KR20160121847A

KR20160121847A - 백미 추출물의 지표성분인 시나프산 또는 이를 함유하는 백미 추출물을 함유하는 피부재생용 화장료 조성물 및 상처 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20160121847A
Application number: KR1020150051584A
Authority: KR
Inventors: 최신욱; 홍인기; 석지현; 김힐; 배형진; 김은지
Original assignee: 주식회사 래디안
Priority date: 2015-04-13
Filing date: 2015-04-13
Publication date: 2016-10-21
Also published as: CN107405272A; WO2016167527A1; KR101768870B1; CN107405272B

Abstract

본 발명은 시나프산(sinapic acid) 또는 이를 함유하는 백미 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부재생용 화장료 조성물 및 상처 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 시나프산(sinapic aicd) 또는 이를 함유하는 백미 추출물을 함유하는 피부재생용 화장료 조성물 및 상처 치료용 약학 조성물은 피부의 염증발생을 제어하는 동시에 우수한 세포재생 효과와 창상 치료 효과를 발휘한다.

Description

백미 추출물의 지표성분인 시나프산 또는 이를 함유하는 백미 추출물을 함유하는 피부재생용 화장료 조성물 및 상처 치료용 약학 조성물 {Cosmetic composition and pharmaceutical composition with sinapic acid or the extract of cynanchum atratum for wound healing}

본 발명은 시나프산(sinapic acid) 또는 이를 함유하는 백미 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부재생용 화장료 조성물 및 상처 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

피부계는 인체 외부를 덮고 있는 기관으로 체온 조절과 외부 환경에 대한 장벽으로의 기능 등 다양한 기능을 가지고 있다. 이러한 피부는 가장 안쪽에서부터 피하지방층, 진피 및 표피의 세개층으로 구성되어 있다. 이중 피하지방층은 지방세포로 이루어져 있고, 피부층 가장 안쪽에 위치한다. 피하지방층 상부에 위치한 진피는 콜라겐 섬유와 탄력 섬유와 같은 기질 단백질로 이루어져 있으며, 혈관, 신경, 땀샘 등이 있다. 가장 바깥쪽에 위치한 표피는 중층편평상피의 각질형성세포가 대부분을 차지하고 있다.

그런데, 이러한 피부 표면은 자외선, 건조한 날씨, 차가운 바람, 잘못된 세안습관과 같이 외부의 유해 환경으로인해 끊임없이 손상되고 있다. 이 때문에 피부를 구성하는 가장 바깥부부분인 외피세포는 끊임없이 벗겨져 제거되고, 그 밑에 자라나는 다른 세포들이 그 자리를 대신하는 과정이 계속 되고 있다.

현대인들의 피부에 대한 관심이 높아짐에 따라, 최근에는 이러한 피부 손상을 인위적으로 유도하기 위해, 화학 약품이나 레이저를 이용하여 피부의 일부를 다양한 정도로 벗겨내는 박피시술이 큰 인기를 얻었다. 박피시술은 새로운 표피의 생성을 유도하고, 진피의 콜라겐 섬유의 생성을 자극하는 시술로서, 이는 여드름, 흉터, 주름살, 색소성 병변, 넓어진 모공의 치료에 이용된다. 이러한 박피술은 인위적으로 피부에 창상을 발생시키는 경우인데, 창상이란 외부의 압력에 의하여 조직의 연속성이 파괴되는 모든 상태를 지칭한다.

피부에 창상이 발생할 시, 첫째로 진피가 재생되며 이와 동시에 표피가 재생된다. 좀 더 구체적으로, 피부에 상처가 나면 진피의 비만세포가 히스타민을 분비하여 혈관이 확장되고, 확장된 혈관으로 염증세포(백혈구, 혈소판 등)가 모여들게 된다. 모여든 염증세포 중 백혈구가 사이토카인을 분비하면 진피의 탄력을 유지시켜 주는 섬유아세포를 활성화시켜 콜라겐과 뮤코다당 등의 물질을 분비하게 한다. 이후, 상처에 의해 찢어진 표피는 세포 이동에 관련된 유전자를 활성화시키고 결과적으로는 표피가 재생된다.

이러한 창상 치유 과정을 조절하는 대표적인 물질 중의 하나로 성장 인자(growth factor)를 들 수 있는데, 이들은 창상 치유 과정 전반에 걸쳐 세포의 성장, 분화, 대사 등을 조절하고 창상 주변 환경을 조절한다. 성장인자 중에서도 표피 성장 인자(epidermal growth factor: EGF)는 창상 치유에 있어 중요한 성장 인자이다.

EGF는 여러 연구를 통해서 피부, 각막, 점막 등의 창상 치유를 촉진한다는 보고가 있어 왔다. 또한, EGF는 창상 치유로 성인에게서 나타나는 산물인 반흔의 발생을 막는다는 연구가 보고되어 있다. 이외에도 다양한 사이토카인(cytokine)들이 창상 치유에 관여한다고 알려져 있다. 예를 들면, TGF-β(transforming growth factor-β)가 있다. 상기 TGF-β는 여러 가지 세포들의 성장과 분화에 관여하는 물질로, 성장 조절, 면역반응의 조절, 골생성의 자극, 연골-특이적 고분자(cartilage-specific macromolecule)의 유도, 창상치유 촉진 등의 여러 가지 복잡한 기능을 한다고 보고된 바 있다(Bennett, N.T. et al., Am. J.Surg. 165: 728, 1993).

한편, 레이저 치료나 박피술 이후에는 염증 반응 없이 상기와 같은 창상 치유 물질을 이용하여 피부재생을 유도하도록 하는 것이 중요하다. 하지만, 지금까지 개발된 피부 재생 및 상처 치유를 위한 화장품 대부분은 인위적으로 제조된 화합물 성분을 다량 함유하여 피부가 자극되는 부작용이 나타나거나 피부 재생 능력에 한계가 있는 실정이다. 그로 인해, 최근에는 부작용이 없고, 가격이 저렴한 천연물을 개발하여 창상을 치료하고자 하는 연구가 이루어지고 있다.

그러나, 백미 추출물 또는 시나프산(sinapic acid)이 세포의 성장, 분화, 대사 또는 창상에 효과가 있다는 연구는 보고된 바 없다.

대한민국 공개특허 제10-2014-0114617호(공개일자 2014. 09. 29)에는, 상처치료 효과를 확인하기 위해 경피전달을 위한 겔 제형에 커큐민(curcumin)을 첨가하여 커큐민 함유 겔을 제조하고, 이를 함유한 피부손상 치료용 약학 또는 화장품 조성물 및 도포용 겔에 대해 기재되어 있다. 대한민국 등록특허 제10-1505903호(등록일자 2015년03월19)에는, 감수(Euphobia kansui) 추출물, 분획물 또는 이로부터 분리한 디테르펜 화합물이 상피세포에 작용하여 분화된 상피세포의 재생능력을 높이는데 필요한 'PKD1'의 활성을 유도하고, 이는 하부의 'ERK1'의 인산화를 유도하고 'Cyclin D'의 생성을 유도함으로써, 상처 치료와 손상된 피부의 재생을 활성화하는 화장품이 기재되어 있다.

본 발명은 식물유래 물질로서, 피부를 재생시키고, 상처를 치유할 수 있는 새로운 성분을 발굴하여, 피부재생용 화장료 조성물 및 상처 치료용 약학 조성물로 개발하고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 시나프산(sinapic acid)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부재생용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 시나프산(sinapic acid)을 함유하는 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부재생용 화장료 조성물을 제공한다. 이때, 상기 식물 추출물은, 바람직하게 백미(Cynanchum atratum) 추출물인 것이 좋다. 또한, 상기 백미(Cynanchum atratum) 추출물은 일 예로 에탄올, 다이클로로메탄 및 에틸아세테이트 중 선택되는 어느 하나를 용매로 사용하여 백미로부터 수득한 추출물인 것이 좋다.

한편, 본 발명의 피부재생용 화장료 조성물은 시나프산 또는 시나프산(sinapic acid)을 함유하는 식물 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 일 예로 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 피부재생용 화장료 조성물에 있어서, 상기 화장료 조성물은 일 예로 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 화장료 조성물, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

본 발명 화장료 조성물의 제형이 페이스트 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제로 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.

또한, 본 발명 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸트 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성유, 라놀린유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.

한편, 본 발명은 시나프산(sinapic acid)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 창상 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 시나프산(sinapic acid)을 함유하는 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 창상 치료용 약학 조성물을 제공한다. 이때, 상기 식물 추출물은 바람직하게 백미(Cynanchum atratum) 추출물인 것일 수 있다. 또한, 상기 백미(Cynanchum atratum) 추출물은 일 예로 에탄올, 다이클로로메탄 및 에틸아세테이트 중 선택되는 어느 하나를 용매로 사용하여 백미로부터 수득한 추출물인 것일 수 있다.

한편, 본 발명의 창상 치료용 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 창상 치료용 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 형태의 피부 외용제 약학 조성물로도 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 창상 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 일 예로 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유가 있으며, 이 중 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.

본 발명의 창상 치료용 약학 조성물에 있어서, 경구투여를 위한 고형제제에는 일예로, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제일 수 있으며, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 중 선택되는 하나 이상이 포함될 수 있다.

본 발명의 창상 치료용 약학 조성물에 있어서, 경구투여를 위한 액상제제로는 일 예로 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제일 수 있으며, 물, 리퀴드 파라핀, 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 중 선택되는 하나 이상이 포함될 수 있다.

본 발명의 창상 치료용 약학 조성물에 있어서, 비경구 투여를 위한 제제는 일 예로 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제일 수 있으며, 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 중 선택되는 하나 이상이 포함될 수 있다.

한편, 본 발명의 창상 치료용 약학 조성물의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일 예로, 본 발명의 창상 치료용 약학 조성물은 유효성분을 기준으로 하였을 때 1일 0.0000001 내지 100 ㎎/㎏(체중)으로 1회 이상 투여가능하다. 다만, 상기의 투여량은 예시하기 위한 일 예에 불과하며, 복용자의 상태에 따라 의사의 처방에 의해 변화될 수 있다.

본 발명의 시나프산(sinapic aicd) 또는 이를 함유하는 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부재생용 화장료 조성물 및 상처 치료용 약학 조성물은 우수한 세포재생 효과와 창상 치료 효과를 발휘한다.

도 1은 백미 추출물의 용매 종류와 농도에 따른 세포 생존 능력 및 성장 능력을 측정한 그래프이다.
도 2는 백미 추출물 용매 종류와 농도에 따른 세포 이동 능력을 측정한 그래프이다.
도 3은 백미 추출물 용매 종류와 농도에 따른 'TNF-α'의 발현 억제능을 측정한 그래프이다.
도 4는 백미 추출물 용매 종류와 농도에 따른 'PGE₂' 발현 억제능을 측정한 그래프이다.
도 5는 백미 추출물 용매 종류와 농도에 따른 'IL-2' 발현 저해능을 측정한 그래프이다.
도 6은 백미 추출물 용매 종류와 농도에 따른 'iNOS' 및 'COX-2' 발현 저해능을 측정한 그래프이다.
도 7은 시나프산(sinapic acid)의 농도에 따른 세포 생존 능력 및 성장 능력을 측정한 그래프이다.
도 8은 시나프산(sinapic acid)의 농도 및 시간 경과에 따른 세포 성장 능력을 측정한 그래프이다.
도 9는 시나프산(sinapic acid)의 농도에 따른 세포 이동 능력을 측정한 그래프이다.
도 10은 시나프산(sinapic acid)의 농도에 따른 'TNF-α'의 발현 억제능을 측정한 그래프이다.
도 11은 시나프산(sinapic acid)의 농도에 따른 'IL-2' 발현 저해능을 측정한 그래프이다.
도 12는 시나프산(sinapic acid)의 농도에 따른 'PGE₂' 발현 억제능을 측정한 그래프이다.
도 13은 백미 추출물 첨가에 따른 창상부위 면적을 측정한 그래프이다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예, 실험예 및 제형예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 제형예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[제조예 1: 백미 추출물의 제조]

본 제조예에서는 백미 추출물을 제조하고자 하였다.

건조된 백미 전초를 구입하여 분쇄기를 이용하여 분말로 만들어 준비하였다. 분말로 만든 백미에 추출 용매로서 '70% 에탄올', '99.5% 다이클로로메탄(dichloromethane)', '99% 에틸아세테이트(ethyl acetate)'를 각각 사용하여 추출하였다. 이때, 각 추출용매의 양은 백미 분말의 건조 중량 1 g 당 5~20 ㎖로 하였다. 추출을 위해 실온에서 3시간 동안 침적 추출하였다. 추출 후, 여과지를 이용하여 추출액을 회수하였다. 회수된 추출액은 회전 감압 농축기를 사용하여 각각 농축한 후, 하기 실험에서 사용하였다.

[실험예 1: 백미 추출물의 세포독성 및 세포성장 측정]

본 실험예에서는 상기 제조예 1에서 제조한 백미 추출물에 'MTT assay'를 수행하여 세포독성을 확인하고자 하였다.

사람 유래의 각질형성세포(HaCaT)를 96웰 플레이트에 1×10⁵ cells/㎖의 농도로 접종하고 배양하여 따로 두었다. 그 후, 상기 제조예 1에서 제조한 각각의 백미 추출물을 하기 표 1의 농도가 되게 희석하여, 상기 웰 플레이트에 첨가하고 24, 48, 72 시간 동안 더 배양하였다. 이때, MTT 시약을 이용하여 세포의 생존율 및 성장률을 평가하였고, 대조군은 시료를 처리하지 않은 음성대조군을 사용하였다.

용매 종류	용매 농도(㎍/㎖)
70% 에탄올	25
	50
	100
	200
99.5% 다이클로로메탄	1
	5
	10
	25
99% 에틸아세테이트	1
	5
	10
	25

실험결과, 70% 에탄올 백미 추출물 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 99.5% 다이클로로메탄 1 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 99% 에틸아세테이트 1 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖ 에서 세포 독성이 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 상기 농도에서 세포 성장도 이루어지는 것을 확인할 수 있었다 (도 1).

[실험예 2: 백미 추출물의 세포이동 능력 측정]

본 실험예에서는 상처 치유에 있어, 중요한 메커니즘인 각질형성세포의 이동을 확인하고자 하였다.

각질형성세포(HaCaT)를 24웰 플레이트에 1×10⁵ cells/㎖의 농도로 접종하고 배양한 후, 200 ㎕ 파이펫 팁을 이용하여 세포를 긁어내었다. 이후, 상기 실험예 1에서 세포독성을 나타내지 않은 70% 에탄올 백미 추출물 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 99.5% 다이클로로메탄 5 ㎍/㎖, 99% 에틸아세테이트 5 ㎍/㎖ 를 각각 첨가하여 72 시간 동안 세포이동을 측정하였다. 이때, 대조군으로는 세포이동 능력을 높이는 물질로 알려진 EGF를 이용하였다.

실험결과, 백미 추출물은 대조군인 EGF와 비교하여, 우수한 세포 이동력을 지니며, 70% 에탄올 백미 추출물 50 ㎍/㎖에서 가장 우수한 세포 이동력을 보이는 것으로 확인할 수 있었다 (도 2).

[ 실험예 3: 백미 추출물의 TNF -α 발현 저해능 평가]

사람 유래의 각질형성세포(HaCaT)를 24웰 플레이트에 1×10⁵ cells/㎖의 농도로 접종하고 24시간 동안 배양한 후, 자외선 B 파장을 12.5 mJ/cm²로 처리하였다. 그 후, 상기 제조예 1에서 제조한 70% 에탄올 백미 추출물 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 99.5% 다이클로로메탄 5 ㎍/㎖, 99% 에틸아세테이트 5 ㎍/㎖ 을 상기 웰 플레이트에 각각 첨가하고, 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 배양액에 분비된 'TNF-α'의 양을 면역분석법을 통해 측정하였다. 이때, 대조군으로는 1 μM의 덱사메타손(dexamethasone)을 양성대조군으로 사용하였다.

실험결과, 덱사메타손(dexamethasone) 보다 백미 추출물에서 자외선 B에 의해 생성되는 'TNF-α'의 발현이 우수하게 억제되는 것을 확인할 수 있었다 (도 3).

[실험예 4: 백미 추출물의 PGE ₂ 발현 저해능 평가]

사람 유래의 각질형성세포(HaCaT)를 24웰 플레이트에 1×10⁵ cells/㎖의 농도로 접종하고, 24시간 동안 배양한 후, 자외선 B 파장을 12.5 mJ/cm²로 처리하였다. 그 후, 상기 제조예 1에서 제조한 70% 에탄올 백미 추출물 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 99.5% 다이클로로메탄 5 ㎍/㎖, 99% 에틸아세테이트 5 ㎍/㎖를 상기 웰 플레이트에 각각 첨가하여 24시간 배양하고, 배양액에 분비된 PGE₂의 양을 면역분석법을 통해 측정하였다. 이때, 대조군으로는 1 μM의 덱사메타손(dexamethasone)을 양성대조군으로 사용하였다.

실험결과, 덱사메타손(dexamethasone) 보다 백미 추출물에서 자외선 B에 의해 생성되는 'PGE₂'의 발현이 우수하게 억제되는 것을 확인할 수 있었다 (도 4).

[실험예 5: 백미 추출물의 IL-2 발현 저해능 평가]

사람 유래의 각질형성세포(HaCaT)를 24웰 플레이트에 1×10⁵ cells/㎖의 농도로 접종하고 24시간 동안 배양한 후, 자외선 B 파장을 12.5 mJ/cm²로 처리하였다. 그 후, 상기 제조예 1에서 제조한 70% 에탄올 백미 추출물 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 99.5% 다이클로로메탄 5 ㎍/㎖, 99% 에틸아세테이트 5 ㎍/㎖를 상기 웰 플레이트에 각각 첨가하여 24시간 배양하고, 배양액에 분비된 IL-2의 양을 면역분석법을 통해 측정하였다. 이때, 대조군으로는 1 μM의 덱사메타손(dexamethasone)을 양성대조군으로 사용하였다.

실험결과, 덱사메타손(dexamethasone) 보다 백미 추출물에서 자외선 B에 의해 생성되는 'IL-2' 의 발현이 우수하게 억제되는 것을 확인할 수 있었다 (도 5).

[실험예 6: 백미 추출물의 iNOS 및 COX-2 발현 저해능 평가]

사람 유래의 각질형성세포(HaCaT)를 60웰 플레이트에 1×10⁵ cells/㎖의 농도로 접종하고 24시간 동안 배양한 후, 자외선 B 파장을 12.5 mJ/cm²로 처리하였다.그 후, 상기 제조예 1에서 제조한 70% 에탄올 백미 추출물 25 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 99.5% 다이클로로메탄 5 ㎍/㎖, 99% 에틸아세테이트 5 ㎍/㎖를 상기 웰 플레이트에 각각 첨가하여 24시간 배양하였다. 배양 후, SDS-PAGE(Sodiumdodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 이용하여 단백질을 분리하고 'Electrotransfer'를 이용하여 PVDF 막(membrane)에 옮긴 후 면역 블로팅법(immuno blotting)을 이용하여 세포 내 발현 수준을 확인하였다. 이때, 대조군으로는 1 μM의 덱사메타손(dexamethasone)을 양성대조군으로 사용하였다.

실험결과, 덱사메타손(dexamethasone) 보다 백미 추출물에서 자외선 B에 의해 생성되는 iNOS, COX-2의 단백질 발현이 우수하게 억제되는 것을 확인할 수 있었다 (도 6).

[ 실험예 7: 시나프산(sinapic acid)의 세포독성 및 세포성장 측정]

본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 제조한 백미 추출물의 지표성분인 시나프산(sinapic acid)의 세포독성을 확인하고자, 시나프산에 대해 'MTT assay'를 수행하였다. 이때, 경기과학기술진흥원 천연물신약연구소에 의뢰하여, 시나프산(sinapic acid)이 상기 제조예 1에서 제조한 백미 추출물의 지표성분임을 확인하였다.

사람 유래의 각질형성세포(HaCaT)를 96웰 플레이트에 1×10⁵ cells/㎖의 농도로 접종하고 배양한 후, 시나프산을 각각 25, 50, 100, 200, 250, 500 μM 농도가 되게 희석하여 상기 웰 플레이트에 첨가하고 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, MTT 시약을 이용하여 세포의 생존율을 평가하였다. 이때, 대조군은 시료를 처리하지 않은 음성대조군을 사용하였다.

실험결과, 25, 50, 100, 200, 250, 500 μM 농도의 시나프산(sinapic acid)에서 모두 세포 독성이 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다 (도 7).

[ 실험예 8: 시나프산(sinapic acid)의 첨가 농도 및 시간 경과에 따른 세포 성장 측정]

사람 유래의 각질형성세포(HaCaT)를 96웰 플레이트에 1×10⁵ cells/㎖의 농도로 접종하고 배양한 후, 시나프산을 각각 25, 50, 100, 200, 250, 500 μM 농도가 되게 희석하여 상기 웰 플레이트에 첨가하고, 각각 24, 48, 72시간 동안 배양하였다. 배양 후, MTT 시약을 이용하여 세포의 성장율을 평가하였다. 이때, 대조군은 시료를 처리하지 않은 음성대조군을 사용하였으며, 양성대조군으로 EGF를 사용하였다.

실험결과, 시나프산(sinapic acid)의 농도에 의존적으로 세포 성장이 이루어지는 것을 확인하였다. 또한, 100 μM 농도 이상에서는 24시간 배양하였을 경우가 48 시간 및 72시간 배양한 경우보다 더 높은 세포 성장을 이루는 것을 확인하였다 (도 8).

[실험예 9: 시나프산(sinapic acid)의 세포이동 능력 측정]

각질형성세포(HaCaT)를 24 웰 플레이트에 1×10⁵ cells/㎖의 농도로 접종하고 배양한 후, 200 ㎕ 파이펫 팁을 이용하여 세포를 긁어내었다. 그 후, 시나프산(sinapic acid)을 상기 웰 플레이트에 첨가하고, 72 시간 동안 세포 이동을 측정하였다. 대조군으로는 세포이동 능력을 높이는 것으로 알려진 EGF를 이용하였다.

실험결과, 시나프산(sinapic acid)에 의해 세포 이동 능력이 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (도 9).

[실험예 10: 시나프산(sinapic acid)의 TNF-α 발현 저해능 평가]

사람 유래의 각질형성세포(HaCaT)를 24웰 플레이트에 1×10⁵ cells/㎖의 농도로 접종하고 24시간 동안 배양하였다. 상기 웰 플레이트에 자외선 B 파장을 12.5 mJ/cm²로 처리한 후, 시나프산 50, 100 μM을 첨가하고, 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 배양액에 분비된 TNF-α의 양을 면역분석법을 통해 측정하였다. 이때, 대조군으로는 1 μM 의 덱사메타손(dexamethasone)을 양성대조군으로 사용하였다.

실험결과, 시나프산은 양성대조군인 덱사메타손(dexamethasone)과 유사하게 TNF-α 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있었다 (도 10).

[실험예 11: 시나프산(sinapic acid)의 IL-2 발현 저해능 평가]

사람 유래의 각질형성세포(HaCaT)를 24웰 플레이트에 1×10⁵ cells/㎖의 농도로 접종하고 24시간 동안 배양하였다. 상기 웰 플레이트에 자외선 B 파장을 12.5 mJ/cm²로 처리한 후, 시나프산 50, 100 μM을 첨가하고, 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 배양액에 분비된 IL-2의 양을 면역분석법을 통해 측정하였다. 대조군으로는 1 μM 의 덱사메타손(dexamethasone)을 양성대조군으로 사용하였다.

실험결과, 시나프산은 양성대조군인 덱사메타손(dexamethasone)과 유사하게 IL-2 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있었다 (도 11).

[실험예 12: 시나프산(sinapic acid)의 PGE ₂ 발현 저해능 평가]

사람 유래의 각질형성세포(HaCaT)를 24웰 플레이트에 1×10⁵ cells/㎖의 농도로 접종하고 24시간 동안 배양하였다. 상기 웰 플레이트에 자외선 B 파장을 12.5 mJ/cm²로 처리한 후 시나프산 50, 100 μM을 첨가하고, 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 배양액에 분비된 PGE₂의 양을 면역분석법을 통해 측정하였다. 대조군으로는 1 M 의 덱사메타손(dexamethasone)을 양성대조군으로 사용하였다.

실험결과, 시나프산은 양성대조군인 덱사메타손(dexamethasone)과 유사하게 PGE₂ 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있었다 (도 12).

[실험예 13: 백미 추출물의 피부 창상 치유 효능 평가]

본 실험예에서는 상기 제조예 1에서 '70% 에탄올'을 사용하여 추출한 백미 추출물을 사용하여 피부 창상 치유 효능을 평가하고자 하였다. 이하, 하기 실험에서는 본 실험예에서 사용한 것과 같은 백미 추출물을 사용하여 실험을 수행하였다.

실험을 위해, 독성 및 약효시험에 널리 사용되고 있는 설치류 중 5주령 수컷 SD rat을 이용하였으며, 창상모델을 제작하기 위해 5주령 수컷 SD rat을 마취하고, 등부위를 제모한 후, 70% 에탄올 및 포비돈을 이용하여 피부를 소독하였다. 척추선을 중심으로 한쪽에 3 cm×3 cm 크기로 메스를 이용하여 창상을 유발하였으며, 진피부분까지 제거 하였다. 그 후, 창상 유발부위에 즉시 0.5%(w/v), 1%(w/v), 2%(w/v) 농도의 백미 추출물을 각각 도포한 다음 안정적으로 드레싱(Dressing)하였다.

창상부위에 시험물질을 1일 1회 도포한 후 주 2회 간격으로 창상부위를 사진으로 찍어 'ImageJ soft' 프로그램을 이용하여 창상부위 면적을 24일간 측정하였다. 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

경과일수	대조군(cm²)	실험군 1(cm²) (0.5% 백미추출물)	실험군 2(cm²) (1% 백미추출물)	실험군 3(cm²) (2% 백미추출물)
0 day	8.60±0.66	8.50±0.98	8.30±0.55	8.24±1.12
3 days	7.22±0.69	6.99±1.14	7.41±0.44	7.54±0.98
7 days	5.36±0.68	4.56±0.85	5.09±0.63	5.56±1.31
10 days	3.55±0.68	2.80±0.56	3.13±0.48	3.24±0.86
14 days	2.72±1.13	1.57±0.39	1.65±0.40	1.39±0.60
17 days	1.87±1.47	0.85±0.32	0.97±0.41	0.77±0.49
21 days	1.25±1.08	0.59±0.24	0.71±0.30	0.63±0.34
24 days	1.08±1.13	0.48±0.25	0.44±0.20	0.33±0.35

실험결과, 10일 이후부터 0.5%(w/v), 0.1%(w/v), 2%(w/v) 백미 추출물 처리군과 대조군이 회복 속도 및 면적에서 차이가 발생하는 것을 확인하였으며, 10일 이후부터 24일까지모든 백미 추출물 군에서의 회복 속도와 면적이 대조군보다 우수한 것을 확인할 수 있었다 (도 13).

[실험예 14: 백미 추출물의 피부 창상 치유 조직병리학적 효능 평가]

백미 추출물의 피부 창상 치유의 조직병리학적 효능 평가를 위하여 'Hematoxylin & Eosin(H&E)' 염색을 수행한 후, 광학현미경을 이용하여 판독하였다.

실험군 별 치유 정도를 비교하기 위하여 염증(inflammation), 결합조직증생(Fiboroplasia), 상피화(epithelialization) 소견을 정하고 해당 소견이 관찰되지 않은 0점부터 가장 심한 3점까지 총 4단계로 구분하여 평가하였다. 평가 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

경과일수	대조군	실험군 1 (0.5% 백미추출물)	실험군 2 (1% 백미추출물)	실험군 3 (2% 백미추출물)
염증	2.8	2.1	2.1	1.8
결합조직증생	2.8	2.5	2.6	2.9
상피화	1.1	2	1.8	2.4

실험결과, 상기 표 3과 같이 백미 추출물 처리군에 의해 염증이 완화되었고, 결합조직증생 및 상피화는 증가된 것으로 확인할 수 있었다.

[실시예 1: 백미 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부재생용 크림형 화장료 조성물]

본 실시예에서는 백미 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부재생용 크림형 화장료 조성물을 제조하고자 하였다. 고형분 함량 2%(w/v)의 백미 추출물을 포함하는 성분들을 하기 표 4의 함량에 따라, 혼합하여 피부재생용 크림형 화장료 조성물을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
2%(w/v) 백미 추출물	4.0
글리세린	2.0
파라벤	0.2
알란토인	2.0
베타인	3.0
히아루론산나트륨	1.0
초산토코페롤	5.0
쉐어버터	2.0
트레할로스	1.0
방부제 및 향	적량
정제수	to 100
합계	100

한편, 하기 실시예에서도 본 실시예에서 사용한 것과 같은 백미 추출물을 사용하였다.

[실시예 2: 백미 추출물을 유효성분으로 함유하는 창상 치료용 약학 조성물]

본 실시예에서는 백미 추출물을 유효성분으로 함유하는 창상 치료용 약학 조성물(연고)을 제조하고자 하였다.

본 발명의 고형분 함량은 2 %(w/v)의 백미 추출물을 포함하는 성분들을 하기 표 5의 함량에 따라, 혼합하여 창상 치료용 약학 조성물(연고)을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
2%(w/v) 백미 추출물	10
디에틸 세바케이트	8
경납	5
폴리옥시에틸렌올레일에테르 포스페이트	6
벤조산 나트륨	적량
바셀린	to 100
합계	100

[실시예 3: 시나프산을 유효성분으로 함유하는 피부재생용 크림형 화장료 조성물]

본 실시예에서는 시나프산을 유효성분으로 함유하는 피부재생용 크림형 화장료 조성물을 제조하고자 하였다. 2%(w/v) 시나프산 현탁액을 포함하는 성분들을 하기 표 6의 함량에 따라, 혼합하여 피부재생용 크림형 화장료 조성물을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
2%(w/v) 시나프산 현탁액	0.4
글리세린	2.0
파라벤	0.2
알란토인	2.0
베타인	3.0
히아루론산나트륨	1.0
초산토코페롤	5.0
쉐어버터	2.0
트레할로스	1.0
방부제 및 향	적량
정제수	to 100
합계	100

한편, 하기 실시예에서도 본 실시예에서 사용한 것과 같은 시나프산을 사용하였다.

[실시예 4: 시나프산을 유효성분으로 함유하는 창상 치료용 약학 조성물]

본 실시예에서는 시나프산을 유효성분으로 함유하는 창상 치료용 약학 조성물(연고)을 제조하고자 하였다.

본 발명의 고형분 함량은 2%(w/v) 시나프산 현탁액을 포함하는 성분들을 하기 표 7의 함량에 따라, 혼합하여 창상 치료용 약학 조성물(연고)을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
2%(w/v) 시나프산 현탁액	1
디에틸 세바케이트	8
경납	5
폴리옥시에틸렌올레일에테르 포스페이트	6
벤조산 나트륨	적량
바셀린	to 100
합계	100

Claims

시나프산(sinapic acid)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부재생용 화장료 조성물.
시나프산(sinapic acid)을 함유하는 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부재생용 화장료 조성물.
제2항에 있어서,
상기 식물 추출물은,
백미(Cynanchum atratum) 추출물인 것을 특징으로 하는 피부재생용 화장료 조성물.
제3항에 있어서,
상기 백미(Cynanchum atratum) 추출물은,
에탄올, 다이클로로메탄 및 에틸아세테이트 중 선택되는 어느 하나를 용매로 사용하여 백미로부터 수득한 추출물인 것을 특징으로 하는 피부재생용 화장료 조성물.
시나프산(sinapic acid)을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 창상 치료용 약학 조성물.
시나프산(sinapic acid)을 함유하는 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 창상 치료용 약학 조성물.
제6항에 있어서,
상기 식물 추출물은,
백미(Cynanchum atratum) 추출물인 것을 특징으로 하는 창상 치료용 약학 조성물.
제7항에 있어서,
상기 백미(Cynanchum atratum) 추출물은,
에탄올, 다이클로로메탄 및 에틸아세테이트 중 선택되는 어느 하나를 용매로 사용하여 백미로부터 수득한 추출물인 것을 특징으로 하는 창상 치료용 약학 조성물.