 있다면, 피부 부작용은 거의 발생될 가능성이 없기 때문에, 단백질을 함유하는 리포좀 제제는 화장료 또는 의약으로서 문제가 없다. 또한 인간성장호르몬과 같은 단백질은 주로 대장균이나 효모와 같은 미생물로부터 유전공학적인 방법을 이용하여 생산되는데 단백질을 대장균을 이용해서 생산할 경우는 대장균 세포벽의 주성분인 LPS(lipopolysaccharide)와 같은 endotoxin이 단백질에 포함되지 않도록 제거해야 한다. 일반적으로 LPS는 단백질을 정제하는 과정에서 제거할 수 있다.

한편, 인간 성장호르몬과 같은 고분자량의 단백질을 함유한 리포좀 혹은 단백질이 피부 각질층을 투과하여 표피세포, 표피의 줄기세포 또는 진피세포에 도달하기는 상식적으로는 거의 불가능하다. 본 발명에서는 처음으로 리포좀에 포위된 인간성장호르몬이 리포좀의 도움을 받아 모낭에 전달되고, 모낭을 둘러 싼 세포조직에 존재하는 인간성장호르몬의 수용체와의 상호작용을 통하여 직접적으로 모낭을 구성하는 세포조직과 작용하거나 간접적으로 모낭을 에워 싸는 세포조직에 영향을 미침으로써 종래에는 전혀 예상치 못하였던 인간성장호르몬의 피부에 대한 효능과 그 기전을 제시하고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 분자량이 큰 단백질을 높은 포위효율로 포위하면서도 소망하는 입자크기를 가지고, 포위된 단백질의 활성이 거의 변화가 없으며, 액상의 나노리포좀을 제조하는 프로토콜을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 나노리포좀을 형성시키기 위한 조성물에 전단력을 부가함에 있어서, 낮은 전단력으로부터 시작해서 높은 전단력으로 순차적으로 전단력을 높이는 방식으로 전단력을 부가하고, 인지질의 양도 순차적으로 증가시켜 첨가해 주는 경우에는 상기한 특성들을 나타내는 단백질-포위 나노리포좀을 제조할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 단백질이 포위된 나노리포좀의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 단백질-포위 나노리포좀을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 단백질이 포위된 나노리포좀의 제조방법을 제공한다: (a) 단백질을 함유한 수용액에 인지질을 분산시켜 분산액을 제조하는 단계; (b) 상기 분산액에 전단력(shearing force)을 부가(applying)하는 단계; (c) 단계 (b)의 결과물에 인지질을 추가적으로 첨가하고 단계 (b) 보다 높은 전단력을 부가하는 단계; 및 (d) 추가적인 인지질과 전 단계보다 높은 전단력을 이용하여 단계 (c)를 반복 실시하여 원하는 입자지름 및 포위효율을 가지는 나노리포좀을 성형하는 단계.

본 발명자들은 분자량이 큰 단백질을 높은 포위효율로 포위하면서도 소망하는 입자크기를 가지고, 포위된 단백질의 활성이 거의 변화가 없으며, 액상의 나노리포좀을 제조하는 프로토콜을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 나노리포좀을 형성시키기 위한 조성물에 전단력을 부가함에 있어서, 낮은 전단력으로부터 시작해서 높은 전단력으로 순차적으로 전단력을 높이는 방식으로 전단력을 부가하고, 인지질의 양도 순차적으로 증가시켜 첨가해 주는 경우에는 상기한 특성들을 나타내는 단백질-포위 나노리포좀을 제조할 수 있었다.

본 발명에 의해 나노리포좀 내로 포위될 수 있는 단백질은 특별하게 제한되지 않으며, 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달단백질 또는 그 일부분, 항체 또는 그 일부분, 단쇄항체, 결합단백질 또는 그 결합도메인, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절 인자, 혈액 응고 인자 및 식물 생체방어 유도 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 단백질은 호르몬이고, 가장 바람직하게는 인간성장호르몬(human growth hormone: hGH)이다.

본 발명에 따르면, 수용액에 용해되어 있는 상태의 단백질이 이용된다. 바람직하게는, 단백질은 본연의 활성을 유지할 수 있도록 그 단백질의 최적(optimum) pH에서 완충력을 가지는 완충용액에 용해되어 있는 것이다. 예컨대, hGH와 같이 약 pH 7.0에서 최적 pH를 가지는 단백질은 pH 6.5-7.5에서 완충력을 가지는 NaH₂PO₄, sodium bicarbonate, imidazole(glyoxaline)-HCl 또는 MOPS 완충액에 용해되어 있는 것이 바람직하다. 본 발명이 hGH-포위 나노리포좀을 제조하기 위하여, 이용되는 경우에는, 바람직하게는 hGH는 NaH₂PO₄(pH 6.5-7.5) 용해되어 있는 것이며, 보다 바람직하게는 EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid)를 함유하는 NaH₂PO₄ (pH 6.5-7.5) 용해되어 있는 것이다. hGH 수용액엣 NaH₂PO₄의 농도는 5-100 mM이 바람직하고, 보다 바람직하게는 10-50 mM이며, 가장 바람직하게는 약 20mM이다.

본 발명에서 이용되는 단백질 수용액은 단백질의 안정화를 위하여 적합한 이온세기(ionic strength)를 부여하기 위하여 염화나트륨 및 EDTA와 같은 수용성 염을 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 단백질 수용액은 단백질의 안정화를 위하여, 아미노산, dipeptide, tripeptide, oligopeptide 등과 같은 수용성 peptide류, 알부민, 콜라겐과 같은 수용성 단백질, 일탄당, 이탄당, 삼탄당, 올리고당과 같은 수용성 당류와 덱스트린(dextrin)과 같은 수용성 다당류와 키토산과 같은 수용성 복합다당류와 황산콘드로이친(chondroitin sulfate),히알루론산(hyaluronic acid)과 같은 수용성 glycosaminoglycan과 PEG(polyethylene glycol), 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol)과 같은 수용성 polymer들을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "인간 성장호르몬(hGH)"는 인간 성장호르몬 활성을 나타내는 어떠한 폴리펩타이드도 의미하며, 예컨대, mature hGH, Met-hGH, hGH variants, modified-hGH, hGH fragments 또는 hGH analogue 중 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는, mature hGH 또는 Met-hGH이다. mature hGH는 인체 혈액 내에 존재하는 주(major) 인간 성장호르몬의 아미노산서열을 가진 인간 성장호르몬을 가리키고, Met-hGH는 mature hGH의 N-말단에 메티오닌이 첨가된 인간 성장호르몬을 가리키고, hGH variants는 인체 내에 존재하는 주 인간 성장호르몬 이외의 인간 성장호르몬의 아미노산서열을 가진 인간 성장호르몬을 가리키고, modified hGH는 인간 성장호르몬의 하나 이상의 아미노산 잔기에 pegylation이나 glycation 등과 같은 첨가물의 부착으로 변형된 인간 성장호르몬을 가리키고, hGH fragments는 인간 성장호르몬의 아미노산 서열 일부를 유전공학적 방법이나 생화학적 방법에 의해 제거시킨 인간성장 호르몬을 가리키고, hGH analogue는 인간 성장호르몬의 아미노산서열을 유전공학적 방법으로 유사한 성질을 가진 다른 아미노산서열로 변형시킨 인간 성장호르몬을 가리킨다.

본 명세서에서 용어 "인지질" 은 특별한 다른 언급이 없는 한, 리포좀을 형성할 수 있는 인지질을 의미하며, 레시틴(포스파티딜 콜린), 포스파티딜 세린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨 및 스핑고마이엘린을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 인지질은 레시틴이며, 가장 바람직하게는 수첨 레시틴이다. 레시틴은 난, 대두 및 다른 식물들에서 얻을 수 있으며, 가장 바람직하게는 대두 레시틴이다. 본 발명에 이용될 수 있는 합성, 반합성 및 천연 레시틴은, 대두 레시틴, 디스테아로일포스파티딜콜린, 수첨 대두 레시틴, 난(egg) 레시틴, 디올레오일포스파티딜콜린, 수첨 난 레시틴, 디엘라이도일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린 및 디미리스토일포스파티딜콜린을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 인지질은 수첨 대두 레시틴이다.

단백질을 함유한 수용액에 인지질을 분산하는 과정은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 실시될 수 있으며, 예컨대, 교반 과정을 통해 분산시킬 수 있다.

리포좀을 형성시키기 위한 분산액을 제조하는 단계에서, 이용되는 단백질의 농도는, 일반적으로 0.1-50 mg/ml, 바람직하게는 0.2-30 mg/ml, 보다 바람직하게는 0.3-20 mg/ml, 가장 바람직하게는 0.8-3 mg/ml이다. 이용되는 인지질의 초기 농도는 분산액의 총 중량 대비 1-50 w/v％, 바람직하게는 2-40 w/v％, 보다 바람직하게는 3-20 w/v％, 가장 바람직하게는 5-10 w/v％이다.

이어, 상기 분산액에 전단력(shearing force)을 부가하여 단백질-포위 리포좀을 형성시킨다.

전단력을 부가하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 바람직하게는 고압균질기(high pressure homogenizer), 음파발생기(sonicator), 미소유동기(microfluidizer), 압출기(extrusion apparatus) 또는 프렌치 프레스(French press)를 이용하여 실시되며, 가장 바람직하게는 고압균질기를 이용하여 실시된다.

본 발명의 가장 큰 특징은, 전단력을 부가하는 과정에서, 높은 전단력을 일 정하게 분산액에 공급하는 것이 아니라, 낮은 전단력으로부터 시작해서 높은 전단력으로 순차적으로 전단력을 높이는 방식으로 전단력을 부가한다는 것이다. 또한, 본 발명의 특징에 따르면, 전단력을 증가시킴에 따라, 인지질의 양도 순차적으로 증가시킨다.

바람직하게는, 상기 단계 (b)-(d)에 의해 이루어지는 순차적으로 증가하는 전단력의 부가는 0-1200 bar의 범위, 보다 바람직하게는 0-1000 bar의 범위, 가장 바람직하게는 0-800 bar의 범위에서 압력을 증가시키면서 고압균질기를 이용하여 실시된다. 고압균질기에서의 압력의 증가는 바람직하게는, 50-200 bar씩, 보다 바람직하게는 약 100 bar씩 증가시킨다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)-(d)에 의해 이루어지는 순차적으로 증가하는 인지질의 양은 0 w/v(％)에서부터 30 w/v(％)까지 증가한다. 상기 인지질의 양의 순차적 증가는 바람직하게는, 1-5 w/v(％)씩 증가시킨다.

고압균질기에서의 처리 과정은 바람직하게는 50℃ 이하, 보다 바람직하게는 40℃ 이하, 보다 더 바람직하게는 30℃ 이하, 가장 바람직하게는 25-30℃에서 실시되도록 한다.

각각의 압력 하에서의 고압균질기 처리는 바람직하게는 수회, 보다 바람직하게는 2-5회를 실시한다. 고압균질기 처리는 총 5-40회, 바람직하게는 10-40회, 보다 바람직하게는 20-40회, 가장 바람직하게는 20-30회 실시한다.

본 발명의 구체적인 일 실시예 따라 본 발명의 과정을 예시적으로 설명하면 다음과 같다: 리포좀을 형성시킬 수 있으며, 단백질과 인지질을 포함하는 분산액을 0 bar에서 고압균질기에 통과시키고, 이러한 처리 과정을 3회 반복한다. 이어, 고압균질기-처리된 산물에 인지질을 1-5 w/v(％) 첨가하고 100 bar에서 고압균질기에 3회 통과시키고, 처리된 산물에 인지질을 1-5 w/v(％) 첨가하고 200 bar에서 고압균질기에 3회 통과시킨다. 이러한 고압균질기 처리 과정을 인지질을 첨가하면서(최대 30 w/v(％)까지) 증가된 압력 하에서 최대 800 bar까지 단계적으로 실시하여 최종적으로 소망하는 특성을 갖는 단백질-포위 나노리포좀을 제조한다.

이러한 단계적인 인지질의 양의 증가 및 전단력의 증가를 통하여 나노리포좀을 제조하게 되면, 빠른 시간 내에 열역학적으로 안정된 형태를 취하게 되어 인지질의 용해도를 높이고 따라서 리포좀화율이 높아지고 따라서 단백질의 포위효율도 증가하는 효과를 가지게 되기 때문에 상기의 소망하는 특성을 가지는 나노리포좀이 생성된다.

본 발명의 과정에 의해 최종적으로 수득하게 되는 나노리포좀은 50-350 nm의 입자지름, 바람직하게는 50-300 nm, 보다 바람직하게는 100-250 nm, 가장 바람직하게는 150-200 nm의 입자지름을 갖는다. 나노리포좀의 작은 입자 크기는, 본 발명의 나노리포좀이 원하는 목표조직에의 침투를 용이하게 한다.

본 발명에 의해 제조되는 나노리포좀은, 바람직하게는 소형 단일층 소포(small unilamellar vesicle) 구조를 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 나노리포좀은 액상의 제형을 갖으며, 이는 하기의 실시예 I에서 확인할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 50％ 이상의 포위효율을 나타낸다. 용어 "포위효율" 은 본 발명의 과정에서 처음 이용되는 단백질 수용액에 포함되어 있는 단백질의 양에 대한 나노리포좀에 포위된 단백질의 양의 비율을 의미한다. 보다 바람직하게는 본 발명의 방법은 70％ 이상의 포위효율, 보다 더 바람직하게는 80％ 이상의 포위효율, 가장 바람직하게는 90％ 이상의 포위효율을 나타낸다.

이러한 나노리포좀의 높은 포위효율은, 인지질의 함량을 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 그러나 인지질의 함량이 높아지면 상온에서는 인지질을 분산시키기가 어려워질 뿐만 아니라 점도가 증가하여 겔 상태가 되므로 고압균질기와 같은 장치를 통과하는 과정에서 리포좀-형성 분산액이 지나는 통로를 막아 버리므로 작업상의 연속성과 생산효율을 저해한다. 한편, 인지질의 분산을 증진시키기 위하여, 열을 가하면 인지질의 분산도를 높일 수 있으나 인간 성장호르몬과 같은 단백질은 일반적으로 60℃ 이상에서는 변형되어 생물학적 활성을 상실하게 된다. 그러나, 본 발명에 따르면, 인지질 함량이 바람직하게는 최대 20 w/v(％), 보다 바람직하게는 최대 25 w/v(％), 가장 바람직하게는 최대 30 w/v(％)이 되도록 나노리포좀을 제조할 수 있어, 높은 포위효율의 나노리포좀을 제조할 수 있다.

인간 성장호르몬과 같은 거대 단백질 분자를 피부를 통하여 목표 조직에 국소적으로 전달하되 전신으로 퍼져 나가거나 피부 이외의 다른 조직에는 영향을 미치지 않도록 하기 위해서는, 적합한 단백질의 제형화가 매우 중요하다. 또한, 인간 성장호르몬과 같은 단백질은 일반적으로 용액 상에서 불안정하여 변형되거나 생물학적 활성을 잃거나 분해 되기 용이하므로, 피부국소표면 투여용 제제(특히, 화장료)로 사용되기 위하여 기본적으로 요구되는 조건인 용액 상에서의 안정성과 장기간 보관성을 갖추기 어렵다.

상술한 단백질의 제형 상의 문제점을 본 발명은 독특한 단백질-포위 나노리포좀 제조방법으로 해결한다. 본 발명에 따르면, 나노리포좀에 포위된 단백질(특히, hGH)는 포위되기 전의 물리화학적 성질과 생물학적 활성을 거의 그대로 유지하며(참조: 실시예 VII), 장기간 보존성이 매우 우수하다(참조: 실시예 V).

본 발명에 따라 제조된 단백질-포위 나노리포좀에서, 나노리포좀에 포위된 단백질은 포위되기 전의 단백질의 활성을 최소 60％, 바람직하게는 최소 70％, 보다 바람직하게는 최소 80％, 보다 더 바람직하게는 90-100％, 가장 바람직하게는 약 100％ 보유한다. 이러한 활성 유지는 종래 기술들과 비교하였을 때 경이로운 효과이다.

본 발명에 따르면, 인간 성장호르몬과 같은 고가의 단백질을 리포좀 내에 포위하는 데에 있어서 산업적 생산이 용이하도록 고압균질기 등을 이용하여 리포좀을 생산하되, 생산성이 높은 연속적 제조가 가능하도록 액상을 유지하면서 제조되도록하며, 동시에 높은 포위효율로 단백질이 리포좀 내에 포위되도록 한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 단백질을 포함하는 단백질-포위 나노리포좀에 있어서, 상기 나노리포좀의 입자지름은 50-350 nm이고, 소형 단일층 소포(small unilamellar vesicle: SUV) 구조를 가지며, 액상의 제형을 가지며, 나노리포좀에 포위된 상기 단백질은 포위되기 전의 단백질의 활성을 90-100％ 보유하는 것을 특징으로 하는 단백질-포위 나노리포좀을 제공한다.

본 발명의 단백질-포위 나노리포좀은 상술한 제조방법에 언급된 내용을 인용하여 상세히 설명될 수 있다. 예를 들어, 단백질 및 리포좀 형성 성분으로서의 인지질에 대한 내용은 상술한 내용을 인용하여 설명될 수 있다. 따라서 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 나노리포좀은 50-350 nm의 입자지름, 바람직하게는 50-300 nm, 보다 바람직하게는 100-250 nm, 가장 바람직하게는 150-200 nm의 입자지름을 갖는다. 나노리포좀의 작은 입자 크기는, 본 발명의 나노리포좀이 원하는 목표조직에의 전달을 용이하게 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 나노리포좀은 인간 성장호르몬을 포위한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 나노리포좀은 상술한 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 단백질-포위 나노리포좀을 실온에서 10개월 저장한 경우 나노리포좀에 포위된 단백질은 포위 전의 단백질 원래의 활성의 72-80％ 활성, 가장 바람직하게는 72-78％의 활성을 보유한다. 즉, 본 발명의 단백질-포위 나노리포좀은 저장 안정성이 매우 우수하다.

본 발명의 단백질-포위 나노리포좀은 상당히 높은 단백질의 생물학적 활성을 유지하며, 입자크기도 가장 바람직하게는 150-200 nm 범위에 있고, SUV 구조를 가지기 때문에, 모낭에의 전달효율이 매우 우수할 뿐 아니라 피부 투과율도 우수하고 피부에서 다양한 생리학적 활성을 나타낸다.

특히, 본 발명의 hGH-포위 나노리포좀은 다양한 피부 상태 (conditions)의 개선에 이용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 hGH-포위 나노리포좀은 여드름 치료, 주름개선, 검버섯 제거, 피부탄력 개선, 발모촉진, 피부노화 방지, 피부보습 개선 및 피부 줄기세포 증식 및 피부표피 줄기세포 증식에 유효하며, 보다 바람직하게는 여드름 치료, 주름개선 및 발모촉진에 유효하다.

도 1은 본 발명에 따라 제조된 hGH-포위 리포좀 크림 제형의 전자현미경 사진이다.

도 2는 본 발명에 따라 제조된 hGH-포위 리포좀(Nanolipo-hGH)에 대한 젤 투과 크로마토그램이다.

도 3은 본 발명에 따라 제조된 Nanolipo-hGH에 포위된 hGH에 대한 SDS-PAGE 결과이다.

도 4는 본 발명에 따라 제조된 Nanolipo-hGH에 포위된 hGH에 대한 역상 HPLC 크로마토그램이다.

도 5는 본 발명에 따라 제조된 Nanolipo-hGH에서 인지질에 대한 역상 HPLC 크로마토그램이다.

도 6은 본 발명에 따라 제조된 Nanolipo-hGH의 안정성 시험 결과를 보여주는 그래프이다.

도 7은 본 발명의 hGH-포위 리포좀의 안전성 시험 결과를 보여주는 그래프이다.

도 8는 본 발명의 hGH-포위 리포좀에 포위된 인간 성장호르몬의 활성을 조사한 결과를 보여준다.

도 9은 본 발명의 hGH-포위 나노리포좀에 대한 입자 크기 분포 분석 결과이다.

도 10은 본 발명의 hGH-포위 리포좀의 주름 개선 효능을 UV-유도된 주름을 갖는 무모 마우스를 이용하여 실험한 결과이다.

도 11는 본 발명의 hGH-포위 나노리포좀의 주름 개선 효능을 나타내는 그래프이다.

도 12a는 본 발명의 hGH-포위 나노리포좀이 스프라그 돌리 래트의 모공을 통해 피부에 전달되는 경우에 인간성장호르몬의 로컬리제이션을 보여주는 사진이다.

도 12b는 본 발명의 hGH-포위 나노리포좀이 스프라그 돌리 래트의 피부의 진피층과 모낭에 미치는 영향을 보여주는 사진이다.

도 13a는 본 발명의 hGH-포위 나노리포좀이 ICR 마우스 피부의 표피 및 진피에 미치는 영향을 보여주는 사진이다.

도 13b는 본 발명의 hGH-포위 나노리포좀이 ICR 마우스 진피층에서 결합조직의 리모델링을 유도함을 보여주는 사진이다.

도 14는 본 발명의 hGH-포위 나노리포좀이 인간 인공피부에 미치는 영향을 보여주는 사진이다.

도 15는 본 발명의 hGH-포위 나노리포좀의 도움으로 모낭으로 전달된 hGH를 면역조직화학적 방법으로 모낭에서의 위치를 파악한 사진이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 I: 인간 성장호르몬-함유 리포좀 (Nanolipo-hGH) 제조

A형 (크림형): 인간 성장호르몬-함유 크림 제형

A형의 제조에 이용된 인지질은 lipoid S100 (Lipoid GmbH, Germany) 또는 lipoid S75 (Lipoid GmbH, Germany)이다.

기기 출구 (outlet)의 온도가 30℃가 넘지 않게 열교환기를 장치한 고압균질기(max. output 5 L/hr, 최대압력 1200 bar, Model HS-1002, (주)화성기계(South Korea))의 열교환기를 얼음물속에 장치한 후 증류수로 기기 내부를 세척하여 작동준비한 후, 완충용액(2 mM NaH₂PO₄ pH 6.5-7.5, 1 mM EDTA)에 용해되어 있는 1 mg/ml 농도의 인간 성장호르몬(LG Life Sciences, Ltd) 용액 100 ml에 인지질을 5 w/v％ 비율로 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 이를 상온에서 균질기를 이용하여 저압 0 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰다. 균질기 처리를 한 용액에 인지질을 6 w/v％ 비율이 되게 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 100 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰다. 그런 다음, 100 bar 조건에서 균질기를 거친 용액에 인지질을 7 w/v％ 비율이 되게 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 200 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰다. 그리고 나서, 200 bar 조건에서 균질기를 거친 용액에 인지질을 8 w/v％ 비율이 되게 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 300 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰다. 상기 균질기 과정을 거친 용액에 인지질을 9 w/v％ 비율이 되게 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 400 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰다. 이어, 상기 균질기 과정을 거친 용액에 인지질을 10 w/v％ 비율이 되게 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 500 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰 다. 그런 다음, 상기 균질기 과정을 거친 용액에 인지질을 11 w/v％ 비율이 되게 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 600 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰다. 그리고 나서, 상기 균질기 과정을 거친 용액에 인지질을 12 w/v％ 비율이 되게 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고 800 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켜, 최종적으로 크림형의 인간 성장호르몬-함유 리포좀 (Nanolipo-hGH)을 제조하였다.

본 실시예에서 제조된 인간 성장호르몬-함유 리포좀 크림 제형의 전자현미경 사진은 도 1에 나타나 있다. 본 실시예에서 제조된 크림형 리포좀을 골드 코팅하여 주사전자현미경(HITACHI S 2500)으로 관찰한 결과, 굴곡지고 연결되어져 있는 바탕물의 형태는 젤로 추정되며 구형의 작은 알갱이 들은 나노크기(0.02-0.3 μm)의 리포좀으로 판단된다.

B형(리포좀 형): 인간 성장호르몬(hGH)-함유 리포좀 제형

B형의 제조에 이용된 인지질은 대두 레시틴(soybean lecithin; (주)신동방, South Korea), Metarin P(Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH ＆ Co. KG), Nutripur S(Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH ＆ Co. KG) 또는 Emultop(Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH ＆ Co. KG) 이다.

기기 출구 (outlet)의 온도가 30℃가 넘지 않게 열교환기를 장치한 고압균질기(max. output 5 L/hr, 최대압력 1200 bar, Model HS-1002, (주)화성기계(Korea))의 열교환기를 얼음물속에 장치한 후 증류수로 기기 내부를 세척하여 작동준비한 후, 완충용액(20 mM NaH₂PO₄ pH 6.5-7.5, 1 mM EDTA)에 용해되어 있는 1 mg/ml 농도 의 인간 성장호르몬(LG Life Sciences, Ltd) 용액 100 ml에 인지질을 10 w/v％ 비율로 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 이를 상온에서 균질기를 이용하여 저압 0 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰다. 이어, 상기 균질기 과정을 거친 용액에 인지질을 14 w/v％ 비율이 되게 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 100 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰다. 그런 다음, 상기 균질기의 과정을 거친 용액에 인지질을 18 w/v％ 비율이 되게 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 200 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰다. 그리고 나서, 상기 균질기의 과정을 거친 용액에 인지질을 20 w/v％ 비율이 되게 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 300 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰다. 이어, 상기 균질기의 과정을 거친 용액에 인지질을 22 w/v％ 비율이 되게 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 400 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰다. 그런 다음, 상기 균질기의 과정을 거친 용액에 인지질을 24 w/v％ 비율이 되게 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 500 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰다. 그리고 나서, 상기 균질기의 과정을 거친 용액에 인지질을 26 w/v％ 비율이 되게 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 600 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰다. 이어, 상기 균질기의 과정을 거친 용액에 인지질을 28 w/v％ 비율이 되게 첨가하여 충분히 수화시켜 교반하고, 700 bar에서 3회 이상 균질기를 통과시켰다.그런 다음, 상기 균질기의 과정을 거친 용액을 800 bar에서 3회 이상 균질기를 통과한 후 균질기로부터 용액을 배출하고 15,000 x g에서 30분간 고속원심분리하여 상등액을 분리하였다.이때 리포좀 내에 들어가지 않은 인간 성장호르몬은 젤 투과 크로마토그래피(GE Healthcare, USA)로 제거하고 액상의 리포좀을 수득 하였다(참조: 도 2).

B 제형에서 용액을 증류수 및 완충용액 pH 6.0-7.5(20 mM NaH₂PO₄, 1 mM EDTA, pH 6.0-7.5)를 사용하여 제조한 결과 리포좀의 물성 및 안정성에 차이점이 없었으며, 또한 결과물을 15-30℃에서 대두 레시틴 10 w/v％ 이상에서 장기간 보관 (한 달 이상) 하면, 지질층과 수용액의 상분해가 발생(위층은 수용액, 아래층은 지질층) 하였으나, 10 w/v％ 미만의 대두 레시틴에서는 상분해가 일어나지 않고 안정성이 우수하였다.

C형: A와 B 인지질을 혼합한 lipo-hGH formulation 특성 및 안정성

C형에 이용된 인지질은 S(lipoid S100) 와 B(lipid B)를 각각 배합하여 B형 균질방법으로 lipo-hGH를 제조하는 방법이다. A와 B 인지질 배합비율은 각각 1형(5％S +10％B), 2형(10％S+10％B) 및 3형(5％S+20％B) 으로 하여 B형 균질방법으로 lipo-hGH를 제조한 후 균질기로부터 용액을 배출 하고 고속 원심분리 하여 상등액을 분리한다. 상온(15 ∼30℃)에서 1형 결과물은 대략 3개월 후 층 분리가 일어나며, 2형 결과물은 대략 1개월 후 층 분리가 일어남. 3형 결과물은 층 분리가 일어나지 않음. 3형 결과물은 고농축 리포좀 으로 보존이 용이한 formulation방법임.

실시예 II: FPLC 분리 및 SDS-PAGE 분석

상기 실시예 I의 제형 B의 인간 성장호르몬-함유 리포좀 분석을 위해 상온에서 FPLC(Acta explorer, Amersham Bioscience)에 Superdex 200 HR/30 컬럼을 장치하고 컬럼 볼륨 두 배의 완충용액(20 mM NaH₂PO₄, 1 mM EDTA 및 150 mM NaCl)으로 평형화시킨 다음, 인간 성장호르몬-함유 리포좀을 분리 및 그 분획을 분취한 다음, 이를 SDS-PAGE로 분석 하였다. 도 3에서 확인할 수 있듯이, 약 22 kDa 부근에서 인간 성장호르몬의 밴드를 볼 수 있다.

실시예 III: 리포좀 내의 인간 성장호르몬의 정량

HPLC(Shimazu)에 C₁₈ Delta pack 컬럼 (Waters, USA)을 장착하고, 용매 A는 0.1％ TFA 아세토니트릴, 용매 B는 0.1％ TFA H₂O를 사용하여 농도구배(B 60-10％ : 0-25 min, B 60％: 25.01-30 min) 방식으로 유속 1 ml/min로 역상-HPLC를 실시하였다. 형광검출기(Excitation: 295 nm, range: 270-300 nm, Emission: 350 nm, range: 300-400 nm)를 이용하여 oven temp(55℃), run time 30 min 기기조건에서 표준시료(International Standard 인간 성장호르몬 NIBSC code 98/574)를 정량한 후, 시료 전처리 과정(인간 성장호르몬 함유한 리포좀 용액을 sonicator를 이용하여 파쇄후 50 mM Tris-Cl pH 8.0, 1 mM EDTA, 8 M 우레아, 2％ Tween 20 용액을 시료와 같은 부피 첨가 후 파이펫팅)하고, 형광검출기를 이용하여 HPLC로 정량하였다(참조: 도 4).

정량 결과, 실시예 I의 제형 B의 Nanolipo-hGH는 약 3.69 ㎍/ml의 인간 성장호르몬을 함유하고 있음을 알 수 있었다.

실시예 IV: 인지질 함량 분석

HPLC(Shimazu)에 Spherisorb S5 NH₂ 컬럼(Waters)을 장착하고, 용매로서 60％ 아세토니트릴, 30％ 메탄올 및 5％ H₂O를 사용하여 등용매 농도구배(isocratic gradient) 방식으로 유속 1 ml/min로 HPLC를 실시하였다. 자외선검출기(215 nm)를 이용하여 oven temp(35℃), run time 20 min 기기조건에서 인지질을 메탄올:클로로포름(90％:10％)인 용액에 완전 용해시켜 정량하였다. 동일한 방식으로 본 발명의 인간 성장호르몬-함유 리포좀 용액을 메탄올:클로로포름(90％:10％) 용액에 완전 용해시킨 후 HPLC로 정량하였다(참조: 도 5).

정량결과, 실시예 I의 제형 B의 Lipo-hGH는 약 3.26 mg/ml의 인지질을 함유하고 있음을 알 수 있었다.

실시예 V: 안정성 시험

상기 실시예 I에서 제조된 B 제형의 인간 성장호르몬-함유 리포좀의 안정성 시험을 다음과 같이 실시하였다: 0.1％ methyl paraben을 함유한 본 발명의 Nanolipo-hGH를 갈색 병에 넣어서 각각 4℃ 및 15-30℃에 방치하여 1주일 간격으로 hGH 함량을 HPLC로 정량하여 안정성을 조사하였다. 도 6에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 Nanolipo-hGH는 저장 10개월 후, 4℃에서는 초기 hGH 함량의 87.5％로 존재하며, 실온에서는 75％로 존재함을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 Lipo-hGH는 안정성이 우수하다는 것을 알 수 있다.

실시예 VI: 안전성 시험

본 발명의 인간 성장호르몬-함유 리포좀(실시예 I의 B 제형)의 안전성을 검사하기 위하여, 인간 각질세포주인 HaCaT (DKFZ, Germany)와 인간 배아 섬유아세포인 HEF(gift from Prof. Lee, Jaeyong, Department of Biochemistry, School of Medicine, Hallym University)에 대한 세포독성을 조사하였다.

HaCaT과 HEF를 각각 1 x 10⁵ 세포/ml 및 5 x 10⁴ 세포/ml의 농도로 10％ FBS/DMEM(FD 배지)에 현탁하고, 이를 24 well 플레이트에 1 ml 첨가한 다음, 37℃, 5％ CO₂ 인큐베이터에서 하루 동안 배양하였다. 배양 1일 후, 상층 배지를 조심스레 제거하고, 적절한 양의 10％ FD 배지와 농도별로 준비한 시료를 플레이트의 웰에 첨가하고 37℃, 5％ CO₂ 인큐베이터에서 하루 동안 반응시켰다. 시료로서 이용된 것은 완충액(20 mM Na-Pi, pH 7.0, 1 mM EDTA 및 0.1％ Methyl paraben 함유), 리포좀, 인간 성장호르몬 및 실시예 I의 B 제형의 Nanolipo-hGH이다. 반응 후 세포의 생존력을 3-(4,5-디메일티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT: Sigma, USA)를 이용하여 측정하였다(Shearman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91(4):1470-4(1994), Shearman et al., J. Neurochem. 65(1):218-27(1995) 및 Kaneko et al., J. Neurochem.65(6):2585-93(1995)). MTT 반응 결과물에 대하여 ELISA 리더(Molecular Devices, USA)를 이용하여 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 각 시료에 의한 생존도는 시료가 첨가되지 않은 웰의 흡광도를 100％로 하여 상대적인 값으로 나타내었다(도 7).

도 7에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 hGH-함유 나노 리포좀은 HaCaT과 HEF의 세포 생존도에 영향을 미치지 않음을 알 수 있고, 결국 생체에 매우 안전한 제형임을 알 수 있다.

실시예 VII: 나노리포좀 제형의 Nanolipo-hGH의 Nb2 세포 증식 분석

Nb2 노블 래트 림프종 세포주(noblerat lymphoma cell line, NIBSC ECACC ＃ 97041101) 1 x 10⁵ 세포/ml 50 ㎕가 있는 96-웰 플레이트 웰에 S-hGH (표준 인간성장호르몬, Standard human growth hormone, NIBSC code 98/574), S-hGH에 1000배 희석된 시료 전처리용액(인간 성장호르몬을 함유하지 않은 리포좀 용액을 sonicator를 이용하여 파쇄후 50 mM Tris-Cl pH 8.0, 1 mM EDTA, 8 M 우레아, 2％ Tween 20 용액을 시료와 같은 부피 첨가 후 파이펫팅)이 첨가된 시료, 또는 시료 전처리과정(인간 성장호르몬 함유한 리포좀 용액을 sonicator를 이용하여 파쇄후 50 mM Tris-Cl pH 8.0, 1 mM EDTA, 8 M 우레아, 2％ Tween 20 용액을 시료와 같은 부피 첨가 후 파이펫팅)을 거친 실시예 I의 B 제형 Nanolipo-hGH(N-hGH)를 1000배 희석한 용액이 첨가된 시료를 첨가하였다. 5일 동안 37℃, 5％ CO₂에서 배양한 다음, 증식된 세포의 양을 MTT를 이용하여 측정하였다. hGH가 첨가되지 않은 대조군의 평균 흡광도를 100％로 하였을 때 시료가 첨가된 군의 상대적인 값을 계산하였다.

도 8에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 Nanolipo-hGH에 포위된 인간 성장호르몬은 본래의 활성을 유지하고 있음을 알 수 있다.

실시예 VIII: 입자 크기 분포 분석

상기 실시예에서 젤 투과 크로마토그래피로 분리한 제형 B의 Nanolipo-hGH를 Particle Size Analyzer(Mastersizer 2000/ Malvern Instruments Ltd)를 이용하여 굴절률 1.52로 입자 크기 분포를 분석하였다(참조: 도 9). 도 9에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 Nanolipo-hGH의 입자크기는 0.193 μm 크기에서 최대분포를 나타내었는 바, 제형 B의 Nanolipo-hGH는 나노 크기로 존재함을 알 수 있다.

실시예 IX: 주름 개선 효능 분석

4주령의 무모 마우스 (한국화학연구원으로부터 구입)와 실시예 I의 B 제형 Nanolipo-hGH(N-hGH)를 이용하여 실험 하였다. 동물 사육실의 온도는 22± 2℃, 습도는 55-60％로 유지시켰으며, 명암 순환이 12 시간 단위로 조절되게 하였고, 방사선 조사로 멸균한 고형사료(중앙실험동물, Seoul, Korea)와 멸균된 급수를 자유로이 섭취하도록 하였다. 2주 정도 적응기간을 가졌다.이러한 누드 마우스의 등쪽에 주름을 유도하기 위하여 UVB-20 mJ을 1주일에 3회 조사하는 방식으로8주 동안 조사하였다.그런 다음, 화장용 솔을 이용하여 시료 및 대조군 용액을 UVB가 조사된 등에 8주 동안 도포하였다.그런 다음, 주름 개선 효과를 Donald 방법(Hyun-Seok Kim et. al, Mech. Ageing Dev. (2005. 8.16 In press)) 으로 평가하였다. 실험 결과는 도 10 및 도 11에 나타나 있다. 도 10에서, 대조군 (n=3)은 아무런 처리를 하지 않은 군이고, UVB-대조군 (n=3)은 UVB-20 mJ을 처리하여 주름만 유도한 군이며, 리포좀 (n=3)은 UVB-20 mJ을 처리하여 주름 유도하고 리포좀을 처리한 군이고, Nanolipo-hGH (n=3)은 UVB-20 mJ을 처리하여 주름 유도하고 본 발명의 Nanolipo-hGH를 처리한 군이다. 도 10 및 도 11에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 Nanolipo-hGH는 UV에 의해 유도된 주름을 효과적으로 제거하며, 그 효과는 국소투여 후 약 2주 후부터 명백하게 나타나고 있음을 알 수 있다.

실시예 X: 여드름 치료 효능 분석

본 발명의 인간 성장호르몬-함유 리포좀의 여드름 치료 효능을 다음과 같이 조사하였다:

15-40세의 여성 중 얼굴 피부에 여드름을 갖는 60명을 20명씩 무작위로 3 그룹으로 나눈 다음, 상기 실시예 I의 hGH-함유 리포좀 제형 B형 (제형 1), 리포좀만 있는 비교 용액 (제형 2), 그리고 비교 완충용액 (제형 3)을 각각 3주간 아침/저녁으로 하루 2번씩 세안 후 가장 먼저 사용하게 하였다. 그 외에는 평소에 사용하는 화장품에 대한 특별한 제한은 두지 않았다. 그런 다음, 사용자의 의견에 따라 여드름에 대한 개선 정도를 하기의 평가기준에 따라 판정 하였다.시험 결과는 표에 나타나 있다.평가 기준: +++ (매우 양호한 개선효과가 있음), ++ (상당한 개선효과가 있음), + (약간의 개선효과가 있음), ± (개선효과는 없으나 악화되지도 않음), - (악화됨).

표 1

표 1에서 보는 바와 같이, 본 발명의 제형은 여드름에 대한 개선 정도가 매우 우수함을 알 수 있으며, 여드름 개선 효과는 application 후 약 2 주부터 명백하게 나타나기 시작하였다.더욱이, 본 발명의 조성물은 피부에 대한 자극, 예컨대, 홍반 또는 가려움증을 거의 유발하지 않았다.

실시예 XI: 검버섯 제거 효능 분석

본 발명의 인간 성장호르몬-함유 리포좀의 검버섯 제거 효능을 다음과 같이 조사하였다:

40-60세의 여성 중 얼굴 피부에 검버섯을 갖는 60명을 20명씩 무작위로 3 그룹으로 나눈 다음, 상기 실시예 I의 hGH-함유 리포좀 제형 B형 (제형 1), 리포좀만 있는 비교 용액 (제형 2), 그리고 비교 완충용액 (제형 3)을각각 8주간 아침 저녁으로 하루 2번씩 세안 후 가장 먼저 사용하게 하였다.그 외에는 평소에 사용하는 화장품에 대한 특별한 제한은 두지 않았다. 그런 다음, 사용자의 의견에 따라 검버섯에 대한 개선 정도를 하기의 평가기준에 따라 판정 하였다. 시험 결과는 표 2에 나타나 있다. 평가 기준: +++ (매우 양호한 개선효과가 있음), ++ (상당한 개선효과가 있음), + (약간의 개선효과가 있음), ± (개선효과는 없으나 악화되지도 않음), - (악화됨).

표 2

표 2에서 보는 바와 같이, 본 발명의 제형은 검버섯에 대한 개선 정도가 상 당히 우수함을 알 수 있으며, 검버섯 개선 효과는application 후 약 3-5주부터 명백하게 나타나기 시작하였다. 더욱이, 본 발명의 조성물은 피부에 대한 자극, 예컨대, 홍반 또는 가려움증을 거의 유발하지 않았다.

실시예 XII: 나노리포좀 제형의 Nanolipo-hGH의 로컬리제이션 및 피부에 미치는 영향 분석

스프라그 돌리 래트의 배 부분을 6개의 구역 (각각 반지름 1 cm 원)으로 나누어 다음의 시료를 처리하였다:0.1％ methyl-paraben 완충액, 0.1％ 리포좀, hGH 0.001 U, hGH 0.0001 U, Lipo-hGH 0.001 U 및 Lipo-hGH 0.0001 U.

24시간 마다 50 ㎕씩 2번 처리하여, 총 7번 처리하였다.마지막 시료 처리 후 24시간이 지나면 래트에서 조직을 채취하였다.채취한 조직을 40 ㎛ 두께로 단편화 하여, 1차 항체로서 폴리클로날 토끼 항-인간성장호르몬 항체 (DAKO, U.S.A.)를 처리한 다음, 2차 항체로서 비오틴이 결합되어 있는 anti-rabbit antibody (VECTOR. VECTASTAIN ABC kit (RABBIT IgG), U.S.A.)를 실온에서 30분 동안 처리하였다.그런 다음, VECTASTAIN ABC reagent (VECTOR, U.S.A.)로 실온에서 30분 동안 처리하고, DAB 기질 (Diaminobenzidine, Sigma, USA)로 발색반응 시켰다.78％ 에탄올, 85％ 에탄올, 95％ 에탄올 및 100％ 에탄올로 순서대로 탈수시킨 다음, 자일렌으로 5분간 처리하였다.조직을 슬라이드 글래스에 고정한 다음, Lipo-hGH에 함유된 인간 성장호르몬의 위치를 관찰하였다.

도 12a서 볼 수 있듯이, 본 발명의 Nanolipo-hGH에 포위된 인간 성장호르몬 또는 래트가 본래 지닌 래트 성장호르몬이 모낭 (hair follicle)의 벌지 줄기세포 (bulge stem cells)로 보여지는 위치에서 확인됨을 알 수 있다.

또한, 도 12b에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 Nanolipo-hGH (0.0001 U의 hGH 함유)가 도포된 래트의 피부에서 진피층 (dermal layer)이 넓어졌고, 모낭의 수가 증가함을 알 수 있다. 더욱이, 도 12b에서, hGH 수용액만을 피부에 도포한 경우에도 모낭의 벌지 줄기세포 위치에 hGH 가 도달하고 있음을 알 수 있는 데, 이러한 발견은 당업계의 기술수준과 상식을 고려하였을 때 매우 경이로운 것이다. 이 결과는 리포좀으로 포위된 hGH뿐만 아니라, hGH 수용액 자체를 피부에 도포하는 경우에도 피부 상태의 개선을 달성할 수 있는 가능성을 보여준다.

실시예 XIII: 나노리포좀 제형의 Nanolipo-hGH가 마우스 피부에 미치는 영향 분석

실시예 I에서 제조한 본 발명의 나노리포좀 제형의 Nanolipo-hGH가 ICR 마우스의 피부에 미치는 영향을 H＆E (Hematoxylin ＆ Eosin) 염색으로 분석하였다.우선, ICR 마우스의 등 털을 제거한 후 척추를 중심으로 나누어 대조군과 본 발명의 Lipo-hGH를 4시간 마다 2주 동안 처리하였다:그룹 1 (3 마리), 비처리 그룹 2 (3 마리), 리포좀/0.1 U 본 발명의Lipo-hGH 처리 그룹 3 (3마리), 리포좀/ 0.01 U 본 발명의Lipo-hGH 처리 그룹 4 (3마리), 리포좀/0.001 U 본 발명의Lipo-hGH 처리.2주 처리 후, 마우스로부터 조직을 채취하였다.채취한 조직을 파라핀 블록을 만들고, 4 ㎛ 두께로 단편화 하여 슬라이드 글래스 위에 올려 놓았다.이어 상기 단편으로부터 탈파라핀한 후, 헤마토자일린 용액으로 실온에서 10분 동안 처리한 다음, 에오신 용액으로 실온에서 1분 동안 처리하였다.78％ 에탄올, 85％ 에탄올, 95％ 에탄올 및 100％ 에탄올로 순서대로 탈수시킨 다음, 자일렌으로 5분간 처리하였다.조직을 고정화한 다음, 현미경 하에서 염색된 조직을 관찰하였다.

도 13a에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 나노리포좀 제형의 Lipo-hGH를 처리한 피부의 표피층에서 세포의 증식이 크게 증가함을 알 수 있고, 진피층에서는 결합조직의 리모델링이 발생하여 보다 치밀한 결합조직이 형성됨 알 수 있다.도 13b는 400배 확대상으로서, 진피층에서 결합조직의 리모델링이 발생한 것을 보다 명확하게 확인할 수 있다.

실시예XIV: 나노리포좀 제형의 Nanolipo-hGH가 인공피부에 미치는 영향 분석

Neoderm-EDTM(Tego Science, South Korea)를 이용하여 본 발명의 나노리포좀 제형의 Nanolipo-hGH가 인공피부에 미치는 영향을 분석하였다.Neoderm-EDTM는 in vitro 시험을 위한 인간 피부 모델로서, 표피와 진피 매트릭스로 구성되어 있다.실험군은 그룹 1은 비처리, 그룹 2는 완충액만 처리, 그룹 3과 4는 리포좀 처리, 그룹 5 및 6은 각각 0.001 unit 및 0.01 unit의 본 발명의 Lipo-hGH 처리군으로 이루어져 있다.파라핀 포배 및 H＆E 염색은 상기 실시예와 동일하게 실시하였다.최종적으로 현미경 하에서 염색된 조직을 관찰하였다.

도 14에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 나노리포좀 제형의 Nanolipo-hGH를 처리한 Neoderm-EDTM의 각질세포층에서 세포의 증식이 활발하게 이루어졌다.

실시예XV: 나노리포좀 제형의 Nanolipo-hGH를 통하여 모낭에 전달된 hGH의 확인

8주령 된 휴지기 (telogen) 시기의 C57BL/6 (Jung Ang Lab Animal Inc., South Korea)를 케타민 (유한양행) ＆ 럼푼 (바이렐코리아주식회사)으로 마취하고 제모제를 사용하여 등 부분의 털을 제거하였다. 구역을 나누어 0.1 U nanolipo-hGH와 0.1 U hGH를 각각 150ul씩 19일 동안 하루에 두 번 처리하였다. 조직 얻기 4시간 전부터는 30분 간격으로 처리 한 후 조직 얻었다. 조직은 10％ 포르말린 용액에 고정하고 파라핀 블록을 만들어 10um로 자른 후 1차 항체로서 폴리클로날 토끼 항-인간성장호르몬 항체 (DAKO, U.S.A.)를 12시간 처리한 다음, Texas-Red 형광이 결합되어 있는 항-토기 2차 항체 (VECTOR)를 실온에서 1시간 30분 동안 처리하였다. 그 후, DAPI를 포함하는 mounting medium (VECTOR)을 떨어뜨려 Cover glass를 덮고 형광 현미경으로 관찰하였다. 결과는 사진에서 보는 바와 같이 Nanolipo-hGH로 처리한 피부의 모낭의 외모근초를 따라서 점점이 빨갛게 염색된 hGH를 도 15에서 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음의 단계를 포함하는 단백질이 포위된 나노리포좀의 제조방법:

(a) 단백질을 함유한 수용액에 인지질을 분산시켜 분산액을 제조하는 단계;

(b) 상기 분산액에 전단력(shearing force)을 부가(applying)하는 단계;

(c) 단계 (b)의 결과물에 인지질을 추가적으로 첨가하고 단계 (b) 보다 높은 전단력을 부가하는 단계; 및

(d) 추가적인 인지질과 단계 (c)보다 높은 전단력을 이용하여 단계 (c)를 반복 실시하여 나노리포좀을 성형하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 단백질은 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달단백질 또는 그 일부분, 항체 또는 그 일부분, 단쇄항체, 결합단백질 또는 그 결합도메인, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절 인자, 혈액 응고 인자 및 식물 생체방어 유도 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 나노리포좀의 제조방법.
제 2 항에 있어서, 상기 단백질은 인간 성장호르몬인 것을 특징으로 하는 나노리포좀의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 인지질은 대두 레시틴, 디스테아로일포스파티딜콜 린, 수첨 대두 레시틴, 난(egg) 레시틴, 디올레오일포스파티딜콜린, 수첨 난 레시틴, 디엘라이도일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린 및 디미리스토일포스파티딜콜린으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 인지질인 것을 특징으로 하는 나노리포좀의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 인지질은 수첨 대두 레시틴인 것을 특징으로 하는 나노리포좀의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 전단력의 부가는 고압균질기, 음파발생기(sonicator), 미소유동기(microfluidizer), 압출기(extrusion apparatus) 또는 프렌치 프레스(French press)를 이용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 나노리포좀의 제조방법.
제 6 항에 있어서, 상기 전단력의 부가는 고압균질기를 이용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 나노리포좀의 제조방법.
제 7 항에 있어서, 상기 단계 (b)-(d)에 의해 이루어지는 순차적으로 증가하는 전단력의 부가는 0-1200 bar의 범위에서 압력을 증가시키면서 고압균질기를 이용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 나노리포좀의 제조방법.
제 8 항에 있어서, 상기 고압균질기에서의 압력의 증가는 0-800 bar의 범위에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 나노리포좀의 제조방법.
제 8 항에 있어서, 상기 고압균질기에서의 압력의 증가는 50-200 bar씩 증가하는 것을 특징으로 하는 나노리포좀의 제조방법.
제 10 항에 있어서, 상기 고압균질기에서의 압력의 증가는 100 bar씩 증가하는 것을 특징으로 하는 나노리포좀의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)-(d)에 의해 이루어지는 순차적으로 첨가하는 인지질의 양은 전체 분산액을 기준으로 0 w/v(%)에서부터 30 w/v(%)까지 증가하는 것을 특징으로 하는 나노리포좀의 제조방법.
제 12 항에 있어서, 상기 인지질의 양의 순차적 첨가는 1-5 w/v(％)씩 첨가하는 것을 특징으로 하는 나노리포좀의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 최종적으로 성형된 나노리포좀은 50-350 nm의 입자지름을 가지는 것을 특징으로 하는 나노리포좀의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 최종적으로 성형된 나노리포좀은 소형 단일층 소포 (small unilamellar vesicle) 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 나노리포좀의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 최종적으로 성형된 나노리포좀은 액상의 제형을 가지는 것을 특징으로 하는 나노리포좀의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 최종적으로 성형된 나노리포좀에 포위된 단백질은 포위되기 전의 단백질의 활성을 90-100％ 보유하는 것을 특징으로 하는 나노리포좀의 제조방법.
제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 단백질을 포함하는 단백질-포위 나노리포좀에 있어서, 상기 나노리포좀의 입자지름은 50-350 nm이고, 소형 단일층 소포(small unilamellar vesicle) 구조를 가지며, 액상의 제형을 가지고, 나노리포좀에 포위된 상기 단백질은 포위되기 전의 단백질의 활성을 90-100% 보유하며, 실온에서 10개월 저장한 경우 상기 나노리포좀에 포위된 단백질은 포위 전의 단백질 원래의 활성의 72-80% 활성을 보유하는 것을 특징으로 하는 단백질-포위 나노리포좀.
제 18 항에 있어서, 상기 나노리포좀은 인간성장호르몬을 포위하는 것을 특징으로 하는 단백질-포위 나노리포좀.
삭제
삭제