WO2006070024A2 - E1 -minus adenoviren und deren verwendung - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Virus, bevorzugterweise Adenovirus, wobei das Virus umfasst - eine fehlende funktionale Wildtyp-El-Region, und - einen Transporter für den Transport von YB-1 in den Zellkern einer Zelle, die mit dem Virus infiziert ist.

Description

El -minus Adenoviren und deren Verwendung
Die Erfindung betrifft El -minus Adenoviren, sowie dafür codierende Nukleinsäuren und deren Verwendung.
Bei der Behandlung von Tumoren werden derzeit eine Vielzahl von Therapiekonzepten verfolgt. Neben der Verwendung chirurgischer Techniken stehen dabei die Chemotherapie und die Strahlentherapie im Vordergrund. All diese Techniken sind jedoch für den Patienten mit nicht unerheblichen Nebenwirkungen verbunden. Mit der Verwendung von replikationsselektiven onkolytischen Viren wurde eine neue Plattform für die Behandlung von Tumoren geschaffen. Dabei wird eine selektive intratumorale Replikation eines viralen Agens herbeigeführt, die in der Folge zur Virusreplikation, Lyse der infizierten Tumorzelle und Verbreitung des Virus auf benachbarte Tumorzellen führt. Infolge der Beschränkung der Replikationsfähigkeit des Virus auf Tumorzellen bleibt normales Gewebe von der Replikation und damit der Lyse durch den Virus verschont.
Derzeit finden verschiedene virale Systeme in klinischen Studien mit dem Ziel der Tumorlyse Anwendung. Ein Beispiel für einen derartigen Adenovirus ist dll520 (Onyx-015), der bereits erfolgreich in den klinischen Phasen I und II eingesetzt wurde (Khuri, F. et al. Nature Medicine 6, 879-885, 2000). Onyx-015 ist ein Adenovirus, bei dem das ElB-55kDa-Gen vollständig deletiert ist. Die vollständige Deletion des ElB55kDa-Proteins des Adenovirus beruht dabei auf der Beobachtung, dass mit bei einem derartigen adenoviralen Vektor die Replikation und somit die Lyse von Zellen mit defektem p53 möglich ist (Kirn, D. et al.5 Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 17, 391a, 1998), wobei normale Zellen nicht geschädigt werden. Genauer ist das ElB-55kDa- Genprodukt beteiligt an der Inhibierung von p53, dem Transport viraler mRNA und dem Abschalten der Proteinsynthese der Wirtszelle. Die Inhibierung von p53 erfolgt dabei durch Ausbilden eines Komplexes aus p53 und dem adenoviral codierten ElB-55kDa Protein und/oder Komplex bestehend aus ElB-55kDA und E4orf6. Von p53, codiert von TP53, geht ein komplexer regulatorischer Mechanismus aus (Zambetti, G.P. et al., FASEB J. 7, 855-865, 1993), der u.a. auch dazu führt, dass eine effiziente Replikation von Viren wie Adenoviren in der Zelle unterdrückt wird. Das Gen TP 53 ist in etwa 50 % aller menschlichen Tumoren deletiert oder mutiert mit der Folge, dass es zu keiner - erwünschten - Apoptose infolge einer Chemotherapie oder einer Bestrahlungstherapie kommt und damit der Erfolg dieser Tumorbehandlungen im Normalfall unterbleibt.
Ein weiteres Konzept tumorlytischer Viren beruht auf der Beobachtung, dass wenn das ElA- Protein in einer bestimmten Weise deletiert vorliegt bzw. eine oder mehrere Mutationen aufweist, welche die Bindung von Rb/E2F und/oder ρl07/E2F und/oder pl30/E2F nicht beeinflussen, solche Adenoviren den Eintritt der infizierten Zellen in die S-Phase nicht induzieren und zur Replikation in Tumorzellen befähigt sind, die kein funktionelles Rb-Protein aufweisen. Zudem kann das EIA-Protein am N-Terminus deletiert vorliegen bzw. eine oder mehrere Mutationen im Bereich der Aminosäurepositionen 1 bis 76 des El A-Proteins umfassen, um die Bindung von ElA an p300 zu unterbinden, um somit eine selektivere Replikation in Tumorzellen zu bewerkstelligen. Diese Vorgehensweisen sind beispielhaft beschrieben in dem europäischen Patent EP 0 931 830. Beispiele derartiger Adenoviren sind AdΔ24, dl922 - 947, ElAd/01/07 und CB016 (Howe, J. A. et al., Molecular Therapy 2, 485-495, 2000; Fueyo, J. et al., Oncogene 19, 2-12, 2000; Heise, C. et al., Nature Medicine 6, 11341139, 2001; Balague, C. et al., J. Virol. 75, 7602-7611, 2001). Diese im Stand der Technik bekannten adenoviralen Systeme zur Onkolyse weisen somit bestimmte Deletionen im ElA Protein auf, wobei diese Deletion vorgenommen worden war unter der Annahme, dass intakte Rb-Proteine bzw. Komplex bestehend aus intaktem Rb-Protein und E2F einer effiziente Replikation in vivo entgegenwirken würden und um eine adenovirale Replikation in vivo nur in Rb-negativen/mutierten Zellen sicher zu stellen. Diese adenoviralen Systeme nach dem Stand der Technik gehen auf ElA zurück, um mittels des frühen E2-Promotors (engl. E2 early Promotor) und freiem E2F die in vivo Replikation zu steuern (Dyson, N. Genes & Development, 12, 2245-2262, 1998).
Eine weitere Form von tumorlytischen adenoviralen Systemen beruht auf dem Einsatz selektiver Promotoren, um das virale Onkogen ElA spezifisch zu exprimieren, was eine selektive Replikation in Tumorzellen erlaubt (Rodriguez, R. et al., Cancer Res. 57, 2559-2563, 1997).
Wie vorstehend beschrieben kommt es bei den verschiedenen Konzepten adenoviraler tumorlytischer Viren auf die Auswahl eines für das dem jeweiligen Konzept zugrundeliegenden Wirkmechanismus geeigneten zellulären Hintergrundes an. Mit anderen Worten, die verschiedenen derzeit bekannten adenoviralen Systeme zur Tumorlyse können nur bei Vorliegen bestimmter molekularbiologischer Voraussetzungen angewandt werden. Dies beschränkt die Anwendung derartiger Systeme auf bestimmte Patientenkollektive. Ein besonderes Problem bei der Behandlung von Tumorerkrankungen stellt sich dann ein, wenn die unter der Tumorerkrankung leidenden Patienten eine sogenannte klassische Vielfachresistenz (engl, multidrug resistence (MDR)) entwickeln, die eine besonders gut untersuchte Resistenzform von Tumoren gegenüber Zytostatika darstellt (Gottesman und Pastan, Annu. Rev. Biochem. 62, 385-427, 1993). Sie beruht auf der Überexpression des membranständigen Transportproteins P-Glykoprotein, das zu den sogenannten ABC-Transportern gehört (Stein, U. et al., JBC 276, 28562-69, 2001, J. Wijnholds, Novartis Found Symp., 243, 69-79, 2002). Bargou, R. C. et al. und Oda, Y. et al (Bargou, R. C. et al., Nature Medicine 3, 447-450, 1997; Clin. Cancer Res. 4, 2273-2277, 1998) konnten zeigen, dass die Kernlokalisation des humanen Transkriptionsfaktors YB-I unmittelbar an der Aktivierung der Expression des P-Glykoproteins beteiligt ist. Weitere Untersuchungen belegen, dass YB-I durch verschiedene Streßbedingungen in den Zellkern gelangt, wie z.B. UV-Bestrahlung, Zytostatika-Applikation (Koike, K. et al., FEBS Lett 17, 390-394, 1997) und Hyperthermie (Stein, U. et al., JBC 276, 28562-69, 2001). Weitere Untersuchungen belegen, dass die nukläre Lokalisation von YB-I einen Einfluss auf einen weiteren ABC-Transporter ausübt. Dieser ABC-Transporter wird als MRP (engl, multidrug resistance-related protein) bezeichnet und ist mit der Ausbildung des sogenannten atypischen, nicht P-Glykoprotein-abhängigen Vielfachresistenz beteiligt (Stein, U. et al., JBC 276, 28562-69, 2001).
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine technische Lehre und insbesondere ein Mittel bereitzustellen, welches erlaubt, einen Organismus, speziell einen menschlichen Organismus bzw. ein Patientenkollektiv spezifisch mit tumorlytisch wirkenden Agenzien zu behandeln. Weiterhin ist es eine der vorliegenden Erfindung zugrundeliegenden Aufgabe, ein Mittel bereitzustellen, welches geeignet ist, bei Patienten mit Tumorerkrankungen eine Tumorlyse herbeizuführen, die gegenüber Zytostatika resistent sind, insbesondere solche, die eine Vielfachresistenz zeigen. Eine weitere, der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe bestand darin, ein Virus bereitzustellen, das in Tumorzellen, insbesondere in Tumorzellen, die YB-I Zellzyklus-unabhängig im Zellkern aufweisen, oder Tumorzellen mit dereguliertem YB-I, repliziert und insbesondere eine hohe Partikelbildung aufweist.
Erfindungsgemäß wir die Aufgabe gelöst durch den Gegenstand der beigefügten unabhängigen Ansprüche. Bevorzugte Ausführungsformen ergeben sich aus den ebenfalls beigefügten Unteransprüchen. In einem ersten Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß auch gelöst durch einen Virus, bevorzugterweise Adenovirus, wobei dass das Virus umfasst:
- eine fehlende funktionale Wildtyp-El -Region, und
- einen Transporter für den Transport von YB-I in den Zellkern einer Zelle, die mit dem Virus infiziert ist.
In einer Ausführungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass der Virus eine für Protein IX codierende Nukleinsäure umfasst und Protein IX exprimiert.
In einer Ausführungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass die fehlende funktionale Wildtyp-El -Region ElA-minus ist.
In einer Ausführungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass die fehlende funktionale Wildtyp-El -Region ElB-minus ist.
In einer bevorzugten Ausführungsforai des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass die fehlende Wildtyp-El -Region ElB55K-minus ist und/oder ElB19K-minus ist und/oder Protein IX-minus ist.
In einer Ausfuhrungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass der Transporter ein von dem Virus bereitgestellter Transporter ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass es sich bei dem Transporter um einen viralen Transporter handelt.
In einer Ausführungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass der Transporter das Protein E4orf6 umfasst.
In einer Ausführungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass der Transporter das Protein E1B55K umfasst. In einer Ausführungsforai des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass der Transporter einen Komplex aus E4orf4 und E1B55K umfasst.
In einer Ausfuhrungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass der Transporter von einer Nukleinsäure codiert ist, wobei die Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Promotors steht.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass der Transporter ein Komplex aus mindestens zwei Faktoren ist und jeder Faktor von einer Nukleinsäure codiert wird, wobei die beiden Nukleinsäuren von einem gemeinsamen Promotor gesteuert werden.
In einer bevorzugteren Ausfiihrungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass die beiden codierenden Nukleinsäuren durch ein die Expressionsstärke regulierendes Element miteinander verbunden sind, wobei das Element bevorzugterweise aus der Gruppe ausgewählt ist, die IRES umfasst.
In einer bevorzugten alternativen Ausfuhrungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass der Transporter ein Komplex aus mindestens zwei Faktoren ist und jeder Faktor von einer Nukleinsäure codiert wird, wobei die beide Nukleinsäuren jeweils von einem eigenen Promotor gesteuert werden.
In einer Ausfuhrungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass der Promotor verschieden ist von dem E4-Promotor, insbesondere dem adenoviralen E4-Promotor, und verschieden ist von dem EIB-Promotor, insbesondere dem adenoviralen EIB-Promotor.
In einer Ausfuhrungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass der Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend gewebespezifische Promotoren, tumorspezifische Promotoren, den CMV-Promotor, virale Promotoren, insbesondere adenovirale Promotoren unter der Vorraussetzung, dass diese verschieden sind von dem E4-Promotor, dem EIB-Promotor und bevorzugterweise auch verschieden ist von dem E2-late-Promotor.
In einer Ausfuhrungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass die für den Transporter codierende Nukleinsäure am 3 '-Ende von ElB 55K eine 3'-UTR von E1B55K aufweist. In einer Ausfuhrungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass wenn die fehlende Wildtyp- El -Region E1B55K positiv ist, die für den Transporter codierende Nukleinsäure keine für E1B55K codierende Nukleinsäure umfasst.
In einer Ausfuhrungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass die für den Transporter codierende Nukleinsäure E1B55K und E1B19K codiert.
In einer Ausfuhrungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass die für den Transporter codierende Nukleinsäure für Protein IX codiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass die für E1B55K und E1B19K codierende Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Promotors stehen.
In einer alternativen bevorzugten Ausfuhrungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass die für E1B55K und/oder E1B19K und/oder Protein IX codierende Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Promotors steht, wobei bevorzugterweise der Promotor verschieden ist von einem ElA- abhängigen Promotor.
In einer Ausfuhrungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass die fehlende funktionale Wildtyp-El -Region ElA13S-minus und/oder El A12S-minus ist.
In einer Ausfuhrungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass die fehlende funktionale Wildtyp-El -Region ElA13S-minus ist.
In einer Ausführungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass bevorzugterweise die fehlende Wildtyp-El -Region ElA13S-minus und ElA12S-minus ist, wobei der Virus eine Nukleinsäure umfasst, die für das E1A12S-Protein codiert, wobei die Nukleinsäure bevorzugterweise eine heterologe Nukleinsäure ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass die für das E1A12S-Protein codierende Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Promotors steht, wobei der Promotor bevorzugterweise ein YB-I abhängiger Promotor ist und bevorzugtererweise aus der Gruppe ausgewählt ist, die den adenoviralen E2-Late-Promotor, den MDR-Promotor und den DNA-Polymerase alpha - Promotor umfasst. In einer Ausführungsform des ersten Aspekts und insbesondere der vorhergehenden Ausfuhrungsform ist vorgesehen, dass die für den Transporter codierende Nukleinsäure(n) für E4orf6 und E1B55K codiert/codieren.
In einer Ausführungsform des ersten Aspekts und insbesondere der vorhergehenden Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Virus eine für das Protein IX codierende Nukleinsäure umfasst, wobei bevorzugterweise die für das ElAl 2S codierende Nukleinsäure und die für das Protein IX codierende Nukleinsäure unter der Kontrolle eines gemeinsamen Promotors stehen, wobei bevorzugtererweise die beiden codierenden Nukleinsäuren durch ein die Expression regulierendes Element miteinander verbunden sind, wobei das Element noch bevorzugtererweise aus der Gruppe ausgewählt ist umfassend IRES.
In einer Ausführungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass die für das E1A12S-Protein codierende Nukleinsäure und die für das Protein IX codierende Nukleinsäure jeweils unter der Kontrolle eines Promotors stehen, wobei der Promotor bevorzugterweise der gleiche Promotor ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass der Promotor ein YB-I abhängiger Promotor ist, der bevorzugterweise aus der Gruppe ausgewählt ist, die den adenoviralen E2-Late-Promotor, den MDR-Promotor und den DNA-Polymerase alpha - Promotor umfasst.
In einer Ausführungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass das Virus eine für YB-I codierende Nukleinsäure umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts und insbesondere der vorhergehenden Ausführungsforni ist vorgesehen, dass die für das E1A12S-Protein codierende Nukleinsäure und die für YB-I codierende Nukleinsäure unter der Kontrolle eines gemeinsamen Promotors stehen, wobei bevorzugterweise die beiden codierenden Nukleinsäuren durch ein die Expression regulierendes Element miteinander verbunden sind, wobei das Element bevorzugtererweise aus der Gruppe ausgewählt ist umfassend IRES. In einer bevorzugten alternativen Ausführungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass die für YB-I codierende Nukleinsäure und die für das E1A12S-Protein codierende Nukleinsäure jeweils unter der Kontrolle eines Promotors stehen, wobei der Promotor bevorzugterweise der gleiche Promotor ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass der Promotor ein YB-I abhängiger Promo tor ist, der bevorzugterweise aus der Gruppe ausgewählt ist umfassend den adenoviralen E2-Late-Promotor, den MDR-Promotor und den DNA-Polymerase alpha - Promotor.
In einer Ausführungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass die für das E1A12S codierende Nukleinsäure in die E3-Region oder E4-Region einkloniert ist.
In einer Ausführungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass die für das E1A12S codierende Nukleinsäure und die für Protein IX codierende Nukleinsäure oder die für YB-I- codierende Nukleinsäure in die E3-Region oder die E4-Region einkloniert ist.
In einer Ausführungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass die Expression der für Protein IX codierenden Nukleinsäure über einen von ElB verschiedenen Promotor, über ElB 19K oder über El A12S gesteuert wird.
In einer Ausführungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass das Virus mindestens ein Transgen umfasst, das bevorzugterweise in die E3-Region einkloniert ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass das Virus mindestens ein Transgen umfasst, das bevorzugterweise in die E4-Region einkloniert ist.
In einer Ausführungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass das Virus eine für ein RGD- Motiv codierende Nukleinsäure umfasst, wobei das RGD-Motiv bevorzugterweise in die HI- Loop-Domäne des Fibre Knobs einkloniert ist.
In einer Ausführungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass das Virus weiter MLP-Gene und/oder E2A-Gene und E2B Gene und/oder E3-Gene und/oder E4-Gene umfasst. In einer Ausführungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass es replikationsdefizient ist in Zellen, die YB-I nicht im Zellkern aufweisen.
In einer Ausfϊihrungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass das Virus replikationsfahig ist in Zellen, die YB-I im Kern aufweisen, insbesondere YB-I unabhängig vom Zellzyklus im Kern aufweisen.
In einer alternativen Ausfuhrungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass das Virus replikationsfahig ist in Zellen, bei oder in denen YB-I dereguliert vorliegt.
In einer weiteren alternativen Ausfuhrungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass es in Tumorzellen, insbesondere Tumorzellen, die eine Resistenz gegen Cytostatika und/oder Bestrahlung aufweisen, replikationsfahig ist.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform des ersten Aspekts ist vorgesehen, dass die Zellen eine Vielfachresistenz aufweisen.
Li einem zweiten Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine Nukleinsäure codierend für ein Virus nach dem erstem Aspekt der Erfindung.
In einem dritten Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung eines Virus nach dem ersten Aspekt oder einer Nukleinsäure nach dem zweiten Aspekt oder eines diese enthaltenden Vektors oder ein diese oder einen Teil der Nukleinsäure enthaltendes Replikationssystem zur Herstellung eines Medikamentes.
In einem vierten Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung eines Virus nach dem ersten Aspekt oder einer Nukleinsäure nach dem zweiten Aspekt zur Replikation in Zellen, wobei die Zellen YB-I im Zellkern aufweisen, bevorzugterweise unabhängig vom Zellzyklus im Kern aufweisen, oder die Zellen dereguliertes YB-I aufweisen, oder die Zellen Tumorzellen sind, insbesondere Tumorzellen, die eine Resistenz gegen Cytostatika und/oder Bestrahlung aufweisen.
In einer Ausführungsform des vierten Aspekts ist vorgesehen, dass die Zellen YB-I im Kern aufweisen nach oder infolge einer Maßnahme, die an der Zelle angelegt wird oder worden ist und ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Bestrahlung, Gabe von Cytostatika und Hyperthermie.
In einer Ausführungsform des dritten Aspekts ist vorgesehen, dass das Medikament für die Behandlung von Tumoren und/oder Krebserkranlcung(en) ist und/oder für die Wiederherstellung der Empfindlichkeit von Zellen gegenüber Cytostatika und/oder Bestrahlung, wobei die Zellen bevorzugterweise Tumorzellen sind, die eine Resistenz gegen Cytostatika und/oder Bestrahlung aufweisen.
In einer Ausführungsform des dritten Aspekts ist vorgesehen, dass mindestens ein Teil der den Tumor ausbildenden Zellen Zellen sind, die YB-I im Kern aufweisen, bevorzugterweise unabhängig vom Zellzyklus YB-I im Kern aufweisen, oder mindestens ein Teil der den Tumor ausbildenden Zellen dereguliertes YB-I aufweisen oder mindestens ein Teil der den Tumor ausbildenden Zellen Tumorzellen sind, insbesondere Tumorzellen, die eine Resistenz gegen Cytostatika und/oder Bestrahlung aufweisen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des dritten Aspekts ist vorgesehen, dass die Zellen, insbesondere die den Tumor oder Teile davon ausbildenden Zellen eine Resistenz, insbesondere Mehrfachresistenz oder Vielfachresistenz gegen pharmakologische Wirkstoffe, bevorzugterweise Antitumormittel und bevorzugtererweise Cytostatika, aufweisen.
In einer Ausführungsform des dritten und vierten Aspekts ist vorgesehen, dass die Zellen eine Expression, bevorzugterweise eine Überexpression des membranständigen Transportproteins P- Glykoprotein zeigen.
In einer Ausführungsform des dritten und vierten Aspekts ist vorgesehen, dass die Zellen YB-I im Kern aufweisen, insbesondere die den Tumor oder einen Teil davon ausbildenden Zellen YB- 1 im Kern aufweisen.
In einer Ausführungsform des dritten und vierten Aspekts ist vorgesehen, dass der Tumor YB-I im Kern nach Induktion des Tranports von YB-I in den Kern enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform des dritten und vierten Aspekts ist vorgesehen, dass der Transport von YB-I in den Kern ausgelöst wird durch zumindest eine Maßnahme, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die Bestrahlung, Gabe von Gytostatika und Hyperthermie umfasst.
In einer bevorzugteren Ausfuhrungsform des dritten und vierten Aspekts ist vorgesehen, dass die Maßnahme an einer Zelle, einem Organ oder einem Organismus angewandt wird.
In einem fünften Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung eines viralen Replikationssystems, insbesondere eines adenoviralen Replikationssystems, umfassend eine Nukleinsäure, die für einen Virus, insbesondere einen Adenovirus, gemäß dem ersten Aspekt oder einen Teil davon codiert, und umfassend eine Nukleinsäure eines Helfervirus, wobei die Nukleinsäure des Helfervirus eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die für YB-I codiert, und den Virus optional komplementiert, bevorzugterweise zur Herstellung eines Medikamentes, bevozugterweise zur Behandlung von Tumoren und/oder Krebserkrankung(en) und/oder für die Wiederherstellung der Empfindlichkeit von Zellen gegenüber Cytostatika und/oder Bestrahlung, wobei die Zellen bevorzugterweise Tumorzellen sind, die eine Resistenz gegen Cytostatika und/oder Bestrahlung aufweisen.
In einer Ausführungsform des fünften Aspekts ist vorgesehen, dass die virale Nukleinsäure, bevorzugterweise die adenovirale Nukleinsäure und/oder die Nukleinsäure des Helfervirus als replizierbarer Vektor vorliegt.
In einem sechsten Aspekt wird die Aufgabe erfmdungsgemäß gelöst durch die Verwendung einer Nukleinsäure codierend für einen Virus, bevorzugterweise einen Adenovirus, gemäß dem ersten Aspekt zur Herstellung eines Medikamentes, bevorzugterweise zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Tumoren und/oder für die Wiederherstellung der Empfindlichkeit von Zellen gegenüber Cytostatika und/oder Bestrahlung, wobei die Zellen bevorzugterweise Tumorzellen sind, die eine Resistenz gegen Cytostatika und/oder Bestrahlung aufweisen.
In einer Ausführungsform des sechsten Aspekts ist vorgesehen, dass die Zellen, insbesondere die den Tumor oder Teile davon ausbildenden Zellen, eine Resistenz, insbesondere eine Mehrfachresistenz gegen pharmakologische Wirkstoffe, bevorzugterweise Antitumormittel, und bevorzugtererweise Cytostatika, aufweisen. In einem siebten Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch einen Vektor umfassend eine Nukleinsäure nach dem zweiten Aspekt bevorzugterweise zur Verwendung gemäß dem dritten und vierten Aspekt.
In einem achten Aspekt wird die Aufgabe erfmdungsgemäß gelöst durch die Verwendung eines mit YB-I wechselwirkenden Mittels zur Charakterisierung von Zellen, Zellen eines Tumorgewebes oder Patienten, um zu bestimmen, ob diese(r) mit einem Virus, insbesondere einem Adenovirus, gemäß dem ersten Aspekt oder einer Nukleinsäure nach dem zweiten Aspekt kontaktiert und/oder behandelt werden kann/sollen.
In einer Ausführungsform des achten Aspekts ist vorgesehen, dass das Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe, die Antikörper, hoch-affin bindende Peptide, Antikaline, Aptamere, Aptazyme und Spiegelmere umfasst.
In einem neunten Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend einen Virus nach dem ersten Aspekt, oder eine Nukleinsäure nach dem zweiten Aspekt oder ein virales Replikationssystem wie im fünften Aspekt beschrieben.
In einer Ausführungsform des neunten Aspekts ist vorgesehen, dass die Zusammensetzung mindestens eine weitere pharmazeutisch wirksame Verbindung enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform des neunten Aspekts ist vorgesehen, dass die pharmazeutisch wirksame Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, die Cytokine, Metalloproteinasen-lnhibitoren, Angiogenese-Inhibitoren, Cytostatika, Zellzyklus-Inhibitoren, Proteosomen-Inhibitoren, rekombinante Antikörper, Inhibitoren der Signaltransduktionskaskade und Proteinkinasen umfasst.
In einer Ausführungsform des neunten Aspekts ist vorgesehen, dass die Zusammensetzung eine Kombination von mindestens zwei Verbindungen umfasst, wobei bevorzugterweise eine jede Verbindung einzeln und unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, die Cytostatika umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform des neunten Aspekts ist vorgesehen, dass mindestens zwei der Verbindungen an unterschiedlichen Zielmolekülen angreifen. In einer Ausführungsförm des neunten Aspekts ist vorgesehen, dass mindestens zwei der Verbindungen über einen unterschiedlichen Wirkmechanismus aktiv sind.
In einer Ausfuhrungsform des neunten Aspekts ist vorgesehen, dass mindestens eine Verbindung die Infϊzierbarkeit einer Zelle durch den Virus erhöht, in der der Virus repliziert.
In einer Ausfuhrungsform des neunten Aspekts ist vorgesehen, dass mindestens eine Verbindung die Verfügbarkeit einer Komponente der Zelle beeinflusst, bevorzugterweise die Verfügbarkeit der Komponente erhöht, wobei die Komponente die Aufnahme des Virus in eine oder die Zelle vermittelt, in der bevozugterweise der Virus repliziert.
In einer Ausführungsform des neunten Aspekts ist vorgesehen, dass mindestens eine Verbindung den Transport von YB-I in den Zellkern vermittelt, bevorzugterweise erhöht.
In einer Ausführungsform des neunten Aspekts ist vorgesehen, dass mindestens eine Verbindung ein Histon-Deacylase-Inhibitor ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform des neunten Aspekts ist vorgesehen, dass der Histon- Deacylase-Inhibitor aus der Gruppe ausgewählt ist, die Trichostatin A, FR 901228, MS-27-275, NVP-LAQ824, PXDlOl Apicidin und Scriptaid umfasst.
In einer Ausführungsform des neunten Aspekts ist vorgesehen, dass mindestens eine Verbindung aus der Gruppe ausgewählt ist, die Trichostatin A, FR 901228, MS-27-275, NVP-LAQ824, PXDlOl Apicidin und Scriptaid umfasst.
In einer Ausführungsform des neunten Aspekts ist vorgesehen, dass mindestens eine Verbindung ein Topoisomerase-Inhibitor ist.
hi einer bevorzugten Ausführungsform des neunten Aspekts ist vorgesehen, dass der Topoisomerase-Inhibitor aus der Gruppe ausgewählt ist, die Camptothecin, Mnotecan, Topotecan, DX-895If, SN-38, 9-Aminocamptothecin, 9-Nitrocamptothecin, Daunorubicn und Etoposid umfasst. In- einer Ausfuhrungsform des neunten Aspekts ist vorgesehen, dass die Zusammensetzung Trichostatin A und Irinotecan umfasst.
In einer Ausfiihrungsform des neunten Aspekts ist vorgesehen, dass das Virus, bevorzugterweise ein Virus nach dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung, getrennt von einem oder beiden oder allen der mindestens zwei Verbindungen ist.
In einer bevorzugten Ausfϊihrungsform des neunten Aspekts ist vorgesehen, dass mindestens eine Einheitsdose des Virus von mindestens einer Einheitsdose von der oder allen weiteren pharmazeutisch wirksamen Verbindung(en) oder von einer oder den mindestens zwei Verbindungen getrennt ist.
In einem zehnten Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch einen Kit umfassend einen Virus, bevorzugterweise ein Virus nach dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung einen Virus nach einem der vorangehenden Ansprüche, und mindestens zwei pharmazeutisch wirksamen Verbindungen, wobei eine jede pharmazeutisch wirksame Verbindung einzeln und unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, die Cytostatika umfasst.
Der vorliegenden Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, dass die erfindungsgemäßen Viren, d.h. Viren, denen eine funktionale El -Region, wie sie im Wildtyp Adenovirus enthalten ist, fehlt und die gleichzeitig einen Transporter umfassen und insbesondere einen solchen codieren, der YB-I in den Zellkern transportieren oder translozieren kann, in der Lage ist in Zellen zu replizieren, die entweder Zellzyklus-unabhängig YB-I im Kern aufweisen, oder in Zellen, die YB-I dereguliert aufweisen.
Weiterhin hat der vorliegende Erfinder festgestellt, dass die erfindungsgemäßen Viren auch unabhängig von E1A13S replizieren können, insbesondere wenn die Replikation durch YB-I vermittelt wird. Dabei tritt die Replikation insbesondere bei den vorstehend beschriebenen Zellen auf. Wie hierein verwendet sind Zellen, die YB-I im Zellkern, bevorzugterweise unabhängig vom Zellzyklus im Zellkern enthalten, auch solche, die YB-I im Zellkern infolge der Verwendung der erfindungsgemäßen Viren und insbesondere der Infektion der Zellen mit diesem enthalten. Schließlich hat der vorliegende Erfinder noch erkannt, dass Protein IX ein wichtiger Faktor insbesondere für die Wirksamkeit der erfmdungsgemäßen Viren bei der Verwendung als onkolytische Viren ist und mit den hierein offenbarten Konstrukten eine Expression dieses Faktors gewährleistet wird, die zu einer hohen Partikelbildung auch bei der YB-I vermittelten El A13S unabhängigen viralen Replikation führt.
Zellen, die YB-I in einer deregulierten Form aufweisen, sind solche, die zumindest eine der folgenden Eigenschaften aufweisen und/oder die YB-I aufweisen, wobei das YB-I zumindest eine der folgenden Eigenschaften aufweist: (1) YB-I ist in den Zellen überexprimiert, bevorzugterweise unabhängig vom Zellzyklus überexprimiert, wobei bevorzugterweise als Maßstab für die Expression die Expression von YB-I in normalen Zellen herangezogen wird, d.h. Zellen, die verschieden sind von Tumorzellen, oder Zellen bzw. Zellinien wie die folgenden: Hepatocyten sowie die Fibroblastenzellinien WI38 und CCD32-Lu. Bevorzugterweise liegt eine Überexpression dann vor, wenn die Expression um den Faktorberich von etwa 2 bis 10, bevorzugterweise 5 bis 10 erhöht ist. Verfahren zur Messung der Expression und insbesondere der Überexpression sind den Fachleuten bekannt und umfassen u.a. das Messen der Proteinkonzentration, insbesondere von YB-I, das Messen der RNA, insbesondere von YB-I, Western Blot Analyse, Northern Blot Analyse und RT-PCR jeweils bevorzugterweise von YB-I. Anstelle von YB-I können auch Surrogat-Marker wie hierin beschrieb verwendet werden. Beispiele für Zellinien, die eine Überexpression von YB-I zeigen, stellen bspw. die folgenden Zellinien dar: Kolonkarzinomzellinie 257RDB, Pankreaskarzinmozellinie 181RDB, Mammakarzinomzellinie MCF-7Adr, Prostatakarzinomzellinie DU145, Prostatakarzinomzellinie PC3, Gliomzellinie U373, Gliomzellinie U87, Lungenkarzinomzellinie A549, Leberkarzinomzellinien Hep3B und HepG2. Das in der Zelle vorhandene YB-I erlaubt die Replikation der erfindungsgemäßen Viren. Dabei ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wenn die Replikationseffizienz unter diesen Bedingungen von einer stark verringerten Replikation verschieden ist.
Wie hierin in einer Ausführungsform verwendet bezeichnet der Begriff der funktionalen Wildtyp-El -Region insbesondere eine El -Region, wie sie im Adenovirus Ad5 vom Wildtyp enthalten ist. In einer Ausfuhrungsform bezeichnet der Begriff fehlende funktionale Wildtyp-El - Region eine El -Region, die eine oder mehrere bei Adenoviren vom Wildtyp vorhandene Funktionen und Funktionalitäten der El -Region nicht oder nicht vollständig aufweist. Die Funktionalität oder Funktion, hierin im folgenden allgemein als Funktion bezeichnet, wird dabei durch eine Nukleinsäure oder ein Protein, bevorzugterweise ein Protein dargestellt oder vermittelt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann das Fehlen der Funktion dadurch bedingt werden, dass diese auf der Ebene der Translation nicht aktiv ist, d. h. das die Funktion vermittelnde Protein nicht vorhanden ist, obgleich die dafür codierenden Nukleinsäuren noch im viralen Genom enthalten ist. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass die die Translation steuernde regulatorische Elemente, die wie beispielsweise am 3'UTR der mRNA vorhanden seien können, die unter anderem für die Stabilität der mRNA verantwortlich sind fehlen, nicht aktiv sind, bevorzugterweise nicht mehr in dem regulatorischen und kontrollierenden Kontext, wie er bei Viren vom Wildtyp für die jeweilige Funktion vorliegt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann das Fehlen der Funktion alternativ oder ergänzend dadurch bedingt werden, dass diese auf der Ebene der Transkription nicht aktiv ist, d. h. das die Funktion vermittelnde Protein nicht vorhanden ist, und die dafür codierenden Nukleinsäuren nicht oder nicht vollständig im viralen Genom enthalten ist. Es ist im Rahmen dieser Ausführungsform, dass die codierende Nukleinsäure eine oder mehrere Mutationen aufweist, die zu dem Verlust der Funktion fuhren. Derartige Mutationen sind bevorzugterweise Punktmutationen und/oder mehrere Basen umfassende Deletionen und/oder eine vollständige Deletion des offenen Leserahmens oder der für das Protein codierenden Nukleinsäure.
Es fehlt an der Funktion im Sinne der vorstehenden Ausführungsformen, wenn das Protein nicht alle Funktionen oder Aktivitäten wie das korrespondierende Protein vom Wildtyp aufweist. In einer Ausführungsform wird als Maß für die Aktivität der Umfang der Replikation, die unter diesen Umstanden erreicht wird herangezogen, wobei diese von einer stark verschiedenen Replikation bevorzugterweise verschieden ist.
Li einer bevorzugten Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung fehlt es an einer Funktion auch dann, wenn die Funktion in einem anderen regulatorischen Kontext im Virus enthalten ist verglichen mit dem Wildtyp-Virus. Ein geänderter regulatorischer Kontext ist in einer bevorzugten Ausführungsform ein solcher, bei dem die Funktion verglichen mit anderen Funktionen zu einem anderen Zeitpunkt exprimiert wird und/oder unter der Kontrolle eines anderen, die Transkription und/oder Translation steuernden oder beeinflussenden Elementes steht. Ein der artiges Element ist in einer besonderen Ausführungsform der Promotor.
Das Fehlen einer Funktion im vorstehenden Sinne wird hierin auch dadurch angezeigt, dass die jeweilige Funktion als „minus" bezeichnet wird. So wird beispielsweise das Fehlen von ElAl 3S als ElAl3S-minus bezeichnet.
In einer Ausführungsform wird unter einer stark verringerten Replikation hierin insbesondere eine solche Replikation verstanden, die gegenüber dem Wildtyp um den Faktor 2, bevorzugterweise um den Faktor 5, bevorzugtererweise um den Faktor 10 und am bevorzugtesten um den Faktor 100 verringert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Vergleich der Replikation bei Verwendung gleicher oder ähnlicher Zellinien, gleicher oder ähnlicher Virustiter für die Infektion (engl, multiplicity of infection, MOI, oder engl, plaque forming unit, pfu) und/oder gleicher oder ähnlicher allgemeiner Versuchsbedingungen durchgeführt wird. Dabei wird unter Replikation insbesondere die Partikelbildung verstanden. In weiteren Ausführungsformen kann jedoch als Mass für die Replikation der Umfang der Synthese viraler Nukleinsäure verstanden sein. Verfahren zur Bestimmung des Umfanges der Synthese viraler Nukleinsäuren sind ebenso wie Verfahren zur Bestimmung der Partikelbildung den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt.
Die erfindungsgemäßen Viren umfassen einen Transporter für den Transport von YB-I in den Zellkern. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Transporter um ein Protein, bevorzugterweise um ein virales Protein. Bei dem YB-I, das durch den Transporter in den Zellkern einer Zelle transportiert wird, handelt es sich bevorzugterweise um dereguliertes YB-I, insbesondere um ein solches, wie hierin definiert. Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass das YB-I ein solches ist, das alternativ oder in Ergänzung zu dem deregulierten YB-I durch das erfindungsgemäße Virus codiert und von diesem in der Zelle, die von dem Virus infiziert ist, exprimiert wird.
Die Zellen, in denen der Transporter der erfindungsgemäßen Viren YB-I in den Zellkern transportiert, sind bevorzugterweise solche, die dereguliertes YB-I enthalten.
Es ist im Rahmen des Könnens der Fachleute auf dem Gebiet, festzustellen, inwieweit ein Virus einen derartigen Transporter umfasst oder für diesen codiert. Dabei kann in einer Ausfuhrungsform eine Zelle, die YB-I nicht Zellzyldus-unabhängig im Zellkern aufweist, wie beispielsweise die Zervixkarzinomzellinie HeLa oder die Osteosarkomzellinie U2OS herangezogen werden und sodann bestimmt werden, ob infolge der Infektion und der sich anschließenden Replikation des Virus die entsprechend infizierte Zelle YB-I im Zellkern aufweist. In einer alternativen Ausführungsform wird als Zelle eine Zelle verwendet, die dereguliertes YB-I aufweist. Der Nachweis von YB-I im Zellkern unter diesen experimentellen Bedingungen kann unter Verwendung der hierin beschriebenen Mittel, insbesondere eines gegen YB-I gerichteten Antikörpers, von den Fachleuten auf diesem Gebiet vorgenommen werden. Wird unter dem Einfluss des Viruses YB-I im Zellkern festgestellt, weist das getestete Virus einen oder den Transporter auf.
Es ist dabei im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die El -Region hinsichtlich einer oder beider Proteingruppen, die von der El-Region codiert werden, „minus" im Sinne der vorstehenden Ausführungen ist. Bei den beiden Proteingruppen handelt es sich um die Gruppe der EIA-Proteine, die insbesondere das ElA 13S Protein, hierin auch als ElA 13S bezeichnet, und das E1A12S Protein, hierin auch als E1A12S bezeichnet, und die Gruppe der EIB-Proteine, die insbesondere das E1B55K Protein, hierin auch als E1B55K bezeichnet, das E1B19K Protein, hierin auch als E1B19K bezeichnet, und das Protein IX umfasst.
Es ist im Rahmen einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, dass das Virus E1A13S- minus ist, wenn es unter der Kontrolle eines Promotors steht, der verschieden ist von dem ElA- Promotor, bevorzugterweise dem adenoviralen EIA-Promotor und bevorzugtererweise dem adenoviralen EIA-Promotor vom Wildtyp; dass das Virus ElA12S-minus ist, wenn es unter der Kontrolle eines Promotors steht, der verschieden ist von dem EIA-Promotor, bevorzugterweise dem adenoviralen EIA-Promotor und bevorzugtererweise dem adenoviralen EIA-Promotor vom Wildtyp; dass das Virus ElB55K-minus ist, wenn es unter der Kontrolle eines Promotors steht, der verschieden ist von dem EIB-Promotor, bevorzugterweise dem adenoviralen EIA-Promotor und bevorzugtererweise dem adenoviralen EIB-Promotor vom Wildtyp; dass das Virus ElB19K-minus ist, wenn es unter der Kontrolle eines Promotors steht, der verschieden ist von dem EIB-Promotor, bevorzugterweise dem adenoviralen EIB-Promotor und bevorzugtererweise dem adenoviralen EIB-Promotor vom Wildtyp; und dass es Protein IX-minus ist, wenn es unter der Kontrolle eines Promotors steht, der verschieden ist von dem ElBIX-Promotor, bevorzugterweise dem adenoviralen ElBIX-Promotor und bevorzugtererweise dem adenoviralen ElBIX-Promotor vom Wildtyp oder wenn es zwar unter der Kontrolle des ElBIX-Promotors steht, dieser aber infolge des Fehlens von insbesondere viralen Faktoren, die die Aktivität des ElBIX-Promotors steuern, nicht aktiv ist; letzteres ist somit ein Beispiel dafür, dass der regulatorische Kontext geändert ist, genauer der regulatorische Kontext indirekt oder auf einer höheren Integrations- oder Regulationsstufe geändert ist. Generell umfasst damit der Begriff des geänderten regulatorischen Kontextes auch solche Änderungen, die indirekt oder auf einer höheren Integrations- oder Regulationsstufe aktive sind, in einem jeden Falle jedoch von den Gegebenheiten des Wildtyps, insbesondere des Wildtyp-Adenovirus abweicht.
In einer Ausfülirungsform der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass das Virus E1A13S- minus ist. In einer weiteren Ausführungsform ist das Virus auch ElA12-minus. Dabei ist besonders bevorzugt, wenn das Virus E1A12S unter der Kontrolle eines Promotors steht, der in seiner Aktivität durch YB-I gesteuert wird, insbesondere durch YB-I aktiviert wird. Diese Promotoren werden hierin auch als YB-I -abhängige Promotoren bezeichnet. Ein besonders bevorzugter YB-I -abhängiger Promotor ist der adeno virale E2-late Promotor. Durch diese Konstruktion wird gewährleistet, dass E1A12S im Rahmen der viralen Replikation erst dann aktiviert wird, wenn YB-I im Zellkern vorhanden ist. Dies wird im Falle von Zellen mit dereguliertem YB-I durch den Transporter der erfindungsgemäßen Viren erreicht, der das deregulierte YB-I in den Zellkern der infizierten Zelle transloziert. Durch die gegenüber der Expression im Wildtyp bevorzugerweise zeitlich umgedrehten Expression des viralen Transporters und von E1A12S wird die Spezifität der Expression von E1A12S in nur solchen Zellen gewährleistet, die YB-I in deregulierter Form aufweisen und damit die Replikation des Virus auf diese Zellen und in der Folge die Lyse auf eben diese Zellen beschränkt, was unter Sicherheitsaspekten ein wesentlicher Vorteil dieser Konstruktion der Viren darstellt.
Vor diesem Hintergrund galt es die Partikelzahl bei der YB-I abhängigen Replikation zu erhöhen. Der vorliegende Erfinder hat erkannt, dass auch bei der YB-I abhängigen Replikation das Protein IX eine wichtige Rolle spielt und dessen Expression von der vorstehend beschriebenen zeitlichen Änderung der Expression von Transporter, der bevorzugt durch die Protein der EIB-Region bereitgestellt wird, und E1A12S unberührt bleibt, wenn die hierin offenbarten Konstrukte realisiert werden. Die im Strand der Technik beschriebenen adenoviralen Konstrukte für die YB-I -abhängige Replikation wiesen trotz hervorragender onkolytischer Eigenschaften eine für manche Anwendung niedrige Partikelbildung auf, die bspw. eine erneute Applikation des onkolytischen Virus bedingt. Eine derartige erneute Applikation von Viren ist zwar grundsätzlich möglich, ist jedoch in der Mehrzahl der Fälle nicht erwünscht. Mit den hierin beschriebenen Konstrukten konnte die Partikelbildung erheblich verbessert werden. Insoweit betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Protein IX und/oder einer dafür codierenden Nukleinsäure zur Bildung viraler, insbesondere adenoviraler Partikel bei YB-I- abhängig replizierenden Viren, insbesondere Adenoviren. Weiterhin betrifft die vorligende Erfindung die Verwendung von YB-abhängig replizierenden Viren, bevorzugterweise Adenoviren, zur Herstellung eines Medikamentes, wobei die Viren Protein IX und/oder eine dafür codierende Nukleinsäure umfassen. In einer bevorzugten Ausfühurngsform ist das Medikament für die Behandlung von Tumoren und Krebserkrankungen, wie sie hierin beschreiben sind. In einer weiteren, zusätzlichen oder alternativen Ausführungsform ist das Medikament für die Aufhebung einer Resistenz bei tierischen Zellen, wie sie hierein beschrieben ist, und/oder für die Wiederherstellung der Empflindlichkeit von Zellen gegenüber Cytostatika und/oder Bestrahlung, wobei es sich bei den Zellen bevorzugterweise um Tumorzellen, die eine Resistenz, insbesondere wie sie hierin beschrieben ist, aufweisen, bevorzugterweise eine Restistenz gegen Cytostatika und Bestrahlung, wie insbesondere hierin beschrieben.
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die verschiedenen Transgene an geeigneten Stellen innherhalb des viralen Genoms enkloniert werden können. Dabei sind die Bereiche El, E2A, E2B, E3 und E4 besonders bevorzugt. Die Einklonierung des Transporters in die El- Region ist besonders bevorzugt. Es wird von den Fachleuten anerkannt werden, dass mit der Einklonierung der Transgene in die besagten Stellen des viralen Genoms die von diesen Stellen codierten Gene teilweise oder vollständig inaktiviert oder deletiert werden können. Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die von der jeweiligen Stelle codierten Gene teilweise oder vollständig aktiv bleiben können.
Die erfindungsgemäßen Viren sind bevorzugterweise Adenoviren.
Der Begriff der Behandlung einer Krakheit oder Erkrankung umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform auch die Prävention dieser Krankheit oder Erkrankung.
Das adenovirale Protein DC zementiert die Kapsidstruktur und ist für die Verpackung von viraler DNA in Virionen bedeutsam (Boulanger et al., Journal of Virology, 44, 783-800, 1979; Jones und Shenk, Cell, 17, 683-689, 1979). Das Gen liegt im viralen Genom zwischen den Positionen 3581 und 4071 (Colby und Shenk T, Journal of Virology, 1981, 39, 977-980), wobei das Gen für Protein IX nur von replizierten DNA-Molekülen aus exprimiert wird (Matsui T et al., Molecular and Cellular Biology, 1986, 6, 4149-4154).
Der im Stand der Technik als solche beschriebene Virus XvirO3-3'UTR, der eine YB-I- abhängige Replikation durchfuhrt, weist wie im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung zwischenzeitlich durchgeführte Analysen ergeben haben, sowohl den Promotor als auch die Sequenz für das Protein DT auf, da die 3'-UTR-Sequenz diese enthält. In Tumorzellen wird das Protein jedoch nur sehr schwach exprimiert und führt zu einer vergleichsweise geringeren Partikelbildung gegenüber dem Wildtyp- Virus. Das Virus Xvir03-3'UTR exprimiert die viralen Proteine ElB55k und E4orf6 vermittelt durch den in Xvir 03-3'UTR eingeführten, heterologen CMV-Promoter (Firma Clontech: Plasmid pShuttle). Anstelle des CMV-Promotors können auch jene hierin beschriebenen Promotoren verwendet werden, wie im Zusammenhang mit der Expression von ElA offenbart. Der offene Leserahmen beider Gene ist über eine sogenante IRES-Sequenz (engl.: internal ribosomal entry site) miteinander verbunden (Pelletier, J. and Sonenberg, N. Nature, 1988, 334, 320-325). Dieses Element (Firma Novagen: pCITE) erlaubt die Expression von zwei Proteinen aus einer rnRNA. Eine weitere Möglichkeit der Expression von zwei Proteinen aus einer RNA besteht in der Verwendung von kurzen Peptiden (2A), die vom foot-and mouth disease virus stammen (Pablo de Felipe, Genetic Vaccines and Therapy, 2004, 2, 13). Dieses Element kann in den verschiedenen hierin beschrienen Ausführungsformen grundsätzlich als Alternative zu der regulatorischen IRES -Sequenz verwendet werden.
Vor dem bis zum Zeitpunkt der vorliegenden Anmeldung nicht bekannten regulatorischen Hintergrund der Expression von Protein DC bei YB-I -abhängig replizierenden Viren und insbesondere Adenoviren, hat der vorliegende Erfinder erkannt, dass die Expression von Protein DC im Rahmen der YB-I -abhängigen Replikation und bei den Viren, die YB-I -abhängig replizieren, grundsätzlich durch die folgenden verschiedene Strategien gewährleistet werden kann:
1. Durch einen unabhängigen Promotor, insbesondere einen solchen, durch den das Protein El A12S oder das Protein ElB 19K gesteuert wird.
Der unabhängige Promotor ist dabei bevorzugterweise ein solcher, der verschieden ist von dem ElBDC Promotor. Bevorzugtererweise ist der unabhängige Promotor ausgewählt aus der Gruppe umfassen gewebespezifische, tumorspezifische, YB-I -abhängige und virale Promotoren. 2. Steuerung der Expression von Protein IX durch E1A12S. Durch die Expression des El A12S Proteins erfolgt eine S-Phase Induktion der infizierten Zelle, die dazu fuhrt, dass das Protein IX durch seinen natürlichen Promotor aktiviert wird.
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass für die Expression des Transporters grundsätzlich solche Promotoren verwendet werden können, die verschieden sind von dem Promotor, der die Expression des Transporters in dem Virus vom Wildtyp steuert. In bevorzugten Ausfuhrungsformen bedeutet dies, dass E1B55K von einem von ElB verschiedenen Promotor gesteuert wird, E4orf6 von einem von dem E4-Promotor verschiedenen Promotor. In einer weiteren Ausfürungsform ist der Promotor ein solcher, der ElA unabhängig ist, d.h. dessen Aktivität nicht von ElA beeinflusst ist. Bevorzugte Promotoren sind somit gewebespezifische Promotoren, tumorspezifische Promotoren und virale Promotoren und insbesondere nicht- adenovirale, bevorzugterweise solche, wie sie hierin beschrieben sind.
YB-I -abhängige Promotoren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt: der adenovirale E2 late- Promotor, der MDR-Promotor [Stein et al, J. Biol. Chem, 2001, 276, 28562-28569;] sowie der DNA- Polymerase alpha - Promotor [En-Nia et al, J. Biol. Chem., 2004, Epub ahead of print].
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete nicht-adenovirale Promotoren können ausgewählt sein aus der Gruppe, die Cytomegalovirus-Promotor, RSV-(Rous sarcoma Virus) - Promotor, Adenovirus-basierender Promotor Va I und den nicht- viralen YB-I -Promotor (Makino Y. et al., Nucleic Acids Res. 1996, 15, 1873-1878) umfasst. Weitere Promotoren, die im Zusammenhang mit einem jeden Aspekt der hierin offenbarten Erfindung verwendet werden können, stellen der Telomerase-Promotor, der Alpha-Fetoprotein (AFP)-Promotor, der Caecinoembryonic Antigen Promotor (CEA) (Cao, G., Kuriyama, S., Gao, J., Mitoro, A., Cui, L., Nakatani, T., Zhang, X., Kikukawa, M., Pan, X., Fukui, H., Qi, Z. Int. J. Cancer, 78, 242-247, 1998), der L-Plastin-Promotor (Chung, L, Schwartz, PE., Crystal, RC, Pizzorno, G, Leavitt, J., Deisseroth, AB. Cancer Gene Therapy, 6, 99-106, 1999), Argenin-Vasopressin-Prornotor (Coulson, JM, Staley, J., WoIl, PJ. British J. Cancer, 80, 1935-1944, 1999), E2f-Promotor (Tsukada et al. Cancer Res., 62, 3428 - 3477), Uroplakin Ü-Promotor (Zhang et al., Cancer Res., 62, 3743-3750, 2002) und der PSA-Promotor (Hallenbeck PL, Chang, YN, Hay, C, Golightly, D., Stewart, D., Lin, J., Phipps, S., Chiang, YL. Human Gene Therapy, 10, 1721-1733, 1999) dar. Ferner stellt der in der deutschen Patentanmeldung DE 101 50 984.7 beschriebenen YB-I abhängigen E2-late-Promotor von Adenoviren einen Promotor dar, wie er im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
Hinsichtlich des Telomerase-Promotors ist bekannt, dass dieser in humanen Zellen von zentraler Bedeutung ist. So wird die Telomeraseaktivität durch die transkriptionelle Kontrolle des Telomerase reverse Transkriptase-Gens (hTERT), welches die katalytische Untereinheit des Enzyms darstellt, reguliert. Die Expression der Telomerase ist in 85% der humanen Tumorzellen aktiv. Im Unterschied dazu ist sie in den meisten normalen Zellen inaktiv. Ausgenommen davon sind Keimzellen und embryonales Gewebe (Braunstein, I. et al., Cancer Research, 61, 5529- 5536, 2001; Majumdar, A. S. et al., Gene Therapy 8, 568-578, 2001). Genaue Untersuchungen am hTERT-Promotor haben gezeigt, dass Fragmente des Promotors von 283 bp bzw. 82 bp vom Initiationscodon entfernt für eine spezifische Expression in Tumorzellen ausreichend sind (Braunstein I. et al.; Majumdar AS et al., aaO). Daher eignet sich dieser Promotor bzw. die spezifischen Fragmente, um eine spezifische Expression eines Gens und insbesondere eines Transgens, bevorzugterweise eines hierin offenbarten Transgens, nur in Tumorzellen zu erzielen.
Ein derartiger Promotor soll auch die Expression des modifizierten Onkogens des erfindungsgemäßen Virus, bevorzugt des EIA-Onkogenproteins, nur in Tumorzellen ermöglichen. Auch ist die Expression eines Transgens, insbesondere eines solchen, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die E4orf6, ElB55kD, ADP und YB-I umfasst, in einem adenoviralen Vektor unter einem dieser Promotoren in einer Ausfuhrungsform vorgesehen. Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass der Leserahmen des transaktivierenden Onkogenproteins, insbesondere des EIA-Proteins im Leserahmen (engl, „in frame") mit einem oder mehreren der Genprodukte des adenoviralen Systems ist. Der Leserahmen des transaktivierenden EIA-Proteins kann jedoch auch unabhängig davon sein.
Wie hierin verwendet umfasst der Begriff Transgene in einer bevorzugten Ausfuhrungsform all jene Gene, die entweder im Virus, insbesondere Adenovirus vom Wildtyp und bevorzugtererweise Adenovirus Ad5 Wildtyp, nicht oder in einem anderen regulatorischen Kontext, insbesondere wie hierin definiert, enthalten sind. Das in einem derartigen anderen regulatorischen Kontext befindliche oder vorliegende Gen wird hierin auch als heterologes Gen bezeichnet. Es ist im Rahmen einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, dass ein oder mehrere der Transgene^ wie sie hierin beschrieben sind, von einem oder mehreren Helfergenen codiert und/oder exprimiert werden.
Die hierin beschriebenen Erkenntnisse bzw. die Verfahren, Verwendungen oder Nukleinsäuren, Proteine, Replikationssysteme und dergleichen sind nicht notwendigerweise auf Adenoviren beschränkt. Grundsätzlich gibt es auch bei anderen Viren derartige Systeme, die hiermit ebenfalls umfasst sind.
Bei Verwendung der erfϊndungsgemäßen Viren oder bei der erfindungsgemäßen Verwendung der hierin beschriebenen Viren kann eine dem Wildtyp vergleichbare Replikation bereits bei einer Infektionsrate von 1 bis 10 pfu/Zelle erreicht werden gegenüber 10 bis 100 pfu/Zelle gemäß dem Stand der Technik.
Die erfindungsgemäßen Viren erlauben eine gegenüber den YB-I -abhängigen Viren des Standes der Technik erheblich höhere Partikelbildung. Bevorzugterweise ist die Partikenbildung um den Faktor 2 bis 50, bevorzugterweise um den Faktor 10 bis 50 erhöht.
Schließlich ist in einer Ausführungsform vorgesehen, dass die erfindungsgemäß verwendeten Adenoviren hinsichtlich ElB defizient, insbesondere hinsichtlich ElB 19K-defizient sind. Dabei wird hierin allgemein unter dem Begriff defizient ein Zustand verstanden, bei dem ElB die im Wildtyp inhärente Gesamtheit der Eigenschaften nicht aufweist und mindestens eine dieser Eigenschaften fehlen. Das Adenovirus BCL2-Homolog ElB19k verhindert die ElA induzierte Apoptose durch Interaktion mit den pro-apoptotischen Proteinen Bak und Bax. Dadurch wird eine maximale Replikation und/oder Partikelbildung in infizierten Zellen ermöglicht (Ramya Sundararajan und Eileen White, Journal of Virology 2001, 75, 7506-7516). Das Fehlen von ElB 19k führt zur besseren Freisetzung der Viren, da es, falls vorhanden, die Funktion des adenoviralen Death-Proteins minimiert. Durch eine solche Deletion wird der Virus induzierte cytopathische Effekt erhöht (Ta-Chiang Liu et al., Molecular Therapy, 2004 ) und führt somit zur stärkeren Lyse von infizierten Tumorzellen. Zudem bewirkt das Fehlen von E1B19K, dass TNF-alpha auf die Replikation von solchen rekombinanten Adenoviren in Tumorzellen keinen Einfluß ausübt, währen in normalen Zellen die Behandlung mit TNF-alpha zu einer geringeren Replikation und Freisetzung von infektiösen Viren führt. Somit wird die Selektivität und Spezifität erhöht (Ta-Chiang Liu et al., Molecular Therapy 2004, 9, 786-803). Es ist im Rahmen der Kenntnisse der Fachleute auf diesem Gebiet, für die Erfindung unwesentliche adenoviralen Nukleinsäuresequenzen zu deletieren bzw. zu mutieren. Derartige Deletionen können z. B die für einen Teil der E3 und E4 codierende Nukleinsäure betreffen wie hierin auch beschrieben. Bei einer Deletion von E4 ist dabei besonders bevorzugt, wenn sich diese nicht auf das Protein E4orf6 erstreckt, mithin der erfindungsgemäß zu verwendende Adenovirus E4orf6 codiert. In bevorzugten Ausführungsformen können diese adenoviralen Nukleinsäuren noch in das virale Kapsid verpackt werden und damit infektiöse Partikel ausbilden. Gleiches gilt für die erfindungsgemäße Verwendung der Nukleinsäuren. Generell gilt es auch noch festzuhalten, dass die adenoviralen Systeme hinsichtlich einzelner oder mehrerer Expressionsprodukte defizient sein können. Dabei ist zu berücksichtigen, dass dies zum einen darauf beruhen kann, dass die für das Expressionsprodukt codierende Nukleinsäure vollständig oder in dem Maße mutiert oder deletiert ist, dass im wesentlichen kein Expressionsprodukt mehr gebildet wird, oder darauf, dass regulative bzw. die Expression steuernde Elemente wie Promotoren oder Transkriptionsfaktoren fehlen oder anders als im Wildtyp aktiv sind, sei es auf der Ebene der Nukleinsäure (Fehlen eines Promotors; eis- wirkende Element) oder auf der Ebene des Translations- bzw. Transkriptionssystems (trans-wirkende Elemente). Gerade der letztere Aspekt kann dabei vom jeweiligen zellulären Hintergrund abhängen.
Die YB-I -abhängige Replikation der erfindungsgemäßen Viren findet vor dem im folgenden beschriebenen Hintergrund des Replikationsverhaltens von Adenoviren vom Wildtyp statt.
Die Replikation von Adenoviren ist ein ausgesprochen komplexer Vorgang und greift im Regelfalle auf den humanen Transkriptionsfaktor E2F zurück. Während einer viralen Infektion werden zunächst die „frühen Gene" El, E2, E3 und E4 exprimiert. Die Gruppe der „späten Gene" ist für die Synthese der viralen Strukturproteine verantwortlich. Für die Aktivierung sowohl der frühen wie auch der späten Gene spielt die El-Region bestehend aus zwei Transkriptionseinheiten ElA und ElB5 welche für verschiedene ElA- und EIB-Proteine codieren, eine entscheidende Rolle, da sie die Transkription der E2, E3, E4-Gene induzieren (Nevins, J. R., Cell 26, 213-220, 1981). Zudem können die EIA-Proteine in ruhenden Zellen die DNA-Synthese induzieren und so deren Eintritt in die S-Phase einleiten (siehe Boulanger and Blair, 1991). Darüber hinaus interagieren sie mit den Tumorsuppressoren der Rb-Klasse (Whyte, P. et al., Nature 334, 124-127, 1988). Dabei wird der zelluläre Transkriptionsfaktor E2F freigesetzt. Die E2F-Faktoren können dann an die entsprechenden Promotorbereiche sowohl zellulärer wie auch viraler Gene binden (insbesonder an den adenoviralen E2 early Promotor) und die Transkription und somit die Replikation einleiten (Nevins, J. R., Science 258, 424-429, 1992).
Für das Einleiten bzw. die Durchführung der Replikation werden insbesondere die Genprodukte der E2-Region benötigt, da sie für drei essentielle Proteine kodieren. Die Transkription der E2- Proteine wird durch zwei Promotoren gesteuert, den „E2-Early E2F-abhängigen", hierin auch als E2-early Promotor oder früher E2-Promotor bezeichnet, und den „E2-late" Promoter (Swaminathan und Thimmapaya, The Molecular Repertoire of Adenoviruses III: Current Topics in Microbiology and Immunology,Vol 199, 177-194, Springer Verlag 1995). Zudem spielen die Produkte der E4-Region zusammen mit dem ElA- und ElB-55kDa-Protein eine wichtige Rolle für die Aktivität von E2F bzw. die Stabilität von p53. Zum Beispiel wird durch eine direkte Interaktion des von der E4-Region codierten E4orf6/7-Proteins mit dem Heterodimer bestehend aus E2F und DPI der E2-Promoter noch stärker transaktiviert (Swaminathan und Thimmapaya, JBC 258, 736-746, 1996 ). Weiterhin wird p53 durch den Komplex bestehend aus ElB-55kDa und E4orf6 inaktiviert (Steegenga, W. T. et al., Oncogene 16, 349-357, 1998), um einen erfolgreichen lytischen Infektionszyklus durchlaufen zu können. Ferner besitzt das ElB-55kDa Protein eine weitere wichtige Funktion insoweit, als dass es in Wechselwirkung mit dem E4orf6 Protein den Export der viralen RNA aus dem Zellkern fordert, wohingegen die zelleigenen RNAs im Kern zurückgehalten werden (Bridge und Ketner, Virology 174, 345-353, 1990). Eine weitere wichtige Beobachtung ist die, dass der Proteinkomplex bestehend aus ElB- 55kDa/E4orf6 in den sogenannten „viral inclusion bodies" lokalisiert ist. Es wird angenommen, dass diese Strukturen Orte der Replikation und Transkription darstellen (Ornelles und Shenk, J. Virology 65, 424-429, 1991).
Eine weitere für die Replikation und insbesondere für die Freisetzung von Adenoviren besonders wichtige Region ist die E3 -Region. Die E3 -Region enthält genauer die genetische Information für eine Vielzahl von relativ kleinen Proteinen, die für den adenoviralen Infektionszyklus in vitro, d.h. in der Zellkultur nicht essentiell sind. Sie spielen jedoch für das Überleben des Virus während einer akuten und/oder latenten Infektion in vivo eine bedeutende Rolle, da sie unter anderem immunregulatorische und apoptotische Funktion(en) besitzen (Marshall S. Horwitz, Virololgie, 279, 1-8, 2001; Russell, a.a.O.). Es konnte gezeigt werden, dass ein Protein mit einer Größe von ca. 11,6 kDa den Zelltod induziert. Das Protein wurde infolge seiner Funktion als ADP - für den englischen Begriff adenovirus death protein - bezeichnet (Tollefson, J. Virology, 70, 2296-2306, 1996). Das Protein wird vornehmlich in der späten Phase des Infektionszyklus gebildet. Femer fuhrt die Überexpression des Proteins zu einer besseren Lyse der infizierten Zellen (Doronin et al., J. Virology, 74, 6147-6155, 2000). Entsprechend sind diese Gene bzw. Proteine in den erfindungsgemäßen Viren noch enthalten.
Die Verwendung der erfindungsgemäßen Adenoviren als Medikamente und besondere bei systemischer Anwendung kann durch ein geeignetes Targeting der Adenoviren verbessert werden. Die Infektion von Tumorzellen durch Adenoviren hängt bis zu einem bestimmten Umfang unter anderem vom Vorhandensein des Coxsackievirus- Adenovirus Rezeptor CAR und bestimmten Integrinen ab. Sobald diese stark in Zellen, insbesondere Tumorzellen exprimiert werden, ist eine Infektion bereits bei sehr geringen Titern (pfu/Zelle) möglich. Verschiedene Strategien sind bisher durchgeführt worden, um ein sogenanntes Re-targeting der rekombinanten Adenoviren zu erzielen, z. B. durch Insertion von heterologen Sequenzen in der fiber knob region und C-Terminus des Proteins IX, Verwendung von bi -spezifischen Antikörpern, Beschichten der Adenoviren mit Polymeren, Einfügen von Liganden im Ad fiber, die Substitution des Serotyps 5 knop bzw. 5 fiber shaft und knop mit dem Serotyp 3 knop bzw. Ad 35 fiber shaft and knob und Modifikationen des penton base (Nicklin S. A. et al., Molecular Therapy 2001, 4, 534-542; Magnusson, M. K. et. al., J. of Virology 2001, 75, 7280-7289; Barnett B. G. et al., Biochimica et Biophysica Acta 2002, 1575, 1-14; Dimitrev IP et al., Journal of Virology, 2002, 76, 6893-6899; Mizuguchi und Hayakawa, Human Gene Therapy, 2004, 15, 1034-1044). Die Realisierung derartiger weiterer Ausgestaltungen bzw. Merkmale bei den erfindungsgemäßen Adenoviren und den erfindungsgemäß verwendeten Adenoviren, in ihren verschiedenen Aspekten der vorliegenden Erfindung, ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung.
Die verschiedenen Transgene, so auch ElB55kD, E4orf6, ADP und dergleichen, insbesondere wenn es sich dabei um virale Gene handelt, können grundsätzlich aus einem jeden entsprechenden Virus, bevorzugterweise Adenovirus und bevorzugtererweise Adenovirus Ad5, cloniert werden. Im Stand der Technik sind darüber hinaus eine Vielzahl von Plasmiden beschrieben, die die entsprechenden Gene enthalten, und aus denen diese sodann entnommen und in die erfindungsgemäßen Adenoviren ebenso wie in die hierin gemäß der Erfindung zu verwendenden Viren eingefügt werden können. Ein Beispiel für ein Plasmid, das ElB55kD exprimiert, ist beispielsweise beschrieben von Dobbelstein, M. et al., EMBO Journal, 16, 4276- 4284, 1997. Die codierende Region des E1B55K-Gens kann zusammen mit der 3'-nicht- codierenden Region des E1B55K-Gens (diese 3'UTR-Region liegt bevorzugterweise etwa bei der Basenposition 3507-4107 im Adenovirus-Wildtypgenom) beispielsweise aus diesem Gen mittels Bam HI aus dem Plasmid pDCRElB herausgeschnitten- werden. Das entsprechende Fragment umfassend das ElB55kD-Gen sowie die 3'-nicht-codierende Region entspricht den Nukleotiden 2019 bis 4107 des Adenovirus Typ 5. Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass das ElB55kD-Gen mittels der Restriktionsenzyme Bam HI und Bfrl bzw. Xbal aus diesem Plasmid geschnitten wird und anschließend in den Adenovirus eincloniert wird. Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass auch Analoge davon und insbesondere Analoge der 3'UTR-Region im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Unter einem Analog oder Analogon zu der 3' UTR-Region wird eine jegliche Sequenz verstanden, die die gleiche Wirkung entfaltet wie die 3' UTR-Region, insbesondere die gleiche Wirkung bei der Expression eines Gens, bevorzugterweise des ElB55kD-Gens. Derartige Analoga können durch die Fachleute auf dem Gebiet im Rahmen von Routineversuchen bestimmt werden, bspw. dadurch, dass die 3'- UTR-Region um ein oder mehrere Nukleotide verlängert und verkürzt wird und dann überprüft wird, ob das solchermassen erhaltene Analogon noch die gleiche Wirkung aufweist wie die 3 '-UTR-Region, wie zuvor beschrieben. In einer Ausführungsform umfasst der Begriff der 3 '-UTR-Region somit auch eine jegliches Analogon dazu.
Eine Weiterentwicklung der erfindungsgemäßen Viren stellen jene dar, bei denen bevorzugterweise unter der Kontrolle eines spezifischen Promotors, insbesondere eines Tumoroder Gewebe-spezifischen Promotors, therapeutische Gene oder Transgene in einer bevorzugten Ausführungsforrn einkloniert sind. Weiterhin ist es im Rahmen eines derartigen Virus, dass auch die Region E4 funktional inaktiv ist, bevorzugterweise deletiert ist. Die hierin beschriebenen Transgene können dabei auch in die E4-Region kloniert werden, wobei dies alternativ oder ergänzend zum Klonieren der Transgene in die E3-Region erfolgen kann bzw. die E3-Region teilweise oder vollständig intakt bleibt. Transgene, wie hierein verwendet, können virale Gene, bevorzugterweise adenovirale Gene sein, die bevorzugterweise im Wildtyp-Adenovirus nicht im Genom bzw. an der Stelle im Genom vorkommen, an der sie in dem konkreten Virus nun vorliegen, oder therapeutische Gene.
Therapeutische Gene können dabei Prodrug-Gene, Gene für Zytokine, Apoptose-induzierende Gene, Tumorsuppressorgene, Gene für Metalloproteinasen-Inhibitoren und/oder Angiogenese- Inhibitoren sein. Ferner können siRNA, Aptameren, Antisense und Ribozyme exprimiert werden die gegen Krebs-relevante Zielmoleküle gerichtet sind. Bevorzugterweise ist das einzelne oder die mehreren Zielmoleküle aus der Gruppe ausgewählt, die Resistenz-relevante Faktoren, Anti- Apoptose-Faktoren, Onkogene, Angiogenese-Faktoren, DNA-Synthese-Enzyme, DNA- Reperaturenzyme, Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren,- Translcriptionsfaktoren, Metalloproteinasen, insbesondere Matrix-Metalloproteinasen, und Plasminogenaktivator vom Urokinase-Typ umfasst. Bevorzugte Ausfuhrungsformen .davon sind hierin bereits offenbart.
In einer Ausführungsform sind die Resistenz-relevanten Faktoren bevorzugt aus der Gruppe ausgewählt, die P-Glykoprotein, MRP und GST umfasst, und umfassen auch die dafür codierenden Nukleinsäuren. .
Mögliche Prodrug-Gene, wie sie in bevorzugten Ausführungsformen verwendet werden können, sind beispielsweise Cytosine deaminase, Thymidin kinase, Carboxypeptida.se, Uracil phosphoribosyltransferase; Purin Nukleosid Phosphorylase (PNP); Kirn et al, Trends in Molecular Medicine, Volume 8, No.4 (Suppl), 2002; Wybranietz W.A. et al., Gene Therapy, 8, 1654-1664, 2001; Niculescu-Duvaz et al., Curr. Opin. Mol. Therapy, 1, 480.486, 1999; Koyama et al., Cancer Gene Therapy, 7, 1015-1022, 2000; Rogers et al., Human Gene Therapy, 7, 2235- 2245, 1996; Lockert et al., Clinical Cancer Res., 3, 2075-2080, 1997; Vijayakrishna et al., J. Pharmacol. And Exp. Therapeutics, 304, 1280-1284, 2003.
Mögliche Zytokine, wie sie in bevorzugten Ausführungsformen verwendet werden können, sind beispielsweise GM-CSF, TNF-alpha, 11-12, 11-2, 11-6, CSF, Interferon-Gamma; Gene Therapy, Advances in Pharmacology, Volume 40, Editor: J. Thomas August, Academic Press; Zhang und Degroot, Endocrinology, 144, 1393-1398, 2003; Descamps et al., J. Mol. Med., 74, 183-189, 1996; Majumdar et al., Cancer Gene Therapy, 7, 1086-1099, 2000.
In einer Ausführungsform sind die Anti-Apopotose-Faktoren ausgewählt aus der Gruppe, die BCL2 umfasst, und umfassen auch die dafür codierenden Nukleinsäuren. In einer Ausführungsform sind die Onkogene ausgewählt aus der Gruppe, die Ras, insbesondere mutiertes Ras, Rb und Myc umfasst, und umfassen auch die dafür codierenden Nukleinsäuren. In einer Ausführungsform sind die Angiogenese-Faktoren ausgewählt aus der Gruppe, die VEGF und HMG-Proteine umfasst, und umfassen auch die dafür codierenden Nukleinsäuren. In einer Ausführungsform sind die DNA-Synthese-Enzyme ausgewählt aus der Gruppe, die Telomerase umfasst, und umfassen auch die dafür codierenden Nukleinsäuren. In einer Ausführungsform sind die DNA-Reparaturenzyme ausgewählt aus der Gruppe, die Ku-80 umfasst, und umfassen auch die dafür codierenden Nukleinsäuren. In einer Ausführungsform sind die Wachstumsfaktoren ausgewählt aus der Gruppe, die PDGF, EGF und M-CSF umfasst, und umfassen auch die dafür codierenden Nukleinsäuren In einer weiteren Ausfuhrungsform ist vorgesehen, dass die Rezeptoren insbesondere solche der Wachstumsfaktoren sind, wobei bevorzugterweise die Wachstumsfaktoren aus der Gruppe ausgewählt sind, die PDGF, EGF und M-CSF umfasst, und umfassen auch die dafür codierenden Nukleinsäuren. In einer Ausfuhrungsform sind die Transkriptionsfaktor ausgewählt aus der Gruppe, die YB-I umfasst, und umfassen auch die dafür codierenden Nukleinsäuren. In einer Ausfuhrungsforrn sind die Metalloproteinasen insbesondere Matrix-Metalloproteinasen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Matrix-Metalloproteinasen ausgewählt aus der Gruppe, die MMP-I und MMP-2 umfasst, und umfassen auch die dafür codierenden Nukleinsäuren. In einer AusführungsforiTi sind die Plasmüiogenaktivatoren vom Urokinase-Typ ausgewählt aus der Gruppe, die uPa-R umfasst, und umfassen auch die dafür codierenden Nukleinsäuren.
Mögliche Apoptose-induzierende Gene, wie sie in bevorzugten Ausführungsformen verwendet werden können, sind beispielsweise Decorin: Tralhao et al., FASEB J, 17, 464-466, 2003; Retinoblastoma 94: Zhang et al., Cancer Res.,63, 760-765, 2003; Bax und Bad: Zhang et al, Hum. Gene Ther., 20, 2051-2064, 2002; Apoptin: Noteborn und Pietersen, Adv. Exp. Med. Biol., 465, 153-161, 2000); ADP: Toth et al., Cancer Gene Therapy, 10, 193-200, 2003; bcl-xs: Sumantran et al., Cancer Res, 55, 2507-2512, 1995; E4orf4: Braithwaite und Russell, Apoptosis, 6, 359-370, 2001; FasL, Apo-1 und Trail: Boehringer Manheim, Guide to Apoptotic Pathways, Arai et al., PNAC, 94, 13862-13867, 1997; Bims; Yamaguchi et al., Gene Therapy, 10, 375-385, 2003; GNRl 63: Oncology News, 17 Juni, 2000, sind.
Mögliche Tumorsuppressor-Gene, wie sie in bevorzugten Ausführungsformen verwendet werden können, sind beispielsweise ElA, p53, pl6, p21, p27, MDA-7. Opalka et al., Cell Tissues Organs, 172, 126-132, 2002 , Ji et al., Cancer Res., 59, 3333-3339, 1999, Su et al., Oncogene, 22, 1164-1180, 2003.
Mögliche Angiogenese-Inhibitoren, wie sie in bevorzugten Ausführungsformen verwendet werden können, sind beispielsweise En dostatin, angiostatin : Hajitou et al., FASEB J., 16, 1802- 1804, 2002, und Antikörper gegen VEGF (Ferrara, N., Semin Oncol 2002 Dec; 29 (6 Suppl 16): 10-4. Mögliche Metalloproteinase-Inhibitoren, wie sie in bevorzugten Ausführungsformen verwendet werden können, sind beispielsweise Timp-3, Ahonen et al, Mol Therapy, 5, 705-715, 2002; PAI- 1; Söff et al., J. Clin. Invest., 96, 2593-2600, 1995 ; Timp-1, Brandt K. Curr. Gene Therapy, 2, 255-271, 2002.
Weitere Transgene im Sinne der vorliegenden Erfindung, die von den erfindungsgemäßen Viren exprimiert werden können, sind auch Tyrosinlcinase-Inhibitoren. Beispielhafte Tyrosinkinasen sind dabei der EGFR (epidermal growth factor receptor) [Onkologie, Entstehung und Progression maligner Tumoren; Verfasser: Christoph Wagner, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1999]. Ein bevorzugter Tyrosinkinase-Inhbitor is Herceptin [Zhang H et al., Cancer Biol Ther. 2003, Jul-Aug; 2 (4 Suppl 1): S 122-6].
siRNA (short interfering RNA) , wie sie im Rahmen der vorliegenden Erfmdunge verwendet werden kann, besteht aus zwei, bevorzugt zwei getrennten RNA-Strängen, die infolge Basenkomplementarität miteinander hybridisieren, d.h. im wesentlichen basengepaart vorliegen, und weist bevozugterweise eine Länge von bis zu 50 Nukleotiden auf, bevorzugterweise zwischen 18 und 30 Nukleotiden, bevorzugtererweise weiniger als 25 Nukleotide und am bevorzugtesten 21, 22 oder 23 Nukleotide, wobei sich diese Zahlenwerte auf einen Einzelstrang der siRNA, insbesondere auf die Länge des Bereiches eines Einzelstranges, der mit einem, genauer dem zweiten Einzelstrang hybridisiert bzw. basenpaart, beziehen. siRNA induziert oder vermittelt spezifisch den Abbau von rnRNA. Die dazu erforderliche Spezifität wird durch die Sequenz der siRNA und damit ihren Bindungsort vermittelt. Die abzubauende Zielsequenz ist dabei im wesentlichen komplementär zu dem ersten oder zu dem zweiten die siRNA aufbauenden Strang. Obwohl die genauen Wirkmechanismen noch unklar sind, wird vermutet, dass siRNA für Zellen eine biologische Strategie darstellt, während der Entwicklung bestimmte Allele zu hemmen und sich vor Viren zu schützen. Die durch siRNA vermittelte RNA- Interferenz wird als Verfahren zur spezifischen Unterdrückung oder gar völligen Ausschaltung der Expression eines Proteins durch Einbringen einer genspezifischen doppelsträngigen RNA benutzt. Für höhere Organismen ist eine 19 bis 23 Nukleotid lange siRNA deshalb besonders geeignet, weil sie nicht zur Aktivierung der unspezifischen Abwehrreaktion, zur sogenannten Interleukin- Antwort führt. Die direkte Transfektion von doppelsträngiger RNA aus 21 Nukleotiden mit symmetrischen 2-nt 3' Überhängen konnte eine RNA-Interferenz in Säugetierzellen vermitteln und zeigte im Vergleich zu anderen Technologien wie Ribozymen und Antisense-Molekülen eine hohe Effizienz (Elbashir, S. Harborth J. Lendeckel W. Yalvcin, A. Weber K Tuschl T: Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 2001, 411: 494-498). Nur wenige siRNA-Moleküle genügten, um die Expression des Zielgens zu unterdrücken. Um die Limitierungen exogen zugeführter siRNA, die insbesondere in der transienten Natur des Interferenz-Phänomens und der spezifischen Abgabe (engl, delivery) der siRNA-Moleküle liegen, zu umgehen, werden im Stand der Technik auch Vektoren eingesetzt, die eine endogene siRNA-Expression erlauben. Hierfür werden beispielsweise Oligonukleotide mit einer Länge von 64 Nukleotiden, die die 19 Nukleotide lange Zielsequenz einschließen, sowohl in sense- als auch in antisense- Orientierung, getrennt durch eine beispielsweise 9 Nukleotide lange Spacer-Sequenz, in den Vektor eingebaut. Das resultierende Transkript faltet sich zu einer Haarnadelstruktur mit einer Stammstruktur (engl.: stem) von beispielsweise 19 Basenpaaren. In der Zelle wird die Schleife rasch abgespaltet, so daß eine funktionelle siRNA entsteht (Brummelkamp et al., Science, 296, 550-553, 2002).
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Medikament, das zumindest einen Virus gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, m einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfmdungsgemäßen Viren zur Herstellung eines Medikaments. Dabei ist vorgesehen, dass das Medikament für die Behandlung von Tumoren und Krebserkrankungen bestimmt ist. Bei den Tumoren und Krebserkrankungen handelt es sich bevorzugterweise um die hierin beschriebenen. Bevorzugterweise handelt es sich bei den Tumoren und Krebserkrankungen um solche, die resistent sind bzw. eine Resistenz aufweisen. Bevorzugterweise ist die Resistenz eine solche wie sie hierin beschreiben ist, besonders bevorzugterweise eine Vielfachresistenz, eine Vielfachresistenz gegen Cytostatika und/oder gegen Bestrahlung. In einem weiteren Aspekt ist vorgesehen, dass das Medikament für die Wiederherstellung der Empfindlichkeit von Zellen gegenüber Cytostatika und/oder Bestrahlung ist, wobei die Zellen bevorzugterweise Tumorzellen sind, die eine Resistenz gegen Cytostatika und/oder Bestrahlung aufweisen. Bei der Wiederherstellung der Empfindlichkeit handelt es sich um einen Vorgang, der im englischen Sprachgebrauch auch als „restoration of drug sensitivity" bezeichnet wird.
In einer noch weiteren Ausführungsform ist dabei vorgesehen, dass das Medikament weiterhin mindestens eine pharmazeutisch wirksame Verbindung enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist dabei vorgesehen, dass die pharmazeutisch wirksame Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, die Zytokine, Metalloproteinase-Inhibitoren, Angiogenese-Inhibitoren, Cytostatika beispielsweise Irinotecan und CPT-Il gegen Kolorektalkarzinoma und Daunorubicin gegen Leukämien, Zellzyklus-Inliibitoren beispielsweise wie das CYC202, welches CDO/CyclinE-lάnasaktivität inhibiert und gegen Kolorektaltumore eingesetzt werden kann (McClue SJ, Int. J. Cancer 2002, 102, 463-468) und BAY 43-9006, welches Raf-1 inhibiert und beispielsweise gegen Mammacarcinoma wirksam ist (Wilhelm SM et al., Cancer Res. 2004, 64, 7099-7109), Proteosomen-Inhibitoren wie das PS-341, welches die 26S Proteasomenaktivität inhibiert und gegen Kopf- und Halsplattenepithelkarzinom eingesetzt wird (Fribley A et al., Mol Cell Biol 2004 Nov; 24(22): 9695-704), rekombinante Antikörper beispielsweise gegen den EGF-Rezeptor (Herceptin für Mammacarcinom und Prostatatumore; H.G. van der Poel, European Urology 2004, 1-17; Erbitux gegen Hals-Kopftumore; Bauman M et al., Radiother. Oncol., 2004, 72, 257-266) und Inhibitoren der Signaltransduktionskaskade wie das STI 571, welches unter anderem c-lcit reprimiert und gegen gastrointensinale Tumore eingesetzt werden kann (H.G. van der Poel, European Urology 2004, 45, 1-17), ABT-627, das ein Endothelininhibitor ist, der unter anderem gegen Prostatatumore eingeetzt werden kann (H.G. van der Poel, European Urology 2004, 45, 1-17), SU5416, welches die Phosphorylierung des VEGF-Tyrosinkinaserezeptor inhibiert und unter anderem gegen Glioblastom und Prostatakrebs eingesetzt werden kann (Bischof M et al Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2004; 60 (4): 1220-32), ZD 1839, welches die EGFR-Tyrosinaseaktivität inhibiert und unter anderem gegen Prostatatumore eingesetzt werden kann ( H.G. van der Poel, European Urology 2004, 45, 1-17); Rapamycin-Derivate wie beispielsweise CCI-779 und RADOOl, welche mTOR inhibieren und gegen Prostatatumore eingesetzt werden können. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die verschiedenen hierin beschrieben Adenoviren bzw. die hierin erfindungsgemäß zu verwendenen Adenoviren mit den vorstehend genannten Verbindungen grundsätzlich für eine jede Indikation verwendet werden können, die hierin im Zusammenhang damit beschrieben ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Indikation eine solche, wie sie für eine jede der vorstehend genannten pharmazeutisch wirksamen Verbindungen beschrieben ist.
Der vorliegende Erfinder hat weiterhin überraschend gefunden, dass die Wirksamkeit der hierin beschriebenen und insbesondere der erfindungsgemäß verwendeten Viren dadurch erhöht werden kann, dass er in Kombination mit mindestens zwei Mitteln verwendet wird, wobei ein jedes der mindestens zwei Mittel einzeln und unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, die Cytostatika umfasst. Die Mittel sind in einer bevorzugten Ausführungsform pharmazeutisch wirksame Verbindungen. Wie hierin in einer bevorzugten Ausflihrungsform verwendet sind Cytostatika insbesondere chemische oder biologische Verbindungen, die während oder nach der Verabreichung an eine Zelle oder einen Organismus, der eine oder diese Zelle enthält, dazu fuhren, dass die Zelle nicht mehr wächst und/oder sich nicht mehr teilt bzw. die Zellteilung und/oder das Zellwachstum verlangsamen. Cytostatika sind dabei auch solche Verbindungen, die erst in der Zelle oder in dem diese enthaltenden Organismus zu einem Cytostatikum im vorstehend beschriebenen Sinne werden. Insoweit umfasst der Begriff der Cytostatika auch Prä-Cytostatika.
Cytostatika werden bevorzugt nach ihrem Wirkmechanismus eingeteilt. Dabei werden die folgenden Gruppen unterschieden, die grundsätzlich alle im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können:
Alkylanzien, d.h. chemische Verbdinungen, die ihre zytotoxische Wirkung durch Alkylierung von Phosphat-, Amio-, Sulfhydryl-, Carboxyl- und Hydroxylgruppen der Nukleinsäure sowie Protein bedingen. Derartige Verbindungen wirken selbst oft kanzerogen. Typische Beispiele dieser Gruppe von Cytostatika sind Cisplatin bzw. Platin-Derivate, Cyclophosphamid, Dacarbazin, Mitomycin, Procarbazin.
Antimetabolite, d.h. Verbindungen, die aufgrund struktureller Ähnlichkeit oder Fähigkeit zur Bindung einen Stoffwechselprozess blockieren oder beeinträchtigen. Innerhalb der Gruppe der Antimetabolite unterscheidet man wiederum zwischen strukturähnlichen Antimetaboliten, strukturverändernden Antimetaboliten und den indirekt wirkenden Antimetaboliten. Bei den strukturähnlichen Antimetaboliten konkurrieren diese aufgrund chemischer Ähnlichkeit mit dem Metaboliten, ohne Übernahme dessen Funktion. Strukturverändernde Antimetaboliten binden den Metaboliten, was dessen Funktion oder Resorption verhindert oder den Metaboliten chemisch modifiziert. Indirekt wirkende Antimetaboliten beeinträchtigen die Funktion des Metaboliten, beispielsweise über Bindung von Ionen. Typische Beispiele dieser Gruppe sind Folsäureantagonisten wie z.B. Methotrexat, Pyrimidinanaloga wie z.B. Fluoruracil, Purinanaloga wie z.B. Azathioprin und Mercaptopurin.
Mitosehemmstoffe, d.h. die Zellteilung hemmen. Innerhalb der Gruppe der Mitosehemmstoffe erfolgt eine Unterscheidung in Zellteilungsgifte, Spindelgifte und Chromosomengifte. Typische Beispiels dieser Gruppe sind Taxane und Vinca-Alkaloide. Die Taxana können dabei wiederum in die beiden Hauptgruppen Taxole und Taxotere eingeteilt werden, wobei ein besonders bevorzugtes Taxol Paclitaxel ist und ein besonders bevorzugtes Taxoter Docetaxel ist.
Antibiotika mit hemmender Wirkung auf die DNA-abhängige RNA-Polymerase. Typische Beispiels dafür sind die Anthrazykline, so zum Beispiel Bleomycin, Daunorabicin, Doxorubicin und Mitomycin.
Topoisomerase-Hemmer, insbesondere Topoisomerase-I-Hemmer. Topoisomerase- Hemmer sind chemische Verbindungen, die die Tertiärstruktur der DNA bestimmen, indem sie in einem dreistufigen Prozess die Veränderung der DNA-Verweindungszahl katalysieren. Dabei werden im wesentlichen zwei Formen von Topoisomerasen unterschieden. Topoisomerasen vom Typ I spalten nur einen DNA-Strang und sind ATP-unabhängig, wohingegen Topoisomerasen vom Typ II beide Stränge einer DNA spalten, wobei diese ATP-abhängig sind. Typische Beispiele hierfür sind nϊnotecan und Topotecan für Topoisomerase-I- -Inhibitoren und Etoposid und Daunorubicin für Topoismerase II-Inhibitoren.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden mindestens eins und bevorzugterweise zwei Mittel aus der vorstehenden Gruppe ausgewählt, Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass insbesondere auch drei, vier oder fünf verschiedene Mittel ausgewählt werden. Die folgenden Ausführungen werden für die Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung gemacht, bei der lediglich ein und bevorzugterweise zwei Mittel zusammen mit dem Virus verwendet werden. Die Ausführungen gelten sinngemäß auch für die Ausführungsform, bei der mehr als zwei Mittel verwendet werden.
Bevorzugterweise unterscheiden sich die Mittel darin, dass sie an unterschiedlichen Zielmolkülen angreifen, oder in der Literatur als an verschiedene Moleküle angreifend beschrieben werden. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass das Mittel auch zwei oder mehr verschiedene Verbindungen umfasst, die an das gleiche Zielmolekül binden. Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass das eine Mittel an einem ersten Ort des Zielmoleküls bindet, während das zweite Mittel an einem zweiten Ort des Zielmoleküls bindet. Es ist ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass mindestens zwei der Mittel über einen unterschiedlichen Wirkmechanismus aktiv sind. Aktiv bedeutend in einer bevorzugten Ausfuhrungsform, dass die das Zellwachstum und/oder Zellteilung inhibierende oder verzögernde Wirkung der chemischen Verbindung jeweils über einen unterschiedlichen Wirkmecham'smus erfolgt aktiv ist. In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform bedeutet der Begriff aktiv, dass dadurch die Effizienz der Replikation eines Virus, insbesondere des erfindungsgemäßen Virus, der hierin beschriebenen Viren und/oder der hierin als erfindungsgemäß zu verwenden offenbarten Viren, erhöht wird verglichen mit einer Situation, bei der eines und/oder beide der Mittel nicht verwendet werden. Als Maß für die Effizienz der Replikation des Virus wird bevorzugterweise die Anzahl der für die Zelllyse erforderliche Anzahl von Viren angegeben, bevorzugtererweise ausgedrückt als pfü/Zelle.
In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform ist eines der mindestens zwei Mittel ein solches, das die Infizierbarkeit der Zelle, in der die Replikation des Virus erfolgen soll, bevorzugt selektiv erfolgen soll, mit dem Virus, bevorzugterweise dem hierin beschriebenen Virus und/oder dem hierin erfindungsgemäß zu verwendenden Virus, erhöht. Dies kann beispielweise dadurch erfolgen, dass die Aufnahme des Virus durch die Zelle erhöht wird. Die Aufnahme des Virus, insbesondere von Adenovirus, wird beispielsweise durch den Coxsackievirus-Adenovirus Rezeptor vermittelt (CAR) (Mizuguchi und Hayakawa, GENE 285, 69-77, 2002) vermittelt. Eine erhöhte Expression von CAR wird beispielsweise durch Trichostatin A bedingt (Vigushin et al., Clinical Cancer Research, 7, 971-976, 2001).
In einer weiteren Ausfuhrungsform ist eines der mindestens zwei Mittel ein solches, welches die Verfügbarkeit einer Komponente innerhalb der Zelle erhöht, wobei die Komponente eine solche ist, die die Replikation des Virus, bevorzugterweise des hierin beschriebenen Virus und/oder des hierin erfindungsgemäß zu verwendenden Virus, erhöht.
In einer weiteren Ausführungsform ist eines der mindestens zwei Mittel ein solches, welches den Transport von YB-I in den Zellkern vermittelt. Ein derartiges Mittel kann aus der Gruppe ausgewählt sein, die Topoisomerase-Hemmer, Alkylanzien, Antimetabolite und Mitose- Hemmstoffe umfasst. Bevorzugte Topoisomerase-Hemmer sind Camptothecin, ϊrinotecan, Etoposide und deren jeweilige Analoga. Bevorzugte Mitose-Hemmstoffe sind Daunorubicin, Doxorubicin Paclitaxel und Docetaxel. Bevorzugte Alkylanzien sind Cisplatin und deren Analoga. Bevorzugte Antimetabolite sind Fluoruracil und Methotrexat. In einer besonders bevorzugten Ausfϊihrungsform ist das eine der mindestens zwei Mittel ein solches, das die Infizierbarkeit der Zelle erhöht, insbesondere die Expression von CAR erhöht, und das zweite der mindestens zwei Mittel ein solches, das den Transport von YB-I in den Zellkern erhöht, wobei bevorzugtererweise als chemische Verbindung eine solche verwendet wird, die die entsprechende erforderliche Eigenschaft aufweist, wie bevorzugt vorstehend erwähnt. Ein Beispiel für eine die Expression von CAR erhöhende Verbindungsklasse sind die Histon-Deacetylase-Inhibitoren und ein Beispiel für eine den Transport von YB-I in den Zellkern erhöhende Verbindungsklasse sind die Topoisomerase-Hemmer.
In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform ist das eine der mindestens zwei Mittel ein Histon-Deacylase-Inhibitor und das andere der mindestens zwei Mittel ein Topoismerase- Inhibitor.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass das eine der mindestens zwei Mittel ein Histon-Deacylase-Inhibitor ist. Ein bevorzugter Histon-Deacylase-Inhibitor ist ein solcher, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die Trichostatin A, FR901228, MS-27-275, NVP-LAQ824 und PXDlOl umfasst. Trichostatin A ist beispielsweise beschrieben in Vigushin et al., Clinical Cancer Research, 7, 971-976, 2001; FR901228 ist beispielsweise beschrieben in Kitazono et al., Cancer Res., 61, 6328-6330, 2001; MS-27-275 beschrieben in Jaboin et al., Cancer Res., 62, 6108-6115, 2002; PXDlOl beschrieben in Plumb et al., Mol. Cancer Ther., 8, 721-728, 2003; NVP-LAQ824 beschrieben in Atadja et al., Cancer Res., 64, 689-695, 2004.
In einer Ausfuhrungsform ist vorgesehen, dass mindestens ein Mittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die Trichostatin A (gegen Glioblatom, Kim JH et al., Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 2004, 59, 1174-1180), FR 901228 (gegen Pankreastumore, Sato N et al., Int. J. Oncol. 2004, 24, 679-685; MS-27-275 (gegen Prastatatumore; Camphausen K et al., Clinical Canver Research 2004, 10, 6066-6071), NVP-LAQ824 (gegen Leukämien; Nimmanapalli R et al., Cancer Res.
2003, 63, 5126-5135; PXDlOl (gegen Ovarialtumore, Plumb JA et al, Mol. Cancer Ther. 2003, 2, 721-728) Scriptaid (gegen Mammakarzinome, Keen JC et al., Breast Cancer Res. Treat. 2003, 81, 177-186), Apicidin (gegen Melanom, Kim SH et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.
2004, 315, 964-970) und CI-994 (gegen verschiedene Tumore, Nemunaitis JJ et al., Cancer J. 2003, 9, 58-66) umfasst. Die Wirkungsweise von Histondeacetylaseinhibitoren ist beschrieben unter anderem in Lindemann RK et al., Cell Cycle 2004, 3, 77-86. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die verschiedenen hierin beschrieben Viren bzw. die hierin erfindungsgemäß zu verwendenen Viren mit den vorstehend genannten Verbindungen grundsätzlich für eine jede Indikation verwendet werden können, die hierin im Zusammenhang damit beschrieben ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Indikation eine solche, wie sie für eine jede der vorstehend genannten pharmazeutisch wirksamen Verbindungen beschrieben ist.
In einer noch weiteren Ausfuhrungsform ist vorgesehen, dass das eine der mindestens zwei Mittel ein Topoisomerase-Inhibitor, bevorzugterweise in Topoisomerase I-Inhibitor ist. Ein bevorzugter Topoismerase-Inhibitor ist ein solcher, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die Camptothecine, Mnotecan, Topotecan, SN-38, 9-Aminocamptothecin, 9-Nitrocamptothecin DX- 895If und Daunorubicin umfasst. Irinotecan und SN-38 ist beispielsweise beschrieben in Gilbert et al., Clinical Cancer Res., 9, 2940-2949, 2003; DX-895IF ist beschrieben in van Hattum et al, British Journal of Cancer, 87, 665-672, 2002; Camptothecin beschrieben in Avemann et al., Mol. Cell. Biol., 8, 3026-3034, 1988; 9-Aminocamρtothecin, und 9-Nitrocamρtothecin sind beschrieben in Rajendra et al., Cancer Res., 63, 3228-3233, 2003; Daunorubicin ist beschrieben in M. Binaschi et al., Mol. Pharmacol., 51, 1053-1059.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Topoisomerase-Inhibitor aus der Gruppe ausgewählt ist, die Camptothecin, Irinotecan, Topotecan, DX-895K, SN-38, 9- Aminocamptothecin, 9-Nitrocamptothecin, Etoposid und Daunorubicin umfasst. Diese können gegen verschiedene Tumore eingsetzt werden beispielsweise Kolorektaltumore, Pankreastumore, Ovarialkarzinome und Prostatakarzinome. Die Anwendungsgebiete sind beschrieben unter anderem bei Recchia F et al., British J. Cancer 2004, 91, 1442-1446; Cantore M et al., Oncology 2004, 67, 93-97; Maurel J. et al., Gynecol. Oncol 2004, 95, 114-119; Amin A. et al., Ural. Oncol. 2004, 22, 398-403; Kindler HL et al., Invest. New Drugs 2004, 22, 323-327, Ahmad T. et al., Expert Opin. Pharmacother. 2004, 5, 2333-2340; Azzariti A. et al., Biochem Pharmacol. 2004, 68, 135-144; Le QT et al., Clinical Cancer Res. 2004, 10, 5418-5424. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die verschiedenen hierin beschrieben Viren bzw. die hierin erfindungsgemäß zu verwendenen Viren mit den vorstehend genannten Verbindungen grundsätzlich für eine jede Indikation verwendet werden können, die hierin im Zusammenhang damit beschrieben ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Indikation eine solche, wie sie für eine jede der vorstehend genannten pharmazeutisch wirksamen Verbindungen beschrieben ist. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform eines jeglichen Aspektes der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass das weitere pharmazeutische Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe, die Zytokine, Metalloproteinase-Inhibitoren, Angiogenese-Inhibitoren, Zytostatika wie beispielsweise Mnotecan und CPT-Il gegen Kolorektalkarzinoma und Daunorubicin gegen Leukämien, Zellzyklus-Inhibitoren wie beispielsweise das CYC202, welches CDK2/CyclinE- kinasaktivität inhibiert und gegen Kolorektaltumore eingesetzt werden kann (McClue SJ, Int. J. Cancer 2002, 102, 463-468), und BAY 43-9006, welches Raf-1 inhibiert und beispielsweise gegen Mammacarcinoma wirksam ist (Wilhelm SM et al., Cancer Res. 2004, 64, 7099-7109), Proteosomen-Inhibitoren wie das PS-341, welches die 26S Proteasomenaktivität inhibiert und gegen Gehirntumore eingesetzt wird (Yin D. et al., Oncogene 2004), rekombinante Antikörper beispielsweise gegen den EGF-Rezeptor (Herceptin für Mammacarcinom und Prostatatumore; H.G. van der Poel, European Urology 2004, 1-17; Erbitux gegen Hals-Kopfrumore; Bauman M et al., Radiother. Oncol., 2004, 72, 257-266) und Inhibitoren der Signaltransduktionskaskade wie das STI 571, welches unter anderem c-kit reprimiert und gegen gastrointensinale Tumore eingesetzt werden kann (H.G. van der Poel, European Urology 2004, 45, 1-17) , ABT-627, ein Endothelininhibitor, welcher unter anderem gegen Prostatatumore eingesetzt werden kann ( H.G. van der Poel, European Urology 2004, 45, 1-17), SU5416 welches die Phosphorylierung des VEGF-Tyrosinkinaserezeptor inhibiert und unter anderem gegen Hals/Kopftumore eingesetzt werden kann (Cooney et al., Cancer Chemother. Pharmacol 2004), ZD 1839, welches die EGFR- Tyrosinaseaktivität inhibiert und unter anderem gegen Prostatatumore eingesetzt werden kann (H.G. van der Poel, European Urology 2004, 45, 1-17); Rapamycin-Derivate wie beispielsweise CCI-779 und RADOOl, welche mTOR inhibieren und gegen Prostatatumore eingesetzt werden können (H.G. van der Poel, European Urology 2004, 45, 1-17) umfasst. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die verschiedenen hierin beschrieben Viren bzw. die hierin erfindungsgemäß zu verwendenen Viren mit den vorstehend genannten Verbindungen grundsätzlich für eine jede Indikation verwendet werden können, die hierin im Zusammenhang damit beschrieben ist. In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform ist die Indikation eine solche, wie sie für eine jede der vorstehend genannten pharmazeutisch wirksamen Verbindungen beschrieben ist.
In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das erfindungsmäße Medikament und/oder das erfindungsgemäß hergestellte Medikament den Virus getrennt von einem oder mehreren des mindestens einen und bevorzugterweise mindenstens zwei Mittel, die mit dem Virus erfindungsgemäß kombiniert sind, enthält. Bei den Mitteln handelt es sich bevorzugterweise um pharmazeutisch aktive Verbindungen. Dabei ist bevorzugt, dass der Virus von einem jeglichen Mittel, das mit dem Virus kombiniert wird, getrennt. Bevorzugterweise ist die Trennung eine räumliche Trennung. Die räumliche Trennung kann dabei so erfolgen, dass der Virus in einer anderen Verpackung vorliegt als das/die Mittel. Bevorzugterweise handelt es sich bei der Verpackung um eine Einzeldose, d.h. der Virus und das/die Mittel sind in Einzeldosen verpackt. Die Einzeldosen können wiederum zu einer Packung zusammengefasst sein. Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Einzeldosen des Virus mit einer oder mehreren Einzeldosen eines oder mehrerer der Mittel kombiniert oder verpackt ist.
Die Art der Verpackung hängt in der den Fachleuten auf dem Gebiet bekannten Art von der Art der Verabreichung ab. Bevorzugterweise wird der Virus als Lyophilisat oder in einer geeigneten flüssigen Phase vorliegen. Bevorzugterweise werden die Mittel in fester Form vorliegen, z.B. als Tabletten oder Kapseln, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Alternativ können die Mittel auch in flüssiger Form vorliegen.
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass der Virus systemisch oder lokal verabreicht wird. Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die mit dem Virus kombinierten Mittel einzeln unabhängig voneinander oder gemeinsam systemisch oder lokal verabreicht werden. Den Fachleuten auf dem Gebiet sind weitere Verabreichungsformen bekannt.
Es ist weiterhin im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass der Virus und das/die mit ihm kombinierten Mittel zeitlich getrennt oder gleichzeitig verabreicht wird/werden. Bei zeitlich getrennter Verabreichung ist es bevorzugt, dass das/die Mittel vor der Verabreichung des Virus verabreicht werden. Die Zeitspanne, wie lange vorher das/die Mittel vorher verabreicht wird/werden, hängt von der Art des/der verwendeten Mittel ab und ergibt sich für den Fachmann aus der Wirkungsweise des/der verwendeten Mittel. Dabei kann auch im Falle der Verabreichung des Virus in Kobination mit mindestens zwei Mitteln die Verabreichung der mindestens zwei Mittel wiederum gleichzeitig oder zu unterschiedlichen Zeitpunkten erfolgen. Bei zeitlich unterschiedlicher Verabreichung ergeben sich die Zeitpunkte wiederum aus den den Mitteln zugrundeliegenden Wirkmechanismen und können von den Fachleuten auf der Grundlage davon festgelegt werden. Die vorstehenden Ausführungen, die im Zusammenhang mit den Medikamenten gemäß der vorliegenden Erfindung, die hierin auch als pharmazeutische Zusammensetzungen offenbart und/oder bezeichnet werden, gemacht werden, gelten sinngemäß auch für eine jegliche Zusammensetzung, so auch für Zusammensetzungen, wie sie erfindungsgemäß für die Replikation von Viren verwendet werden, bevorzugterweise für die in vitro Replikation von Viren. Die vorstehenden Ausführungen gelten auch für den erfindungsgemäßen Kit bzw. den erfindungsgemäß verwendeten Kit, der neben der hierin beschrieben Viren bzw. den erfindungsgemäß verwendeten Viren, auch ein oder eine Kombination von Mitteln, wie hierin beschrieben, umfassen kann. Derartige Kits umfassen den Virus und/oder das oder die Mittel in einer für die Anwendung fertigen Form und bevorzugterweise noch eine Gebrauchsanweisung. Weiterhin gelten die hierin gemachten Ausführungsformen zu einem Aspekt ganz allgemein für alle anderen Aspekte der vorliegenden Erfindung und insbesondere die Ausführungen zu den erfindungsgemäßen Viren auch für die gemäß der vorliegenden Erfindung erfindungsgemäß zu verwendenden, hierin beschriebenen oder offenbarten Viren, Nukleinsäuren und die erfindungsgemäß verwendeten Nukleinsäuren, und die erfindungsgemäßen Replikationssysteme und die dafür codierenden Nukleinsäuren bzw. die erfindungsgemäß verwendeten Replikationssysteme und die erfindungsgemäß verwendeten dafür codierenden Nukleinsäuren und vice versa.
Bei dem Medikament, im Rahmen dessen oder bei dessen Herstellung die hierin beschriebenen Viren, insbesondere Adenoviren, erfindungsgemäß verwendet werden, ist vorgesehen, dass dieses in der Regel systemisch appliziert wird, gleichwohl es auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist, wenn dieses lokal appliziert oder abgegeben wird. Die Applikation erfolgt mit der Absicht, dass insbesondere jene Zellen mit dem Virus infiziert werden und insbesondere darin eine Replikation der Viren erfolgt, bei denen eine Beteiligung, bevorzugter Weise kausal, an der Ausbildung eines Zustandes, typischerweise einer Erkrankung, vorliegt, zu deren Diagnose und/oder Prävention und/oder Behandlung das erfmdungsgemäße Medikament verwendet wird oder verwendet werden kann.
Ein derartiges Medikament ist bevorzugter Weise für die Behandlung von Tumorerkrankungen vorgesehen. Dabei sind, wie hierin noch detaillierter ausgeführt, jene Tumorerkrankungen besonders bevorzugt, bei denen entweder YB-I bereits im Zellkern infolge des der Tumorerkrankung zugrundeliegenden Mechanismus, insbesondere des zugrundeliegenden pathologischen Mechanismus, vorliegt, dereguliertes YB-I aufweisen, oder aber durch äußere Maßnahmen die Anwesenheit von YB-I im Zellkern bedingt wird, wobei die Maßnahmen geeignet sind, YB-I in den Zellkern zu transferieren, dort zu induzieren oder dort zu exprimieren. Der Begriff Tumor oder Tumorerkrankung soll hierbei sowohl maligne wie benigne Tumoren und entsprechende Erkrankungen bezeichnen. Dabei kann vorgesehen sein, dass das Medikament mindestens eine weitere pharmazeutisch wirksame Verbindung enthält. Die Art und der Umfang dieser weiteren pharmazeutisch aktiven Verbindungen wird dabei von der Art der Indikation abhängen, für die das Medikament eingesetzt wird. Im Falle der Verwendung des Medikamentes für die Behandlung und/oder die Prophylaxe von Tumorerkrankungen werden, sind aber nicht darauf beschränkt, typischerweise Zytostatika, wie beispielsweise cis-Platin und Taxol, Daunoblastin, Daunorubicin, Adriamycin (Doxorabicin) und/oder Mitoxantron oder andere der hierin beschriebenen Zytostatika oder Gruppen von Zytostatika verwendet.
Das erfindungsgemäße Medikament kann dabei in verschiedenen Formulierungen vorliegen, bevorzugter Weise in einer flüssigen Form. Weiterhin wird das Medikament Hilfsstoffe wie Stabilisatoren, Puffer, Konservierungsstoffe und dergleichen enthalten, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Galenik bekannt sind.
Der vorliegende Erfinder hat überraschenderweise festgestellt, dass die erfindungsgemäßen Viren mit besonders großer Erfolgsrate bei solchen Tumoren verwendet werden kann, bei denen YB-I unabhängig vom Zellzyklus im Zellkern vorkommt und solchen Tumoren, die dereguliertes YB-I aufweisen. Normalerweise ist YB-I im Cytoplasma, insbesondere auch im perinukleären Plasma, vorhanden. In der S-Phase des Zellzyklus findet sich YB-I im Zellkern von sowohl normalen wie auch Tumorzellen. Dies ist jedoch nicht ausreichend, um eine virale Onkolyse unter Verwendung derartiger modifizierten Adenoviren zu bewerkstelligen. Die im Stand der Technik beschriebene, vergleichsweise geringe Wirksamkeit von derartigen attenuierten Adenoviren beruht letztlich auf deren fehlerhaften Anwendung. Mit anderen Worten, es können derartige adenovirale Systeme, insbesondere auch mit einer größeren Wirksamkeit dort eingesetzt werden, wo die molekularbiologischen Voraussetzungen für eine virale Onkolyse unter Verwendung dieser, hierin beschriebenen attenuierten oder modifizierten Adenoviren gegeben sind. Diese Voraussetzungen liegen bei den vorstehend beschriebenen Tumorerkrankungen vor, d. h. bei solchen Tumorerkrankungen, deren Zellen eine vom Zellzyklus unabhängige Kernlokalisation von YB-I oder dereguliertes YB-I aufweisen. Diese Form der Kernlokalisation kann dabei durch die Art des Tumors selbst bedingt sein, oder aber durch die hierin beschriebenen erfindungsgemäßen Agenzien, einschließlich der hierin .beschriebenen Viren, oder Maßnahmen bewirkt werden. Die vorliegende Erfindung definiert somit eine neue Gruppe von Tumoren bzw. Tumorerkrankungen und damit auch von Patienten, die mit den erfindungsgemäßen Viren, besonders aber auch mit den im Stand der Technik bereits beschriebenen attenuierten oder modifizierten Adenoviren, noch wirksam behandelt werden können.
Ohne im Folgenden daran gebunden zu sein, scheint es sich bei dem „deregulierten" YB-I um ein überexprimiertes oder phosphoryliertes YB-I zu handeln. Dies gründet sich auf den folgenden Gegebenheiten. Akt, das eine Serin/Threonm-Kinase ist, fördert das Wachstum von Tumorzellen durch Phosphorylierung von Transkriptionsfaktoren und Zellzyklusproteinen (Nicholson KM and Anderson NG, Cell. Signal., 14, 381-395, 2002). Zusätzlich hat man festgestellt, dass aktiviertes Akt (phosphoryliertes Akt) positiv mit der Proteinexpression von YB-I korreliert und dass Akt an YB-I bindet und dieses an der Position Ser 102 der CoId- Shock-Domäne phosphoryliert (Sutherland BW et al., Oncogene, 24, 4282-4292, 2005). Dies zeigt an, dass es Signaltransduktionswege gibt, die die subzelluläre Lokalisation von YB-I ändern und als solches direkt seine Funktion. Zusätzlich erhöht diese Phosphorylierung die Produtktion von Proteinen wie beispielsweise MDR und MRP, die an Stressantwort, Zeilproliferation und onkogener Transformation beteiligt sind (Evdokimova V et al., Molecular and Cellular Biology, 26, 277-292, 2006). Die Phosphorylierung von YB-I durch Akt schwächt jedoch auch seine Cap-Bindungsfähigkeit, wodurch eine translationeile Aktivierung von stummen mRNA-Spezies erleichtert wird (Evdokimova V et al., Molecular and Cellular Biology, 26, 277-292, 2006). Da Akt nicht in normalen Zellen aktiv ist, liegt YB-I nicht in der phosphorylierten Form vor, wohingegen YB-I in derartigen Zellen dereguliert, d. h. phosphoryliert und/oder überexprimiert vorliegt.
Eine weitere Gruppe von Tumoren bzw. Tumorerkrankungen und damit von Patienten, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Viren und damit des diese enthaltenden Medikamentes behandelt werden kann, sind jene, bei denen durch Anlegen oder Realisieren bestimmter Bedingungen gewährleistet wird, dass YB-I in den Kern wandert oder dort induziert oder dorthin transportiert wird, einschließlich unter Verwendung der erfindungsgemäßen oder der erfindungsgemäß verwendeten Viren. Diese Verwendung der Viren bei diesen Tumoren bzw. dieser Patientengruppe beruht insoweit auf der Erkenntnis, dass die Induktion der viralen Replikation auf der Kernlokalisation von YB-I mit anschließender Bindung von YB-I an den E2-late-Promotor beruht. Dies gilt auch für solche Zellen, die YB-I Kern-positiv sind und/oder in Zellen, in denen YB-I dereguliert im Sinne der vorliegenden Erfindung vorliegt. Insoweit können die erfmdungsgemäßen Adenoviren erfmdungsgemäß für die Behandlung von
Erkrankungen bzw. Patientengruppen verwendet werden, die Zellen mit diesen Eigenschaften aufweisen, insbesondere dann, wenn diese Zellen an der Ausbildung der jeweiligen zu behandelnden Erkrankung beteiligt sind. Eine weitere Gruppe von Patienten, die unter
Verwendung derartiger Viren, insbesondere Adenoviren, behandelbar sind, sind somit solche, die YB-I Kern-positiv sind und/oder YB-I Kern-positiv sind als Ergebnis der nachfolgend beschriebenen Behandlungen und/oder solche Patienten, die eine der hierin beschriebenen
Maßnahmen, bevorzugt im Sinne einer Behandlung, erfahren haben oder mit der Gabe der erfindungsemäßen Viren erfahren. Dabei ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass
YB-I Kern-positive Patienten solche Patienten sind, die insbesondere in einer Anzahl der einen
Tumor ausbildenden Zellen YB-I unabhängig vom Zellzyklus im Kern aufweisen. Zu diesen
Maßnahmen gehört die Verabreichung von Cytostatika, wie sie hierin insgesamt beschrieben sind und/oder im Rahmen einer Tumortherapie verwendet werden. Weiterhin gehört zu dieser
Gruppe von Maßnahmen Bestrahlung, insbesondere eine Bestrahlung, wie sie im Rahmen einer
Tumortherapie angewandt wird. Bestrahlung bedeutet dabei insbesondere die Bestrahlung mit energiereicher Strahlung, bevorzugterweise mit radioaktiver Strahlung, bevorzugtererweise wie sie im Rahmen einer Tumortherapie verwendet wird. Eine weitere Maßnahme stellt
Hyperthermie bzw. das Anlegen von Hyperthermie dar, bevorzugterweise Hyperthermie, wie sie im Rahmen einer Tumortherapie verwendet wird. In einer ganz besonders bevorzugten
Ausführungsform ist dabei vorgesehen, dass die Hyperthermie lokal angewandt wird. Schließlich ist eine weitere Maßnahme die Hormonbehandlung, insbesondere die Hormonbehandlung, wie sie bei der Tumorbehandlung zur Anwendung gelangt. Im Rahmen einer derartigen
Hormonbehandlung werden Anti-Östrogene und/oder Anti-Androgene verwendet. Dabei werden
Anti-Östrogene, wie beispielsweise Tamoxifen, insbesondere bei der Therapie von Brustkrebs verwendet und Anti-Androgene, wie beispielsweise Flutamid oder Cyproteronacetat, bei der
Therapie von Prostatakrebs verwendet.
Dabei ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, wenn zumindest einige der den Tumor aufbauenden Zellen YB-I entweder inhärent oder nach Induktion bzw. aktivem Einfuhren in den Kern dort aufweisen oder aber hinsichtlich YB-I dereguliert im- Sinne der vorliegenden Offenbarung vorliegt. Bevorzugterweise sind etwa 5 % oder ein jeglicher Prozentsatz darüber, d. h. 6 %, 7 %, 8 % etc. der den Tumor aufbauenden Zellen derartige YB-I Kern-positive Zellen oder Zellen, in denen YB-I dereguliert vorliegt. Die Kernlokalisation von YB-I kann durch Stress von außen bzw. lokal appliziertem Stress induziert werden. Diese Induzierung kann beispielsweise durch Bestrahlung, insbesondere UV-Bestrahlung, Anwendung von Zytostatika, wie sie unter anderem hierin ebenfalls offenbart sind, und Hyperthermie erfolgen. Im Zusammenhang mit Hyperthermie ist beachtlich,, dass diese zwischenzeitlich sehr spezifisch, insbesondere örtlich spezifisch, realisiert werden kann und somit ebenfalls spezifisch einen Kerntransport von YB-I in den Zellkern bedingen kann und infolgedessen die Voraussetzungen für eine Replikation des Adenovirus und damit einer Zell- und Tumorlyse, die bevorzugt lokal beschränkt erfolgt, gegeben sind (Stein U, Jurchott K, Walther W, Bergmann S, Schlag PM, Royer HD. J Biol Chem. 2001,276(30):28562-9; Hu Z, Jin S, Scotto KW. J Biol Chem. 2000 Jan 28; 275(4):2979-85; Ohga T, Uchiumi T, Makino Y, Koike K, Wada M, Kuwano M, Kohno K. J Biol Chem. 1998, 273(11):5997-6000).
Hinsichtlich der Art bzw. Eigenschaft der Zellen, zu deren Lyse die hierin beschriebenen Adenoviren erfmdungs gemäß verwendet werden, ist vorgesehen, dass diese in einer Ausfuhrungsform eine Resistenz, bevorzugterweise eine Mehrfach- oder Vielfach-Resistenz zeigen. Resistenz, wie hierin verwendet, bezeichnet dabei bevorzugterweise eine Resistenz gegen Zytostatika und insbesondere die hierin beschriebenen Zytostatika und/oder Bestrahlung. Diese Mehrfach-Resistenz geht bevorzugterweise mit der Expression, bevorzugter Weise einer Überexpression, des membranständigen Transportproteins P-Glycoprotein einher, welches als Marker für die Bestimmung entsprechender Zellen und damit auch von Tumoren bzw. entsprechenden Patientengruppen herangezogen werden kann. Der Begriff Resistenz, wie er hierin verwendet wird, umfasst dabei sowohl die auch als klassische Resistenz bezeichnete, durch das P-Glycoprotein vermittelte Resistenz, wie auch die auch als atypische Resistenz bezeichnete Resistenz, die durch MRP vermittelte oder andere, nicht-P-Glycoprotein vermittelte Resistenzen umfasst. Weitere Resistenzen, wie sie hierin bezeichnet werden und für die erfindungsgemäß zu behandelnden Tumoren bzw. Patienten charakteristisch sind, sind solche die durch die folgenden Gene vermittelt werden, sind aber nicht auf diese beschränkt: MDR, MRP, Topoisomerase, BCL2, Glutathion-S-Transferase (GST), Proteinkinase C (PKC). Da die Wirkung von Zytostatika unter anderem auf der Induktion der Apoptose beruht, spielt die Expression von Apoptose-relevanten Genen bei der Ausbildung der Resistenz eine bedeutende Rolle, so dass auch die folgenden Faktoren diesbezüglich relevant sind, nämlich Fas, die BCL2- Familie, HSP 70 und EGFR [Kim et al., Cancer Chemther. Pharmacol. 2002, 50, 343-352]. Ein weiterer Marker, der mit der Expression von YB-I korreliert, ist die Topoisomerase II alpha. Insoweit kann in einem Screening-Verfahren, um zu bestimmen, ob ein Patient mit den hierin beschriebenen Viren erfmdungsgemäß mit Aussicht auf Erfolg behandelt werden kann, an Stelle von der bzw. in Ergänzung zur Bestimmung von YB-I im Kern oder von dereguliertem YB-I die Expression von Topoisomerase II alpha oder einer der anderen hierin beschreibenen Marker herangezogen werden. Ein Marker, der grundsätzlich ähnlich wie das P-Glycoprotein verwendet werden kann, ist MRP. Ein weiterer Marker, zumindest in dem Umfang, als dass colorectrale Karzinomzellen oder Patienten mit einem Colorectalcarcinom betroffen sind bzw. identifiziert werden (können), ist PCNA (engl, proliferating cell nuclear antigen (Hasan S. et al, Nature, 15, 387-391, 2001.), wie beispielsweise beschrieben von Shibao K. et al. (Shibao K et al., Int. Cancer, 83, 732-737, 1999). Schließlich ist, zumindest für den Bereich der Brustkrebs- und Osteosarcoma-Zellen die Expression von MDR (engl, multiple drug resistance) ein Marker im vorstehend beschriebenen Sinne (Oda Y et al., Clin. Cancer Res., 4, 2273-2277, 1998). Ein weiterer möglicher Marker, der erfindungsgemäß verwendet werden kann, ist p73 (Kamiya, M., Nakazatp, Y., J Neurooncology 59, 143-149 (2002); Stiewe et al., J. Biol. Chem., 278, 14230- 14236, 2003).
Es ist somit ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass auch jene Patienten unter Anwendung der erfindungsgemäßen Verwendung der Adenoviren, wie hierin beschrieben, therapiert werden können, die ansonsten im medizinisch-klinischen Sinne infolge der Entwicklung einer der vorstehend beschriebenen Resistenzen gegen Zytostatika und/oder Bestrahlung als „austherapiert" gelten und somit eine weitgehende Behandlung der Tumorerkrankung nach den Methoden des Standes der Technik mit Aussicht auf Erfolg nicht mehr möglich ist, insbesondere die Verwendung von Zytostatika oder Bestrahlung sinnvoller Weise nicht mehr möglich ist bzw. nicht mehr erfolgreich durchgeführt werden kann im Sinne einer Beeinflussung bzw. Verringerung des Tumors. Der Begriff des Tumors bezeichnet hierin allgemein auch eine jegliche Tumor- oder Krebserkrankung, die entweder inhärent YB-I im Zellkern oder dereguliertes YB-I enthält oder aber durch Realisieren exogener Maßnahmen, wie hierin offenbart, YB-I im Zellkern, bevorzugterweise unabhängig vom Zellzyklus, aufweist.
Weiterhin können die hierin beschriebenen Viren zur Behandlung grundsätzlich von Tumoren verwendet werden.
Die Tumoren, die durch die hierin beschriebenen Viren insbesondere behandelt werden können, sind bevorzugterweise auch jene Tumoren, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die Tumore des Nervensystems, okulare Tumoren, Tumore der Haut, Tumore der Weichteile, gastrointestinale Tumore, Tumore des respiratorischen Systems, Tumore des Skeletts, Tumore des endokrinen Systems, Tumore des weiblichen Geschlechtssystem, Tumore der Mammadrüse, Tumore des männlichen Geschlechtssystems, Tumore des harnableitenden Systems, Tumore des haematopoetischen Systems sowie vermischte und embryonale Tumore umfasst. Dabei ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass es sich bei diesen Tumoren insbesondere um resistente Tumoren handelt, wie insbesondere hierin definiert.
Die Gruppe der Tumore des Nervensystems umfasst dabei bevorzugterweise:
1. Tumore der Schädelhöhle sowie des Gehirns (Mracranium), bevorzugtererweise Astrozytom, Oligodendrogliom, Menigiom, Neuroblastom, Ganglioneurom, Ependymom, Schwannom, Neurofibrom, Hemangioblastom, Lipom, Craniopharyngiom, Teratom und Chondrom;
2. Tumore des Rückenmarkes und des Wirbelkanals, bevorzugtererweise Glioblastom, Meningiom, Neuroblastom, Neurofibrom, Osteosarkom, Chondrosarkom, Hemangiosarkom, Fibrosarkom und multiple Myelome; und
3. Tumore der peripheren Nerven, bevorzugtererweise Schwannom, Neurofibrom, Neurofibrosarkom und perineurale Fibroblastome.
ie Gruppe der okularen Tumore umfasst dabei bevorzugterweise:
1. Tumore der Augenlider und der Liddrüsen, bevorzugtererweise Adenom, Adenokarzinom, Papillom, Histiozytom, Mastzelltumor, Basalzelltumor, Melanom, Plattenepithelkarzinom, Fibrom und Fibrosarkom;
2. Tumore der Konjunktiven und der Nickhaut, bevorzugtererweise Plattenepithelkarzinom, Hemangiom, Hemangiosarkom, Adenom, Adenokarzinom, Fibrosarkom, Melanom und Papillom; und
3. Tumore der Orbita, des Nervus opticus und des Augapfels, bevorzugtererweise Retinoblastom, Osteosarkom, Mastzelltumor, Meningiom, Retikulozelltumor, Gliom, Schwannom, Chondrom, Adenokarzinom, Plattenepithelkarzinom, Plasmazelltumor, Lymphom, Rhabdomyosarkom und Melanom.
uppe der Tumore der Haut umfasst dabei bevorzugterweise:
Tumore des Histiocytom, Lipom, Fibosarkom, Fibrom, Mastzelltumor, malignes Melanom, Papillom, Basalzelltumor, Keratoakanthom, Hemangioperizytom, Tumore der Haarfollikel, Tumore der Schweißdrüsen, Tumore der Talgdrüsen, Haemangiom, Haemangiosarkom, Lipom, Liposarkom, malignes fibröses Histiozytom, Plasmazytom und Lymphangiom.
uppe der Tumore der Weichteile umfasst dabei bevorzugterweise:
Tumore des alveoläres Weichteilsarkom, epitheloidzelliges Sarkom, Chondrosarkom der Weichteile, Osteosarkom der Weichteile, Ewing-Sarkom der Weichteile, primitive neuroektodermale Tumore (PNET), Fibrosarkom, Fibrom, Leiomyosarkom, Leiomyom, Liposarkom, malignes fibröses Histiozytom, malignes Hemangioperizytom, Hemangiom, Hemangiosarkom, malignes Mesenchymom, maligner peripherer Nervenscheidentumor (MPNST, malignes Schwannom), malignes melanozytisches Schwannom, Rhabdomyosarkom, Synovialsarkom, Lymphangiom und Lymphangiosarkom.
ppe des Gastrointestinale Tumors umfasst dabei bevorzugterweise:
1. Tumore der Mundhöhle und Zunge, bevorzugtererweise Plattenepithelkarzinom, Fibrosarkom, Merkelzelltumor, induktives Fibroameloblastom, Fibrom, Fibrosarkom, virale Papillomatose, idiopathische Papillomatose, nasopharyngeale Polypen, Leiomyosarkom, Myoblastom und Mastzelltumor;
2. Tumore der Speicheldrüsen, bevorzugtererweise Adenokarzinom; 3. . . Tumore des Oesophagus, bevorzugtererweise Plattenepithelkarzinom, Leiomyosarkom, Fibrosarkom, Osteosarkom, Barrettkarzinom und paraoesophageale Tumore;
4. Tumore des exokrines Pankreas, bevorzugtererweise Adenokarzinom; und
5. Tumore des Magens, bevorzugtererweise Adenokarzinom, Leiomyom, Leiomyosarkom und Fibrosarkom.
uppe der Tumore des respiratorischen Systems umfasst dabei bevorzugterweise:
1. Tumore der Nase und Nasenhöhle, des Kehlkopfes und der Trachea, bevorzugtererweise Plattenepithelkarzinom, Fibrosarkom, Fibrom, Lymphosarkom, Lymphom, Hemangiom, Hemangiosarkom, Melanom, Mastzelltumor, Osteosarkom, Chondrosarkom, Oncozytom (Rhabdomyom), Adenokarzinome und Myoblastom; und
2. Tumore der Lunge, bevorzugtererweise Plattenepithelkarzinom, Fibrosarkom, Fibrom, Lymphosarkom, Lymphom, Hemangiom, Hemangiosarkom, Melanom, Mastzelltumor, Osteosarkom, Chondrosarkom, Oncozytom (Rhabdomyom), Adenokarzinome, Myoblastom, kleinzelliges Karzinom, nicht-kleinzelliges Karzinom, bronchiales Adenokarznom, bronchoalveoläres Adenokarzinom und alveoläres Adenokarzinom.
uppe der Tumore des Skeletts umfasst dabei bevorzugterweise:
Osteosarkom, Chondrosarkom, parosteales Osteosarkom, Hemangiosarkom, Synovialzellsarkom, Hemangiosarkom, Fibrosarkom, malignes Mesenchymom, Riesenzelltumor, Osteom und multilobulares Osteom.
ppe der Tumore des endokrinen Systems umfasst dabei bevorzugterweise:
1. Tumore der Schilddrüse/Nebenschilddrüse, bevorzugtererweise Adenome und Adenokarzinome; 2. Tumore der Nebenniere, bevorzugtererweise Adenom, Adenokarzinom und Pheochromozytom (Nebennierenmarktumor);
3. Tumore der Hypothalamus/Hypophyse, bevorzugtererweise Adenom und Adenokarzinom;
4. Tumore des endokrines Pankreas, bevorzugtererweise Insulinom (Betazelltumor, APUDom) und Zollinger-Ellison Syndrom (Gastrin sezernierender Tumor der Deltazellen des Pankreas); und
5. multiple endokrine Neoplasien (MEN) und Chemodectom.
uppe der Tumore des weiblichen Geschlechtssystems umfasst dabei bevorzugterweise:
1. Tumore der Ovarien, bevorzugterweise Adenom, Adenokarzinom, Zystadenom, und undifferenzierte Karzinome;
2. Tumore der Uterus, bevorzugtererweise Leiomyom, Leiomyosarkom, Adenom, Adenokarzinom, Fibrom, Fibrosarkom und Lipom;
3. Tumore der Zervix, bevorzugtererweise Adenokarzinom, Adenom, Leiomyosarkom und Leiomyom;
4. Tumore der Vagina und Vulva, bevorzugtererweise Leiomyom, Leiomyosarkom, Fibroleiomyom, Fibrom, Fibrosarkom, Polypen und Plattenepithelkarzinom.
ppe der Tumore der Mammadrüse umfasst dabei bevorzugterweise:
Fibroadenom, Adenom, Adenokarzinom, mesenchymale Tumore, Karzinome, Karzinosarkome. uppe der Tumore des männlichen Geschlechtssystems umfasst dabei bevorzugterweise:
1. Tumore der Hoden, bevorzugtererweise Seminom, Interstitialzelltumor und S ertolizelltumor;
2. Tumore der Prostata, bevorzugtererweise Adenokarzinome, undifferenzierte Karzinome, Plattenepithelkarzinome, Leiomyosarkome und Transitionalzellkarzinom; und
3. Tumore des Penis und der externen Genitalien, bevorzugtererweise Mastzelltumor und Plattenepithelkarzinom.
uppe der Tumore des harnableitenden Systems umfasst dabei bevorzugterweise:
1. Tumore der Niere, bevorzugtererweise Adenokarzinom, Transitionalzellkarzinom (epitheliale Tumore), Fibrosarkom, Chondrosarkom (mesenchymale Tumore), WiIm' s Tumor, Nephroblastom und embryonales Nephrom (embryonal pluripotente Blastome);
2. Tumore des Urethers, bevorzugtererweise Leiomyom, Leiomyosarkom, Fibropapillom, Transitionalzellkarzinom;
3. Tumore der Harnblase, bevorzugtererweise Transitionalzellkarzinom, Plattenepithelkarzinom, Adenokarzinom, Botryoid (embryonales Rhabdomyosarkom), Fibrom, Fibrosarkom, Leiomyom, Leiomyosarkom, Papillom und Hemangiosarko; und
4. Tumore der Urethra, bevorzugtererweise Transitionalzellkarzinom, Plattenepithelkarzinom und Leiomyosarkom.
ppe der Tumore des hämatopoetischen Systems umfasst dabei bevorzugterweise:
1. Lymphome, lymphatische Leukämie, nichtlymphatische Leukämie, myeloproliferative Leukämie, Hodgkin's Lymphom, Non-Hodgkin's Lymphom. Die Gruppe der vermischten und embryonalen Tumore umfasst dabei bevorzugterweise:
Hemangiosarkome, Thymom und Mesotheliom.
Ganz besonders bevorzugterweise sind diese Tumoren ausgewählt aus der Gruppe, die Brustkrebs, Ovarialkarzinom, Prostatakarzinom, Osteosarkom, Glioblastom, Melanom, kleinzelliges Lungenkarzinom und Kolorektalkarzinom umfasst. Weitere Tumoren sind jene, die resistent, wie hierin beschrieben, sind, bevorzugt jene, die mehrfach resistent sind, insbesondere auch solche Tumoren der vorstehend beschriebenen Gruppe. Besonders bevorzugte Tumoren sind dabei auch jene, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die Brusttumore, Knochentumore, Magentumore, Darmtumore, Gallenblasentumore, Bauspeicheldrüsentumore, Lebertumore, Nierentumore, Gehirntumore, Eierstocktumore, Haut- und Hautanhangsorgantumore, Kopf- /Nackentumore, Gebärmuttertumore, Synovialtumore, Kehlkopftumore, Speiseröhrentumore, Zungentumore und Prostatatumore umfasst. Dabei ist bevorzugt, dass diese Tumoren hinsichtlich ihrer Ausprägung solche sind, wie sie hierin insgesamt offenbart sind.
Weitere Tumoren, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Viren verwendet werden können, sind Leukämien und metastasierende Tumoren, insbesondere metastasierende Tumoren der vorstehend genannten Tumoren. Weitere Tumoren, die erfindungsgemäß behandelt werden können, sind ausgewählt aus der Gruppe, die Primärtumoren, Sekundärtumoren, Tertiärtumoren und metastasierende Tumoren umfassen. Dabei ist bevorzugt, wenn die Tumoren zumindest eines der folgenden Merkmale aufweisen, nämlich dass sie YB-I im Kern Zellzyklus- unabhängig aufweisen, unabhängig von der Ursache dafür, und/oder, dass sie dereguliertes YB-I aufweisen. Eine weitere Gruppe von Tumoren, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Viren behandelt werden können, sind alle der vorstehend genannten Tumoren bzw. Tumoren, die hierin als mit den erfindungsgemäßen Viren behandelbar beschrieben sind, sofern sie eine der oder mehrere der hierein offenbarten Resistenzen aufweisen.
Es ist weiterhin im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass auch solche Tumoren mit den erfindungsgemäßen Viren oder unter Verwendung der hierin als erfindungsgemäß zu verwenden offenbarten Viren behandelt werden können, die weder YB-I im Zellkern, bevorzugt unabhängig vom Zellzyklus im Zellkern aufweisen, noch dereguliertes YB-I aufweisen. Dies ist insbesondere dann gegeben, wenn die Viren selbst für YB-I codieren. Aus Gründen der Spezifität der Expression von YB-I und damit der Spezifität der Replikation der Viren wird in diesen Ausfuhrungsformen die Expression der Viren unter die Kontrolle eines bevorzugterweise hoch regulierten Promotors stellen. Ein derartiger Promotor kann grundsätzlich ein jeder Promotor sein, der spezifisch aktiviert werden kann, damit die Viren nur in den beabsichtigten Zellen replizieren. Besonders bevorzugte Promotoren sind dabei insbesondere tumorspezifische Promotoren und gebespezifische Promotoren, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind. Weiterhin ist es auch möglich die codierende Sequenz fiir YB-I in das virale Genom so zu Monieren, dass es über den adenoviralen major late Promotor (MLP) zur Expression gebracht wird. Dieser ist hauptsächlich nach dem Start der adenoviralen Replikation aktiv (Tollefson A. E. et al., Journal of Virology 66, 3633-3642, 1992; Bauzon M. et al., Molecular Therapy 7, 526- 534, 2003).
YB-I gehört zu einer Gruppe hoch konservierter Faktoren, die an der invertierten CAAT- Sequenz, der sogenannten Y-Box, binden. Sie können sowohl auf der Ebene der Transkription als auch der Translation regulatorisch wirken (Wolffe, A. P. Trends in Cell Biology 8, 318-323, 1998).
Die für YB-I codierende Nukleinsäure, die in einer Ausfuhrungsform der erfindungsgemäß zu verwendenden Viren Bestandteil der Viren ist, kann dabei eine einen Kerntransport von YB-I vermittelnde Nukleinsäuresequenz umfassen. Als Viren bzw. virale Systeme und damit die entsprechenden Nukleinsäuren können im Zusammenhang damit und in Kombination mit diesen erfindungsgemäßen Nukleinsäuren die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, Viren, insbesondere Adenoviren, und adenoviralen Systeme sowie die im Stand der Technik bekannten Adenoviren wie beispielsweise Onyx-015, AdΔ24, dl922-947, ElAd701/07, CB016, dl 520 und die im Patent EP 0931 830 beschriebenen Adenoviren verwendet werden. Geeignete, den Kerntransport vermittelnde Nukleinsäuresequenzen sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und beispielsweise beschrieben in (Whittaker, G.R. et al., Virology, 246, 1-23, 1998; Friedberg, E.C., TIBS 17, 347, 1992; Jans, D. A. et al., Bioessays 2000 Jun; 22(6): 532-44; Yoneda, Y., J. Biochem. (Tokyo) 1997 May; 121(5): 811-7; Boulikas, T., Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 1993; 3(3): 193-227; Lyons RH, Mol. Cell Biol., 7, 2451-2456, 1987). Bei den Kerntransport vermittelnden Nukleinsäuresequenzen können verschiedene Prinzipien verwendet werden. Ein derartiges Prinzip besteht beispielsweise darin, dass, dass YB-I als Fusionsprotein mit einem Signalpeptid ausgebildet wird und infolge des Signalpeptids YB-I in den Zellkern geschleust wird und damit die erfindungsgemäße Replikation der Adenoviren erfolgt. Ein weiteres Prinzip, welches bei der Ausgestaltung der erfindungsgemäß verwendeten Adenoviren zur Anwendung gelangen kann, besteht darin, dass YB-I mit einer Transportsequenz versehen wird, die dazu fuhrt, dass YB-I, bevorzugterweise ausgehend von einer Synthese im Cytoplasma, in den Zellkern geschleust oder transloziert wird und dort die virale Replikation befördert. Ein Beispiel für eine besonders wirksame, den Kerntransport vermittelnde Nukleinsäuresequenz stellt die TAT-Sequenz von HIV dar, die neben weiteren geeigneten derartigen Nukleinsäuresequenzen beispielsweise beschrieben ist in Efthymiadis, A., Briggs, LJ, Jans, DA., JBC 273, 1623-1628, 1998. Dabei ist es Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die erfindungsgemäß verwendeten Adenoviren die Nukleinsäuresequenzen umfassen, die für die den Kerntransport codierenden Peptide codieren.
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass YB-I in vollständiger Länge vorliegt, insbesondere in einer Form, die dem Wildtyp von YB-I entspricht. Es ist weiterhin im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass YB-I als Derivat, zum Beispiel, in verkürzter oder trunkierter Form verwendet wird oder vorliegt. Ein YB-I -Derivat, wie es im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, oder vorliegt, ist dabei ein solches, das an den E2 late-Promotor zu binden in der Lage ist und dadurch die Genexpression von der adenoviralen E2-Region oder Elementen davon aktiviert. Derartige Derivate umfassen insbesondere die hierin offenbarten YB- 1 -Derivate. Weitere Derivate können durch Deletion einzelner oder mehrerer Aminosäuren am N-Terminus, am C-Terminus oder innerhalb der Aminosäuresequenz erzeugt werden. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass auch YB-I -Fragmente als YB-I -Proteine im Sinne der vorliegenden Erfindung bezeichnet und verwendet werden. In der Publikation von Jürchott K et al. [JBC 2003, 278, 27988-27996] werden verschiedene YB-I -Fragmente offenbart, die sich durch Deletionen am C- und am N-Terminus auszeichnen. Die Verteilung der verschiedenen YB-1-Fragemente hat ergeben, dass sowohl die cold-shock-Domäne (CSD) wie auch der C- Terminus für den Zellzyklus-regulierten Transport von YB-I in den Zellkern von Bedeutung ist. Es ist daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt, dass ein verkürztes YB-I (hierin ebenfalls als YB-I -Protein bezeichnet) in Verbindung mit der erfindungsgemäßen Expression von ElB55k und E4orf6 besser in den Kern wandert und somit eine stärkere CPE induziert, ohne zwangsläufig besser an den E2-late-Promotor zu binden im Vergleich zum nativen YB-I, wobei nicht ausgeschlossen werden soll, dass auch ein verkürztes YB-I besser in den Kern wandert und beides macht, d.h. CPE induziert und an den E2-late-Promotor bindet. Schließlich können derartige verkürzten YB-1-Fragemente auch besser in den Kern wandern und dort effektiver an den E2-late-Promotor binden, ohne dass eine besserer CPE induziert wird. Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass verkürzte YB-1-Proteine oder -Fragmente weitere Sequenzen umfassen, wie hierin im Zusammenhang mit dem Vollängen-YB-1 beschrieben, insbesondere Zelllokalisationssignalsequenzen (NLS) und dergleichen.
Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt auch ein Verfahren zum Screenen von Patienten, die mit den erfmdungsemäßen Viren und/oder unter erfindungsgemäßer Verwendung der hierin beschriebenen Viren und Mittel bzw. Medikamente behandelbar sind, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
Untersuchen einer Probe des Tumorgewebes und
Festellen, ob YB-I im Kern Zellzyklus-unabhängig lokalisiert ist, oder ob die Zelle dereguliertes/überexprimiertes YB-I enthält.
Anstelle von oder in Ergänzung zu YB-I kann auch das Vorhandensein der hierin beschriebenen, zu YB-I alternativen Marker festgestellt werden.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die Untersuchung des Tumorgewebes unter Verwendung eines Mittels oder Agens erfolgt, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Antikörper gegen YB-I, spezifisch bindende Peptide, Aptamere gegen YB-I, Spiegemiere gegen YB-I sowie Anticaline gegen YB-I umfasst. Grundsätzlich die gleichen Mittel können für die entsprechenden zu YB-I alternativen Marker hergestellt bzw. verwendet werden. Die Herstellung von Antikörpern, insbesondere monoklonalen Antikörpern, ist den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Ein weiteres Mittel zum spezifischen Nachweis von YB-I oder den Markern stellen Peptide dar, die mit hoher Affinität an ihre Zielstrukturen, im vorliegenden Falle YB-I oder die besagten Marker, binden. Im Stand der Technik sind Verfahren bekannt, wie beispielsweise phage-display, um derartige Peptide zu erzeugen. Dabei wird typischerweise von einer Peptid-Bibliothek ausgegangen, wobei die einzelnen Peptide eine Länge von etwa 8 bis 20 Aminosäuren aufweisen und die Größe der Bibliothek etwa 102 bis 1018, bevorzugterweise 108 bis 1015 verschiedene Peptide beträgt. Eine spezielle Form von an Zielmolekülen bindenden Polypeptiden stellen die sogenannten Anticaline dar, wie sie beispielsweise in der deutschen Patentanmeldung DE 197 42 706 beschrieben sind. Ein weiteres Mittel zum spezifischen Binden an YB-I oder die entsprechenden, zu YB-I alternativen Marker und damit zum Nachweis einer Zellzyklus-unabhängigen Lokalisation von YB-I im Zellkern sind die sogenannten Aptamere, d. h. D-Nukleinsäure, die auf RNA- oder DNA-Basis entweder als Einzelstrang oder als Doppelstrang vorliegen und spezifisch an ein Zielmolekül binden. Die Herstellung von Aptameren ist beispielsweise beschrieben im europäischen Patent EP 0 533 838. Eine Sonderform der Aptamere stellen die sogenannten Aptazyme dar, die beispielsweise beschrieben sind von Piganeau, N. et al. (2000), Angew. Chem. Int. Ed., 39, Nr. 29, Seiten 4369 - 4373. Dabei handelt es sich um eine spezielle Ausführungsform von Aptameren insoweit, als dass sie neben dem Aptameranteil noch einen Ribozymanteil aufweisen und nach Bindung oder Freisetzung des an den Aptamerteil bindenden Zielmoleküls der Ribozymanteil katalytisch aktiv wird und ein Nukleinsäuresubstrat spaltet, was mit der Erzeugung eines Signals einhergeht.
Eine weitere Form der Aptamere stellen sogenannte Spiegemiere dar, d. h. zielmolekülbindende Nukleinsäuren, die aus L-Nukleinsäuren hergestellt sind. Das Verfahren zur Herstellung von Spiegelmeren ist beispielsweise beschrieben in WO 98/08856.
Die Probe des Tumorgewebes kann durch Punktion oder durch einen chirurgischen Eingriff erhalten werden. Die Feststellung, ob im Kern YB-I Zellzyklus-unabhängig lokalisiert ist, erfolgt dabei häufig unter Verwendung mikroskopischer Techniken und/oder mittels Immunhistoanalyse, typischerweise unter Verwendung von Antikörpern oder einem der weiteren vorstehenden Mitteln. Weitere Verfahren zum Nachweis, dass YB-I im Kern und insbesondere dort Zellzyklus-unabhängig lokalisiert ist, sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise kann bei dem Durchmustern von gegen YB-I gefärbten Gewebeschnitten die Lokalisation von YB-I leicht erkannt werden. Dabei ergibt sich bereits infolge der Häufigkeit des Auftretens von YB-I im Kern, dass es sich um eine Zellzyklus-unabhängige Lokalisation im Kern handelt. Eine weitere Möglichkeit zum Zellzyklus-unabhängigen Nachweis von YB-I im Kern besteht in der Durchführung einer Färbung gegen YB-I und Feststellen, ob YB-I im Kern lokalisiert ist, und Durchführung der Bestimmung des Zellstadiums der Zellen. Dies bzw. die Detektion von YB-I kann aber auch unter Verwendung der vorstehend genannten, gegen YB-I gerichteten Mittel erfolgen. Der Nachweis der Mittel wiederum erfolgt dabei durch Verfahrensweisen, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind. Dadurch, dass die besagten Mittel spezifisch gegen YB-I gerichtet sind und insoweit nicht an andere Strukturen innerhalb der zu untersuchenden Probe binden, insbesondere die Zellen, binden, kann durch eine geeignete Markierung der Mittel deren Lokalisierung und infolge der spezifischen Bindung derselben an YB-I auch die Lokalisierung von YB-I entsprechend nachgewiesen und festgestellt werden. Verfahren zum Markieren der Mittel sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt.
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die hierin beschriebenen Viren, seien es die erfindungsgemäßen Viren oder die gemäß der Erfindung zu verwendenden Viren, auch bei Erkrankungen, bevorzugterweise Tumorerkrankungen und bevorzugtererweise Tumorerkrankungen, bei denen zumindet ein Teil der Tumorzellen eine Mehrfach-Resistenz, insbesondere eine multidrug resistance aufweist, verwendet werden können, bei denen YB-I dereguliert vorliegt. Dies gilt auch für einen jeden anderen Aspekt, wie er hierin im Zusammenhang mit Zellen und Tumoren beschrieben ist, soweit sie sich auf Zellen und Erkrankungen bezieht, bei denen sich YB-I im Zellkern befindet, bevorzugterweise unabhängig vom Zellzyklus im Kern befindet.
Obwohl die hierin beschriebenen erfindungsgemäßen Viren bzw. die erfindungsgemäß zu verwendenden Viren und viralen Systeme, bevorzugterweise Adenoviren bzw. adenovirale Systeme sind, sind die hierin beschriebenen Erkenntnisse, Verfahren und Verwendungen, Nukleinsäuren, Proteine, Replikationssysteme und dergleichen nicht auf Adenoviren beschränkt.
Die vorstehend gemachten Ausführungen, einschließlich jeglicher Verwendungen sowie die Ausbildungen der Viren bzw. viralen Systeme gelten im gleichen Maße für die dafür codierenden Nukleinsäuren und umgekehrt.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, dass die erfindungsgemäß verwendeten Viren bzw. die für sie codierenden Nukleinsäuren eine jede entsprechende virale Nukleinsäure ist, die zu einem Replikationsereignis für sich oder in Verbindung mit weiteren Nukleinsäuresequenzen führt. Dabei ist es möglich, dass mittels Helferviren die für die Replikation erforderlichen Sequenzen und/oder Genprodukte bereitgestellt werden. Sofern hierin auf codierende Nukleinsäuresequenzen Bezug genommen wird und es sich dabei um solche Nukleinsäuresequenzen handelt, die bekannt sind, ist es im Rahmen der Erfindung, dass nicht nur die identische Sequenz verwendet wird, sondern auch hiervon abgeleitete Sequenzen. Unter abgeleiteten Sequenzen sollen hierin insbesondere solche Sequenzen verstanden sein, die noch zu einem Genprodukt, sei es eine Nukleinsäure oder ein Polypeptid, führen, das eine Funktion aufweist, die einer oder der Funktion der nicht abgeleiteten Sequenz entspricht. Dies kann durch einfache, dem Fachmann geläufige Routinetests festgestellt werden. Ein Beispiel für derartige abgeleitete Nukleinsäuresequenzen sind jene Nukleinsäuresequenzen, die für das gleiche Genprodukt, insbesondere für die gleiche Aminosäuresequenz kodieren, jedoch infolge der Degeneriertheit des genetischen Codes eine andere Basenabfolge aufweisen.
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die erfindungsgemäßen Viren als Replikationssysteme mit und ohne Helferviren vorliegen.
Es ist bei einem derartigen erfindungsgemäßen adenoviralen Replikationssystem in einer Ausfuhrungsform vorgesehen, dass die adenovirale Nukleinsäure und/oder die Nukleinsäure des Helfervirus als replizierbarer Vektor vorliegt.
Dabei ist es weiter im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die für die Viren, wie sie erfindungsgemäß verwendet werden, codierende Nukleinsäure(n) in einem Vektor, bevorzugter Weise in einem Expressionsvektor vorliegt/vorliegen und dieser Expressionsvektor erfindungsgemäß verwendet wird.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch eine Vektorgruppe umfassend mindestens zwei Vektoren, wobei die Vektorgruppe insgesamt ein virales Replikationssystem umfasst, wie hierin beschrieben, und die Vektorgruppe erfindungsgemäß verwendet wird. Dabei kann vorgesehen sein, dass eine jede Komponente des viralen Replikationssystems auf einem eigenen Vektor, bevorzugter Weise einem Expressionsvektor angeordnet ist.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt auch die Verwendung einer Zelle, die eine oder mehrere der Nukleinsäuren, wie sie für die erfindungsgemäße Verwendung der hierin beschriebenen Viren, die erfindungsgemäß verwendet werden sollen, codiert, und/oder ein entsprechendes adenovirales Replikationssystem und/oder einen entsprechenden Vektor und/oder eine erfindungsgemäße Vektorgruppe umfasst, zu denselben Zwecken, wie hierin für die Viren beschrieben
Die vorstehend beschriebenen Konstrukte von Viren und insbesondere deren Nukleinsäuren bzw. die dafür codierenden Nukleinsäuren können auch in eine Zelle, insbesondere eine Tumorzelle, als Einzelkomponenten eingebracht werden, wobei dann infolge der Anwesenheit der verschiedenen Einzelkomponenten diese so zusammenwirken, als stammten die Einzelkomponenten von einer einzelnen Nukleinsäure bzw. einem einzelnen oder mehreren Viren.
Die erfindungsgemäß verwendeten, für Viren, virale Systeme oder Teile davon codierenden Nukleinsäuren können als Vektoren vorliegen. Bevorzugter Weise handelt es sich um virale Vektoren. Im Falle der virale Nukleinsäuren umfassenden Nukleinsäuren ist das Viruspartikel dabei bevorzugterweise der Vektor. Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die besagten Nukleinsäuren in einem Plasmidvektor vorliegen. In einem jeden Fall weist der Vektor Elemente auf, die für die Vermehrung der inserierten Nukleinsäure, d. h. Replikation und ggf. Expression der inserierten Nukleinsäure sorgen bzw. diese steuern. Geeignete Vektoren, insbesondere auch Expressionsvektoren, und entsprechende Elemente sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und beispielsweise beschrieben in Grunhaus, A., Horwitz, M.S., 1994, Adenoviruses as cloning vectors. In Rice, C, Hrsg., Seminars in Virology, London: Saunders Scientific Publications.
Der oben beschriebenen Ausführungsform, dass die verschiedenen Elemente der besagten Nukleinsäure nicht notwendigerweise auf nur einem Vektor enthalten sein müssen, trägt der Aspekt der Erfindung Rechnung, der die Vektorgruppe betrifft. Eine Vektorgruppe umfasst entsprechend mindestens zwei Vektoren. Ansonsten gilt betreffend die Vektoren bzw. die Vektorengruppe das hierin allgemein zu Vektoren Ausgeführte.
Die erfindungsgemäß verwendeten Viren sind durch die verschiedenen hierin offenbarten Nukleinsäuren bzw. Genprodukte charakterisiert und können ansonsten all jene den Fachleuten auf dem Gebiet bekannten Elemente umfassen, wie dies auch insbesondere bei Adenoviren vom Wildtyp der Fall ist (Shenk, T.: Adenoviridae: The virus and their replication. Fields Virology, 3. Auflage, Hrsg. Fields, B.N., Knipe, D.M., Howley, P.M. et al., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996, Kapitel 67).
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Tumorerkrankungen umfassend die Verabreichung eines erfmdungsgemäßen Virus, oder erfindungsgemäß zu verwenden offenbarten Virus Nukleinsäure, Vektors, Replikationssystems, Medikamentes oder pharmazeutischen Zusammensetzung. Die Tumorerkrankung ist dabei eine solche, wie hierin offenbart. Der Patient bedarf der Behandlung und ist bevorzugt ein solcher aus einer der hierin offenbarten Patientengruppen. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass, sofern nichts Gegenteiliges angegeben ist, die jeweils für die erfindungsgemäßen Viren, Nukleinsäure, Vektoren, Replikationssystemen, Medikamente und pharmazeutischen Zusammensetzungen offenbarten Merkmale und Ausführungsformen bzw. die der gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Viren, Nukleinsäuren, Vektoren, Replikationssystemen, Medikamenten und pharmazeutischen Zusammensetzungen auch für alle anderen Aspekte der vorliegenden Erfindung gelten und vice versa.
Die vorliegende Erfindung soll im folgenden anhand der Figuren und Beispiele weiter veranschaulicht werden, wobei sich daraus neue Merkmale, Ausführungsformen und Vorteile der Erfindung ergeben. Dabei zeigt
Fig. 1 eine schematische Darstellung der Regulation der E2 -Region von Adenovirus durch die Promotoren E2-late und E2 early durch E2F und YB-I;
Fig. 2 den schematischen Aufbau von Adenovirus vom Wildtyp;
Fig. 3 eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Adenovirus Xvir 05/Promotor, der Protein IX unter der Kontrolle des E2 late-Promotors exprimiert;
Fig. 4 eine schematische Darstellung eines erfmdungsgemäßen Adenovirus Xvir 05/E1A12S, der Protein DC als Teil des E1B55K-Leserahmens unter der Kontrolle von E1A12S exprimiert;
Fig. 5 eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Adenovirus Xvir 05/E1B19K, der Protein DC unter der Kontrolle von ElB 19K exprimiert;
Fig. 5a eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Adenovirus Xvir 05/E3-DC, der Protein DC unter der Kontrolle des E3-Promotors exprimiert
Fig. 6 eine schematische Darstellung des Wildtyp Adenovirus und des erfindungsgemäßen Adenovirus Xvir 05, der eine Ausführungsform des Virus Xvir 05/E1B19K ist; Fig. 7 eine schematische Darstellung des Wildtyp Adenovirus und des erfindungsgemäßen Adenovirus Xvir 05/Protein IX, der eine Ausfuhrungsform des Virus Xvir 05/E1A12S ist;
Fig. 8 eine schematische Darstellung des Wildtyp Adenovirus und des erfindungsgemäßen Adenovirus Xvir 05/01, der eine Ausfuhrungsform des Virus Xvir 05/Protein IX ist;
Fig. 9 eine schematische Darstellung des Wildtyp Adenovirus und des erfindungsgemäßen Adenovirus Xvir 05/02, der eine weitere Ausfuhrungsform des Virus Xvir 05/Protein IX ist;
Fig. 10 das Ergebnis einer Northern Bio t- Analyse zum Nachweis von Protein DC; und
Fig. 11 den schematischen Aufbau des onkolytischen Adenoviruses XVir03-3'UTR.
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung der Regulation der E2-Region von Adenovirus durch die Promo toren E2-late und E2 early durch E2F und YB-I. In Fig. 1 sind die beteiligten Promotoren, E2-early und E2-late Promotor hinsichtlich der Bindung bzw. der Aktivierung durch E2F und YB-I dargestellt. Das Wildtyp El A-Protein unterbricht die Bindung von E2F am Retinoblastoma-Protein Rb. Das solchermaßen freigesetzte E2F bindet an den E2-early Promotor und induziert dadurch die adenovirale Replikation. Nach 8-12 h erfolgt ein sogenannter Switch zum E2-late Promotor. Dieser wird erst durch die Translokalisation von YB-I aus dem Zytoplasma in den Kern ermöglicht. Nach der Kerntranslokation aktiviert YB-I durch Bindung an den E2-late Promotor die E2-Genexpression.
Der Bindungsmechanismus von E2F/RB und die durch ElA vermittelte Freisetzung von E2F ist grundlegend verschieden von dem der vorliegenden Erfindung zugrunde liegenden Mechanismus. Nicht die Freisetzung von E2F vom Rb-Protein ist, wie im Stand der Technik angenommen, ist ein wichtiger, um nicht zu sagen der entscheidende Vorgang der adenoviralen Replikation, sondern die Kernlokalisation des humanen Translcriptionsfaktors YB-I. Dieser Transkriptionsfaktor kommt in normalen Zellen über den größten Teil des Zellzyklus lediglich im Zytoplasma vor. Nach Infektion mit einem Adenovirus wird dieser unter bestimmten Bedingungen in den Kern induziert oder liegt bei bestimmten zellulären Systemen wie bestimmten Tumorerkrankungen, wie z.B., aber nicht darauf beschränkt, Brustkrebs, Ovarialkarzinom, Prostatakarzinom, Osteosarkom, Glioblastom, Melanom, kleinzelliges Lungenkarzinom und Kolorektalkarzinom, bereits im Kern vor.
Beispiel 1 : Konstruktion verschiedener Protein IX exprimierender Adenoviren
Ausgehend von dem in Fig. 2 dargestellten Aufbau der viralen Nukleinsäure des Wildtyp- Adenovirus wurden die verschiedenen hierin offenbarten Konstruktionsprinzipien für die Expression von Protein IX bei Adenoviren, die YB-I abhängig replizieren, realisiert und sind in den Fig. 3, 4, 5 und 5a dargestellt. Allen Konstruktionen ist dabei gemein, dass sie E1A13S- minus und ElA12S-minus sind, in dem Sinne, dass diese nicht durch den natürlichen bzw. den im Wildtyp vorhandenen ElA Promotor gesteuert werden.
Bei dem in Fig. 3 dargestellten Adenovirus Xvir 05/Promotor ist der Adenovirus darüber hinaus noch ElB19K-minus und Protein IX-minus in dem Sinne, dass Protein IX nicht in den im Wildtyp vorhandenen regulatorischen Kontext enthalten ist und Protein IX nicht exprimiert wird. Die Expression wird vielmehr durch den E2 late-Promotor gesteuert. Das Protein IX ist in die E3- Region einkloniert worden, kann jedoch grundsätzlich auch in die E4-Region einkloniert werden. Die Gene für E2A, E2B, E4 und MLP sind noch vorhanden und auch exprimierbar. Der Transporter bestehend aus E4orf6 und E1B55K wird durch die unter der Kontrolle des CMV- Promotor stehende Kassette E4orf6-IRES-E1B55K gebildet. Die entsprechende Kassette ist in den Bereich der El-Region kloniert worden, könnte jedoch auch in andere Regionen wie beispielsweise in die E3- oder E4- Region kloniert werden.
Bei dem in Fig. 4 dargestellten Adenovirus XvirO5/ElA12S ist der Adenovirus darüber hinaus noch ElB19K-minus und Protein IX-minus in dem Sinne, dass Protein IX nicht in den im Wildtyp vorhandenen regulatorischen Kontext enthalten ist und Protein IX nicht exprimiert wird. Die Expression wird vielmehr durch das durch den E2 late-Promotor gesteuerte E1A12S bedingt, das dazu führt, dass der in dem für E1B55K codierenden Bereich enthaltene Leserahmen von Protein IX aktiviert wird. Das Protein E1A12S ist in die E3- Region einkloniert worden, kann jedoch grundsätzlich auch in die E4-Region einkloniert werden. Die Gene für E2A, E2B, E4 und MLP sind noch vorhanden und auch exprimiertbar. Der Transporter bestehend aus E4orf6 und E1B55K wird durch die unter der Kontrolle des CMV-Promotor stehende Kassette E4orf6-IRES- E1B55K gebildet. Die entsprechende Kassette ist in den Bereich der El -Region kloniert worden, könnte jedoch auch in andere Regionen wie beispielsweise in die E3- oder E4- Region kloniert werden.
Bei dem in Fig. 5 dargestellten Adenovirus Xvir 05/E1B19K ist der Adenovirus darüber hinaus noch ElB19K-minus und Protein IX-minus in dem Sinne, dass Protein IX nicht in den im Wildtyp vorhandenen regulatorischen Kontext enthalten ist. Die Expression wird vielmehr durch das Protein ElB 19K gesteuert, das unter dem Einfluss des CMV-Promotors exprimiert und den im E1B55K Leserahmen enthaltenen Leserahmen von Protein DC zur Expression gelangen lässt. Die Gene für E2A, E2B, E3, E4 und MLP sind noch vorhanden und auch exprimierbar. Der Transporter bestehend aus E4orf6 und E1B55K wird durch die unter der Kontrolle des CMV- Promotor stehende Kassette E4orf6-RSV-Promotor -El B-Region gebildet. Die entsprechende Kassette ist in den Bereich der El -Region kloniert worden, könnte jedoch auch in andere Regionen wie beispielsweise in die E3- oder E4- Region kloniert werden.
Bei dem in Fig. 5a dargestellten Adenovirus Xvir05/E3-IX ist der Adenovirus darüber hinaus noch ElB19K-minus und Protein IX-minus in dem Sinne, dass Protein ElB 19K nicht in den im Wildtyp vorhandenen regulatorischen Kontext enthalten ist und Protein DC nicht exprimiert wird. Die Expression wird vielmehr durch das durch den natürlichen E3-Promotor gesteuert wird. Die Gene für E2A, E2B, E4 und MLP sind noch vorhanden und auch exprimierbar. Der Transporter bestehend aus E4orf6 und E1B55K wird durch die unter der Kontrolle des CMV-Promotor stehende Kassette E4orf6-IRES-E1B55K gebildet. Die entsprechende Kassette ist in den Bereich der El -Region kloniert worden, könnte jedoch auch in andere Regionen wie beispielsweise in die E3- oder E4- Region kloniert werden.
Die Figs. 6 bis 9 stellen weitere Ausfuhrungsformen der erfmdungsgemäßen Adenoviren dar.
Der in Fig. 6 dargestellte Virus ist ein Weiterentwicklung des in Fig. 5 dargestellten Adenovirus Xvir 05/E1B19K ist. In Ergänzung zu XirO5/ElB19K weist dieser Virus eine unter der Kontrolle des E2-late-Promotors stehende Kassette auf, die E1A12S und YB-I bzw. eine jeweils dafür codierende Nukleinsäure umfasst, wobei die beiden Leserahmen durch eine IRES voneinander getrennt sind. In einer Ausführungsform kann vorgesehen sein, dass die für YB-I codierende Nukleinsäure nicht in der Kassette enthalten ist. Die durch das Virus exprimierte Nukleinsäure für YB-I fuhrt zu einer noch stärkeren Replikation in Zellen mit dereguliertem YB-I .
Der in Fig. 8 dargestellte Adenovirus ist eine Weiterentwicklung des in Fig. 6 dargestellten Adenovirus, wobei hier die unter der Kontrolle des E2-late-Promotors stehende Kassette, die El A12S und YB-I bzw. eine jeweils dafür codierende Nukleinsäure umfasst, in die E4 Region Moniert ist und in die E3-Region unter der Kontrolle des E3-Promotors verschiedene Transgene einkloniert sind wie beispielsweise Apoptose induzierende Gene, prodrug-Gene, siRNA, Tumorsuppressor-Gene oder Zytokine. Alternativ können in diese Region die verschiedenen hierin offenbarten Transgene einkloniert werden.
Der in Fig. 9 dargestellte erfmdungsgemäße Adenovirus ist schließlich eine Weiterentwicklung des in Fig. 8 dargestellten Adenvirus, wobei hier zusätzlich das für das Taregting der Viren vorteilhafte RGD-Motif einkloniert ist. Dies befindet sich im adenoviralem Genom im Fiber- Protein im Bereich etwa der Positionen 32675- 32685. Diese Schwankung der genauen Positionsangabe wird dadurch bedingt, dass die Sequenzen des Wildtyp Adenovirus in den verschiedenen Datenbanken oder Datenbakneinträgen unterschiedlich sind bzw. eine unterschiedliche Länga aufweisen.
Der in Fig. 7 dargestellte erfindungsgemäße Adenovirus beruht auf dem in Fig. 3 dargestellte Virus. Im Unterschied dazu weist dieser Adenovirus jedoch keine Kassette aus E4orf6 und E1B55K auf, sondern beide werden durch unterschiedliche Promotoren, nämlich den CMV- Promotor und den RSV-Promotor gesteuert. Die Einklonierung erfolgt in die El -Region. Zusätzlich weist der Adenovirus neben der unter der Kontrolle des E2-late-Promotors stehenden, für E1A12S codierenden Nukleinsäure noch eine für das Protein DC codierende Nukleinsäure auf, die durch eine IRES von derjenigen von E1A12S getrennt ist. Auch diese Kassette könnte grundsätzlich ohne die für Protein IX codierende Nukleinsäure ausgestaltet sein. Eine weitere mögliche Ausführungsform wäre die, dass die Kassette in die E4-Region kloniert ist. Schließlich könnte auch dieser Virus noch die Transgene, wie im Zusammenhang mit dem in Fig. 8 dargestellten Virus beschrieben in der E3- oder der E4-Region enthalten. In einer weiteren Ausführungsform dieses Adenoviruses ist das RGD-Motiv enthalten. Beispiel 2: Nachweis der Protein IX Expression
Dieses Experiment wurde durchgeführt, um die Bedeutung der Expression von Protein DC für die effektive Partikelbildung bei der YB-I -vermittelten Replikation zu bestätigen. Dazu wurde der im Stand der Technik beschrieben onkolytische, YB-I -abhängig replizierende Adenovirus Xvir 03-3'UTR verwendet, der in Fig. 11 dargestellt ist.
Bei der Durchführung des Versuchs wurde wie folgt vorgegangen: Pro 10 cm-Schale wurden 10
293-und 257RDB-Zellen ausplattiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen wie in Fig. 11 dargestellt entweder nicht infiziert (K), mit dem Wildtyp-Adenovirus oder mit Xvir03 infiziert. Die Infektion erfolgte in 1,5 ml serumfreie DMEM-Medium für 1 h bei 37° C. Anschließend wurde das Infektionsmedium entfernt und durch 10 ml Vollmedium (10 % FKS/DMEM) ersetzt. Nach 24-48 h wurde die RNA isoliert. Anschließend wurde eine Northern Blot Analyse durchgeführt. Dafür wurde jeweils 10 μg RNA elektrophoretisch in einem Agarosegel mit 3 % Forrnaldehyd aufgetrennt, anschließend auf eine Nylonmembran geblottet und gegen eine spezifische 386 bp große Sonde hybridisiert. Als Sonde, die mit Hilfe einer PCR generiert wird, diente eine mit P32 markierte Sonde die gegen das Protein IX gerichtet ist. Folgende Primer wurden für die PCR verwendet: 5'-TATTTGACAACGCG; 5'-TTTTAAACCGCATTGGG. Die Position der Sonde im Wildtyp Adenovirusgenom liegt zwischen Position 3648 und 4033. Der verwendetete Virus ist Xvir 03, der keine Expression des Proteins DC zeigt.
Das Ergebnis des Versuchs ist in Fig. 10 dargestellt.
Wie aus der Fig. 11 ersichtlich, zeigt das Virus Xvir03-3'UTR eine verminderte Expression in den Tumorzellen 257RDB im Vergleich zum Wildtyp-Adenovirus. In 293-Zellen, die ElA und EIB-Proteine exprimieren, unter anderem auch das ElB 19K Protein, wird genügend Protein DC exprimiert. Beispiel 3: Struktureller Aufbau der rekombinanten Adenoviren XvirO5, Xvir05/Protein IX, Xvir05/01 und Xvir05/02
Bei dem Vektor XvirO5 wird durch die Expressionskassetten CMV- E4Orf6 und RSV-ElB- Region unter anderem die Expression der viralen Proteine E4ORF6 und ElB55k sichergestellt. Dies führt zur Translokalisation von YB-I in den Zellkern. Das E1A12S-Genprodukt wie auch das YB-I -Genprodukt, gesteuert über den E2-late Promotor, fordern zusätzlich die virale Replikation. Das Virus ist zudem in der Lage die Expression der ABC-Transporter MRP und MDRl zu inhibieren. Zudem werden die Proteine E1B19K und Protein DC als Bestandteil der Kassette RSV-ElB-Region exprimiert.
Der Vektor Xvir05 -Protein DC stellt eine weitere Vektorentwicklung dar. Dort wird die Expression des adenoviralen Proteins DC, welches in der Expressionskassette E21ate-E1A12S- IRES-Protein DC vorliegt, sichergestellt. Der Verktor enthält nicht die gesamte EIB-Region, sondern nur den offenen Leserahmen von ElB55k.
Bei dem Vektor Xvir05/01 wird die gesamte EIB-Region, d.h. das ElB19k, ElB55k und das Protein DC von einem viralen, nicht-adenoviralen Promotor gesteuert, beispielsweise der RSV- Promotor. Die Expressionskassette E21ate-E1A12S-IRES-YB-1 befindet sich in der E4-Region. Somit können spezifische therapeutische Transgene in die E3-Region kloniert werden. Die E3- Deletion ist so ausgeführt, dass das adenovirale ADP-Protein „adenoviral death Protein" noch exprimiert wird. Zudem bewirkt die Expression von E1A12S und ElB19k, dass das Protein DC exprimiert wird
Bei dem Vektor Xvir05/02 weist zusätzlich ein RGD-Motiv in dem H-Loop vom Fiber-Knob auf, um eine bessere Infektionsrate zu gewährleisten.
Bei der Herstellung der Viren wurde wie folgt vorgegangen: Modifikation des Rescue-Plasmids pAdEASY CFirma Obiogene)
Verwendung des Shuttlevektors pShuttle-AdEASY für die Herstellung eines ΔE3E4-Shuttle- Vektors
Zunächst wurde in den vorliegenden Vektor pShuttle-AdEASY ein CMV-Promotor und ein Bovine Growth Hormone Polyadenylierungssignal hineinkloniert. Hierzu wurde das Plasmid mit EcoBl verdaut, die Enden durch Auffüllen mit T4-Polymerase und dNTPs geglättet, das Backbone dephosphoryliert und die beiden entstandenen Schnittprodukte religiert. Durch diese Vorgehensweise wurde die Restriktionserkennungssequenzen für EcoRI vernichtet. Das daraus hervorgegangene Plasmid wurde pShuttle(-EcoRI)-AdEAS Y genannt.
Anschließend wurde die Kassette CMV-MCS-polyA aus dem pShuttle von Clontech mit Mfel und EcoRI geschnitten, die Enden geglättet und in den Vektor pShuttle (-EcoRI)-AdEASY Moniert, der dafür mit Xbäl linearisiert, geglättet und dephosphoryliert wurde. Daraus entstand das Plasmid CMV-MCS-PolyA-pShuttle-AdEASY.
Für die Manipulation der E3 und der E4 Region wurde die ΔE3E4-Region aus dem Plasmid pAdEASY mit Spei und Päd in das Plasmid CMV-MCS-PolyA-pShuttle-AdEASY Moniert und damit das Plasmid ΔE3E4-p Shuttle- AdE AS Y generiert. Durch Restriktion mit Ndel und Religation wurde von zwei Ndel Schnittstellen eine deletiert und damit auch die Multiple Klonierungsstelle aus dem Plasmid. Durch diese Prozedur entstand das Plasmid ΔE3E4-pShuttle (-AWeI)-AdEASY.
E4-Manipulation
Um für mögliche therapeutische Transgene Platz zu schaffen und um eine unerwünschte homologe Rekombination zu unterbinden wurde die E4-Region im Plasmid ΔE3E4-pShuttle (- AWeI)-AdEASY spezifisch deletiert werden. Dabei wird die E4orf6-Region durch Herausschneiden mit Pstϊ und Religation um ca. 634 bp verkürzt = ΔE3E4ΔORF6-pShuttle (- AWeI)-AdEASY. Entsprechende Deletionen sind in anderen Systemen zur Herstellung rekombinanter Adenoviren durch den Fachmann durchführbar. Klonierung des RGD-Motivs in ΔE3E4ΔORF6-pShuttle (-NJgD-AdEASY
Für die verbesserte Infektiosität wurde in Anlehnung an Dmitriev et al. 1998 (An Adenovirus Vector with Genetically Modified Fibers Demonstrates Expanded Tropism via Utilization of a Coxsackievirus and Adenovirus Receptor-Independent Cell Entry Mechanism) der HI Loop des Fiber-knob Domäne modifiziert: Die entsprechende Region wurde mit Primern RGD-Hpa fw (5'-GAGgttaacCTAAGCACTGCCAAG-3'), RGD-EcoRV rev (5'-
CATAGAGTATGCAGATATCGTTAGTGTTACAGGTTTAGTTTTG-S') sowie RGD-EcoRV fw (5'-GTAACACTAACGATATCTGCATACTCTATGTCATTTTCATGG-S') und RGD-5/rI rev (5'-CAGCGACATGAActtaagTGAGCTGC-3') amplifiziert und dabei eine EcoRV- Schnittstelle generiert. In diese Schnittstelle wurden gepaarte Oligonukleotide kloniert, die für ein Arg-Gly-Asp (RGD)- Peptid kodieren: RGD-Oligo 1 (5'- CACACTAAACGGTACACAGGAAACAGGAGACACAACTTGTGACTGCCGCGGAGACT GTTTCTGCCC-3') und RGD-Oligo 2 (5'-GGGCAGAAACAG TCTCCGCGGCAGTCA CAAGTTGTGTCTCCTGTTTCCTGTGTACCGTTTAGTGTG-S'). Durch Umklonierung über die Hpal und BM -Schnittstellen im ΔΕ3Ε4ΔORF6-pShuttle (-NtfeD-AdEASY entstand ΔE3- RGD-E4ΔORF6-ρShuttle (-MeI)-AdEASY. Das RGD-Motiv befindet sich im HI Loop der Fiberknob-Domäne.
Klonierung der E3a Region in ΔE3-Region von ΔE3RGD-E4ΔORF6-pShuttle (-Ndeϊ)- AdEASY.
Hierfür wurde der Vektor pcDΝA3.1(+) der Firma Invitrogen mit BgM und BamΗI geschnitten, dabei der CMV-Promotor entfernt und der Vektor religiert (pcDNA3.1(+) ohne CMV = oCMV). Über die Spei und Xhόl Restriktionsstellen des pcDNA3.1(+) oCMV- Vektors wurde das 2709 bp große Fragment, das mit Spei (27083 bp) und Xliol (29792 bp) aus der Wildtypvirus DNA ausgeschnitten wurde, hineinkloniert (pcDNA3.1(+) oCMV/E3a¥7zöI). Alternativ kann am 3' Ende statt mit Xhol mit Hpal (30570 bp) geschnitten werden. Dazu wird der Vektor pcDNA3.1(+) oCMV dann mit Spei und EcoRV aufgeschnitten und das adenovirale Spel-Hpäl- Fragment hineikloniert (pcDNA3.1(+) oCMV/E3aHpal). Eine weitere Möglichkeit bietet das 2718 bp große EcoRI-Fragment aus der Adenovirus Wildtyp-DNA (Positionen 27332 bp und 30050 bp), das in den mit EcoRI geöffneten ρcDNA3.1(+) oCMV kloniert wird (ρcDNA3.1(+) oCMV/E3aEcoi?7). Mit Hilfe von ρcDNA3.1(+) oCMV/E3a konnte die E3a-Region in den Vektor ΔE3RGD- E4ΔORF6-pShuttle (-NJeI)-AdEASY kloniert werden: Der Shuttlevektor ΔE3RGD-E4ΔORF6- pShuttle (-NJeI)-AdEASY wurde hierzu mit Nhel geschnitten, die Enden geglättet und weiter mit Spei geschnitten. In diese Stelle wurde das Insert aus pcDNA3.1(+) oCMV/E3aA7zoI hineinkloniert: Das Plasmid wurde dazu mit Xhol geschnitten, die Enden geglättet und weiter mit Spei geschnitten. Das so herausgeschnittene Fragment wurde in das zuvor aufgeschnittene Plasmid ΔE3RGD-E4ΔORF6-pShuttle (-MM)-AdEAS Y kloniert.
Auf die gleiche Weise lassen sich die Fragmente Spei - Hpäl (Position 27083 bp bis 30570 bp) und EcoRI (Position 27332 bp bis 30050 bp) aus den jeweiligen aus pcDNA3.1(+) oCMV/E3a- Konstrukten rausschneiden und umklonieren.
Alternativ kann der E3a-B ereich durch PCR mit den Primern E3a forward (Spei) 5'- CTTAAGGACTAGTTTCGCGC -3' und E3a reverse {Xhol, Nhel) 5'- CAAGCTAGCTCGAGGAATCATG -3' mit der Adenovirus Typ 5 wildtyp-DNA als Template amplifiziert werden. Mit dem E3a reverse-Vήmsx wird dabei eine NAeI Schnittstelle generiert. Das Amplifikat wird mit Spei und Nhel restringiert und in den ebenso Spei und Nhel aufgeschnittenen Vektor ΔE3RGD-E4ΔORF6-pShuttle (-MM)-AdEASY kloniert.
Für das Spei - Hpal - Fragment
Alternativ kann der E3a-Bereich durch PCR mit den Primern E3a forward (Spei) 5'- CTTAAGGACTAGTTTCGCGC -3' und E3a reverse {Hpal, Nhel) 5'- CACGCTAGC AAGTT AACCATGTCTTGG-3' mit der Adenovirus Typ 5 wildtyp-DΝA als Template amplifiziert werden. Mit dem E3a reverse-Primer wird dabei eine Nhel Schnittstelle generiert. Das Amplifikat wird mit Spei und NAeI restringiert und in den ebenso Spei und Nhel aufgeschnittenen Vektor ΔE3RGD-E4ΔORF6-pShuttle (-NJeI)-AdEASY kloniert.
Für das EcoRI- Fragment
Alternativ kann der E3a-Bereich durch PCR mit den Primern E3a forward (EcoRI) 5'- GAAACCGAATTCTCTTGGAAC -3' und E3a reverse {Nhel, EcoRI) 5'- GAATTCTAGCTAGCTCAGCTATAG -3' mit der Adenovirus Typ 5 wildtyp-DΝA als Template amplifiziert werden. Mit dem Ε3a reverae-Primer wird dabei eine N7zel Schnittstelle generiert. Das Amplifikat wird mit EcoRI und Nhel restringiert und in den ebenso EcoRI und MeI aufgeschnittenen Vektor ΔE3RGD-E4ΔORF6-ρShuttle (-Ndeϊ)- AdEASY kloniert.
Durch Umklonierung des E3a-Bereiches aus pcDNA3.1(+) oCMV/E3a in ΔE3RGD-E4ΔORF6- pShuttle (-7V^eI)-AdEASY entstand E3aΔE3RGD-E4ΔORF6-pShuttle (-Ndeϊ)- AdEASY.
Der so ldonierte Bereich umfaßt die E3-Region bis nach dem offenen Leserahmen für das E3 ADP (Position 29772 bp) und damit den E3 Promotor, den gesamten E3A-Bereich mit Polyadenylierungssignal, den Transkriptionsstart, und die offenen Leserahmen für 12,5 K, E3 6,7 K5 E3 gpl9 K und E3 ADP.
Die E3 Region ist im Vergleich zur Adenovirus Typ 5-DNA Sequenz im Falle der Spei -Xhol Klonierung von Position 29796 bis 31509 bp deletiert (= 1713 bp).
Weitere Deletionen sind zwischen dem E3 Promotor und dem offenen Leserahmen für das ADP sind mit dem Plasmid pcDNA3.1(+) oCMV/E3a möglich: Durch weitere Restriktionen zwischen Position 27596 bp und 29355 bp, zum Beispiel mit EcoRlI, BsiWI, Dral, Muni, können die dazwischen liegenden offenen Leserahmen für 6,7 K und gpl9 K entfernt und damit bis zu 1,8 kb mehr Platz für den Einbau weiterer Transgene bereitet werden. Durch eine entsprechende Restriktion können ebenfalls die oben genannten E3a-Amplifikate verkürzt und wie zuvor beschrieben umkloniert werden.
Klonierung der zweiten Expressionskassette EIa 12S unter der Kontrolle des E2Late- Promotors
Zunächst wurde der E2Late-Promotor als gepaarte Oligonukleotide (Upper Primer 5'- TCGAGCTCCGCATTTGGCGGGCGGGATTGGTCTTCGTAGAACCTAATCTCGTGGGCG TGGTAGTCCTC AGGT AC AAAT-3' und Lower Primer 5'-
AGCTTATTTGTACCTGAGGACTACCACGCCCACGAGATTAGGTTCTACGAAGACCAA TCCCGCCCGCCAAATGCGGAGC-3' in die HMII und BgHI Schnittstelle des pGL3- Enhancer Plasmids der Firma Promega kloniert (pGL3-E2Late).
Anschließend wurde das Luziferasegen mit Ncol und Xhal ausgeschnitten, die Enden geglättet und T-Enden angehängt. An der somit geöffneten Stelle wurde das Transgen ElA 12S, das durch RT-PCR mit den Primern EIa 12S forward 5'-ATGGCCGCCAGTCTTTTG-S' und EIa 12S reverse 5 '-TTATGGCCTGGGGCGTTTAC-S' amplifiziert wurde, durch TA-Klonierung eingebracht.
Die Kassette enthält damit den E2Late-Promotor, den offenen Leserahmen Ela-12S und das SV- 40 Late Polyadenylierungssignal des Vektors pGL3.
Diese Kassette wurde mit Pvul und CIaI rausgeschnitten, die Enden geglättet und kann nun wahlweise in die mit EcoRII, BsiΨl, Dral, Muni deletierte (nach Entfernung der offenen Leserahmen für E3 6,7 K und gpl9 K, siehe oben) E3a-Region Moniert werden, oder in Deletion des E4ORF6, zum Beispiel in die geglättete und dephosphorylierte 5/rI-Sclτnittstelle.
Das entstandene Konstrukt ist E3a/E2Late-Ela-12S/ΔE3RGD-E4ΔORF6-pShuttle (-NJeI)- AdEASY oder E3aΔE3RGD-E4ΔORF6/E2Late-Ela-12S -pShuttle (-NJeI)-AdEASY.
Klonierung der zweiten Expressionskassette EIa 12S mit YB-I unter der Kontrolle des E2Late-Promotors
Die Amplifikate EIa 12S (Siehe oben) und das IRES-Element (pCITE-4a(+) der Firma Νovagen als Template, lKESforward= 5'-TCCGGTTATTTTCCACCATATTGC-S' und IRES reverse = 5'-TTATCATCGTGTTTTTCAAAGG-S') wurden nacheinander in die multiple Klonierungsstelle des pcDΝA3.1(+)-Vektor (Invitrogen) hineinkloniert. Hierzu wurden das EIa- 12S Amplifϊkat in die geglättete i?αmHI-Schnittstelle durch TA-Klonierung eingebracht. Anschließend wurde das Plasmid Ela-12S in pcDNA3.1(+) mit EcoRV linearisiert, T-Εnden angehängt und das Amplifikat für das IRΕS-Εlement hineinkloniert. Das so entstandene Konstrukt Εla-12S-IRΕS-pcDNA3.1(+) wurde mit NotI linearisiert und die Enden geglättet, ebenso wurde das YB-l-EcoRI-Schnittprodukt aus dem Plasmid pHVad2c CMV/S40 + Yb-I s (Stephan Bergmann) geglättet und in den dephosphorylierten Vektor E1A-12S-IRES- pcDΝA3.1(+) eingebracht. Als Alternative kann auch in die geglättete Notl Schnittstelle des Vektors Ela-12S-IRES-ρcDNA3.1(+) nach Anhängen von T-Enden das PCR-Amplifikat für den offenen Leserahmen des Protein IX eingefügt werden, und zwar mit den Primern TXforward 5'- ATGAGCACCAACTCGTTTG-3' und IX reverse 5'-GTTTTAAACCGCATTGGGAGG-S'. Die Kassette E1A-12S-IRES-YB-1 oder ElA-12S-IRES-Protein IX wurde mit Pmel rausgelöst und in das oben beschriebene Plasmid pGL3-E2Late nach Entfernung des Luziferasegens mit Ncol und Xbal und Glätten und Dephosphorylierung hineinkloniert.
Diese Kassette E21ate-ElA-12S-IRES-YB-l wurde mit Pvul und CM rausgeschnitten, die Enden geglättet und kann nun wahlweise in die mit EcoRTL, BsiWl, Dral, Muni deletierte (nach Entfernung der offenen Leserahmen für E3 6,7 K und gpl9 K, siehe oben) E3a-Region kloniert werden, oder in Deletion des E4ORF6, zum Beispiel in die geglättete und dephosphorylierte 5/rI-Schnittstelle.
Das entstandene Konstrukt ist E3a/E2Late-Ela-12S-IRES-YB-l/ΔE3RGD-E4ΔORF6-pShuttle (- MZeI)-AdEASY oder E3aΔE3RGD-E4ΔORF6/E2Late-Ela-12S-IRES-YB-l -pShuttle (-Ndel)- AdEASY.
Herstellung des Rescue-Plasmids E3a/E2Late-Ela-12S/ΔE3RGD-E4ΔORF6-pAdEASY oder E3aΔE3RGD-E4ΔORF6/E2Late-Ela-12S -pAdEASY beziehungsweise E3a/E2Late-Ela-12S- IRES- YB-l/ΔE3RGD-E4ΔORF6-pAdEASY oder E3aΔE3RGD-E4ΔORF6/E2Late-Ela-12S- IRES-YB-I -pAdEASY
Die E3aΔE3RGD-E4ΔORF6-Region mit der zweiten Expressionskassette E2Late-Ela-12S oder E2Late-Ela-12S-IRES-YB-l in E3a oder E4ΔORF6 wurde mit Spei und Päd aus dem entsprechenden pShuttle-Plasmid E3aΔE3RGD-E4ΔORF6-ρShuttle (-MM)-AdEASY herausgeschnitten und in den entsprechend geöffneten Vektor pAdEASY kloniert, wodurch der neue Rescue-V ektoτ E3a/E2Late-Ela-12S/ΔE3RGD-E4ΔORF6-ρAdEASY oder E3aΔE3RGD- E4ΔORF6/E2Late-Ela-12S -pAdEASY beziehungsweise E3a/E2Late-Ela-12S-IRES-YB- l/ΔE3RGD-E4ΔORF6-pAdEASY oder E3aΔE3RGD-E4ΔORF6/E2Late-Ela-12S-IRES-YB-l - pAdEASY entstand.
E3aΔE3RGD-E4ΔORF6-pAdEASY enthält die E3a-Region, ein RGD-Motiv und einen deletierten E4ORF6, als zweite Expressionskassette liegen entweder E2Late-Ela-12S oder E2Late-Ela-12S-IRES-YB-l in E3a oder E4ΔORF6 vor. Dieses Konstrukt stellt das Rescue- Plasmid für das Einbringen weiterer Transgene in die El Region durch ein Shuttle Plasmid dar. Generierung der Trans genkassette für die El Region
Klonierung der ElB-Region
Für den ElB Bereich wurde das Adenogenom mit Xbal (Position 1340 bp) und Muni (Position 3925 bp) restringiert und das 2585 bp-Framgent in den pShuttle von AdEASY in die Xbal und Muni Schnittstellen kloniert, das damit den gesamten EIB-Bereich enthält (pShuttle/ElB).
Alternativ kann der EIB-Bereich durch PCR mit den Primern ElB forward 5'- GTGTCTAGAGAATGCAATAGTAG-3' und ElB reverse 5'-
GTCAAAGAATCCAATTGTGC-3' mit der Adenovirus Typ 5 wildtyp-DNA als Template amplifϊziert werden, mit Xbal und Muni restringiert werden und in die Xbal und Muni Schnittstellen des pShuttle von AdEASY kloniert werden.
Damit umfaßt pShuttle/ElB den EIB-Promotor, die offenen Leserahmen für E1B19K, E1B55K und das Protein IX und den natürlichen PoIy-A Teil. Der EIB-Promotor wurde mit Hilfe von Xbal und Hpal entfernt, die Enden des Vektors geglättet und durch den CMV-Promotor aus pcDNA3.1(+) der Firma Invitrogen, der mit MIuI und Xhόl geschnitten wurde und dessen Enden ebenfalls geglättet wurden, ersetzt. Alternativ kann anstelle des CMV- Promotors ein RSV- Promotor oder ein tumorspezifischer bzw. virale Promotoren die Expression des EIB-Bereichs steuern, beispielsweise die im Patent aufgeführten Promotoren.
Vorbereitung des RSV-PIasmids für die Herstellung der Kassette RSV-E40RF6-polyA.
Das Plasmid pRc/RSV der Firma Invitrogen wurde mit Xhol, Spei und Xbal geschnitten. Die daraus entstandenen 2810 bp und 278 bp Fragmente wurden religiert, so daß dadurch der Fl Origin und das Neomyzin-Resistenzgen (oNeo) entfernt wurden.
Der daraus entstandene Vektor pRc/RSV (oNeo) besitzt nur noch eine 5αmHI-Schnittstelle3 in die der offene Leserahmen von E4ORF6 aus dem Plasmid CGN von Dobbelstein hineinldoniert wurde. Alternativ kann das Ampfilikat einer PCR mit den Primern Ε,4ORF6-forward 5'- ATGACTACGTCCGGCGTTCC-3' und E4OKF6-reverse 5'-CTACATGGGGGTAGAGTC-S' in die EcoRV-Schnittstelle des Vektors pRc/RSV (oNeo) nach Anhängen von T-Enden (TA- Klonierung) eingebracht werden. Alternativ kann anstelle des RSV- Promotors (durch Herauslösen mit MIuI und HindΩI) ein CMV-Promotor (herausgelöst aus pcDNA3.1(+) mit MM und HindΩI) oder ein tumorspezifischer bzw. virale Promotoren die Expression des E4orf6 steuern, beispielsweise die im Patent aufgeführten Promotoren.
Die Kassette RSV-E4ORF6-polyA (das Bovine Growth Hormone Polyadenylierungssignal stammt aus dem Plasmid pRC/RSV) wurde mit Muni geschnitten, die Enden geglättet und weiter mit Xhol aus den Plasmid herausgelöst. Die Expressionskassette wurde anschließend in den mit Notl geschnittenen und geblunteten, dann mit Xhol geschnittenen Vektor p Shuttle/E IB kloniert. Daraus entstand der Vektor RSV-E4ORF6-polyA/ElB-pShuttle-AdEASY.
Einbringung der transgenen Kassette in den Rescue- Vektor
Der Vektor RSV-E4ORF6-polyA/ElB-ρShuttle-AdEASY für den El -Bereich wurde mit Bstl 1071 und Mrol linearisiert und zusammen mit dem i?e^cwe-Plasmid (siehe oben) in BJ5183 (EC) Bakterien mittels Elektroporation eingebracht. Durch homologe Rekombination entstand das adenovirale Plasmid RSV-E4ORF6-polyA/ElB-E3a/E2Late-Ela-12S/ΔE3RGD-E4ΔORF6- pAdEASY (oder entsprechend mit den anderen oben genannten Rescue- Vektor- Varianten), das nach Transfektion in HEK293 Zellen zur Virusproduktion führte.
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung und für den Fachmann im Lichte der vorliegenden Offenbarung durchführbar, dass für die Herstellung der erfindungsgemäßen, bevorzugterweise rekombinanten Adenoviren, insbesondere solche, welche die oben genannten Expressionskassetten einzeln und/oder zusammen enthalten, auch andere Systeme verwendet werden können, z. B. pAdenoX-System der Firma Clontech/ BD Biosciences oder das System der Firma Microbix.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen sowie den Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebigen Kombinationen für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausfuhrungsformen wesentlich sein.

Claims

Ansprüche
1. Virus, bevorzugterweise Adenovirus, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus umfasst:
- eine fehlende funktionale Wildtyp-El -Region, und
- einen Transporter für den Transport von YB-I in den Zellkern einer Zelle, die mit dem Virus infiziert ist.
2. Virus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus eine für Protein IX codierende Nukleinsäure umfasst und Protein IX exprimiert.
3. Virus nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die fehlende funktionale Wildtyp-El -Region ElA-minus ist.
4. Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die fehlende funktionale Wildtyp-El -Region ElB-minus ist.
5. Virus nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die fehlende Wildtyp-El -Region ElB55K-minus ist und/oder ElB19K-minus ist und/oder Protein IX-minus ist.
6. Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Transporter ein von dem Virus bereitgestellter Transporter ist.
7. Virus nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen viralen Transporter handelt.
8. Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Transporter das Protein E4orf6 umfasst.
9. Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Transporter das Protein E1B55K umfasst.
10. Virus nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Transporter einen Komplex aus E4orf4 und E1B55K umfasst.
11. Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Transporter von einer Nukleinsäure codiert ist, wobei die Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Promotors steht.
12. Virus nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Transporter ein Komplex aus mindestens zwei Faktoren ist und jeder Faktor von einer Nukleinsäure codiert wird, wobei die beiden Nukleinsäuren von einem gemeinsamen Promotor gesteuert werden.
13. Virus nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden codierenden Nukleinsäuren durch ein die Expressionsstärke regulierendes Element miteinander verbunden sind, wobei das Element bevorzugterweise aus der Gruppe ausgewählt ist, die IRES umfasst.
14. Virus nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Transporter ein Komplex aus mindestens zwei Faktoren ist und jeder Faktor von einer Nukleinsäure codiert wird, wobei die beide Nukleinsäuren jeweils von einem eigenen Promotor gesteuert werden.
15. Virus nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor verschieden ist von dem E4-Promotor, insbesondere adenoviralen E4-Promotor, und verschieden ist von dem EIB-Promotor, insbesondere dem adenoviralen EIB-Promotor.
16. Virus nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend gewebespezifϊsche Promotoren, tumorspezifische Promotoren, den CMV-Promotor, virale Promotoren, insbesondere adenovirale Promotoren unter der Vorraussetzung, dass diese verschieden sind von dem E4-Promotor, dem EIB-Promotor und bevorzugterweise auch verschieden ist von dem E2-late-Promotor.
17. Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die für den Transporter codierende Nukleinsäure am 3'-Ende von ElB 55K eine 3'-UTR aufweist.
18. Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass wenn die fehlende Wildtyp-El -Region E1B55K positiv ist, die für den Transporter codierende Nukleinsäure keine für E1B55K codierende Nukleinsäure umfasst.
19. Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die für den Transporter codierende Nukleinsäure E1B55K und E1B19K codiert.
20. Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 19, bevorzugterweise Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die für den Transporter codierende Nukleinsäure für Protein IX codiert.
21. Virus nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass die für E1B55K und E1B19K codierende Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Promotors stehen.
22. Virus nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass die für E1B55K und/oder ElB 19K und/oder Protein IX codierende Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Promotors steht, wobei bevorzugterweise der Promotor verschieden ist von einem ElA- abhängigen Promotor.
23. Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die fehlende funktionale Wildtyp-El -Region ElA13S-minus und/oder ElA12S-minus ist.
24. Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass die fehlende funktionale Wildtyp-El-Region El A13S-minus ist.
25. Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass bevorzugterweise die fehlende Wildtyp-El-Region ElA13S-minus und ElA12S-minus ist, wobei das Virus eine Nukleinsäure umfasst, die für das E1A12S-Protein codiert, wobei die Nukleinsäure bevorzugterweise eine heterologe Nukleinsäure ist.
26. Virus nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die für das E1A12S-Protein codierende Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Promotors steht, wobei der Promotor bevorzugterweise ein YB-I abhängiger Promotor ist und bevorzugtererweise aus der Gruppe ausgewählt ist, die den adenoviralen E2-Late-Promotor, den MDR-Promotor und den DNA-Polymerase alpha - Promotor umfasst.
27. Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 26, insbesondere Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass die für den Transporter codierende Nukleinsäure^) für E4orf6 und E1B55K codiert/codieren.
28. Virus nach Anspruch 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, dass der Virus eine für das Protein IX codierende Nukleinsäure umfasst, wobei bevorzugterweise die für das E1A12S codierende Nukleinsäure und die für das Protein IX codierende Nukleinsäure unter der Kontrolle eines gemeinsamen Promotors stehen, wobei bevorzugtererweise die beiden codierenden Nukleinsäuren durch ein die Expression regulierendes Element miteinander verbunden sind, wobei das Element noch bevorzugtererweise aus der Gruppe ausgewählt ist umfassend IRES.
29. Virus nach einem der Ansprüche 25 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass die für das E1A12S-Protein codierende Nukleinsäure und die für das Protein IX codierende Nukleinsäure jeweils unter der Kontrolle eines Promotors stehen, wobei der Promotor bevorzugterweise der gleiche Promotor ist.
30. Virus nach einem der Ansprüche 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor ein YB-I abhängiger Promotor ist, der bevorzugterweise aus der Gruppe ausgewählt ist, die den adenoviralen E2-Late-Promotor, den MDR-Promotor und den DNA-Polymerase alpha - Promotor umfasst.
31. Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 30, bevorzugterweise einem der Ansprüche 24 bis 30, bevorzugtererweise Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus eine für YB-I codierende Nukleinsäure umfasst.
32. Virus nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass die für das E1A12S-Protein codierende Nukleinsäure und die für YB-I codierende Nukleinsäure unter der Kontrolle eines gemeinsamen Promotors stehen, wobei bevorzugterweise die beiden codierenden Nukleinsäuren durch ein die Expression regulierendes Element miteinander verbunden sind, wobei das Element bevorzugtererweise aus der Gruppe ausgewählt ist umfassend IRES.
33. Virus nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass die für YB-I codierende Nukleinsäure und die für das E1A12S-Protein codierende Nukleinsäure jeweils unter der Kontrolle eines Promotors stehen, wobei der Promotor bevorzugterweise der gleiche Promotor ist.
34. Virus nach einem der Ansprüche 31 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor ein YB-I abhängiger Promotor ist, der bevorzugterweise aus der Gruppe ausgewählt ist umfassend den adenoviralen E2-Late-Promotor, den MDR-Promotor und den DNA- Polymerase alpha - Promotor.
35. Virus nach einem der Ansprüche 24 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass die für das El A12S codierende Nukleinsäure in die E3-Region oder E4-Region einkloniert ist.
36. Virus nach einem der Ansprüche 24 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass die für das ElAl 2S codierende Nukleinsäure und die für Protein IX codierende Nukleinsäure oder die für YB-I -codierende Nukleinsäure in die E3-Region oder die E4-Region einkloniert ist.
37. Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression der für Protein IX codierenden Nukleinsäure über einen von ElB verschiedenen Promotor, über E1B19K oder über E12AS gesteuert wird.
38. Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 37, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus mindestens ein Transgen umfasst, das bevorzugterweise in die E3-Region einkloniert ist.
39. Virus nach Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus mindestens ein Transgen umfasst, das bevorzugterweise in die E4-Region einkloniert ist.
40. Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 39 umfassend eine für ein RGD-Motiv codierende Nukleinsäure, wobei das RGD-Motiv bevorzugterweise in die HI-Loop-Domäne des Fibre Knobs einkloniert ist.
41. Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 40 weiter umfassend MLP-Gene und/oder E2A- Gene und E2B Gene und/oder E3-Gene und/oder E4-Gene.
42. Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 41, dadurch gekennzeichnet, dass es replikationsdefϊzient ist in Zellen, die YB-I nicht im Zellkern aufweisen.
43. Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 42, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus replikationsfahig ist in Zellen, die YB-I im Kern aufweisen, insbesondere YB-I unabhängig vom Zellzyklus im Kern aufweisen.
44. Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 42, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus replikationsfahig ist in Zellen, bei oder in denen YB-I dereguliert vorliegt.
45. Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 42, dadurch gekennzeichnet, dass es in Tumorzellen, insbesondere Tumorzellen, die eine Resistenz gegen Cytostatika und/oder Bestrahlung aufweisen, replikationsfahig ist.
46. Virus nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen eine Vielfachresistenz aufweisen.
47. Nukleinsäure codierende für ein Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 46 oder einen Teil davon.
48. Verwendung eines Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 46 oder einer Nukleinsäure nach Anspruch 47 oder eine diese enthaltenden Vektor oder ein diese oder einen Teil der Nukleinsäure enthaltendes Replikationssystem zur Herstellung eines Medikamentes.
49. Verwendung eines Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 46 oder einer Nukleinsäure nach Anspruch 47 zur Replikation in Zellen, wobei die Zellen YB-I im Zellkern aufweisen, bevorzugterweise unabhängig vom Zellzyklus im Kern aufweisen, oder die Zellen dereguliertes YB-I aufweisen, oder die Zellen Tumorzellen sind, insbesondere Tumorzellen, die eine Resistenz gegen Cytostatika und/oder Bestrahlung aufweisen.
50. Verwendung nach Anspruch 49, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen YB-I im Kern aufweisen nach oder infolge einer Maßnahme, die an der Zelle angelegt wird oder worden ist und ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Bestrahlung, Gabe von Cytostatika und Hyperthermie.
51. Verwendung nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament für die Behandlung von Tumoren und/oder Krebserkranlcung(en) ist und/oder für die Wiederherstellung der Empfindlichkeit von Zellen gegenüber Cytostatika und/oder Bestrahlung, wobei die Zellen bevorzugterweise Tumorzellen sind, die eine Resistenz gegen Cytostatika und/oder Bestrahlung aufweisen.
52. Verwendung nach Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Teil der den Tumor ausbildenden Zellen Zellen sind, die YB-I im Kern aufweisen, bevorzugterweise unabhängig vom Zellzyklus YB-I im Kern aufweisen, oder mindestens ein Teil der den Tumor ausbildenden Zellen dereguliertes YB-I aufweisen oder mindestens ein Teil der den Tumor ausbildenden Zellen Tumorzellen sind, insbesondere Tumorzellen, die eine Resistenz gegen Cytostatika und/oder Bestrahlung aufweisen.
53. Verwendung nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen, insbesondere die den Tumor oder Teile davon ausbildenden Zellen eine Resistenz, insbesondere Mehrfachresistenz oder Vielfachresistenz gegen pharmakologische Wirkstoffe, bevorzugterweise Antitumormittel und bevorzugtererweise Cytostatika, aufweisen.
54. Verwendung nach einem der Ansprüche 51 bis 53 bevorzugterweise Anspruch 53, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen eine Expression, bevorzugterweise eine Überexpression des membranständigen Transportproteins P-Glykoprotein zeigen.
55. Verwendung nach einem der Ansprüche 49 bis 54 dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen YB-I im Kern aufweisen, insbesondere die den Tumor oder einen Teil davon ausbildenden Zellen YB-I im Kern aufweisen.
56. Verwendung nach einem der Ansprüche 49 bis 55, dadurch gekennzeichnet, dass der Tumor YB-I im Kern nach Induktion des Tranports von YB-I in den Kern enthält.
57. Verwendung nach Anspruch 56, dadurch gekennzeichnet, dass der Transport von YB-I in den Kern ausgelöst wird durch zumindest eine Maßnahme, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die Bestrahlung, Gabe von Cytostatika und Hyperthermie umfasst.
58. Verwendung nach Anspruch 57, dadurch gekennzeichnet, dass die Maßnahme an einer Zelle, einem Organ oder einem Organismus angewandt wird.
59. Verwendung eines viralen Replikationssystems, insbesondere eines adenoviralen Replikationssystems, umfassend eine Nukleinsäure, die für einen Virus, insbesondere einen Adenovirus, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 46 oder einen Teil davon codiert, und umfassend eine Nukleinsäure eines Helfervirus, wobei die Nukleinsäure des Helfervirus eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die für YB-I codiert, und den Virus optional komplementiert, bevorzugterweise zur Herstellung eines Medikamentes, bevozugterweise zur Behandlung von Tumoren und/oder Krebserkrankung(en) und/oder für die Wiederherstellung der Empfindlichkeit von Zellen gegenüber Cytostatika und/oder Bestrahlung, wobei die Zellen bevorzugterweise Tumorzellen sind, die eine Resistenz gegen Cytostatika und/oder Bestrahlung aufweisen.
60. Verwendung eines viralen Replikationssystems, bevorzugterweise eines adenoviralen Replikationssystems nach Anspruch 59, dadurch gekennzeichnet, dass die virale Nukleinsäure, bevorzugterweise die adenovirale Nukleinsäure und/oder die Nukleinsäure des Helfervirus als replizierbarer Vektor vorliegt.
61. Verwendung einer Nukleinsäure codierend für einen Virus, bevorzugterweise einen Adenovirus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 46 zur Herstellung eines Medikamentes, bevorzugterweise zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Tumoren und/oder für die Wiederherstellung der Empfindlichkeit von Zellen gegenüber Cytostatika und/oder Bestrahlung, wobei die Zellen bevorzugterweise Tumorzellen sind, die eine Resistenz gegen Cytostatika und/oder Bestrahlung aufweisen.
62. Verwendung nach Anspruch 61, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen, insbesondere die den Tumor oder Teile davon ausbildenden Zellen, eine Resistenz, insbesondere eine Mehrfachresistenz gegen pharmakologische Wirkstoffe, bevorzugterweise Antitumormittel, und bevorzugtererweise Cytostatika, aufweisen.
63. Vektor umfassend eine Nukleinsäure nach Anspruch 47 bevorzugterweise zur Verwendung gemäß einem der Ansprüche 48 bis 58.
64. Verwendung eines mit YB-I wechselwirkenden Mittels zur Charakterisierung von Zellen, Zellen eines Tumorgewebes oder Patienten, um zu bestimmen, ob diese(r) mit einem Virus, insbesondere einem Adenovirus, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 46 oder einer Nukleinsäure nach Anspruch 47 kontaktiert und/oder behandelt werden kann/sollen.
65. Verwendung nach Anspruch 64, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel ausgewählt ist aus der Gruppe, die Antikörper, hoch-affin bindende Peptide, Antikaline, Aptamere, Aptazyme und Spiegelmere umfasst.
66. Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend einen Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 46, oder eine Nukleinsäure nach Anspruch 47 oder ein virales Replikationssystem wie in Anspruch 59 oder 60 beschrieben.
67. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 66, wobei die Zusammensetzung mindestens eine weitere pharmazeutisch wirksame Verbindung enthält.
68. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 67, wobei die pharmazeutisch wirksame Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, die Cytokine, Metalloproteinasen- Inhibitoren, Angiogenese-Inhibitoren, Cytostatika, Zellzyklus-Inhibitoren, Proteosomen- Inhibitoren, rekombinante Antikörper, Inhibitoren der Signaltransduktionskaskade und Proteinkinasen umfasst.
69. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung eine Kombination von mindestens zwei Verbindungen umfasst, wobei bevorzugterweise eine jede Verbindung einzeln und unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, die Cytostatika umfasst.
70. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 69, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei der Verbindungen an unterschiedlichen Zielmolekülen angreifen.
71. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 68 bis 70, bevorzugterweise Anspruch 70, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei der Verbindungen über einen unterschiedlichen Wirkmechanismus aktiv sind.
72. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 69 bis 71, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Verbindung die Infizierbarkeit einer Zelle durch den Virus erhöht, in der der Virus repliziert.
73. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 69 bis 72, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Verbindung die Verfügbarkeit einer Komponente der Zelle beeinflusst, bevorzugterweise die Verfügbarkeit der Komponente erhöht, wobei die Komponente die Aufnahme des Virus in eine oder die Zelle vermittelt, in der bevozugterweise der Virus repliziert.
74. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 69 bis 73, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Verbindung den Transport von YB-I in den Zellkern vermittelt, bevorzugterweise erhöht.
75. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 69 bis 74, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Verbindung ein Histon-Deacylase-Inhibitor ist.
76. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 75, dadurch gekennzeichnet, dass der Histon-Deacylase-Inhibitor aus der Gruppe ausgewählt ist, die Trichostatin A, FR 901228, MS-27-275, NVP-LAQ824, PXDlOl Apicidin und Scriptaid umfasst.
77. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 69 bis 75, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Verbindung aus der Gruppe ausgewählt ist, die Trichostatin A, FR 901228, MS-27-275, NVP-LAQ824, PXDlOl Apicidin und Scriptaid umfasst.
78. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 69 bis 77, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Verbindung ein Topoisomerase-Inhibitor ist.
79. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 78, dadurch gekennzeichnet, dass der Topoisomerase-Inhibitor aus der Gruppe ausgewählt ist, die Camptothecin, Irinotecan, Topotecan, DX-895If, SN-38, 9-Aminocamptothecin, 9-Nitrocamptothecin, Daunorubicn und Etoposid umfasst.
80. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 67 bis 79, insbesondere 79, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung Trichostatin A und Irinotecan umfasst.
81. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 66 bis 80, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus, insbesondere das Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 46, getrennt von einem oder beiden oder allen der mindestens zwei Verbindungen ist.
82. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 81, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Einheitsdose des Virus von mindestens einer Einheitsdose von der oder allen weiteren pharmazeutisch wirksamen Verbindung(en) oder von einer oder den mindestens zwei Verbindungen getrennt ist.
83. Kit umfassend einen Virus, insbesondere einen Virus nach einem der vorangehenden Ansprüche, und mindestens zwei pharmazeutisch wirksamen Verbindungen, wobei eine jede pharmazeutisch wirksame Verbindung einzeln und unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist, die Cytostatika umfasst.
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