KR102515644B1 - Ｃｌａｓｐ２ 폴리펩티드를 포함하는 상처 치유 또는 피부 재생용 조성물 - Google Patents

Abstract

상기 조성물은 CLASP2을 유효 성분으로 포함하는 피부 재생 또는 상처 치유용 약학 조성물 및 화장료 조성물로서, CLASP2가 섬유아세포의 이동을 촉진하여 상처 부위 세포의 이동을 증가시켜 피부 재생 또는 상처 치료 효과를 기대할 수 있다.

Description

ＣＬＡＳＰ２ 폴리펩티드를 포함하는 상처 치유 또는 피부 재생용 조성물{Composition for skin regeneration or wound healing comprising CLASP2 polypeptide}

CLASP2를 이용한 상처 치유 또는 피부 재생용 조성물에 관한 것이다.

창상 치유 과정은 조직이 손상을 입게 된 후, 일어나는 피부 재생의 복잡한 과정으로서, 조직의 손상 크기, 정도에 따라 그 치유 기간이 달라진다. 치유 과정은 4가지의 개별적인 과정 즉, 지혈(hemostasis), 염증(inflammation), 증식(proliferation), 리모델링(remodeling) 등의 4가지의 개별적인 과정이 순서적이고 엄격하게 조절되어 일어나는 과정이며 다양한 세포의 상호작용, 성장 인자들 그리고 사이토카인들이 필요하게 된다.

피부의 섬유아세포는 조직의 기능과 구조가 다시 복구되고 재생되는 창상 치유 과정에서 매우 중요한 역할을 담당한다. 이 세포는 창상 부위 쪽으로 다른 세포들을 이동시키고 창상 부위의 가장자리에서 세포의 분열을 조절한다. 섬유아세포는 증식과 이동 과정에서 모두 사이토카인들과 세포외기질(extracellular matrix: ECM)을 생산하여 섬유아세포-각질세포(keratinocyte)-내피(endothelium) 간의 상호작용을 조절한다. 세포외기질은 조직의 강도와 탄력성에 관여하는 다양한 성분으로 구성되어 있고 피부 섬유아세포의 이동을 촉진한다.

따라서, 성공적인 창상 치유는 세포 증식, 이동 그리고 세포외기질의 많은 생물학적 과정이 관여한다. 특히, 세포 증식과 이동은 창상 부위에서 분비되는 성장 인자에 의해 조절되고 이들은 세포 성장과 증식, 분화, 이동을 자극시키는 단백질 같은 거대분자(macromolecules)이거나 호르몬 같은 소분자(small molecules)일 수 있다. 상피세포 성장 인자(Epidermal growth factor: EGF)는 상피세포의 이동을 유도하고, 진피 창상 치료 과정에서 각질세포의 증식과 이동을 자극시키는 창상 치유에 필수적인 역할을 한다.

피부 재생 또는 창상 치료용 의약품이 지금까지 개발되어 오고 있으나, 기존의 치료제보다 생체에 더 안전하고, 무엇보다도 기존에 피부 재생 또는 창상 치료에 효과가 있다고 알려진 물질보다 우수한 피부 재생을 지닌 신규 성분의 개발이 절실히 요구되고 있다. 또한, CLASP2가 섬유아세포의 이동(migration)을 촉진하여 피부 재생이나 창상 치료에 이용될 수 있다는 것에 관한 연구에 대해서는 보고된 바 없다. 이에, 본 발명자들은 상기의 필요성을 인식하고, CLASP2를 유효 성분으로 사용하여 창상과 같은 상처 치유 및/또는 피부 재생 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

일 양상은 CLASP2(CLIP-association protein 2)를 유효 성분으로 포함하는 상처 치유용 또는 피부 재생 촉진용 약학 조성물을 제공한다.

다른 양상은 CLASP2(CLIP-association protein 2)를 유효 성분으로 포함하는 상처 개선용 또는 피부 재생용 화장료 조성물을 제공한다.

다른 양상은 상기한 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상처를 치료하는 방법을 제공한다.

일 양상은 CLASP2(CLIPassociation protein 2)를 유효 성분으로 포함하는 상처 치유용 또는 피부 재생 촉진용 약학 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 상피세포 성장 인자를 더 포함할 수 있다.

상기 CLASP2(CLIP-association protein 2)는 미세소관 단백질의 한 부류이며, 세포의 피층과 골지체, 세포의 중심체, 염색체의 동원체, 또는 미세소관 말단 부분 존재한다. CLASP는 2개의 동종 미세소관 단백질(CLASP1, CLASP2)로 구성되고 미세소관 성장을 촉진시키며 성장하는 미세소관 말단부분에 관여하는 세포질 연계 단백질(CLIP-170, CLIP-115)에 결합하는 특징을 가지고 있다.

상기 CLASP2(CLIP-association protein 2)는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 일부일 수 있다. 서열번호 3의 아미노산 서열은 CLASP2의 전체 아미노산 서열일 수 있다(http://www.uniprot.org/uniprot/J3KR49). 상기 CLASP2는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 서열번호 1에 일부 서열이 부가된 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다.

상기 조성물은 CLASP2를 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 1 내지 90 중량%의 양으로 포함할 수 있다.

상기 조성물은 섬유아세포의 증식 및 이동 효과로 인해 피부에 발생하는 상처를 빠르게 치료하고 회복시키는 효과를 가질 수 있다. 또한, 손상된 피부에 자극을 거의 주지 않으면서 상처의 치료를 촉진시킬 수 있고, 손상된 부위가 정상적인 촉감을 가지면서 본래의 모습으로 재생되는 것을 도와 흉터 및 과립 조직의 형성을 억제할 수 있는 효과를 기대할 수 있다.

상기 "상처"란 조직 구조의 연속성 또는 완전성의 물리적인 파열을 의미하며, "상처 치유"란 조직 완전성의 복원을 의미하는 것으로, 조직 완전성의 부분적 또는 완전 복원을 포함할 수 있으며, 치료(treat)와 혼용될 수 있다. 상기 치유(cure 또는 heal)는 자연 치유에 비하여 단축된 시간에 상처가 치유되는 것일 수 있다. 상기 치유는 상처의 개선 및/또는 완화를 포함할 수 있다. 상처의 개선은 상처의 정도를 낮추는 것을 의미한다. 또한, 상기 치유는 상처 및/또는 상처와 관련된 질환의 치유를 모두 포함할 수 있다. 상기 치유는 상처로부터 유발되는 손상된 조직의 치유 및/또는 재생을 의미할 수 있다. 상기 치유는 피부 재생의 의미를 포함할 수 있다. 또한, 상기 치유는 손상된 조직의 원래 조성을 유지하는 것일 수 있다. 또한, 상기 치유는 상처와 관련된 질환의 합병증 및/또는 흉터를 최소화하면서 상기 손상된 조직을 치료 및/또는 재생을 촉진하는 것일 수 있다. 따라서 상처 치유란 상처 치료 과정에 관여하는 하나 이상의 단계 또는 과정의 촉진, 개선, 진행, 가속 또는 진전을 의미한다.

또한, 상처는, 예를 들면 타박상 또는 내부 궤양화와 같이 피부의 외부 구조적 완전성이 유지되는 임의의 내부 상처이거나 외부 상처, 특히 피부 상처일 수 있으며, 따라서 조직은 내부 또는 외부의 신체 조직일 수 있다. 일례로, 조직은 피부(예컨대, 인간 피부)이며, 상처는 진피 또는 표피 상처와 같은 피부 상처일 수 있다.

상기 조성물이 적용될 수 있는 상처의 종류로는, 이에 제한되지는 않으나, 베인 상처 또는 열상, 외과적 절개 또는 상처, 천자, 찰과상(graze), 긁힌 상처, 압박 상처, 찰과상(abrasion), 마찰 상처(예: 기저귀 발진, 마찰 수포), 욕창 궤양(예: 욕창 또는 와창), 열 작용에 의한 상처(직접, 또는 전도, 대류 또는 복사선을 통한 냉원 및 열원 및 전기 공급원으로부터의 화상), 화학적 상처(예: 산 또는 알칼리 화상) 또는 개방 또는 무손상 종기, 피부 발진, 흠집 및 여드름을 비롯한 병원성 감염(예: 바이러스, 박테리아 또는 진균 감염), 궤양, 및 만성적인 상처(당뇨병-관련 상처, 예를 들면 하퇴 및 족부 궤양, 정맥성 다리 궤양 및 욕창 포함)를 포함할 수 있다.

상기 조성물은 CLASP2를 활성 성분 또는 유효 성분으로 포함할 수 있다. "활성 성분 또는 유효 성분"이란 본 명세서에서 언급된 기능을 수행하는 것을 의도한 것이며, 불순물로 소량으로 포함되어 있어서 상기 기능을 수행하지 않은 것을 제외한다.

상기 조성물은 상기한 유효 성분과는 별도로 항염증제, 항균제, 진통제, 완화제 또는 수렴제와 같은 상처 치료 기능을 갖는 다른 통상적인 약제를 더 포함할 수 있는데, 이러한 통상적인 약제를 포함시키는 것은 본 발명이 속하는 기술적 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 용이하게 실시할 수 있을 것이다. 그 밖에도 보습제, 피부보호제 및 방부제 등을 추가로 첨가할 수도 있다.

상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 조성물에 있어서, "허용가능한 담체"는 활성 성분의 적용을 돕기 위하여 활성 성분과 조합되어 사용되는 물질, 일반적으로 불활성 물질을 나타낸다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 희석제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다. 기 조성물에 포함되는 담체는 겔(gel), 페이스트(paste), 연고, 프로스트(frost), 산제, 유제 또는 에어로졸(aerosol) 등의 피부외용제에 있어서 통상적으로 사용되는 것들이 사용될 수 있으며, 상기와 같은 담체와 기타 첨가제들의 조성비는 유효 약물의 용출율과 성상에 따라 결정된다.

상기 조성물은 비경구 또는 경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제, 또는 피부외용제일 수 있다. 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부외용제는 통상 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제 등을 필요에 따라서 적절하게 배합할 수 있다. 상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류 등도 적절하게 배합할 수 있다. 경구 투여 제형은 정제, 캡슐제, 수성액제 또는 현탁제일 수 있다. 정제의 경우 락토즈, 옥수수 전분 등의 부형제 및 마그네슘 스테아레이트와 같은 활택제가 통상 가해질 수 있다. 캡슐제의 경우, 락토즈 및/또는 건조 옥수수 전분이 희석제로서 사용될 수 있다. 현탁제가 필요할 경우, 활성성분을 유화제 및/또는 현탁화제와 결합시킬 수 있다. 필요할 경우, 특정 감미제 및/또는 향미제를 가할 수 있다.

상기 조성물은 CLASP2를 "치료학적 유효량"으로 포함할 수 있다. 상기 조성물에 있어서, "치료학적 유효량"은 치료를 필요로 하는 개체 또는 세포에게 투여되는 경우 치료 효과를 나타내기에 충분한 양을 의미한다. "치료"는 개체, 예를 들면 사람을 포함한 포유동물에서 질환 또는 의학적 증상을 치료함을 의미하고, 이는 다음을 포함한다: (a) 질환 또는 의학적 증상의 발생을 예방, 즉, 환자의 예방적 치료; (b) 질환 또는 의학적 증상의 완화, 즉, 환자에서 질환 또는 의학적 증상의 제거 또는 회복 야기; (c) 질환 또는 의학적 증상의 억제, 즉, 개체에서 질환 또는 의학적 증상의 진행을 늦춤 또는 정지; 또는 (d) 개체에서 질환 또는 의학적 증상을 경감.

상기 조성물에서 CLASP2는 개체에 0.0001 내지 100 ㎎/㎏, 0.5 내지 5000 ug/㎏, 1 내지 2500 ug/㎏, 2.5 내지 1000 ug/㎏, 5 내지 500 ug/㎏, 또는 20 내지 100 ug/㎏으로 투여될 수 있다. 상기 조성물은 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 7일 이상, 1개월 이상, 3개월 이상, 6개월 이상, 또는 1년 이상, 또는 5일 내지 150일, 10일 내지 75일, 15일 내지 50일, 20일 내지 40일, 또는 25일 내지 35일 동안, 일당 1회 이상 투여될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 조성물의 투여용법은 통상적인 외용제제로 1일 1회 내지 수회 환부에 따라 적량을 아침 및/또는 저녁으로 도포할 수 있다.

다른 양상은 CLASP2(CLIP-association protein 2)를 유효 성분으로 포함하는 상처 개선 또는 피부 재생용 화장료 조성물을 포함한다.

상기 "화장료 조성물"은 인체를 청결, 미화하여 매력을 더하고 용모를 밝게 변화시키거나 피부, 모발의 건강을 유지 또는 증진하기 위하여 인체에 사용되는 물품을 의미한다. 상기 화장료 조성물은 피부 재생 효과를 갖는 기능성 화장품인 것일 수 있다.

상기 조성물은 상피세포 성장 인자를 더 포함할 수 있다.

최소한의 상처를 개선하고 피부 재생을 촉진하는 효과를 달성할 수 있도록 CLASP2의 함량은 상기 최소치 이상일 수 있으며, 과량 첨가에 따른 사용감 저하 및 각종 제형에의 적용 가능성을 고려하여 베타-라파콘의 함량은 상기 최대치 이하일 수 있다. 이때, CLASP2의 함량은 제형 또는 화장료 조성물에 함유되는 성분들의 함량에 따라 상기 범위 내에서 적절히 조절할 수 있다.

상기 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들면 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 젤, 파우더, 보디로션, 보디크림, 보디오일, 보디에센스 등의 화장료로 제형화될 수 있다.

상기 조성물은 유효 성분으로서의 CLASP2 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있고, 예를 들면 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 화장품학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.

상기 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다. 상기 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 상기 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용될 수 있고, 예를 들면 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르를 포함할 수 있다. 상기 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 상기 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

다른 양상은 상기 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상처를 치료하는 방법을 제공한다.

투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피(transdermal), 점막, 코안(intranasal), 기관내(intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적 또는 간접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 상처가 존재하는 부위 또는 피부 재생이 필요한 부위에 국소적으로 투여하는 것일 수 있다. 상기 투여는 예를 들면 도포 또는 주사에 의한 것일 수 있다. 상기 도포는 적절한 방법으로 개체의 피부에 상기 조성물을 접촉시키는 모든 방법을 의미하며, 이를 통하여 상기 조성물을 피부 내부로 흡수시킬 수 있다.

상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 상처 치유 또는 피부 재생을 필요로 하는 개체일 수 있다.

상기 조성물에서 CLASP2는 개체에 0.0001 내지 100 ㎎/㎏, 0.5 내지 5000 ug/㎏, 1 내지 2500 ug/㎏, 2.5 내지 1000 ug/㎏, 5 내지 500 ug/㎏, 또는 20 내지 100 ug/㎏으로 투여될 수 있다. 상기 조성물은 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 7일 이상, 1개월 이상, 3개월 이상, 6개월 이상, 또는 1년 이상, 또는 5일 내지 150일, 10일 내지 75일, 15일 내지 50일, 20일 내지 40일, 또는 25일 내지 35일 동안, 일당 1회 이상 투여될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.

상기 조성물은 CLASP2을 유효 성분으로 포함하는 피부 재생 또는 상처 치유용 약학 조성물 및 화장료 조성물로서, CLASP2가 섬유아세포의 이동을 촉진하여 상처 부위 세포의 이동을 증가시켜 피부 재생 또는 상처 치료 효과를 기대할 수 있다.

도 1은 10x His pPROEX HTb CLASP2 (60-311) 벡터, 및 10x His GST pPROEX HTb CLASP2 (60-311) 벡터의 모식도이다.
도 2는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 발현 여부 및 크기를 확인한 결과이다.
도 3은 제작된 CLASP2 폴리펩티드, 표피 생장 인자, 및 제작된 CLASP2 폴리펩티드와 표피 생장 인자를 혼합한 것 각각을 상처 유발 동물 모델에 투여한 후, 상처 치유 정도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 제작된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 CLASP2 폴리펩티드, 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 CLASP2 폴리펩티드 각각을 상처 유발 동물 모델에 투여한 후, 상처 치유 정도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 5는 제작된 CLASP2 폴리펩티드, 및 CLASP2 폴리펩티드(MBS1192601) 각각을 상처 유발 동물 모델에 투여한 후, 상처 치유 정도를 측정한 결과를 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: CLASP2 폴리펩티드 제작 및 상처 치유 효과 확인

1. CLASP2 폴리펩티드 발현 벡터 제작 및 CLASP2 폴리펩티드 발현 여부 확인

서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 발현이 불안정하여, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에서, 활성을 유지하면서 안정적으로 발현할 것으로 예측되는 일부 서열을 선별하였다. 선별된 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하도록 하였다.

서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 과발현시키기 위해, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 합성하고, 이를 증폭하여 산물을 수득하였다. 증폭된 산물과, 10x His pPROEX HTb 벡터, 10x His GST pPROEX HTb 벡터, 및 GST PROEX HTb 벡터 각각(Addgene)을 NdeⅠ 및 XhoⅠ 제한효소로 절단하여 반응시킨 후, 절단된 산물을 T4 DNA 리가제 (NEB)로 연결 (ligation)시켜 클로닝하였다. 클로닝하여 수득된 벡터를 각각 10x His pPROEX HTb CLASP2 (60-311) 벡터, 10x His GST pPROEX HTb CLASP2 (60-311) 벡터, 및 GST PROEX HTb CLASP2 (60-311) 벡터로 명명하였다. 도 1은 상기 10x His pPROEX HTb CLASP2 (60-311) 벡터, 및 10x His GST pPROEX HTb CLASP2 (60-311) 벡터의 모식도이다.

클로닝된 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 전기천공법(electroporation)으로 형질전환시키고, 암피실린을 포함하는 LB 배지에서 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 배양액으로부터 대장균 펠렛 및 상층액을 수득하고, 대장균 펠렛을 용해시킨 후, 용해물 및 상층액 각각을 아가로스 젤에 로딩하여, 단백질의 발현 여부를 확인하였다.

이어서, 10x His GST pPROEX HTb CLASP2 (60-311) 벡터 선택하여, 대장균 BL21(DE3)에 전기천공법으로 형질전환시키고, 암피실린을 포함하는 LB 배지 4 리터에서 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 배양액으로부터 대장균 펠렛 및 상층액을 수득하고, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 발현되는지 여부를 재확인하였다. 대장균 펠렛을 용해시킨 후, 용해물 및 상층액을 단백질 GST 태그(tag) 융합 단백질 정제 레진 (Clontech) 8㎖에 로딩하여, 단백질을 레진에 결합시켰다. 다음, 완충액으로 세척하고, 용출액을 수득하고, 아가로스 젤에 로딩하여, 단백질의 발현 및 크기를 확인하였다. 아미노산 서열 분석 결과, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것을 확인하였다.

도 2는 상기 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 발현 여부를 확인한 결과이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 약 29kDa에서 발현되는 것을 알 수 있다.

2. CLASP2 폴리펩티드의 피부 재생 및 상처 치유 촉진 효과 확인

(1) 당뇨병 유발 모델에서 CLASP2 폴리펩티드의 상처 치유 촉진 효능 확인 1

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 1에서 제작된 CLASP2 폴리펩티드가 당뇨 유발 동물 모델에서 상처 치유 효능을 나타내는지 확인하였다. 모든 절차는 차의과대학 동물윤리 위원회의 승인을 받아 수행하였다.

스트렙토조토신(streptozotocin, Sigma사)을 0.1M의 시트레이트(citrate) 버퍼(pH 4.5)에 용해한 다음, 용해된 스트렙토조토신을 6 내지 8주령 Balb/c 마우스에 55 mg/kg로 5일 연속 복강 내 주사하여 당뇨를 유발하였다. 이어서, 마우스에서 혈청 글루코스 수준을 Accu-Check Advantage 글루코미터 (Roche, Indianopolis, IN)를 사용하여 측정하였다. 채혈된 혈장 글루코스 수준이 300 mg/dl 이상인 경우를 당뇨가 유발된 것으로 판단 및 분류하였다.

당뇨가 유발된 것으로 확인된 마우스 및 당뇨를 유발하지 않은 대조군 마우스를 아이소플루란으로 마취시키고, 표준 피부 생검 펀치 (직경 0.5cm, Acuderm Inc., Fort Lauderdale, FL, USA)을 사용하여 2군데의 피부 전층을 제거하여, 배면(dorso-lateral)에 피부 창상을 유발하였다. 상처의 크기는 약 2.5cm이었다. 수술 직후, 생리식염수(Saline), 1에서 제작된 CLASP2 폴리펩티드, 표피 생장 인자(Epidermal Growth Factor: EGF) 및 1에서 제작된 CLASP2 폴리펩티드와 표피 생장 인자를 혼합한 것 각각을 마우스에 1㎍/마우스로 3일 간격으로 총 2회 반복 투여하였다.

개방 창상 면적은 알려진 방법을 사용하여 치료 0, 3, 5, 7, 10, 14 및 21일 후에 측정하였다 (Stem cells, 23:1571-1578; 2005.). 상처 이미지를 Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Inc., Silver Spring, MD, USA)를 사용하여, 픽셀 면적을 계산하고 이미지 마진을 추적하여 분석하였다. 픽셀의 수는 각 상처를 촬영한 눈금자의 눈금으로 정규화하였다. 측정은 반복 수행하였고, 개방 창상 면적은 각 시점에서 상처 부위의 면적을 0일째 상처의 면적으로 나눈 값의 퍼센트로 나타내었다.

도 3은 생리식염수, 1에서 제작된 CLASP2 폴리펩티드, 표피 생장 인자, 및 1에서 제작된 CLASP2 폴리펩티드와 표피 생장 인자를 혼합한 것 각각을 상처 유발 동물 모델에 투여한 후, 상처 치유 정도를 측정한 결과를 나타낸다. 도 3에서, saline은 생리식염수를 나타내고, EGF는 표피 생장 인자를 나타내고, CL은 1에서 제작된 CLASP2 폴리펩티드를 나타내고, EGF+CL은 1에서 제작된 CLASP2 폴리펩티드와 표피 생장 인자를 혼합한 것을 나타낸다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 1에서 제작된 CLASP2 폴리펩티드를 투여한 군은 상처 면적이 현저하게 감소하였다. 구체적으로 투여 7일, 10일 및 14일째에, 1에서 제작된 CLASP2 폴리펩티드를 투여한 군은, 표피 생장 인자를 투여한 군 및 1에서 제작된 CLASP2 폴리펩티드와 표피 생장 인자를 혼합한 것을 투여한 군에 비하여, 상처가 빠른 속도로 치유되었다.

(2) 당뇨병 유발 모델에서 CLASP2 폴리펩티드의 상처 치유 촉진 효능 확인 2

서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 경우, 상처 치유 효능이 유지되는지 확인하였다.

1에서 제작된 서열번호 1 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 CLASP2 폴리펩티드에 대하여, 상기 2의 (1)의 방법에 따라 상처 치유 효능을 확인하였다.

도 4는 생리식염수, 1에서 제작된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 CLASP2 폴리펩티드, 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 CLASP2 폴리펩티드 각각을 상처 유발 동물 모델에 투여한 후, 상처 치유 정도를 측정한 결과를 나타낸다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 CLASP2 폴리펩티드 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 CLASP2 폴리펩티드 각각은, 대조군에 비하여, 상처 면적을 빠른 속도로 감소시켰다. 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 CLASP2 폴리펩티드는 투여 10일째에, 정상인 군과 유사한 속도로 상처를 치유하였다.

(3) 당뇨병 유발 모델에서 CLASP2 폴리펩티드의 상처 치유 촉진 효능 확인 3

다른 아미노산 서열을 포함하는 CLASP2 폴리펩티드와 1에서 제작된 CLASP2 폴리펩티드의 상처 치유 촉진 효능을 비교하였다.

대조군으로 CLASP2 폴리펩티드(Mybiosource 카달로그 번호 # MBS1192601)를 구입하여 사용하였다. 이어서, 1에서 제작된 CLASP2 폴리펩티드와 CLASP2 폴리펩티드(MBS1192601)에 대하여, 상기 2의 (1)의 방법에 따라 상처 치유 효능을 확인하였다.

도 5는 생리식염수, 1에서 제작된 CLASP2 폴리펩티드, 및 CLASP2 폴리펩티드(MBS1192601) 각각을 상처 유발 동물 모델에 투여한 후, 상처 치유 정도를 측정한 결과를 나타낸다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 1에서 제작된 CLASP2 폴리펩티드를 포함하는 조성물은 CLASP2 폴리펩티드(MBS1192601)에 비하여, 상처 면적을 현저하게 감소시켰다. 구체적으로 투여 직후부터 12일까지, 1에서 제작된 CLASP2 폴리펩티드를 투여한 군은 상처를 빠른 속도로 치유할 수 있음을 확인하였다.

<110> CHA BIOTECH <120> Therapeutic composition for skin regeneration and wound healing using CLASP2 <130> CLASP2 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CLASP2 polypeptide <400> 1 Gly Gly Ala Gly Ala Val Asp Glu Asp Asp Phe Ile Lys Ala Phe Thr 1 5 10 15 Asp Val Pro Ser Ile Gln Ile Tyr Ser Ser Arg Glu Leu Glu Glu Thr 20 25 30 Leu Asn Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ser Asp Asp Lys His Asp Trp Asp 35 40 45 Gln Arg Ala Asn Ala Leu Lys Lys Ile Arg Ser Leu Leu Val Ala Gly 50 55 60 Ala Ala Gln Tyr Asp Cys Phe Phe Gln His Leu Arg Leu Leu Asp Gly 65 70 75 80 Ala Leu Lys Leu Ser Ala Lys Asp Leu Arg Ser Gln Val Val Arg Glu 85 90 95 Ala Cys Ile Thr Val Ala His Leu Ser Thr Val Leu Gly Asn Lys Phe 100 105 110 Asp His Gly Ala Glu Ala Ile Val Pro Thr Leu Phe Asn Leu Val Pro 115 120 125 Asn Ser Ala Lys Val Met Ala Thr Ser Gly Cys Ala Ala Ile Arg Phe 130 135 140 Ile Ile Arg His Thr His Val Pro Arg Leu Ile Pro Leu Ile Thr Ser 145 150 155 160 Asn Cys Thr Ser Lys Ser Val Pro Val Arg Arg Arg Ser Phe Glu Phe 165 170 175 Leu Asp Leu Leu Leu Gln Glu Trp Gln Thr His Ser Leu Glu Arg His 180 185 190 Ala Ala Val Leu Val Glu Thr Ile Lys Lys Gly Ile His Asp Ala Asp 195 200 205 Ala Glu Ala Arg Val Glu Ala Arg Lys Thr Tyr Met Gly Leu Arg Asn 210 215 220 His Phe Pro Gly Glu Ala Glu Thr Leu Tyr Asn Ser Leu Glu Pro Ser 225 230 235 240 Tyr Gln Lys Ser Leu Gln Thr Tyr Leu Lys Ser Ser 245 250 <210> 2 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CLASP2 polypeptide <400> 2 Gly His Met Gly Gly Ala Gly Ala Val Asp Glu Asp Asp Phe Ile Lys 1 5 10 15 Ala Phe Thr Asp Val Pro Ser Ile Gln Ile Tyr Ser Ser Arg Glu Leu 20 25 30 Glu Glu Thr Leu Asn Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ser Asp Asp Lys His 35 40 45 Asp Trp Asp Gln Arg Ala Asn Ala Leu Lys Lys Ile Arg Ser Leu Leu 50 55 60 Val Ala Gly Ala Ala Gln Tyr Asp Cys Phe Phe Gln His Leu Arg Leu 65 70 75 80 Leu Asp Gly Ala Leu Lys Leu Ser Ala Lys Asp Leu Arg Ser Gln Val 85 90 95 Val Arg Glu Ala Cys Ile Thr Val Ala 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Leu Thr Thr Thr Ala Leu Ser Thr Val Ser Ser Gly Val 465 470 475 480 Gln Arg Val Leu Val Asn Ser Ala Ser Ala Gln Lys Arg Ser Lys Ile 485 490 495 Pro Arg Ser Gln Gly Cys Ser Arg Glu Ala Ser Pro Ser Arg Leu Ser 500 505 510 Val Ala Arg Ser Ser Arg Ile Pro Arg Pro Ser Val Ser Gln Gly Cys 515 520 525 Ser Arg Glu Ala Ser Arg Glu Ser Ser Arg Asp Thr Ser Pro Val Arg 530 535 540 Ser Phe Gln Pro Leu Ala Ser Arg His His Ser Arg Ser Thr Gly Ala 545 550 555 560 Leu Tyr Ala Pro Glu Val Tyr Gly Ala Ser Gly Pro Gly Tyr Gly Ile 565 570 575 Ser Gln Ser Ser Arg Leu Ser Ser Ser Val Ser Ala Met Arg Val Leu 580 585 590 Asn Thr Gly Ser Asp Val Glu Glu Ala Val Ala Asp Ala Leu Lys Lys 595 600 605 Pro Ala Arg Arg Arg Tyr Glu Ser Tyr Gly Met His Ser Asp Asp Asp 610 615 620 Ala Asn Ser Asp Ala Ser Ser Ala Cys Ser Glu Arg Ser Tyr Ser Ser 625 630 635 640 Arg Asn Gly Ser Ile Pro Thr Tyr Met Arg Gln Thr Glu Asp Val Ala 645 650 655 Glu Val Leu Asn Arg Cys Ala Ser Ser Asn Trp Ser Glu Arg Lys Glu 660 665 670 Gly Leu Leu Gly Leu Gln Asn Leu Leu Lys Asn Gln Arg Thr Leu Ser 675 680 685 Arg Val Glu Leu Lys Arg Leu Cys Glu Ile Phe Thr Arg Met Phe Ala 690 695 700 Asp Pro His Gly Lys Val Phe Ser Met Phe Leu Glu Thr Leu Val Asp 705 710 715 720 Phe Ile Gln Val His Lys Asp Asp Leu Gln Asp Trp Leu Phe Val Leu 725 730 735 Leu Thr Gln Leu Leu Lys Lys Met Gly Ala Asp Leu Leu Gly Ser Val 740 745 750 Gln Ala Lys Val Gln Lys Ala Leu Asp Val Thr Arg Glu Ser Phe Pro 755 760 765 Asn Asp Leu Gln Phe Asn Ile Leu Met Arg Phe Thr Val Asp Gln Thr 770 775 780 Gln Thr Pro Ser Leu Lys Val Lys Val Ala Ile Leu Lys Tyr Ile Glu 785 790 795 800 Thr Leu Ala Lys Gln Met Asp Pro Gly Asp Phe Ile Asn Ser Ser Glu 805 810 815 Thr Arg Leu Ala Val Ser Arg Val Ile Thr Trp Thr Thr Glu Pro Lys 820 825 830 Ser Ser Asp Val Arg Lys Ala Ala Gln Ser Val Leu Ile Ser Leu Phe 835 840 845 Glu Leu Asn Thr Pro Glu Phe Thr Met Leu Leu Gly Ala Leu Pro Lys 850 855 860 Thr Phe Gln Asp Gly Ala Thr Lys Leu Leu His Asn His Leu Arg Asn 865 870 875 880 Thr Gly Asn Gly Thr Gln Ser Ser Met Gly Ser Pro Leu Thr Arg Pro 885 890 895 Thr Pro Arg Ser Pro Ala Asn Trp Ser Ser Pro Leu Thr Ser Pro Thr 900 905 910 Asn Thr Ser Gln Asn Thr Leu Ser Pro Ser Ala Phe Asp Tyr Asp Thr 915 920 925 Glu Asn Met Asn Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Ser Leu Arg Gly Val Thr 930 935 940 Glu Ala Ile Gln Asn Phe Ser Phe Arg Ser Gln Glu Asp Met Asn Glu 945 950 955 960 Pro Leu Lys Arg Asp Ser Lys Lys Asp Asp Gly Asp Ser Met Cys Gly 965 970 975 Gly Pro Gly Met Ser Asp Pro Arg Ala Gly Gly Asp Ala Thr Asp Ser 980 985 990 Ser Gln Thr Ala Leu Asp Asn Lys Ala Ser Leu Leu His Ser Met Pro 995 1000 1005 Thr His Ser Ser Pro Arg Ser Arg Asp Tyr Asn Pro Tyr Asn Tyr Ser 1010 1015 1020 Asp Ser Ile Ser Pro Phe Asn Lys Ser Ala Leu Lys Glu Ala Met Phe 1025 1030 1035 1040 Asp Asp Asp Ala Asp Gln Phe Pro Asp Asp Leu Ser Leu Asp His Ser 1045 1050 1055 Asp Leu Val Ala Glu Leu Leu Lys Glu Leu Ser Asn His Asn Glu Arg 1060 1065 1070 Val Glu Glu Arg Lys Ile Ala Leu Tyr Glu Leu Met Lys Leu Thr Gln 1075 1080 1085 Glu Glu Ser Phe Ser Val Trp Asp Glu His Phe Lys Thr Ile Leu Leu 1090 1095 1100 Leu Leu Leu Glu Thr Leu Gly Asp Lys Glu Pro Thr Ile Arg Ala Leu 1105 1110 1115 1120 Ala Leu Lys Val Leu Arg Glu Ile Leu Arg His Gln Pro Ala Arg Phe 1125 1130 1135 Lys Asn Tyr Ala Glu Leu Thr Val Met Lys Thr Leu Glu Ala His Lys 1140 1145 1150 Asp Pro His Lys Glu Val Val Arg Ser Ala Glu Glu Ala Ala Ser Val 1155 1160 1165 Leu Ala Thr Ser Ile Ser Pro Glu Gln Cys Ile Lys Val Leu Cys Pro 1170 1175 1180 Ile Ile Gln Thr Ala Asp Tyr Pro Ile Asn Leu Ala Ala Ile Lys Met 1185 1190 1195 1200 Gln Thr Lys Val Ile Glu Arg Val Ser Lys Glu Thr Leu Asn Leu Leu 1205 1210 1215 Leu Pro Glu Ile Met Pro Gly Leu Ile Gln Gly Tyr Asp Asn Ser Glu 1220 1225 1230 Ser Ser Val Arg Lys Ala Cys Val Phe Cys Leu Val Ala Val His Ala 1235 1240 1245 Val Ile Gly Asp Glu Leu Lys Pro His Leu Ser Gln Leu Thr Gly Ser 1250 1255 1260 Lys Met Lys Leu Leu Asn Leu Tyr Ile Lys Arg Ala Gln Thr Gly Ser 1265 1270 1275 1280 Gly Gly Ala Asp Pro Thr Thr Asp Val Ser Gly Gln Ser 1285 1290

Claims (4)

1. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 CLASP2(CLIP-association protein 2)의 단편을 유효성분으로 포함하는 상처 치유 또는 피부 재생 촉진용 약학 조성물.
   
2. 삭제
3. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 CLASP2(CLIP-association protein 2)의 단편을 유효성분으로 포함하는 상처 개선 또는 피부 재생용 화장료 조성물.
   
4. 삭제

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