KR101879315B1 - 천연 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 피부진정용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 피부진정 화장료 조성물에 관한 것이다. 상기 피부진정 화장료 조성물은 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물의 혼합물이 0.9 내지 1.1 : 0.4 내지 0.6 내지 1.4 내지 1.6의 중량비로 포함된 것으로 피부를 냉감시키고 피지분비를 억제하고 모공을 수축하며, 산화질소의 생성 및 COX-2의 발현을 감소시키며, 에오탁신-1의 생성을 억제함으로 인해 피부를 진정시킬 수 있다. 또한 상기 화장료 조성물은 손상된 피부의 수분 손실을 차단시키거나 홍반을 개선하는 효과를 나타내므로, 외용제로 사용하는 경우 외부자극으로 인하여 손상된 피부를 개선시킬 수 있다. 그리고 세포독성 및 피부 부작용이 없어 화장료 또는 약학적 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

Description

천연 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 피부진정용 조성물{A composition for skin smoothing comprising natural complex extracts}

본 발명은 천연 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 피부진정용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물의 혼합물을 함유하여 피부냉감, 피지분비 억제, 모공수축 및 항염증 효과를 가짐으로써, 피부 진정효과를 나타내는 화장료 또는 약학적 조성물에 관한 것이다.

여름철은 강한 자외선으로 인해 기온이 오르게 되고 피부온도가 상승하게 된다. 피부는 이를 떨어뜨리기 위해 땀 분비를 증가시키게 되는데, 과도한 땀 분비는 피부건조를 유발할 수 있으므로 피부는 피지분비를 증가시킴으로써 수분손실을 막으려는 특성이 있다. 이러한 피지분비량의 증가로 인해 모공이 점차 넓어지게 되며, 넓어진 모공을 통해 모낭 내로 세균이 침입하기 쉬워져 피부 트러블을 일으키게 된다.

피지는 적절하게 분비되면 피부 표면의 산성 균형을 유지하고 수분 증발을 막아 피부가 적절한 보습상태를 유지할 수 있게 돕는다. 그러나, 피지 분비가 과도하게 되는 경우 분비된 피지는 박테리아로 인해 변질되기 쉬운데, 모낭벽에서 떨어져 나간 각질세포들과 피지가 섞이면서 모공을 막고 염증을 유발하게 되며, 특히 피지가 과다하게 분비되는 여름에 피부 염증반응이 발생하기 쉽다. 이와 같은 피지의 과다 분비로 인한 피부 염증을 일으키는 원인으로는 자외선, 공해물질, 잘못된 화장품의 사용 등과 같은 외적 요인과 수면부족, 다양한 스트레스 등으로 인한 내적 요인들이 있으며, 이러한 다양한 피부 스트레스는 세균감염 및 염증인자를 증가시키며 만성적인 피부염증, 피부질환, 및 주름 등을 일으켜 피부노화를 발생시키게 된다.

또한, 최근에는 피부에 가해지는 열에 의해 피부로의 염증인자의 투과성이 증가되며, 세포외 기질의 손상을 유발함으로 인해 피부노화를 일으킨다는 연구결과가 발표되었다(J Investig Dermatol Symp Proc. 2009, 14(1):15-9).

이에, 본 발명자들은 다양한 피부 스트레스 요인으로부터 피부를 건강하게 유지하고자 하는 방법으로, 각질층의 기능향상을 통해 피부의 수분손실을 막고 정상적인 피지분비를 유지함과 동시에 모공을 수축시키며, 과도한 피지분비로 인한 피부 염증유발을 방지하고, 이와 더불어 열에 의해 상승한 피부온도를 효과적으로 냉감시킬 수 있는 천연 소재를 연구하던 중 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물의 혼합물의 혼합물이 그 상승작용에 의해 피부의 온도를 낮추고, 피지분비를 억제하며, 모공을 수축시키고 피부의 항염증 효과를 나타냄으로써, 우수한 피부진정 효과를 갖는다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 피부냉감, 피지분비 억제, 모공수축 또는 항염증 효과가 우수한 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물의 혼합물을 함유하는 피부진정용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 피부냉감, 피지분비 억제, 모공수축 또는 항염증 효과가 우수한 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물의 혼합물을 함유하는 피부진정용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 피부진정용 화장료 또는 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 녹차(Green tea, Camellia sinensis O. Kuntze)는 차나무과에 속하는 여러해살이 식물인 상록교목의 잎을 의미한다.

본 발명에 있어서, 타임(Thyme, Thymus vulgaris)은 전세계에 분포하는 쌍떡잎식물 통화식물목 꿀풀과의 여러해살이풀을 의미한다. 상기 타임은 높이가 30㎝ 정도 이고, 잔뿌리가 많은 뿌리에서 사각 모양의 줄기가 나와 위로 올라가며 곁가지를 많이 친다. 잎줄기는 매우 짧고, 길이가 5~9㎜이고 너비가 3㎜ 정도인 긴 타원형의 잎 가장자리는 안으로 굽고 잔털이 많다

본 발명에 있어서, 애플민트(Apple mint, Mentha)는 유럽이 원산지인 허브의 일종으로 통화식물목 꿀풀과의 여러해살이풀을 의미한다. 상기 애플민트는 높이가 30∼60cm 정도 이고, 사과와 박하가 섞인 듯한 향기가 나며, 잎은 달걀 모양으로 둥글고 흰 털이 나 있으며 연해 보인다.

본 발명에 있어서, “피부진정”은 피부냉감, 피지분비 억제, 모공수축 또는 피부의 항염증 효과를 부여하여 피부를 건강한 상태로 유지하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, “피부냉감”은 피부에 시원함을 주는 것, 피부온도를 낮추는 것 또는 피부에 청량감을 부여하는 것을 의미한다.

본 발명의 피부진정용 화장료 또는 약학적 조성물은 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하며, 이들 추출물을 각각 사용할 때보다 피부냉감, 피지분비 억제, 모공수축 및 항염증에 있어서 상승된 효과를 나타낸다.

본 발명의 “항염증 효과”는 반드시 이로 한정하는 것은 아니나, 아토피 피부염, 지루성 피부염, 접촉성 피부염, 홍반성 루프스, 구진상 두드러기, 여드름 및 건선 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 염증성 피부질환의 예방, 개선 또는 치료 효과를 의미한다.

본 발명의 피부진정용 화장료 또는 약학적 조성물에는 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물이 바람직하게는 0.9 내지 1.1 : 0.4 내지 0.6 내지 1.4 내지 1.6의 중량비로 포함되며, 보다 바람직하게는 0.95 내지 1.05 : 0.45 내지 0.55 : 1.35 내지 1.55의 중량비로 포함되며, 보다 더 바람직하게는 1 : 0.5 : 1.5의 중량비로 포함된다.

본 발명에 있어서, 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물의 혼합물의 중량비가 상기 한정범위를 벗어나는 경우, 피부진정의 효과가 감소한다.

본 발명의 하나의 구체적인 예로, 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물 각각은 당 분야에 공지된 통상적인 용매를 사용하여 추출할 수 있으며, 추출한 액은 액체 형태로 사용되거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용될 수 있다. 이때, 상기 용매로 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 또는 1,3-부틸렌글리콜 중 어느 하나의 용매를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 메탄올, 에탄올 또는 부탄을 이용하여 추출하는 것이 좋다. 그러나, 특별히 이에 한정되는 것은 아니다. 추출하는 유기용매에 따라 추출물의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 하는 것이 바람직하다. 상기 추출 방법으로는 냉침 추출, 초음파 추출, 또는 환류 냉각 추출 방법 등이 있으며, 특별히 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 하나의 구체적인 예로, 녹차, 타임 및 애플민트의 추출방법으로 초임계 추출방법을 이용할 수 있다.

상기 초임계 추출은 용매 추출, 식물성 오일 추출 또는 수증기 증류 추출과 달리 저온에서 초고압으로 식물의 필요한 성분만을 고농도로 추출하는 방법으로, 각 식물이 가지는 유효성분들을 파괴하지 않고 추출할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 하나의 구체적인 예로, 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물은 40~60℃ 및 300~500 bar, 바람직하게는 45~55℃ 및 350~450 bar 조건의 초임계 이산화탄소를 이용하여 2 내지 4시간 동안 추출되며, 바람직하게는 3시간 동안 추출된다.

본 발명의 하나의 구체적인 예로, 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물은 추출, 분획, 또는 정제(분리, 분획)의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획, 정제물, 그들의 희석액, 농축액, 또는 건조물일 수 있다.

본 발명의 하나의 구체적인 예로, 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 피부진정용 화장료 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 하나의 구체적인 예로, 본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 사용되는 경우, 유효성분인 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물의 혼합물은 전체 화장료 조성물의 총 중량을 기준으로 0.00001 내지 15.0 중량%, 바람직하게는 0.0001 내지 10 중량%, 보다 바람직하게는 0.0001 내지 5 중량%로 포함될 수 있다.

본 발명의 하나의 구체적인 예로, 상기 화장료 조성물은 상기 녹차, 타임 및 애플민트 추출물의 혼합물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 항료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 하나의 구체적인 예로, 본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 사용되는 경우, 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 또는 스프레이 등으로 제형화될 수 있다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림 등의 제형으로 제조될 수 있다. 그러나, 특별히 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용될 수 있다. 예를 들어, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 냉감센서를 활성화시키고, 피지 분비를 억제시키며, 염증과 관련된 면역관련 반응을 억제시키므로, 염증성 피부질환을 예방하거나 개선할 수 있고, 외용제로 사용하는 경우 피부에 청량감을 느끼게 하여 통증을 감소시키며, 수분손실을 차단하거나 홍반을 개선시킬 수 있다.

본 발명의 하나의 구체적인 예로, 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물의 혼합물을 유효성분으로 하는 조성물은 피부진정용 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 하나의 구체적인 예로, 본 발명의 조성물이 약학적 조성물로 사용되는 경우, 유효성분인 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물의 혼합물은 전체 약학적 조성물의 총 중량을 기준으로 0.00001 내지 15.0 중량%, 바람직하게는 0.0001 내지 10 중량%, 보다 바람직하게는 0.0001 내지 5 중량%로 포함될 수 있으며, 유효성분으로서 상기 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물의 혼합물 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001 내지 300㎎/kg 범위 내이다. 다만, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물(예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름(예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

상기 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 주사제 또는 외용제 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 피부냉감, 피지분비 억제, 모공수축 또는 항염증 효과가 있을 수 있는데, 치료방법은 상기 약학적 조성물을 약학적 유효량으로 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여하는 것을 포함한다. 상기 투여방법은 여러 방식으로 이루어질 수 있는데, 예를 들어, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 도포에 의한 국부 투여 등으로 투여될 수 있다.

상기 약학적 조성물의 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태 등의 요인에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001 내지 300㎎/kg 범위 내이다. 다만, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 냉감센서를 활성화시키고, 피지 분비를 억제시키며, 염증과 관련된 면역관련 반응을 억제시키므로, 염증성 피부질환을 개선하거나 치료할 수 있고, 외용제로 사용하는 경우 피부에 청량감을 느끼게 하여 통증을 감소시키며, 수분손실을 차단하거나 홍반을 개선시킬 수 있다.

본 발명의 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 개체 내 투여, 피하 투여 또는 도포에 의한 국부 투여 등에 의하여 개체의 피부결의 손상 및 피부 위축증을 개선, 호전, 예방 또는 치료하는 등의 목적을 달성할 수 있는 이점이 있다.

한편, 본 발명의 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물의 혼합물은 식물로부터 유래하여 인체에 대한 부작용이 거의 없는 천연 추출물로서, 화장료 및 의약품에 유효성분으로 안전하게 이용할 수 있다.

본 발명의 피부진정용 조성물은 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물의 혼합물이 유효성분으로 혼합된 것으로, 냉감센서를 활성화시키고, 피지분비 억제 및 모공을 수축시키며, 산화질소(Nitric Oxide, NO)의 생성 및 사이클로옥시겐아제-2(COX-2)의 발현을 감소시킴으로 인해 피부 염증질환을 개선 또는 치료할 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물은 각질 세포막 기능향상을 통해 피부손상으로 인한 수분손실을 차단하거나 홍반을 개선하므로, 피부 외용제로 사용하는 경우 외부 자극으로 인하여 손상된 피부를 진정시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 추출물은 천연소재로부터 유래한 것으로 세포독성 및 피부 부작용이 없어 화장료 또는 약학적 조성물에 안전하게 적용될 수 있다.

도 1은 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물을 조성비를 달리하여 혼합 제조한 시료들의 산화질소, COX-2 활성 저해 정도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물을 조성비를 달리하여 혼합 제조한 시료들의 세포내로의 Ca²⁺ 유입량을 측정한 그래프이다.
도 3은 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물을 조성비를 달리하여 혼합 제조한 시료들의 피지분비 억제효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 섬유아세포에 IL-4로 자극하였을 경우 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물이 1 : 0.5 : 1.5의 중량비로 혼합된 시료의 농도에 따른 에오탁신-1의 생성 감소 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물이 1 : 0.5 : 1.5의 중량비로 혼합된 시료의 농도에 따른 각질 세포막 형성 정도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 SDS에 의해 손상된 피부에 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물이 1 : 0.5 : 1.5의 중량비로 혼합된 시료를 농도에 따라 첩포하는 경우 수분손실(TEWL) 및 홍반(erythema)의 개선 효과를 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 피부냉감, 피지분비 억제 및 항염효능을 가지는 천연물의 선정

항염 효능에 관한 선행연구결과를 바탕으로 하기 표 1에 개시된 바와 같이 천연재료 20종을 선별하였고, 초임계 추출방법을 이용하여 이들로부터 수득한 추출물의 효능을 피부냉감, 피지분비 억제 부분으로 각각 나누어 비교 검증하였다.

1-1. 천연 추출물의 제조

하기 표 1에 기재된 각 식물의 부위를 채취하여 세척 후 음건한 다음, 입자의 크기가 1mm 이하가 되도록 분쇄하였다. 추출용매인 이산화탄소는 -20℃의 냉각기에 주입하여 액화시켜 준비한 다음, 상기 천연물 분말을 초임계 추출장치의 추출조에 투입한 후 고압펌프를 이용하여 초임계 추출 장치 내 압력을 350~450 bar까지 가압한 다음, 상기 액화 이산화탄소를 30 SFC/min의 유량으로 도관을 통해 추출조에 투입하였다. 이어서, 추출조의 온도를 45~55℃가 유지되도록 조절하고, 상기 온도 조건에서 3시간 동안 추출하여 각각의 천연식물 추출물을 확보하였다.

1-2. 항염 효과 검정

상기 실시예 1-1에서 추출한 각각의 식물 추출물을 산화질소(Nitric oxide, NO) 생성저해 실험과 사이클로옥시겐아제-2(COX-2) 프로모터 리포터 어세이(cyclooxygenase-2(COX-2) promoter reporter assay)를 통해 항염 효능을 검정하였다. 구체적으로 24웰-플레이트에 COX-2 프로모터 가우시아 루시퍼라제 벡터(GeneCopoeia, USA)를 마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포에 형질주입제(transfection reagent, Superfect, Qiagen, Germany)를 이용하여 형질주입(transfection) 하였다. 형질주입 후 24시간 뒤 각 식물 추출물을 전처리 후 LPS (200ng/ml)를 처리하였다. 18시간 경과 후 세포 배양액을 수집하여, 그리스 시약(Griess reagent)를 이용하여 산화질소 생성 저해 정도를 측정하였다. 또한, 수집한 세포 배양액을 가우시아 루시퍼라제(Gaussia luciferasae) 기질(NEB, USA)과 반응 시킨 후 루미네선스 마이크로플레이트 리더(luminescence microplate reader, Infinite 200 Pro, Tecan, Swiss)를 이용하여 발광도를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

1-3. 냉감 효과 검정

상기 실시예 1-1에서 추출한 각각의 식물 추출물을 냉감 수용체인 TRPM8(transient receptor potential cation channel subfamily M member 8)의 활성화능을 알아보기 위해 TRPM8의 활성화 시 변화를 나타내는 Ca^{2 +} 유입량을 Ca^{2 +}에 특이적으로 결합하여 반응하는 Fluo-4, AM(Molecular probe, USA)를 이용하여 측정하였다. 구체적으로 TRPM8 human LentiORF clones-GFP(Origene, USA)를 HEK293 세포에 형질주입 후 TRPM8이 안정하게 발현되는 TRPM8-HEK293 세포주를 확립하였다. TRPM8-HEK293 세포주를 96 웰-플레이트에 2 X 10⁴ 세포/웰로 접종후 24시간 배양한 뒤 HBSS(Hanks' balanced salt solution) 용액에 각 식물 추출물을 농도별로 준비한 후 37℃로 미리 가열시켜 놓는다. Probenecid 2.5mM이 포함된 Fluo-4, AM을 5μM 농도로 처리한 후 37℃에서 45분간 배양하였다. 플루오로선스 마이크로플레이트 리더(Fluorescence microplate reader, Infinite 200 Pro, Tecan, Swiss)를 이용하여 준비된 추출물을 처리하면서 여기/배출(Excitation/Emission)을 494nm/516nm의 파장에서 형광을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

1-4. 피지분비 억제효과 측정

상기 실시예 1-1에서 추출한 각각의 식물 추출물의 피지분비 억제효과 측정을 위해 피지세포(sebocyte)의 지방소립(lipid droplet) 형성 저해 정도를 통해 피지 생성 저해 정도를 측정하였다. 구체적으로 피지세포를 콜라겐이 코팅된 24 웰-플레이트에 2 X 10³ 세포/웰로 seeding하여 배양한 뒤 각각의 식물 추출물을 전처리 후 인슐린을 20nM 농도로 처리하였다. 처리 후 8일 동안 배양 한 다음 나일레드(nile red) 염색을 통해 생성된 지질량을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

천연물명 (추출부위)	항염효과		냉감 효과 (TRPM8)	피지분비 억제	선정 여부
	NO	COX-2
녹차(잎)	++	++	+	+++	0
레몬티트리(전초)	+++	-	-
스피아민트(전초)	++	-	++
제라늄(전초)	++	+	+	-
타임(전초)	++	-	+++	-	0
유칼립투스(잎)	++	-	++	-
애플민트(전초)	++++	+++	-	-	0
스테비아(잎)	++	+	-	-
로즈마리(전초)	++	+	-	-
바질(전초)	++	+	-	-
감귤미숙과(열매)	++	-	-	++
옥수수(껍질)	++	++	-	-
곰솔(잎/줄기)	+++	+	-	+
달맞이꽃(꽃)	++	++	-	-
으아리덩굴(전초)	+++	+	-	-
예덕나무(열매)	++	++	-	--
샤스타데이지(꽃)	+++	+	-	-
왕모시풀(줄기)	+++	+	-	-
수선화(지상부)	+++	+	-	-
후박나무(껍질)	++	+	-	-
-: 효과없음, +: 약한 효과, ++: 중간정도의 효과, +++: 강한 효과, ++++: 매우 강한 효과

총 20종의 항염증 효과를 가진 식물 추출물에 대한 상기 시험결과에 기초하여 항염증효과가 우수한 애플민트와 피부냉감 효과, 피지분비 억제 평가항목에서도 우수한 효능을 나타낸 녹차 추출물, 타임 추출물을 선정하였다.

실시예 2: 피부냉감 , 피지분비 억제 및 항염증 효과를 나타내는 조성비 확립

본 실시예 2에서는 실시예 1에서 선정된 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물의 혼합물이 피부진정 효과의 상승작용을 나타낼 수 있는지를 실험하였다.

2-1. 혼합물 제조

상시 실시예 1에서 수득한 녹차 추출물, 타임 추출물, 애플민트 추출물을 다양한 비율(중량비)로 혼합하여 시료들을 제조하였다. 시료의 조성비는 하기 표 2에 나타낸 것처럼 10개의 조성비(#001 내지 #010)로 각각 제조하였다.

시료 번호	녹차 추출물	타임 추출물	애플민트 추출물
#001	1	0.5	1.5
#002	1	1	1
#003	1	1.5	0.5
#004	2	0.5	0.5
#005	2	1	1
#006	2	1.5	0.5
#007	0.5	0.5	2
#008	0.5	1	1.5
#009	0.5	1.5	1
#010	0.5	2	0.5

2-2. 항염 효과 측정

상기 실시예 2-1에서 제조한 각 시료의 항염 효과를 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 측정하였다. 음성대조군으로는 LPS를 처리하지 않은 대식세포를 사용하였고, 양성대조군으로는 LPS만을 처리한 대식세포를 사용하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물을 1 : 0.5 : 1.5의 중량비로 혼합한 시료(#001)를 처리한 세포는 COX-2 프로모터 루시퍼라제(COX-2 promoter luciferase) 활성을 양성대조군과 대비하여 75% 감소시켰고, 1 : 1 : 1의 중량비로 혼합한 시료(#002)를 처리한 세포는 양성대조군과 대비하여 67%의 감소효능을 나타내었다. 산화질소 생성 감소능에 있어서도 1 : 0.5 : 1.5의 중량비로 혼합한 시료(#001)를 처리한 경우 양성대조군과 대비하여 산화질소 생성이 85% 감소되었고, 1 : 1 : 1 의 중량비로 혼합한 시료(#002)를 처리한 경우 64%의 산화질소 생성 감소능이 나타났다.

2-3. 냉감 효과 측정

상기 실시예 2-1에서 제조한 시료에 대한 냉감 효과는 상기 실시예 1-3과 동일한 방법으로 측정하였다. 시료를 처리하지 않은 TRPM8-HEK293 세포주를 대조군으로 사용하였다. 냉감 효과는 Ca^{2 +} 유입량에 근거하여 판단하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, Ca^{2 +}의 유입량은 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물을 1 : 0.5 : 1.5 의 중량비로 혼합한 시료(#001), 1 : 1 : 1 의 중량비로 혼합한 시료(#002), 및 1 : 1.5 : 0.5의 중량비로 혼합한 시료(#008)를 처리한 세포가 높게 측정되었다.

2-4. 피지분비 억제효과 측정

상기 실시예 2-1에서 제조한 복합 화합물에 대한 피지분비 억제효과는 상기 실시예 1-4와 동일한 방법으로 측정하였다. 시료를 처리하지 않은 피지세포를 음성대조군으로 사용하였고 양성대조군으로는 인슐린만을 처리한 피지세포를 사용하였다. 피지분비 억제효과는 지방소립의 나일레드 염색정도에 따라 판단하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, 피지분비 억제효과는 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물을 1 : 1.5 : 0.5의 중량비로 혼합한 시료(#003)를 처리한 세포가 양성대조군과 대비하여 75%의 피지분비 저해효과를 나타내었고, 다음으로 1 : 1 : 1 의 중량비와 1 : 1.5 : 0.5의 중량비로 혼합한 시료(#002 및 #001)를 처리한 세포가 양성대조군과 대비하여 각각 68% 및 67%의 피지분비 억제효과를 나타내었다.

녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물을 혼합하여 처리한 경우 단일 추출물 1 종류만 처리하였을 때보다 복합적인 효능을 나타내었으며, 항염효과, 냉감효과 및 피지분비 감소효과에서 이상적인 효능을 보인 시료는 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물이 1 : 0.5 : 1.5의 조성비로 혼합된 시료(#001)임을 확인하였다.

실시예 3: 시료(#001)의 세포독성 시험

상기 실시예 2에서 항염, 냉감 및 피지분비 억제 효능이 종합적으로 가장 우수하게 나타난 시료(#001)의 인체에 대한 안정성 여부를 조사하였다. 구체적으로, 인간 각질세포주인 HaCaT 세포를 이용하여 세포독성 시험을 수행하였다. HaCaT 세포에 상기 시료(#001)을 각각 10, 50, 100, 200, 500, 1000 ㎍/ml의 농도로 처리하고, 3일 배양 후 세포의 생존율을 MTT assay를 통해 측정하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

시료(#001)의 농도 (㎍/ml)	0	10	50	100	200	500	1000
세포생존율	100	98.3	101	97.5	95.7	93.8	81.6

실험결과, 시료(#001)은 500 ㎍/ml 이하 농도에서는 세포독성을 나타내지 않았으며, 1000 ㎍/ml의 농도에서는 세포생존율이 떨어지는 것을 확인하였다.

실시예 4: 시료(#001)의 에오탁신 -1 생성 감소효과

에오탁신-1은 아토피 및 알러지성 염증 피부병변에서 그 발현 정도가 높아지는 것으로 알려져 있으며, 호산구를 병변부위로 응집시킴으로써 염증반응을 유발시키는 것으로 알려져 있다. 아토피 및 알러지성 피부 염증반응의 감소측정을 위해 에오탁신-1의 생성 저해 정도를 측정하였다. 구체적으로 섬유아세포인 NIH/3T3를 24-웰 플레이트에 웰당 2 X 10⁵ 세포가 되도록 접종하고 24시간 동안 배양한다. 그 후 시료 #001을 1, 10, 100 ㎍/ml의 농도로 전처리한 다음 IL-4(50ng/ml)를 처리하여 24시간 동안 배양한다. 배양 후 세포배양액을 수집하여 에오탁신-1 ELISA 키트를 이용하여 에오탁신-1의 생성정도를 측정하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, IL-4에 의해 유도된 에오탁신-1의 생성이 시료 #001에 의해 효과적으로 감소되는 것으로 나타났다.

실시예 5: 시료(#001)의 모공수축 효과 측정시험

피부의 구조는 단백질들의 결합에 의해서 구성되어 있으며, 이들은 폴리페놀과 결합하여 모공을 당겨 수축시킨다. 모공수축 효과 측정은 단백질 응고작용에 의해 땀샘과 모공이 일시적으로 수축되는 화학작용을 이용하여 측정하였다. 구체적으로 피부를 대신할 단백질로 헤모글로빈(human hemoglobin, Sigma)을 사용하였고, 헤모글로빈은 1mg/ml의 농도로 PBS(pH6.8)에 녹여서 용액을 제조하였다. 시료(#001)을 PBS에 농도별(1, 10, 100 ㎍/ml)로 희석한 후 두 용액을 1 : 1로 혼합하여 30분간 반웅시킨 다음 원심분리(1500rpm, 12min)하여 상등액만을 취하였다. 상등액을 576nm에서 흡광도를 측정함으로써 남아있는 헤모글로빈의 양을 판단하였다. 양성대조군은 탄닌산을 처리한 조건이고 음성대조군은 시료(#001)을 처리하지 않은 조건이다. 하기 수학식 1에 따라 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

처리물질	처리 농도 (㎍/ml)	모공수축 효과 (%)
탄닌산	100	85.25
시료(#001)	0	2.24
	1	13.49
	10	28.6
	100	52.4

실험결과, 시료(#001)을 100 ㎍/ml 농도로 반응시킨 조건에서 최고 52%의 모공수축 효과를 나타내었다.

실시예 6: 시료(#001)의 각질 세포막 형성 시험

시료(#001)의 피부장벽 기능에 대한 영향을 알아보기 위해 각질 세포막(cornified envelope, CE) 형성 정도를 측정하였다.

구체적으로, 인간 각질세포주인 HaCaT 세포를 6 웰-플레이트에 1 X 10⁵ 세포/웰로 seeding 후 웰이 가득 찰 때까지 키운다. 시료(#001)을 농도별로 처리하여 10일간 배양 후 배지를 제거하고 2% SDS를 웰당 100 μl씩 처리하고 얼음에 3 내지 5분간 반응시킨다. 그 다음 세포를 회수하여 초음파 분쇄기로 5초간 세포를 파쇄하여 원심분리하여 세포를 회수한 뒤 20mM DTT가 포함된 2% SDS 용액에 가하여 분산시켜서 90℃에서 1시간 동안 가열시킨다. 그 후 310nm에서 흡광도를 측정하여 각질 세포막 형성 정도를 측정한다. 음성대조군으로 아무것도 처리하지 않은 각질세포주를, 양성대조군으로 Ca^{2 +}만을 처리한 각질세포주를 사용하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, 시료(#001)을 처리한 각질세포주가 양성대조군으로 처리한 각질세포주보다 우수한 각질세포막 형성 정도를 나타내었으며, 이는 농도 의존적인 결과를 나타내었다.

실시예 7: 시료(#001)의 인체 피부에 대한 안전성 시험

시료(#001)이 실시예 3의 세포독성시험에서 세포독성이 없다고 판명되었으므로, 실제 인체피부에도 안전한지를 확인하기 위하여 피부 안전성 검증시험을 수행하였다.

7-1. 시료(#001)을 포함한 피부 외용제의 제조

시료(#001)의 피부 안전성 시험을 위해, 하기 표 5의 성분 및 함량으로 시료 #001을 함유한 피부 외용제를 제조한 다음 피부 안전성과 임상효능 검정 시험을 수행하였다. 먼저 정제수, 글리세린, 부틸렌글리콜을 혼합하고 70℃에서 용해하였으며(물파트), 상기 3가지 성분과 나머지 성분을 70℃에서 용해하였다(오일파트). 상기 오일파트를 물파트에 첨가하고 호모믹서(Tokushu Kika, Japan)로 교반하여 유화하였으며, 기포를 제거한 후 실온으로 냉각시켜 피부 외용제를 제조하였다.

성분	함량 (%)
	대조군	시험군 1	시험군 2
정제수	72.1	72	71.1
부틸렌글리콜	4.0	4.0	4.0
글리세린	8.0	8.0	8.0
시료(#001)	0	0.1	1.0
카프릴릭 카프리 트리글리세라이드	8.0	8.0	8.0
스쿠알란	5.0	5.0	5.0
세테아릴 글루코사이드	1.5	1.5	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4	0.4	0.4
세테아릴 알코올	1.0	1.0	1.0
총 중량	100	100	100

7-2. 피부 누적 자극시험

상기 7-1의 방법으로 제조한 피부 외용제를 건강한 30명의 성인을 대상으로 윗 팔뚝 부위에 격일로 총 9회, 24시간 첩포를 시행하여 시료 #001이 피부에 자극을 주는지의 여부를 측정하였다. 대조군으로는 스쿠알란 베이스로 시료 #001이 함유되지 않은 피부 외용제를 사용하였다.

첨포 방법은 핀 챔버(Finn chamber, Epitest Ltd. 핀란드)를 이용하였으며, 챔버에 상기 각 피부 외용제를 15μl씩 적하한 후 첩포를 실시하였다. 매회 피부에 나타난 반응의 정도를 하기 수학식 2를 이용하여 점수화 하였으며, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

이때, 반응도에서 ±는 1점, +는 2점, ++는 4점의 점수를 부여하였으며, 평균 반응도가 3 미만일 때 안전한 조성물로 판정하였다.

시험 물질	반응이 나타난 피검자수									평균 반응도
	1주			2주			3주
	1차	2차	3차	1차	2차	3차	1차	2차	3차
	±/+/++	±/+/++	±/+/++	±/+/++	±/+/++	±/+/++	±/+/++	±/+/++	±/+/++
대조군	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	0.00
시험군 1	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	0.00
시험군 2	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	-/-/-	0.00
피검인원	30	30	30	30	30	30	30	30	30

실험결과, 대조군과 시험군 1 및 시험군 2의 경우, ±, +, ++에 해당하는 사람의 수가 각각 0명, 0명, 0명으로 반응이 나타나지 않았다. 상기 수학식 2에 따라 계산한 결과 대조군, 시험군 1 및 2의 평균 반응도는 모두 0.00으로 모두 3 이하로 나타나 안전한 조성물로 판단되었다.

실시예 8: 시료(#001)의 피부진정 효과 시험

SDS(0.05%)로 피부에 자극을 주어 피부조직을 손상시킨 후, 상기 표 5의 성분 및 함량으로 제조된 피부 외용제(대조군, 시험군 1, 시험군 2)를 상박부 부위에 첩포하여 피부조직이 개선되는지 여부를 관찰하였다. 이 실험에서는 건강한 성인 20명을 대상으로 하였다.

첩포 방법은 핀 챔버(Finn chamber, Epitest Ltd, 핀란드)를 이용하였다. 챔버에 상기 각 피부 외용제를 15μl씩 적하한 후 24시간 동안 첩포를 실시하였다. 24시간 후 첩포를 제거하고 SDS에 의해 유도된 홍반 정도를 각 처리물질이 얼마나 완화시키는지를 Chroma meter CR-300(코니카미놀타, 일본)을 이용하여 측정하였으며, 경피수분 손실(TEWL)정도를 TEWA(Tewameter TM210, Germany) 측정기를 이용하여 측정하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, SDS를 처리한 경우 피부자극으로 피부홍반이 유도되었고, 시료(#001)을 처리하였을 때 뛰어난 홍반완화 정도를 나타내었다. 또한, 경피 수분 손실정도를 측정하였을 때, SDS 처리에 의해 증가된 경피 수분손실을 시료 #001이 우수하게 완화시키는 결과를 나타내었다.

제제예 1: 화장료의 제제

1-1. 유연 화장수의 제조

하기 표 7과 같이 시료(#001)을 유효성분으로 포함하는 우연 화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량 %)
시료(#001)	0.1
글리세린	3.0
부틸렌 글리콜	2.0
프로필렌 글리콜	2.0
카복시 비닐 폴리머	0.1
에탄올	10.0
방부제, 미량색소, 미량향료 및 정제수	잔량
총계	100.0

1-2. 영양 화장수의 제조

하기 표 8과 같이 시료(#001)을 유효성분으로 포함하는 영양 화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량 %)
시료(#001)	0.1
밀납	4.0
폴리소르베이트 60	1.5
소르비탄세스퀴올레이트	0.5
유동파라핀	5.0
스쿠알란	5.0
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	5.0
글리세린	3.0
부틸렌 글리콜	3.0
프로필렌 글리콜	3.0
카복시 비닐 폴리머	0.1
방부제, 미량색소, 미량향료 및 정제수	잔량
총계	100.0

1-3. 영양 크림의 제조

하기 표 9과 같이 시료(#001)을 유효성분으로 포함하는 영양 크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량 %)
시료(#001)	0.1
밀납	10.0
폴리소르베이트 60	1.5
소르비탄세스퀴올레이트	0.5
유동파라핀	10.0
스쿠알란	5.0
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	5.0
글리세린	5.0
부틸렌 글리콜	3.0
프로필렌 글리콜	3.0
카복시 비닐 폴리머	0.1
방부제, 미량색소, 미량향료 및 정제수	잔량
총계	100.0

제제예 2: 약학적 제제의 제조

2-1. 산제의 제조

시료(#001)을 유효성분으로 포함하는 산제를 제조하기 위하여, 하기 표 10의 성분을 혼합한 다음 기밀포에 충진하여 산제를 제조였다.

성분	함량(g)
시료(#001)	2
유당	1

2-2. 정제의 제조

시료(#001)을 유효성분으로 포함하는 정제를 제조하기 위하여, 하기 표 11의 성분을 혼합한 다음 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

성분	함량(mg)
시료(#001)	100
옥수수 전분	100
유당	100
스테아린산 마그네슘	2

2-3. 캡슐제의 제조

시료 (#001)을 유효성분으로 포함하는 캡슐제를 제조하기 위하여, 하기 표 12의 성분을 혼합한 다음 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

성분	함량(mg)
시료(#001)	100
옥수수 전분	100
유당	100
스테아린산 마그네슘	2

Claims (6)

1. 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물이 0.9 내지 1.1 : 0.4 내지 0.6 : 1.4 내지 1.6의 중량비로 혼합된 혼합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부냉감, 피지분비 억제, 모공수축 및 피부의 항염증으로 이루어진 군에서 선택된 피부진정 효과를 가지는 화장료 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 녹차 추출물, 타임 추출물 및 애플민트 추출물이 0.9 내지 1.1 : 0.4 내지 0.6 : 1.4 내지 1.6의 중량비로 혼합된 혼합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 항염증용 약학적 조성물.
   
   
5. 삭제
6. 삭제

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