MX2010014079A

MX2010014079A - Inmunoglobulinas con agregacion reducida.

Info

Publication number: MX2010014079A
Application number: MX2010014079A
Authority: MX
Inventors: Naresh Chennamsetty; Bernhard Helk; Veysel Kayser; Vladimir Voynov; Bernhardt Trout
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2008-06-20
Filing date: 2009-06-19
Publication date: 2011-02-22
Also published as: JP2017071627A; PL2310412T3; US8747848B2; CA2727937A1; JP2015107126A; TR201807049T4; RU2532226C2; EP2310412A2; CN106822891A; EP2310412B1; AU2009259901B2; JP2012502622A; WO2009155513A2; US20120003211A1; JP2019000121A; CN102625813A; US20140348820A1; KR20110059588A; BRPI0915419A2; RU2011101994A

Abstract

La presente descripción se relaciona a inmunoglobulinas con agregación reducida y composiciones, métodos para generar las inmunoglobulinas con herramientas computacionales y métodos para usar las inmunoglobulinas particularmente en el tratamiento y prevención de enfermedades.

Description

INMUNOGLOBULINAS CON AGREGACION REDUCIDA Campo de la Invención La presente invención se relaci oglobulinas mejoradas las cuales tienen ag ida.

Antecedentes de la Invención El entender y controlar la estabilidad de p ido un propósito muy codiciado para los b eos, e ingenieros. El primer enlace e itución de aminoácidos y enfermedades (Ingram, , 180 (4581) : 326-8) ofrece una perspectiva ial en la estabilidad de proteínas en medad. El reciente incremento tremendo de farma se de proteínas, particularmente farmacéuticos a oglobulinas , ha creado un reto nuevo. Las p medades, los anticuerpos constituyen actualm más rápidamente creciente de terapéuticos er. Nature Reviews Immunology, 2006, 6(5), 343) su mercado ha estado creciendo en una velo miento promedio anual de 35%, la velocidad todas las categorías de fármacos de Biot wal . Nature. Biotech. 2007, 25 (10) 1097).

Las inmunoglobul inas terapéuticas son prep enadas en soluciones acuosas en concentracione es requerido para el tratamiento de enfermeda go, estas inmunoglobulinas son in dinámicamente bajo estas condiciones y se o a la agregación. La agregación a su vez lle inución en una actividad de anticuerpo que co ineficaz y puede incluso generar una r ológica. De esta forma, hay una necesidad urge nticuerpos son sales de bases que contienen ni la arginina, guanidina, o imidazol (patente 5275) . Otros aditivos adecuados para estabiliza oliéteres (EPA0018609) , glicerina, albúmina y su ano (Patente de los Estados Unidos de Norteamé 05) , detergentes y tensioactivos como los tensi se de polisorbato (Publicación DE2652636, y Pub 5906 (Solicitud de Patente de Gran Bret 4349) ) , chaperonas como GroEL (Mendoza, Bio 1991, (10) , 535-540) , amortiguador de 22335) o agentes quelantes (solicitud WO9115509) aditivos permiten a las proteínas ser estabili grado en solución, sufren de ciertas desventa ecesidad de etapas de procesamiento adicion ión de aditivos.

Las variantes de inmunoglobulinas optimiz De esta forma, hay una necesidad siciones de inmunoglobulinas mejoradas, co éuticos de anticuerpos, que son estab tamente sin el uso de aditivos .

Sumario de la Invención Se describe en la presente inmunogl adas las cuales exhiben agregación reduc ilidad mejorada que cumplen esta necesidad.

De esta forma un aspecto incluye inmunogl icadas y/o aisladas que tienen una tendencia agregación las cuales comprenden por lo me ion reductora de agregación en un residuo en un rvado de la inmunoglobulina que (i) tiene una t agregación espacial (radio de esfera 5Á) de por ó (ii) tiene una tendencia a la agregación o de esfera 5Á) de más de 0.0 y está dentro de ión de reducción de agregación no es en un res sponde al residuo Kabat 23 (bisagra) ó 235 (bis en base a la alineación con la secuencia I as modalidades que pueden ser combinadas idades precedentes, la inmunoglobulina tiene una ción de agregación en un residuo que (i) ti ncía a la agregación espacial (radio de esfera o menos 0.15, ó (ii) tiene una tendencia a la ag ial (radio de esfera 5Á) de más de 0.01 y está d e un residuo el cual tiene una tendencia a la ag ial (radio de esfera 5Á) de por lo menos 0.15, segunda mutación reductora de agregación itución con un residuo de aminoácidos que itución con un residuo de aminoácidos que dism ncía a la agregación especial (radio de esfera úo como se compara con la inmunoglobulina no mu nes de agregación diferentes. En ciertas modalid n ser combinadas con cualquiera de las mod dentes, la mutación reductora de agregación itución con un residuo de aminoácidos que e fóbico que el residuo en la inmunoglobu icada. En ciertas modalidades que pueden ser co las modalidades precedentes, la mutación redu ación es una substitución con un residuo de ami cionado del grupo el cual consiste de lisina, a dina, glutamato, aspartato, glutamina, y aspara as modalidades que pueden ser combinadas idades precedentes, la mutación reductora de ag una substitución con un residuo de ami cionado del grupo el cual consiste de lisina, a tidina. En ciertas modalidades que pueden ser co las modalidades precedentes, la mutación redu idades precedentes, la inmunoglobulina es una as modalidades que pueden ser combinadas idades precedentes, la inmunoglobulina es una as modalidades que pueden ser combinadas idades precedentes, la inmunoglobuina tiene un umano. En ciertas modalidades que pueden ser co las modalidades precedentes, la inmunoglobulina io CH2 humano. En ciertas modalidades que pu nadas con las modalidades precedente ioglobulina tiene un dominio CH3 humano. En idades que pueden ser combinadas con las mod dentes, la inmunoglobulina tiene un dominio CL iertas modalidades que pueden ser combinadas idades precedentes, la inmunoglobulina ti dad de enlace para un antígeno objetivo y la afi e para el antígeno objetivo es por lo menos set g/ml, por lo menos 125 mg/ml, o por lo menos 150 Otro aspecto, incluye una inmunog icada o aislada que tiene una tendencia reduc ación la cual comprende por lo menos una tora de agregación en un residuo seleccionado d ual consiste de residuos de un patrón de agreg (CHi) , 175 (cHi) , y 181 (CHi) ; un patrón de agreg (bisagra) , 227 (bisagra) , 228 (bisagra) , 229 (b (bisagra) , 231 (bisagra) y 232 (bisagra) ; un p ación 3: 234 (bisagra) y 235 (bisagra); un p ación 4: 252 {CR2) y 253 (CH2) ; un patrón de ag 82 (CH2) ; un patrón de agregación 6: 291 (CH2) ; u gregación 7: 296 ((¾) ; un patrón de agregació y 309 (CH2) ; un patrón de agregación 9: 328 ( , 330 (CH2) / y 331 (CH2) ; un patrón de agregación , 396 (CH3), 397 (CH3), 398 (CH3) y 404 (CH3) ; un p úos son los miembros de residuos Kabat correspo gGl en base a la alineación con la secuencia as modalidades, el por lo menos un residuo de tora de agregación se selecciona del grupo ste de residuos de un patrón de agregación 1: 1 atrón de agregación 2: 227 (bisagra), 228 (bis (bisagra); un patrón de agregación 3: 234 (bisagr grá) ; un patrón de agregación 4: 253 ((¾) ; un p ación 5: 282 (CH2) ; un patrón de agregación 6: 2 atrón de agregación 7: 296 ((¾) ; un patrón de ag 09 (CH2) ; un patrón de agregación 9: 329 (¾ ; un patrón de agregación 10: 395 (<¾) y 398 ( n de agregación 11: 443 (CH3) un patrón de ag 110 (CL) ; un patrón de agregación 13: 154 (CL) n de agregación 14: 201 (CL) . En ciertas mod ueden ser combinadas con las modalidades precede una segunda mutación reductora de agregació úo hidrofóbico que (i) tiene una tendenci acion espacial de por lo menos 0.15, ó (ii) est Á de un residuo el cual tiene una tendenci acion espacial de por lo menos 0.15, en donde l una mutación reductora de agregación ituyente con un residuo de aminoácidos que e fóbico que el residuo en la inmunoglobu icada. En ciertas modalidades que pueden ser co las modalidades precedentes que tienen una ión reductora de agregación, la mutación redu acion y la segunda mutación reductora de ag por lo menos 5Á, por lo menos 10Á, por lo meno lo menos 20Á aparte. En ciertas modalidades qu combinadas con cualquiera de las modalidades pre tienen una segunda mutación reductora de agrega tora de agregación es una substitución con un re ácidos seleccionado del grupo el cual cons a, arginina, histidina, glutamato, aspartato, gl sparagina. En ciertas modalidades que pue nadas con cualquiera de las modalidades precede ión reductora de agregación es una substitució o de aminoácidos seleccionado del grupo ste de lisina, arginina, e histidina. En idades que pueden ser combinadas con cualquier idades precedentes, la mutación reductora de ag na substitución con un residuo de lisina. En idades que pueden ser combinadas con las mod dentes, la tendencia a la agregación espacial (e 5Á) se calcula usando la escala de hidrofobi and Mould normalizada de tal forma que la a a 0. En ciertas modalidades que pueden ser co umano . En ciertas modalidades que pueden ser co cualquiera de las modalidades precedent oglobulina tiene un dominio CH3 humano. En idades que pueden ser combinadas con cualquier idades precedentes, la inmunoglobulina tiene u mano. En ciertas modalidades -que pueden ser co cualquiera de las modalidades precedent oglobulina tiene una afinidad de enlace para un ivo y la afinidad de enlace para el antígeno obj lo menos setenta por ciento, por lo menos och o, por lo menos noventa por ciento, por lo me ciento, o por lo menos ciento cinco por cíent idad de enlace de la inmunoglobulina no mutada eno objetivo. En ciertas modalidades que pu inadas con las modalidades precedentes, la ida, concentrada está en una concentración de o menos 20 mg/ml, por lo menos 30 mg/ml , por lo , por lo menos 50 mg/ml, por lo menos 75 mg/ml, 100 mg/ml, por lo menos 125 mg/ml, o por lo m . En ciertas modalidades, la inmunoglobulina est ntración de más de la concentración en. la oglobulina no mutada se agrega consigo misma ión líquida, concentrada bajo las mismas condici as modalidades que pueden ser combinadas idades precedentes, por lo menos ochenta por cie ños ochenta y cinco por ciento, por lo menos nov o, por lo menos noventa y cinco por ciento, por ta y seis por ciento, por lo menos noventa y s o, por lo menos noventa y ocho por ciento, o noventa y nueva por ciento de la inmunog icada no es un monomero agregado. En ciertas mod pueden ser combinadas con cualquiera de las mod ado después de veinticuatro horas de ag rada como se compara con la inmunog1obulina n las mismas condiciones. En ciertas modalida n ser combinadas con las modalidades precede ación es medida por SEC-HPLC. En ciertas modalid n ser combinadas con cualquiera de las mod dentes, la formulación de inmunoglobul ancialmente libre de cualquier aditivo que re ación de inmunog1obulinas . En ciertas modalid n ser combinadas con cualquiera de las mod dentes, la formulación de inmunog1obu1 ancialmente libre de histidina libre, sacá les .

Aún otro aspecto incluye polinucleótidos ai binantes que codifican inmunog1obulina de cualq aspectos de inmunog1obulinas modificadas prece munoglobulina codificada por el polinucleótido .

Otro aspecto incluye métodos para produ oglobulina con una tendencia a la agregación red comprende proporcionar un medio de cultivo ende la célula hospedera del aspecto prece ar el medio de .cultivo en condiciones bajo las c sa la inmunoglobulina . En ciertas modalidad os incluyen una etapa adicional para ai oglobulina expresada.

Otro aspecto incluye métodos para red neia a la agregación de una inmunoglobulina lación farmacéutica altamente concentrada ende proporcionar una inmunoglobulina que tien ación; substituir un residuo en un dominio conse inmunoglobulina que (i) tiene una tendenci ación espacial de por lo menos 0.15, o (ii) t , por lo menos 75 mg/ml, por lo menos 100 mg/ml, 125 mg/ml ó por lo menos 150 mg/ml, y en ncia de agregación que se reduce es agregación ulas de inmunog1obulinas en una solución ntrada .

. Otro aspecto incluye usa usos de cualquier tos de inmunog1obulina modificada precede uiera y todas las combinaciones de las mod dentes en la preparación de un medicamento ende una formulación líquida altamente concent la concentración modificada de i munog1obulina enos 20 mg/ml, por lo menos 30 mg/ml, por lo , por lo menos 50 mg/ml, por lo menos 75 mg/ml, 100 mg/ml, por lo menos 125 mg/ml, o por lo m . En ciertas modalidades, el uso del medicamento tratamiento de enfermedades autoinmuno clastoma; cáncer de mama; osteopania de enf trición; enfermedad periodontal, enfermedad de ocitosis de células de Langerhan, daño de la al, artritis séptica aguda, osteomalacia, sín ng, displasia fibrosa monoostótica, displasia stótica, reconstrucción periodontal, y fractura idosis; cánceres óseas osteolíticas , cáncer d r pulmonar, cáncer renal y cáncer rectal, me manejo del dolor óseo e hipercalcemia maligna dilitis anquilosante y otras espondiloartr zo de trasplante, infecciones virales, ne ológicas y afecciones similares neoplástic lo, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin urkitt, linfoma linfocítico pequeño/leucemia lin ca, fungoides de micosis, linfoma celular rna folicular, linfoma de células B grandes genas agudas, que incluyen AML con maduración, enciación, leucemia promielocítica aguda, monocítica aguda, y leucemias monocíticas omes mielodisplásticas , y trastornos mieloprolif eas, que incluyen leucemia mielógena crónica, sistema nervioso central, por ejemplo tumores ce rna, neuroblastoma, astrocitoma, medulob imoma y retinoblastoma) , tumores sólidos aríngeo, carcinoma celular basal, cáncer panc r del ducto biliar, sarcoma de Kaposi, cular, uterino, cáncer vaginales o cervicales, co, cáncer hepático primario o cáncer endome es del sistema vascular (angiosarc giopericitoma) , osteoporosis , hepatitis, VIH dil artritis, artritis reumatoide, enfe tinales inflamatorias (IBD por sus siglas en is ulcerativa, linfoma no de Hodgkin, cáncer r colorectal, artritis idiopática juvenil, dege ar, virus sincisial respiratorio, enfermedad d tis reumato de, artritis psoriática, espo losante, osteoporosis , pérdida ósea induci miento, metástasis ósea, mieloma múltiple, enfer imer, glaucoma y esclerosis múltiple.

En ciertas modalidades que pueden ser co cualquiera de las modalidades precedentes, el amento además comprende un excipiente a céuticamente .

En ciertas modalidades que pueden ser co cualquiera de las modalidades precedent oglobulina en el medicamento muestra por lo men iento, por lo menos diez por ciento, por lo meno ciento, por lo menos veinte por ciento, por uier aditivo que reduce la agregaci oglobulinas . En ciertas modalidades que pue nadas con cualquiera de las modalidades precede amento es substancialmente libre de histidina idos y polioles.

Otro aspecto incluye usos de cualquiera tos de inmunoglobulinas modificadas preced uiera y todas las combinaciones de las mod dentes como un ingrediente activo farmacéu ante .

Otro aspecto incluye composiciones farma incluyen una inmunoglobulina de cualquiera tos precedentes y cualquiera y todas las combi as modalidades precedentes y un excipiente a céuticamente . En ciertas modalidades, la inmunog por lo menos en una concentración de por lo nos ochenta y cinco por ciento, por lo menos nov o, por lo menos noventa y cinco por ciento, por ta y seis por ciento, por lo menos noventa y s o, por lo menos noventa y ocho por ciento, o noventa y nueve por ciento de la inmunog ica es monómero no agregante. En ciertas moda ueden ser combinadas con cualquiera de las mod dentes, la formulación de inmunoglobulina muestr cinco por ciento, por lo menos diez por ciento quince por ciento, por lo menos veinte por cie enos veinticinco por ciento, por lo menos tre o, por lo menos treinta y cinco por ciento, por nta por ciento, o por lo menos cincuenta po agregado después de veinticuatro horas de ag rada como se compara con la inmunoglobulina n las mismas condiciones. En ciertas modalida les .

Otro aspecto incluye una inmunoglobulina mo lada que tiene una tendencia reducida para agreg comprende por lo menos una mutación reduc ación en un residuo seleccionado del grupo ste de 235 (bisagra), 241 (CH2) , 243 (CH2) , 282 (CH2) en donde si el residuo 235 se selecciona, s utamato o una serina, si el residuo 282 es sele ta a una lisina, y si el residuo 309 es seleccio a una lisina, y en donde la por lo menos una tora de agregación es una substitución con un re ácido que es menos hidrofóbico que el residuo oglobulina no modificada y la tendencia a la ag es reducida es agregación entre las moléc oglobulinas en una solución líquida, concentra los números residuo son los números residu tora de agregación del residuo 243 para tiro as modalidades, la por lo menos una mutación r regación es una mutación del residuo 282 para l munoglobulina modificada o aislada además compr da y una tercera mutación reductora de agrega la segunda mutación reductora de agregación ión del residuo 235 para lisina y la tercera tora de agregación es una mutación del residuo a. En ciertas modalidades, la inmunoglobulina t da mutación reductora de agregación en un fóbico, en donde la por lo menos una mutación r regación es una substitución en un residuo hidr nde la por lo menos una mutación reductora de ag na substitución con un residuo de aminoácidos hidrofóbico que el residuo en la inmunoglob icada. En ciertas modalidades que pueden ser co ncía a la agregación espacial de por lo menos está dentro de 5Á de un residuo que tiene la ten gregación espacial de por lo menos 0.15, en ra mutación reductora de agregación es una subs n residuo de aminoácidos que es menos hidrofóbic úo en la inmunoglobulina no modificada. En idades que pueden ser combinadas con las mod dentes que tienen una segunda mutación reduc ación, la mutación reductora de agregación y la ión reductora de agregación están por lo menos ños 10Á, por lo menos 15Á, o por lo menos 20Á ap as modalidades que pueden ser combinadas con cu las modalidades precedentes que tienen una ión reductora de agregación, la mutación redu ación y la segunda mutación reductora de ag en patrones de agregación diferente. En mato, aspartato, glutamina, asparagina, tir a. En ciertas modalidades que pueden ser combin uiera de las modalidades precedentes, la tora de agregación es una substitución con un re ácidos seleccionado del grupo el cual cons a, serina, glutamato y tirosina. En ciertas mod ueden ser combinadas con las modalidades precede ncía a la agregación espacial (esfera, de radio la usando la escala de hidrofobicidad de Black a lizada de tal forma que la glicina igual a 0. En idades que pueden ser combinadas con cualquier idades precedentes, la inmunoglobulina es una I , una IgG3 , o una IgG4. En ciertas modalidades qu ombinadas con cualquiera de las modalidades prec munoglobulina comprende una IgGl. En ciertas mod pueden ser combinadas con cualquiera de las mod cualquiera de las modalidades precedent oglobulina tiene una afinidad de enlace para un ivo y la afinidad de enlace para el antígeno obj lo menos setenta por ciento, por lo menos och o, por lo menos noventa por ciento, por lo me ciento,* por lo menos ciento cinco por cient dad de enlace de la inmunog1obulina no mutada eno objetivo. En ciertas modalidades que pue nadas con las modalidades precedentes, la ida, concentrada está en una concentración de 10 mg/ml, por lo menos 20 mg/ml, por lo menos 3 lo menos 40 mg/ml , por lo menos 50 mg/ml , por lo l , por lo menos 100 mg/ml, por lo menos 125 mg/m ños 150 mg/ml.

Otro aspecto incluye formulacion oglobulina modificadas que pueden ser he ión líquida, concentrada bajo las mismas condici as modalidades que pueden ser combinadas idades precedentes, por lo menos ochenta por cie nos ochenta y cinco por ciento, por lo menos nov o, por lo menos noventa y cinco por ciento, por ta y seis por ciento, por lo menos noventa y s o, por lo menos noventa y ocho por ciento, o noventa y nueve por ciento de la inmunoglobuli ero no agregado. En ciertas modalidades que pu nadas con cualquiera de las modalidades precede lación incluye un excipiente a céuticamente . En ciertas modalidades que pue nadas con cualquiera de las modalidades precede lación de inmunoglobulina muestra por lo menos c o, por lo menos diez por ciento, por lo menos qu o, por lo menos veinte por ciento, por l dentes, la formulación de inmunoglobul ancialmente libre de cualquier aditivo que re ación de inmunoglobulina . En ciertas modalida n ser combinadas con cualquiera de las mod dentes, la formulación de inmunoglobul ancialmente libre de histidina libre, sacá les .

Aún otro aspecto incluye polinucleótidos ai binantes que codifican inmunoglobulina de cualq spectos de inmunoglobuli a modifica y cualquiera as combinaciones de las modalidades preceden as modalidades, el polinucleótido está en un ve as modalidades, el vector está en un ve sion. En ciertas modalidades que pueden ser co ueden ser combinadas con las modalidades precede tor inducible está enlazado operableme oglobulina. En ciertas modalidades, el método tapa adicional para aislar la inmunoglobulina ex Otro aspecto incluye usar cualquiera tos de inmunoglobulina modificada preced uiera y todas las combinaciones de las mod dentes en la preparación de un medicamento ende una formulación líquida altamente concen la concentración de inmunoglobulina modificad menos 20 mg/ml, por lo menos 30 mg/ml, por lo , por lo menos 50 mg/ml, por lo menos 75 mg/ml , 100 mg/ml, por lo menos 125 mg/ml , o por o m . En ciertas modalidades, el uso del medicamento tratamiento de enfermedades autoinmuno medades inmunológicas , enfermedades infe medades inflamatorias, enfermedades neurológ medades oncológicas y neoplásticas que incluyen al, artritis séptica aguda, osteomalacia, sín ng, displasia fibrosa monoostótica, displasia stótica, reconstrucción periodontal, y fractura idosis; cánceres óseas osteolíticas , cáncer d r pulmonar, cáncer renal y cáncer rectal, me , manejo del dolor óseo e hipercalcemia maligna dilitis anquilosante y otras espondiloartr zo de trasplante, infecciones virales, ne ológicas y afecciones similares neoplástic lo, linforna de Hodgkin, linforna no de Hodgkin urkitt, linforna linfocítico pequeño/leucemia lin ca, mucosis fungoide, linforna del células del rna folicular, linfoma de células B grandes rna de zona marginal, leucemia de célula ca mia linfoplamacítica) , tumores de células pre cíticas, que incluyen leucemia/linforma linfo omes mielodisplásticas , y trastornos mieloprolif cas, que incluyen leucemia mielógena crónica, istema nervioso central, por ejemplo tumores ce rna, neuroblastoma , astrocitoma, medulob imoma y retinoblastoma) , tumores sólidos aríngeo, carcinoma celular basal, cáncer panc r del ducto biliar, sarcoma de aposi, cular, uterino, cáncer vaginales o cervicales, co, cáncer hepático primario o cáncer endome es del sistema vascular (angiosarc giopericitoma) , osteoporosis , hepatitis, VIH, dil artritis, artritis reumatoide, enfe tinales inflamatorias (IBD por sus siglas en s y choque séptico, enfermedad de Crohn, ps raderma, enfermedad de injerto contra huésped ( siglas en inglés) , rechazo de injerto de ratorio, enfermedad de Crohn, artritis reux tis psoriática, espondilitis anquilosante, osteo da ósea inducida por tratamiento, metástasi rna múltiple, enfermedad de Alzheimer, gla rosis múltiple. En ciertas modalidades que pu ñadas con cualquiera de las modalidades precede del medicamento además comprende un excipiente a céuticamente . En ciertas modalidades que pue nadas con cualquiera de las modalidades precede oglobulina en el medicamento muestra por lo men iento, por lo menos diez por ciento, por lo meno ciento, por lo menos veinte por ciento, por icinco por ciento, por lo menos treinta por cie enos treinta y cinco por ciento, por lo menos ciento, o por lo menos cincuenta por cíent ado después de veinticuatro horas de ag reduce la agregación de inmunoglobulinas . En idades que pueden ser combinadas con cualquiera idades precedentes, el medicamento es substanc de histidina libre, sacáridos y polioles.

Otro aspecto incluye uso de los aspe oglobulina modificada precedente y cualquiera combinaciones de las modalidades precedentes diente activo farmacéutico no agregado.

Otro aspecto incluye composiciones farma incluyen una inmunoglobulina de cualquiera tos precedentes y cualquiera y todas las combi as modalidades precedentes y un excipiente a céuticamente . En ciertas modalidades, la inmunog en una concentración de por lo menos 10 mg/ml, 20 mg/ml, por lo menos 30 mg/ml, por lo , por lo menos 50 mg/ml, por lo menos 75 mg/ml o, por lo menos noventa y cinco por ciento, noventa y seis por ciento, por lo menos noventa iento, por lo menos noventa y ocho por ciento, noventa y nueve de la inmunog1obulina modifi ero no agregante. En ciertas modalidades que pu nadas con cualquiera de las modalidades precede lación de inmunog1obulina muestra por lo menos c o, por lo menos diez por ciento, por lo menos qu o, por lo menos veinte por ciento, por 1 icinco por ciento, por lo menos treinta por cie enos treinta y cinco por ciento, por lo menos ciento, o por lo menos cincuenta por cíent ado después de veinticuatro horas de ag rada como se compara con la inmunog1obulina n las mismas condiciones. En ciertas modalida n ser combinadas con las modalidades precede Adicionalmente los aspectos y modalidade ción pueden ser encontradas en toda la especific Descripción Detallada de la Invención La presente descripción se relaci oglobulinas mejoradas, particularmente ant os, que tienen agregación reducida. En idades, las inmunoglobulinas de la descripc icadas en residuos hidrofóbicos específicos d regiones constantes de las cadenas pesadas o li inmunoglobulina . La descripción pro oglobulinas modificadas, métodos para hac oglobulinas, inmunoconjugados y moléculas tiespecíficas los cuales comprenden las inmunogl composiciones farmacéuticas que contiene oglobuinas inmunoconjugados o moléculas bioesp descripción. n variable de cadena pesada (abreviada como V n constante de cadena pesada. La región cons a pesada está comprendida de tres dominios, C Cada cadena ligera está comprendida de una ble de cadena ligera (abreviada como VL) y un ante de cadena ligera. La región constante d a está comprendida de un dominio, CL. Las regio pueden ser además subdivididas en regio variabilidad, nombrada regiones determinan ementaridad (CDR por sus siglas en mezcladas con regiones que están más cons ada regiones de cuadro (FR por sus siglas en VH y VL está compuesta de tres CDR y cuatro FR di terminación amino a terminación carboxi en el s : FR1, CDR1, FR2 , CDR2 , FR3 , CDR3 , FR4. Las bles de las cadenas pesadas y ligeras conti eta o uno o más fragmentos de un anticuerpo que pacidad para enlazar específicamente a un antíge enos una porción de la región constante de l a o ligera. Se ha mostrado que la función de en eno de un anticuerpo puede ser realizada por fr anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fr lace comprendidos dentro del término porción d tígeno" de un anticuerpo incluyen un fragmento entó monovalente el cual consiste de dominios V ; un fragmento F(ab)2, un fragmento bivalente ende dos fragmentos Fab enlazados por un furo en la región bisagra; un fragmento Fd ste de los dominios VH y CHi; y un fragmento Fv ste de los dominios VL y VH de un extremo sencil uerpo .

Adicionalmente , aunque los dos domini no "región de enlace de antígeno" de un ant fragmentos de anticuerpo son obtenidos usando ncionales conocidas por aquellos expertos en la S fragmentos son tamizados para utilidad en 1 ya que son anticuerpos intactos.

Un anticuerpo "aislado" o inmunoglobulina, en la presente, se refiere a un antic oglobulina que está substancialmente libre d nentes en los cuales los anticuerpos o inmunog encontrados en forma natural . Por otra pa uerpo aislado o inmunoglobulina puede ancialmente libre de otro material celular y/o q Los términos "anticuerpo monoclonal" o "com nticuerpo monoclonal" como se usa en la pres re a una preparación de moléculas de anticuerp sición molecular sencilla. Una composición de an a, o versiones mutadas de secuencias de línea a o secuencias de cuadro de consenso que c uerpo derivadas de análisis de secuencias de o como se describe en Knappik, et al. (2000, 296, 57-86) .

Los anticuerpos humanos de la descripció ir residuos de aminoácidos no codificados ncías humanas (por ejemplo, mutaciones introduc énesis aleatoria o específica a sitio in vitr ión somática in vivo) . Sin embargo, el cuerpo humano", como se usa en la presente, esto para incluir anticuerpos en los cua ncias CDR derivadas de línea germinal de otras eras, como un ratón, han sido injertadas en se adro humano.

El término "dominio humano" , como se us sa en la presente, incluya todas los anticuerpos son preparados, expresado, creado o aislado po binantes , como los anticuerpos aislados de ani lo, un ratón) que es transgénico o transcromosom de inmunoglobulina humanas o un hibridoma prepa mismos, anticuerpos aislados de una células no formadas para expresar el anticuerpo huma lo, de un transfectoma , anticuerpos aislados ioteca de anticuerpo humano combinatorial , recom ticuerpos preparados, expresado, creado o ais uier otro medio que implica división de tod ión de un gen de inmunoglobulina humana, secuenc S secuencias de ADN. Los anticuerpos binantes tienen regiones variables en las c ro y regiones CDR son derivadas de secuen noglobulinas de línea germinal humanas. En Un "anticuerpo quimérico" es una molé uerpo en la cual (a) la región constante, o una misma, es alterada, reemplazada o intercambiad que el sitio de enlace de antígeno (región vari ada es enlazada a una región constante de u ente o alterada, función y/o especies efectoras ula enteramente diferente la cual confiere edades al anticuerpo quimérico, por ejemplo a, toxina, hormona, factor de crecimiento, o (b) la región variable, o una porción de la m ada, reemplazada o intercambiada con una región ual tiene una especificidad de antígeno dife ada. Por ejemplo, un anticuerpo de ratón pu icado por reemplazar su región constante con l ante a partir de la inmunoglobulina humana ende una modificación como se describe en la p ejemplo, por retener las regiones CDR no hu lazar las partes restantes del anticuerpo apartes humanas (es decir, la región constante én las porciones de cuadro de la región variabl ejemplo, Morrison et al., Proc . Nati. Acad. S 51-6855, 1984; Morrison and Oi, Adv. Immunol . , 1988; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 n, Molec. Immun. , 28 :489-498, 1991 ; y Padlan, ., 31:169-217, 1994. Otros ejemplos de tecnol icación humana incluyen, pero no se limitan a te descrita en la Patente de los Estados Un américa US 5,766,886.

El término "Humaneering" como se usa en la fiere a un método para convertir anticuerpos no ticuerpos en anticuerpos humanos modificados ( lo tecnología KaloBios Humaneering™) . uerpo y el antígeno en sitios antigénicos se o de cada sitio antigénico, la región varia emo" del anticuerpo interactúa a través de las ovalentes débiles con un antígeno en sitios nu más interacciones, más fuerte es la afinid icaciones descritas en la presente no rentemente la afinidad de las inmunoglobu uerpos descritos en la presente o la afin ida menos que el treinta por ciento, menos de iento, menos del diez por ciento, o menos del c o. Como se usa en la presente, cuando se deter modificaciones descritas en la presente red dad se hace la comparación entre la inmunoglo nticuerpo con la modificación y la misma inmunog cual carece de la modificación pero in squiera mutaciones no relacionadas. Por la f , pollos, anfibios, reptiles, etc.

Como se usa en la presente, el término "opt fica que una secuencia de nucleótidos ha sido codificar una secuencia de aminoácidos que usa son preferidos en la producción celular u or aímente una célula eucariótica, por ejemplo, un chia, una célula de ovario de hámster chino (CHO s en inglés) o una célula humana. La secue ótidos optimizada es modificada para etamente o tanto como sea posible la secue ácidos originalmente codificada por la secue ótidos de partida, la cual es también conocida neia "parental" . La expresión optimizada d ncías en otras células eucarióticas está endida en la presente. Las secuencias de ami ficadas por secuencias optimizadas son también r ro y no el último se pierde en la presencia de s turalizantes .

El término "variante modificado en rvada" aplica tanto para las secuencias de amino s nucleicos. Con respecto a las secuencias d icos particulares, variantes modificadas e rvada se refiere a aquellos ácidos nucleicos lo ican secuencias de aminoácidos idénticas o esenc icas, o donde el ácido nucleico no codif ncia de aminoácidos, para secuencias esenc icas. Debido a la degeneración del código gené número de ácidos nucleicos idénticos funcio ican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los GCC, GCG y GCU todos codifican el aminoácido ala forma, en cada posición donde se especifica una n codon, el codon puede ser alterado para cualq el cual es ordinariamente el único cod ófano) puede ser modificado para producir una onalmente idéntica. Por consiguiente, cada v ciosa de un ácido nucleico que codifica un pol implícita en cada secuencia descrita.

Para secuencias de polipéptido, "v icadas conservativamente" incluyen substit iones o adiciones individuales para una secu éptido la cual resulta en la substitución ácido con un aminoácido similar químicamente. La ubstitución conservadas que proporcionan ami onalmente similares son bien conocidos en la ariantes modificadas conservativamente están adei xcluyen variantes polimórficas , homólogos interé elos de la descripción. Los siguientes ocho enen aminoácidos que son substituciones conse ncías de polipéptido, se refiere a dos o más se bsecuencias que son las mismas. Dos secuenc tancialmente idénticas" si dos secuencias ti ntaje específico de residuos de aminoác ótidos que son -los mismos (es decir, 60% de id nalmente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ó idad sobre una región específica, o cuando ifica; sobre la secuencia total) , cuando se c a para correspondencia máxima sobre una ven ración, o región designada como se mide usand siguientes algoritmos de comparación de secuenc ación manual e inspección visual. Opcionalme idad existe sobre una región que es por lo ótidos (ó 10 aminoácidos) en longitud, rentemente sobre una región que es 100 a 500 nucleótidos (ó 20, 50, 200 ó más aminoáci usados o pueden ser designados parámetros alter lgoritmo de comparación de secuencia entonces cal idades para el porcentaje de las identid ncías para las secuencias de prueba con relaci ncía de referencia, en base a los paráme ama. Cuando se compara con dos secuenci tidad, no es necesario que las secuencias sean co cualquier espacio puede portar con esto una p puede reducir el porcentaje total de identid tn, los parámetros de factores predetermina lidad de abertura Gap =5 y la penalidad de e 2. Para blastp, los parámetros de eterminados son penalidad de abertura Gap=ll y p tension Gap=l.

"Una ventana de comparación", como se us enté, incluye la referencia a un segmento de CU zadas, por ejemplo, por el algoritmo de homolog ith and Waterman (1970) Adv. Appl . Math. 2:482c, itmo de alineación de homología de Needleman and l . Biol.. 48:443, 1970, por la búsqueda para m itud de Pearson and Lipman, Proc . Nati. Acad. 44, 1988, por implementaciones computarizadas itmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFAST en el W ics Software Package, Genetics Computer Gro ce Dr., Madison, WI) o por alineación m cción visual (ver, por ejemplo, Brent et al., ois in Molecular Biology, John Wiley & Son bou ed. , 2003) ) .

Dos ejemplos de algoritmos que son adecua minar el porcentaje de identidad de secu itud de secuencia son los algoritmos BLAST y Bh cuales son descritos en Altschul et al., Nuc . Ac tud en una secuencia de base de datos. T es el umbral de clasificación de palabra de chul et al . , supra) . Estos sucesos de pal dad inicial actúan como semillas para inic edas para encontrar HPS más largos que los co sucesos de palabra son extendidos en ambas dir largo de cada secuencia para hasta ahora pu mentada la clasificación de alineación acumulat ficaciones acumulativas son calculadas usand ncías de nucleótido, los parámetros M (rev ficación para un par de residuos de acople: sie ( clasificación de penalidad para resid oplamiento; siempre < 0) . Para las secuen ácidos, se usa una matriz de clasificación para lasificación acumulativa. La extensión de los su ras en . cada dirección se detiene cuan tación (E) ó 10, M=5, N=-4 y una comparación as. Para las secuencias de aminoácidos, el P usa como factores predeterminados una long ra de 3, y una expectación (E) de 10, y la m ficación BLOSUM62 (ver Henikoff and Henikoff . Acad. Sci. USA 89:10915, 1989) alineaciones tación 50 (E) de 10, M=5, N=-4, y una compar cadenas .

El algoritmo BLAST también realiza un istico de la similitud entre dos secuencias ( lo, Karlin and Altschul, Proc . Nati. Acad. 873-5787, 1993) . Una medición de similitud propo el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más ) ) , lo cual proporciona una indicación de la prob la cual puede haber la oportunidad de un acop dos secuencias de nucleótidos o aminoácid icas es que el polipéptido codificado por el nucleico es reactivo de cruce inmunológicamenté uerpos originados contra el polipéptido codifi gundo ácido nucleico, como se describe posteri sta forma, un polipéptido es substancial y típ ico a un segundo polipéptido, por ejemplo, donde dos difieren solamente por substituciones conser indicación que dos secuencias de ácido nucle ancialmente idénticas es que las dos molécula ementos se hibridizan entre sí bajo con ngentes, como se describe posteriormente. ? ación que dos secuencias de ácido nucle ancialmente idénticas es que los mismos cebadore sados para amplificar la secuencia.

El término "enlazado operablemente" se r relación funcional entre dos o más segme crita son físicamente contiguas a la s crita, es decir, están actuando en cis. Sin as de las secuencias regulatorias transcripc los incrementadores , no necesitan ser c amente o ubicadas en proximidad cercana a las se dificación cuya transcripción se incrementa.

El término "vector" se propone para ref molécula de polinucleótido capaz de transport ucleótido al cual se ha enlazado. Un tipo de v plásmido" el cual se refiere a un circuito de cadena circular en el cual los segmentos ionales pueden ser ligados. Otro tipo de vecto r viral, en donde los segmentos de ADN adi n ser ligados en el genoma viral. Ciertos veet es de replicacion autónoma en una célula hospede se introducen (por ejemplo, vectores bacteri ores de expresión") . En general, los vect sión de utilidad en técnicas de ADN recombinant frecuencia en la forma de plásmidos. En la ificación, "plásmido" y "vector" pueden ser cambiamente en cuanto el plásmido es la forma u mente del vector. Sin embargo, la descrip esta para incluir otras formas de vectores de ex los vectores virales (por ejemplo, retrovirus de replicación, adenovirus y virus adenoasociado s sirven a funciones equivalentes.

El término "célula hospedera recombina lemente "células hospederas") se refiere a una c cual se ha introducido un vector de e binante . Debe ser entendido que los térmi estos para referirse no solamente a la célul icular sino a la progenie de la célula. Ya que El término "inmunoglobulina no mutada" se r nmunoglobulina la cual no comprende las por 1 iones reductoras de agregación. Como se usa nte, la inmunoglobulina no mutada puede rucción hipotética para los propósitos de compar endencia de agregación o afinidad de enlace oglobulina con y sin las mutaciones reduct ación. Por la forma de ejemplo, un anticuerpo d incluye mutaciones de humanización así como iones reductoras de agregación no s la inmunog utada. La inmunoglobulina no mutada puede uerpo con las mutaciones humanizantes, pero iones reductoras de agregación. Donde se pro ión para servir a más de un propósito el cual eion de agregación, la inmunoglobulina no mu ye la mutación.

Cualesquiera de los patrones que tienen por lo r úo en común son emergidos en un patrón más rativamente hasta que no haya patrones resta s tienen un residuo en común. Estos patrones c s de residuos constituyen patrones de agregac 2 posterior indica los patrones de agregación ios constantes IgG.

Es por consiguiente un objeto de la ción para proporcionar una inmunoglob lina mo d .

Es por consiguiente un objeto de la ción para proporcionar una inmunoglobulina modi da que tiene tendencia reducida para agregación ende por lo menos una mutación reductora de ag n residuo seleccionado del grupo el cual con úos de un patrón de agregación 1: 174 (CHi) , 175 (CH3 ) / 398 (Cm) y 404 (CH3 ) ; un patrón de agrega (<¾) ; un patrón de agregación 12: 110 (CL) y 111 n de agregación 13: 153 (CL) y 154 (CL) ; un p ación 14: 201 (CL) , en donde la por lo me ión reductora de agregación es una substitució úo de aminoácidos que es menos hidrofóbico úo en la inmunoglobulina no modificada y la ten gregación que es reducida es agregación en ulas' de inmunoglobuli as en una solución ntrada; y en donde los miembros de residuos ros de residuos Kabat correspondientes en IgGl e lineación con la secuencia IgGl. En ciertas moda or lo menos un residuo de mutación reduc ación se selecciona del grupo el cual cons úos de un patrón de agregación 1: 175 (CHi) ; u agregación 2: 227 (bisagra), 228 (bisagra), ueden ser combinadas con las modalidades precede ión reductora de agregación no es un resi grá) o 235 (bisagra) . En ciertas modalidades qu ombinadas con las modalidades precedentes, el re ión reductora de agregación es 234 (bisagr grá) , 253 ((¾) ó 309 (CK2) . En ciertas modalid n ser combinadas con las modalidades precede úo de mutación reductora de agregación es 253 (CH En ciertas modalidades que pueden ser combin uiera de las modalidades precedentes, la inmunog una segunda mutación reductora de agregació úo hidrofóbico que (i) tiene una tendenci ación espacial de por lo menos 0.15, ó (ii) est Á de un residuo el cual tiene una tendenci ación espacial de por lo menos 0.15, en donde l una mutación reductora de agregación da mutación reductora de agregación, la tora de agregación y la segunda mutación redu ación están en diferentes patrones de agrega as modalidades que pueden ser combinadas con cu s modalidades precedentes, la inmunoglob lina t ños catorce mutaciones reductoras de agregación mutación reductora de agregación se seleccion n de agregación diferente. En ciertas modalid n ser combinadas con cualquiera de las mod dentes, la mutación reductora de agregación itución con un residuo de aminoácidos selecció el cual consiste de lisina, arginina, hi mato, aspartato, glutamina, y asparagina. En dades que pueden ser combinadas con cualquier idades precedentes, la mutación reductora de ag una substitución con un residuo de ami ombinadas con cualquiera de las modalidades prec nmunoglobulina es una IgGl, una IgG2, una IgG3 En ciertas modalidades que pueden ser combin uiera de las modalidades precedentes, la inmunog ende una IgGl . En ciertas modalidades que pu nadas con cualquiera de las modalidades precede oglobulina tiene un dominio CHi humano. En idades que pueden ser combinadas con cualquier idades precedentes, la inmunoglobulina tiene un umano. En ciertas modalidades que pueden ser co cualquiera de las modalidades precedent oglobulina tiene un dominio CH3 humano. En idades que pueden ser combinadas con cualquier idades precedentes, la inmunoglobulina tiene u mano. En ciertas modalidades que pueden ser co cualquiera de las modalidades precedent 10 mg/ml, por lo menos 20 mg/ml, por lo , por lo menos 40 mg/ml, por lo menos 50 mg/ml 75 mg/ml, por lo menos 100 mg/ml, por lo m , o por lo menos 150 mg/ml.

Es por consiguiente un objeto adicional ción proporcionar una inmunoglobulina modif da que tiene una tendencia reducida a la agreg comprende por lo menos una mutación reduc ación en un residuo seleccionado del grupo ste de 23 5 (bisagra) , 241 ( CH2 ) , 243 ( CH2 ) / 282 (<¾) en donde si el residuo 235 se selecciona, s lutamato o una serina, si el residuo 282 es sele ta a una lisina, y si el residuo 3 09 es seleccio a una lisina, y en donde la por lo menos una tora de agregación es una substitución con un re ácido que es menos hidrofóbico que el residuo residuo 243 para serina. En ciertas modalidades, nos una mutación reductora de agregación es una residuo 241 para tirosina, y la inmunog icada o aislada además comprende una segunda tora de agregación del residuo 243 para tiro as modalidades, la por lo menos una mutación r regación es una mutación del residuo 282 para l nmunoglobulina modificada o aislada además compr da y una tercera mutación reductora de agrega la segunda mutación reductora de agregación ión del residuo 235 para lisina y la tercera tora de agregación es una mutación del residuo a. En ciertas modalidades, la inmunoglobulina t da mutación reductora de agregación en un fóbico, en donde la por lo menos una mutación r gregación es una substitución en un residuo hidr o menos 0.15. En ciertas modalidades que pue nadas con las modalidades precedentes que tien da mutación reductora de agregación, la inmunog una tercera mutación reductora de agregación la tendencia a la agregación espacial de por o (ii) está dentro de 5Á de un residuo que ncia a la agregación espacial de por lo menos la tercera mutación reductora de agregación itución con un residuo de aminoácidos que e fóbico que el residuo en la inmunoglobu icada. En ciertas modalidades que pueden ser co las modalidades precedentes que tienen una ión reductora de agregación, la mutación redu ación y la segunda mutación reductora de ag por lo menos 5Á, por lo menos 10Á, por lo meno o menos 20Á aparte. En ciertas modalidades qu ente. En ciertas modalidades que pueden ser cot cualquiera de las modalidades precedentes, la tora de agregación es una substitución con un re ácidos seleccionado del grupo el cual cons a, arginina, histidina, glutamato, aspartato, gl agina, tirosina y serina. En ciertas modalid n ser combinadas con cualquiera de las mod dentes, la mutación reductora de agregación itución con un residuo de aminoácidos selecció el cual consiste de lisina, serina, glut dina. En ciertas modalidades que pueden ser co as modalidades precedentes, la tendencia a la ag ial (esfera de radio 5Á) se calcula usando la e fobicidad de Black and Mould normalizada de t la glicina igual a 0. En ciertas modalidades qu ombinadas con cualquiera de las modalidades prec cualquiera de las modalidades precedent oglobulina tiene un dominio CH3 humano. En idades que pueden ser combinadas con cualquier idades precedentes, la inmunoglobulina tiene un mano. En ciertas modalidades que pueden ser co cualquiera de las modalidades precedent oglobulina tiene una afinidad de enlace para un ivo y la afinidad de enlace para el antígeno obj lo menos setenta por ciento, por lo menos och o, por lo menos noventa por ciento, por lo menos o, por lo menos ciento cinco por ciento de la afi e de la inmunoglobulina no mutada para el ivo. En ciertas modalidades que pueden ser combin modalidades precedentes, la solución líquida, con en una concentración de por lo menos 10 mg/ml, 20 mg/ml, por lo menos 30 mg/ml, por lo menos 4 dominio CHi : IgGl (SEQ ID NO: 1) Ig62 (SEQ ID NO: 2) IgG4 (SEQ ID NO: 3) IgG3 (SEQ ID NO: 4) .. A .. circuito B .. circuito . c .. , cir 120 130 140 150 160 I I I I I IgGl ASTKGPSVFPLAPSS STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL IgG2 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL IgG4 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL IgG3 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW SGAL .. circuito · · E circuit . .. F ...circuito . G .... unir 180 190 200 210 I I í I IgGl PAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE IgG2 PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNT VDKTVE IgG4 PAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVE IgG3 PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVD RVE bisagra: IgGl (SEQ ID NO: 5) IgG2 (SEQ ID NO: 6) IgG4 (SEQ ID NO: 7) IgG3 (SEQ ID NO: 8) superior medio inferior 230 IgGl -DKTHT CPPCP APELLGG IgG2 -VE CPPCP AP-PVAG IgG4 -PP CPSCP APEFLGG IgG3 LGTTHT CPRCPEPK* ****** * CPRCP APELLGG dominio Cu : dominio CH3 : gGl (SEQ ID NO: 13) gG2 (SEQ ID NO: 14) gG4 (SEQ ID NO: 15) gG3 (SEQ ID NO: 16) . G .. circuito .. . . B ....Circuito.. C...circu 350 360 370 380 I I I I gGl PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN gG2 PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN gG4 PQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN gG3 PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPEN circuito , .. E ... circuito ... F„ ..circuito ... G ... , 410 420 430 440 l i l i gGl DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV HEALHNHYTQKSLSLS IgG2 DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS IgG4 DGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS IgG3 DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNHFTQKSLSLS Tendencia a la Agregación Espacial La invención en la presente se relaciona a identificar regiones tendientes a la agregació ficie de proteína y para evitar o reducir la ag lo menos en parte, al cálculo del SAA (área acc nte) , lo cual es conocido en la técni terizar la superficie de una proteína. SAA da ficial de cada aminoácido o estructura de prot en contacto con el solvente. SAA puede ser c amente por computarizar el locus del centro a de sonda en cuanto se enrolla sobre la super oteína, es decir, la superficie de un modelo est oteína. La esfera de la sonda tiene el mismo ra I de una molécula de agua, R=1.4A. Los nativos para calcular SSA, descritos posteriorme idos en la técnica y son compatibles con los itos en la presente. Aunque SAA es muy út terizar la superficie de la proteína, se encon decuado para caracterizar los parches hidrofóbic superficie de la proteína que son potenc hidrofobicidad de una cierta región. Estos pueden ser cercanos ya sea en la secuencia pr en la estructura terciaria a pesar de que est de la secuencia primaria. Cualquiera que sea, incrementar la hidrofobicidad de un cierto p el área superficial.

Una medición la cual es descrita en la pres efectivo, es generado por calcular la hidrofobi racción del aminoácido el cual es expuesto a la rior : SAA AA efectivo = x hidrofobicidad d SAA total mente expuesto Una modalidad adicional del SAA efectivo ende resumir el SAA efectivo sobre por lo menos daria, terciaria o cuaternaria duplicada ína. Los duplicados de la proteína pueden nes tendientes a la agregación los cuales no apa structura primaria sola, o lo cual puede solam tado por analizar más robustamente de la estru ína duplicada.

La presente invención proporciona una , más avanzada, llamada tendencia de ag ial, la cual destaca la hidrofobicidad efectiv o parche o región en la superficie de prote ncía de agregación espacial es calculada para iadas definidas en o cerca de los átomos de un m ctura de proteína.

En este contexto, una "región espacial defi pacio tridimensional o volumen elegido para capt ctura física local y/o ambiente químico en o cer En ciertas modalidades, el radio elegido 1Á y 50Á. En modalidades particulares el radio r lo menos 1Á, por lo menos 3Á, poar- lo menos 4Á 5Á, por lo menos 6Á, por lo menos 7Á, por lo m lo menos 9Á, por lo menos 10Á, por lo menos 11Á 12Á, por lo menos 15Á, por lo menos 20Á, por ó por lo menos 30Á. En ciertas modalidades, ido está entre 5Á y 15Á, entre 5Á y 12Á, o en En modalidades específicas el radio elegido es 5 En otras modalidades, la región para la ncia a la agregación espacial es calculada rica. La posible conformación de la región pued render una cuba, un cilindro, un cono, un e tico, una pirámide, un hemisferio, o cualqui ormación la cual puede ser usada para ence ión del espacio. En tales modalidades, el tama ncía de proteínas por si misma y (2) incluir adi formulación líquida. Ambos procedimientos h tigados y se han obtenido resultados significat r procedimiento ha dependido de bibliotecas ex tamizado de variantes aleatorias in si imentalmente . En el segundo procedimiento, el lto rendimiento para estabilizar aditivos, a én el diseño racional de aditivos per ificación de formulaciones óptimas para una éutica .

La presente invención es esperada para per so de incremento de estabilidad por identifica ntes existentes para agregación computacional izar variantes con substituciones en aquellos rimentalmente .

De esta forma, en términos generales, u plicar cada proporción por la hidrofobicidad d o o más átomos; y (d) sumar los productos de en donde la suma es la SAP para el átomo particu En una modalidad relacionada, la SAP pu lada de acuerdo a un método diferente el cual c identificar uno o más residuos de aminoácido o estructural el cual representa la proteína, más residuos de aminoácidos tiene por lo menos o de una región espacial definida centrada en átomo particular; (b) calcular, para cada uno úos de aminoácidos identificados, una proporc accesible al solvente (SAA) de los átomos ácido para el SAA de los átomos en un residuo cual es totalmente expuesto; (c) multiplic rción por la hidrofobicidad de uno o más res ácidos como se determina por una esc nativamente puede ser requerido un átomo para de cadena principal.

En otras modalidades, este método puede ender opcionalmente realizar una simulación ular antes a la etapa (c) y repetir las etapas vez que realizan una simulación de dinámica m onal en una pluralidad de etapas de tiempo, por ciendo múltiples sumas como en la etapa (d) , y romedio de las sumas; donde el promedio calcula ara el átomo particular.

Una experiencia en la técnica apreciará idad de la presente invención la cual emplea el alores calculados sobre una simulación de d ulares será más intensivo computacionalme idad también, en algunos casos, proporcionará preciso o altamente resuelto de la tendenci ína conocidas. Este método permite el tamizado r es grupos de proteínas para identificar entes a la agregación potencial y/o si acción de proteína.

En una solicitud preferida, la tendenci ación espacial es descrita por la siguiente fórm AP átomo " ^ promedio de simulación ( ^ átomos dentro de R del átomo ((SAA-RSAA-fe) En donde : ) SAA-R es SAA de los átomos de cadena latera del radio R el cual es computado en cada simulación. SAA es calculado preferentement modelo de simulación por computarizar el l centro de la esfera de sonda en cuanto se sobre la superficie de la proteína. La es sonda tiene el mismo radio como aquel de una asociados) . Alternativamente, el SAA pu calculado en solamente los átomos de cadena p de aminoácido con la exclusión de hi asociados ; SAA-fe es SAA de cadena lateral de residuo to expuesto (es decir para el aminoácido "X") el obtenido, en una modalidad preferida, por cal SAA de las cadenas laterales del residuo med conformación totalmente extendida de tripépti X-Ala" ; y Atom-hb es hidrofobicidad de átomo la obtenida como se describe anteriormente US escala de hidrofobicidad de Black and oul and Mould, Anal. Biochem. 1991, 193, 72-escala es normalizada de tal forma que la tiene una hidrofobicidad de cero. Por lo ta mplado que otros residuos además alanina puede la cálculo sin alterar totalmente o alte tados.

Como se describió anteriormente, los métod nte invención pueden ser aplicados para cualquie ctural de proteína incluyendo una estructura de o la misma fórmula como anteriormente.

Similarmente , si la estructura de rayos X nible, el mismo parámetro de tendencia a la ag ial puede ser aplicado a la estructura generada a modelación de homología, y el parámetro SAP p lado usando la misma fórmula como anteriormente.

En ciertas modalidades la tendencia a la ag ial es calculada para todos los átomos en u ctural de proteína. En algunas modalidades, los endencia de agregación espacial atómica pue idrofóbicos , o para estar en una región de tend ación. Dependiendo del tipo de proteína, la es cular, y el solvente en cual existe, puede ser identificar átomos o residuos usando un corte ligeramente abajo del cero, por ejemplo, por el s o residuos los cuales tienen una tendenci ación espacial de más de -0.1, -0.15, -0 nativamente , puede ser deseable emplear un c ngente, por ejemplo, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, etc, de elegir los átomos hidrofóbicos más fuertes, r arches . Además, en cuanto el algoritmo da iores a residuos en el centro de un parche, o 3A, 4A, 5A, 7.5A ó 10A del residuo que cumple también ser seleccionado para mutación a menos fóbicos para reducir la agregación. En otra mo ser simplemente ventajoso para seleccionar ejemplo usando una codificación de color o codi ico, en el modelo estructural de la proteína lo cual se derivan, de esta forma visu encias en la tendencia a la agregación espaci uperficie de proteína y por lo tanto per ción fácil de parches hidrofóbicos o residuos, idad preferida particularmente, los cálcul ncía a la agregación espacial son re adamente usando dos valores elegidos para el ra esolución superior, por ejemplo 5A, y uno de re ior, por ejemplo 10A. En una modalidad los fóbicos más grandes o más estrechos pueden ser la estructura de proteína con el mapa de re ior. Una vez que los parches hidrofóbicos de int cionados en el mapa de baja resolución, aquellos n vistos con mayor detalle en el mapa de re En una modalidad específica un métod ificar una región con tendencia a la agregación ína comprende (a) mapear sobre el modelo estruc omo se calcula de acuerdo a cualquiera de los itos en la presente para átomos en la proteína ificar una región dentro de la proteína la cu luralidad de átomos que tienen una SAP>0; en n tendiente a la agregación comprende los ami cuales comprenden la pluralidad de átomos, idad la SAP puede ser calculada para todos lo a proteína o una porción de los átomos. Se conte ede calcular la SAP para residuos particulares siduos los cuales son de interés.

En una modalidad similar, puede ser inf car las clasificaciones SAP de los átomos (o cí como promediado sobré los residuos de aminoáci fóbicas . En modalidades particulares será cionar el reemplazo de uno o más residuos los cu ificados como que existen en un pico, rentemente , en un pico con un AUC grande.

En modalidades particulares la presente i ser usada para hacer una variante de inmunog exhibe una tendencia reducida para agregac lazar por lo menos un residuo de aminoácidos d región con tendencia a la agregación oglobulina identificada por cualquiera de los itos en la presente con un residuo de aminoá es más hidrofílico por cualquiera de los itos en la presente con un residuo de aminoá es más hidrofílico entonces el residuo el lazado, de tal forma que la tendencia a la agreg ariante es reducida. Como se usa en la presente ar una pluralidad de variantes de inmunoglobu lazar, en cada variante por lo menos un residu na región con tendencia a la agregación oglobulina, en donde la región con tend ación es identificada usando las clasificaci ladas de acuerdo a cualquier método descrit nte, en donde uno o diferentes residuos o di naciones de residuos se reemplazan en cada var onde el por lo menos un residuo es reemplazado úo el cual es más hidrofílico, y (b) selecci nte de inmunoglobulina como en (a) el cual ex ncia reducida para agregación.

Además, un residuo de aminoácidos en una re ncia a la agregación puede ser eliminado lazado. En algunas modalidades, donde se selecci úos de aminoácidos múltiples para reemplazado, oglobulina uno o más residuos de ami cionados (o uno o más residuos que caen en e cionado) con residuos de aminoácidos, los cuales fílieos, de tal forma que una pluralidad de vari oglobulina son creadas representando una var entes substituciones de aminoácidos. Esta p entonces ser tamizada para seleccionar una ntes de inmunoglobulina las cuales tienen una t ida para agregación. Un experto en la técnica a últiples regiones tendientes a la agregación pu ificadas, y que una o más substitución naciones pueden ser hechas en una o mas entes a la agregación. La capacidad hidrofóbica s aminoácidos puede ser determinada por la e fobicidad de Black and Mould como se iormente. En modalidades específicas, un amin comprende por lo menos una mutación reduc ación en un residuo en un dominio conservad oglobulina que (i) tiene una tendencia a la ag ial (esfera de radio 5Á) de por lo menos 0.15, una tendencia a la agregación espacial (esfero de más de 0.01 y está dentro de 5A de un res tendencia a agregación espacial (esfera de radi lo menos 0.15, en donde la por lo menos tora de agregación es una substitución con un re ácidos que disminuye la tendencia a la ag ial (esfera de radio 5Á) del residuo como se com nmunoglobulina no mutada y la tendencia para ag es reducida es agregación entre molécu oglobulina en una solución líquida, concentr as modalidades, la por lo menos mutación redu ación no está en un residuo el cual corres ial (esfera de radio 5Á) de por lo menos 0.15, segunda mutación reductora de agregación itución con un residuo de aminoácido que itución con un residuo de aminoácidos que dism ncía de agregación espacial (esfera de radio úo como se compara con la inmunog1obulina no mu as modalidades que pueden ser combinadas idades precedentes que tienen una segunda tora de agregación, la mutación reductora de ag segunda mutación reductora de agregación están 5Á, por lo menos 10Á, por lo menos 15Á o por En ciertas modalidades que pueden ser combinadas idades precedentes que tienen una segunda tora de agregación están en diferentes patr ación. En ciertas modalidades que pueden ser co cualquiera de las modalidades precedentes, la ión reductora de agregación es una substitució úo de aminoácidos seleccionado del grupo ste de lisina, arginina · e histidina. En idades que pueden ser combinadas con las mod dentes, la mutación reductora de agregación itución con un residuo de lisina. En idades que pueden ser combinadas con las mod dentes, la tendencia a la agregación espacial (e 5Á) es calculada usando la escala de hidrof Mould normalizada de tal forma que la glicina s En ciertas modalidades que pueden ser combinadas lidades precedentes, la inmunoglobulina es una I , una IgG3, o una IgG4. En ciertas modalidades qu combinadas con las modalidades precedent oglobulina es una IgGl . En ciertas modalidad en ser combinadas con las modalidades precede oglobulina tiene una afinidad de enlace para un ivo y la afinidad de enlace para el antígeno obj o menos setenta por ciento, por lo menos och o, por lo menos noventa por ciento, por lo me ciento, o por lo menos ciento cinco por cíent dad de enlace de la inmunoglobulina no mutada eno objetivo. En ciertas modalidades que pue ñadas con las modalidades precedentes, la da, concentrada está en una concentración de 10 mg/ml, por lo menos 20 mg/ml, por lo menos 3 o menos 40 mg/ml, por lo menos 50 mg/ml, por lo , por lo menos 100 mg/ml, por lo menos 125 mg/ ños 150 mg/ml.

Las variantes de inmunoglobulina pueden se cualquier método conocido en la técnica inclu énesis dirigida a sitio y otra tecnología nte con un residuo de aminoácidos natural, un re ácidos modificado, un residuo de aminoácidos n esiduo de aminoácidos no natural, o un aná ácidos o derivado del cual es más hidrofílico esiduo el cual es reemplazado, de tal forma ncía a la agregación de la variante es reducida.

La síntesis de aminoácidos no naturales es aquellos con experiencia en la técnica, y es ita, por ejemplo, en la publicación de patente os Unidos de Norteamérica NO. 2003-0082575. En uier método conocido en la técnica para sint porar aminoácidos no naturales, modificados o i roteínas puede ser empleado incluyendo, pero no uellos métodos descritos o a los que se hace re as publicaciones Liao J. Biotechnol Prog. 2007 : 28-31; Rajes, and Iqbal, Curr Pharm Biotech ción pueden exhibir estabilidad mejorada o incr se determina, por ejemplo, por estudios de est rada. Estudios de estabilidad acelerada de yen, pero no se limitan a, estudios que cara raturas de almacenamiento incrementadas. Una dis a formación de agregados observada para una var oglobulina como se compara con la proteína stre o inicial indica una estabilidad incremen ilidad de las variantes de inmunoglobulina puede probada por medir el cambio en la transició eratura de fusión de una variante como se compar oglobulina del tipo silvestre o inicial, lidad, la estabilidad incrementada puede ser un incremento en la transición de la temper ón en la variante. Se describen los métodos adí medir la agregación de proteínas en la soli idades precedentes, un promotor inducible está blemente al polinucleótido . Otro aspecto incl as hospederas con el vector de cualquiera idades precedentes. En ciertas modalidades, las deras son capaces de expresar la inmunog icada por el polinucleótido.

Es por consiguiente un objeto de la ción proporcionar métodos pa a produci oglobulina con una tendencia a la agregación cuales comprenden proporcionar un medio de cul rende la célula hospedera del párrafo precede ar el medio de cultivo en condiciones bajo las c sa la inmunoglobulina . En ciertas modalidad os incluyen una etapa adicional para ai oglobulina expresada.

En otro aspecto de la invención la tenden ína-proteína o proteína ligando.

En algunas modalidades, la invención ad iona a código de computadora para determinar do a los métodos de la invención. En otras moda invención se relaciona a una computador computadora, o grupo de computadoras dedicado a métodos de la invención. En aún otro aspe ción proporciona un servicio a base web, a dor, a base de internet para determinar las reg ncía a la agregación en una proteína, el ser comprende aceptar datos acerca de una prote ío, un modelo estructural de proteína) a partí io (por ejemplo, sobre la internet) o recupe a partir de la base de datos de tal forma edor de servicio puede generar, recuperar o acc ctura estática de la proteína, opcionalmente que itmo de computadora automatizado .

En algunas modalidades la presente invenció istema de cálculo SAP el cual comprende: un ser ara proporcionar un servicio web para calcular io terminal a través de la internet, una base almacenar información general en el método de fobicidad de aminoácido , etc, y un servidor de realizar el cálculo SAP en base en informació de datos e información proporcionada o trans s del internet por el usuario.

En algunas modalidades, el servidor we idor de cálculo son el mismo sistema de computa as modalidades el sistema de computadora computadora, una computadora de cluster, o una rabajo sencilla o servidor. En una modalidad rel ervidor web del sistema de cálculo SAP además c un modelo estructural, calcular SAA, calcu iva, manipular los modelos estructurales, imp simulaciones dinámicas moleculares, organ enar los datos relevantes, o realizar otras ope ritas en la presente. El medio leíble en comput uier dispositivo de almacenamiento de datos q cenar datos los cuales después de esto pueden se un sistema de computadora. Ejemplos de medios omputadora incluyen, pero no se limitan a disco s suave, mandos rápidos, discos ópticos (por DVD, HD-DVD, discos de rayos Blu, etc.) y conf cialmente dispositivos hardware tales como c rados especificados de aplicación (ASIC) o disp eos programables (PLD por sus siglas en ingl o leíble en computadora puede también ser dis una señal de datos e emplificada en una onda p Composiciones Farmacéuticas las cuales contiene Inmunoglobulinas y Variantes de Inmunoglobulina En otro aspecto la presente invención pro composición, por ejemplo, una composición farma cual contiene una o variantes de inmunog cidos por los métodos de la invención, formulad un portador aceptable farmacéuticamente siciones farmacéuticas de la invención tambié administradas en terapia de combinación, es nadas con otros agentes. Por ejemplo, la te nación puede incluir una inmunoglobulina de la ción combinada con por lo menos otro agente anti Como se usa en la presente, "portador a céuticamente" incluye cualquiera y todos los so s de dispersión, recubrimientos, y agentes antif es isotónicos y de retraso de absorción, y simil Las composiciones farmacéuticas de la i n incluir una o más sales aceptables farmacéuti "sal aceptable farmacéuticamente" se refiere a retiene la actividad biológica deseada del c nitor y no imparte ningún efecto toxicólo do (ver por ejemplo, Berge, S. M. , et al. ( . Sci. 66:1-19). Ejemplos de las sales incluyen on de ácido y sales de adición de base. Las on de ácido incluyen aquellas derivadas de ánicos no tóxicos, como ácido clorhídrico, rico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fó ares, así como también de ácidos orgánicos no ácidos mono y dicarboxílieos alifáticos, oicos fenil substituidos, ácidos hidroxi alc s aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y ar milares. Las sales de adición de base incluyen como el ácido ascórbico, clorhidrato de c fato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito milares; (2) antioxidantes solubles en aceit tato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA s en inglés) , hidroxitolueno butilado (BHT s en inglés) , lecitina, galato de propilo erol, y similares; y (3) agentes de quelacion d el ácido cítrico, ácido etilendiamintetraacéti sus siglas en inglés) , sorbitol, ácido tartáric rico, y similares .

Ejemplos de portadores acuosos y no ados que pueden ser empleados en las compo céuticas de la invención incluyen agua, etanol, glicerol, propilenglicol , polietilengli ares) , y mezclas adecuadas de los mismos, ales, como el aceite de oliva, y ásteres o rada tanto por procedimientos de esterilizació inclusión de varios agentes antibacteri úngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol sórbico, y similares. Puede también ser ir agentes isotónicos, como los azúcares, cío , y similares en las composiciones. Además, la a ngada de la forma farmacéutica inyectable pu da aproximadamente por la inclusión de agen s retrasan la absorción como el monoestea nio y gelatina.

Los portadores aceptables farmacéut yen soluciones o dispersiones acuosas estériles iles para la preparación extemporánea de solu rsiones inyectables estériles. El uso de los es para substancias farmacéuticamente act ido en la técnica. Excepto hasta ahora en que c étodos descritos en la presente, ser usados par isminuir la agregación de una inmunoglobuli guiente, los métodos convencionales usados par gregación pueden ser empleados en el desarr siciones farmacéuticas que contienen varía oglobulina producidas por los métodos de la ción. Por ejemplo, una variedad de los compu ilización o desagregación pueden ser inclu siciones farmacéuticas de la invención dependien propuesto y su toxicidad biológica. Los compu ilización pueden incluir, por ejemplo, ciclode derivados (Patente de los Estados Unidos de Nort 5730969) , composiciones de alquilglicósido (soli te de los Estados Unidos de Norteaméri 74,049), el uso de moléculas chaperonas (por ejem l et al., Biochem. J. 2005, 388 (pt 1) : 15 naciones de diferentes clases de excipient ío, (1) disacáridos (por ejemplo, sacarosa, treh les (por ejemplo, sorbitol, manitol) actú ilizantes por exclusión preferencial y son es de actuar como crioprotectores dura lización, (2) tensioactivos (por ejemplo, Polyso orbat 20) actúan por minimizar interacci ínas en las interfaces como liquid do/superfice material y/o líquido/interfaces de mortiguadores (por ejemplo, fosfato, citrato, hi n a controlar y mantener la formulación de guiente, los polioles de disacárido, tensioac iguadores pueden ser usados además de los métod nte invención para además estabiliza oglobulinas evitar su agregación.

Las composiciones terapéuticas típicament ecitina, por el mantenimiento del tamaño de pa ridas en el caso de dispersión por el oactivos. En muchos casos, será preferible es isotónicos, por ejemplo, azúcares, polial manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la comp bsorción prolongada de las composiciones iny ser llevada aproximadamente por incluir sición un agente que retrasa la absorción, por de monoestearato y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles pue radas por incorporar el compuesto activo en la rida en un solvente apropiado con una o una com ngredientes enumerados anteriormente, como se r do por microfiltración de esterilización. Gener reparan las dispersiones por incorporar el c o en un vehículo estéril que contiene un combinada con un material portador para prod de dosis sencilla variará dependiendo del sujet do, y el modo particular de administración. La ingrediente activo la cual puede ser combinada ial portador producir una forma de dosis aímente será esa cantidad de la composición ce un efecto terapéutico. Generalmente, fuera ciento, esta cantidad estará en el inter imadamente 0.01 por ciento a aproximadamente n por ciento del ingrediente activo, preferente imadamente 0.1 por ciento a aproximadamente o, más preferentemente de aproximadamente 1 por imadamente 30 por ciento del ingrediente ac nación con un portador aceptable farmacéuticamen Es por consiguiente un objeto de la ción para proporcionar formulaciones de inmunog munoglobulina no mutada consigo misma en una da, concentrada bajo las mismas condiciones. En idades que pueden ser combinadas con las mod dentes, por lo menos ochenta por ciento, por ta y cinco por ciento, por lo menos noventa por o menos noventa y cinco por ciento, por lo menos s por ciento, por lo menos noventa y siete por o menos noventa y ocho por ciento, o por l ta y nueve por ciento de la inmunoglobulina mo monómero agregado. En ciertas modalidades qu ombinadas con cualquiera de las modalidades prec formulación incluye un excipiente a céuticamente . En ciertas modalidades que pue nadas con cualquiera de las modalidades precede lacion de inmunoglobulina muestra por lo menos c o, por lo menos diez por ciento, por lo menos qu ualquiera de las modalidades precedentes, la for nmunoglobulina es substancialmente libre de c vo que reduce la agregación de inmunoglobuli as modalidades que pueden ser combinadas con cu las modalidades precedentes, la formulac oglobulina es substancialmente libre de histidin idos y polioles.

Es por consiguiente un objeto de la ción proporcionar usos de las inmunogl icadas como se discute en los párrafos (0059) , ( ) y cualquiera y todas las combinaciones idades como un ingrediente activo farmacéu ante Es por consiguiente un objeto de la ción proporcionar composiciones farmacéutic yen una inmunoglobulina modificada como se di rega la inmunoglobulina no mutada consigo mism ión líquida, concentrada bajo las mismas condici as modalidades que pueden ser combinadas idades precedentes, por lo menos ochenta por cie nos ochenta y cinco por ciento, por lo menos nov o, por lo menos noventa y cinco por ciento, por ta y seis por ciento, por lo menos noventa y s o, por lo. menos noventa y ocho por ciento, o noventa y nueve por ciento de la inmunog icada es monómero no agregado. En ciertas mod pueden ser combinadas con cualquiera de las mod dentes, la formulación de inmunoglobulina muestr cinco por ciento, por lo menos diez por ciento quince por ciento, por lo menos veinte por cie enos veinticinco por ciento, por lo menos tre o, por lo menos treinta y cinco por ciento, por ación de inmunoglobulinas . En ciertas modalid n ser combinadas con cualquiera de las mod dentes, la formulación de inmunoglobul ancialmente libre de histidina libre, sacá les .

Los regímenes de dosis son ajustado rcionar la respuesta deseada óptima (por ejem esta terapéutica) . Por ejemplo, puede ser admi olo sencillo, pueden ser administradas varia idas al paso del tiempo o la dosis puede ser rcionalmente o incrementarse como se indique ncías de la situación terapéutica. Es espec joso formular composiciones parentales én f d de dosis para facilidad de administr rmidad de dosis. La forma de unidad de dosis com a presente se refiere a unidades discretas fís ompuesto como un compuesto activo para el tratam bilidad en individuos.

Para administración de la inmunoglobulina, en el intervalo de aproximadamente 0.0001 a 100 sualmente 0.01 a 5 mg/kg, del peso corporal hués los las dosis pueden ser 0.3 mg/kg de peso cor de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 corporal ó 10 mg/kg de peso corporal o de valo de 1-10 mg/kg. Un régimen de tratamiento de ende administración una vez por semana, una vez as, una vez cada tres semanas, una vez cad as, una vez al mes, una vez cada 3 meses o una a 6 meses. Los regímenes de dosis preferidas oglobulina de la invención incluye 1 mg/kg ral ó 3 mg/kg de peso corporal por medio istración intravenosa, con el anticuerpo que ciente. En general, los anticuerpos humanos mué media más larga, seguido por anticuerpos huma uerpos quiméricos, y anticuerpos no humanos. La encia de administración puede variar dependien ratamiento es administrado en intervalos relat entes sobre un periodo largo de tiempo, ntes continúan recibiendo tratamiento por el vidas. En aplicaciones terapéuticas, una ivamente alta en intervalos relativamente co as veces requerido hasta que la progresión rmedad es reducida o terminada, y preferentemen el paciente muestra mejora parcial o compl mas de la enfermedad. Después de esto, el pacien administrado con un régimen profiláctico.

Los niveles de dosis actuales de los ingr os en las composiciones farmacéuticas de la rción de excreción del compuesto particular ado, la duración del tratamiento, otros f estos y/o materiales usados en combinación siciones particulares empleadas, la edad, sex ión, salud general e historia médica anter nte que es tratado, y factores similares bien c s técnicas médicas.

Una "dosis efectiva terapéuticament oglobulina de la invención resulta preferenteme disminución de la severidad de los sínt medad, un incremento en la frecuencia y duració dos libres de síntomas de la enfermedad, o pr daño o discapacidad debido a la aflicción medad. Por ejemplo, para el tratamiento de tumo s efectiva terapéuticamente" inhibe preferente miento celular o crecimiento tumoral por al me ensayos conocidos para el practicante exper dad efectiva terapéuticamente de un c éutico puede disminuir el tamaño del tumor, o mejoran los síntomas en un sujeto. Un experto o técnica puede ser capaz de determinar las canti a los factores como el tamaño del sujeto, la s s síntomas del sujeto, y la composición part de administración seleccionada.

Una composición de la presente invención p istrada por medio de una o más rutas de admini o una o más de una variedad de métodos conocid ea. Como se apreciará por el experto técnico, modo de administración variará dependiendo tados deseados. Las rutas preferidas de admini porciones de enlace de la invención incluyen venosas, intramuscular, intradérmica, intraper ral e intraesternal e infusión.

Alternativamente, una inmunoglobulina ción puede ser administrada por medio de la tal, como una ruta tópica, epidérmica o muc istración, por ejemplo, intranasal, oral, l, sublingual o tópicamente.

Los compuestos activos pueden ser prepar dores que protegerán al compuesto contra la li a, como la liberación controlada de form yendo implantes, parches transdérmicos , y sis istro microencapsuladas . Los polímeros biodegr mpatibles pueden ser usados, como el ace nvinilo, polianhidrídos , ácido poliglicólico, c rtoesteres , y ácido poliláctico. Muchos métodos ración de las formulaciones son patent aímente conocidos por aquellos expertos en la os Unidos de Norteamérica No. 5,399,163; 5, ,335; 5,064,413; 4,941,889; 4,790,824; ó 4, íos de implantes bien conocidos y módulos útil nte invención incluyen: Patente de los Estados U américa No. 4,487,603, la cual describe una infusión implantable para dispensar medicació rción controlada: Patente de los Estados Un américa NO. 4,486,194 la cual describe un dis éutico para administrar medicamentos a travé ; la Patente de los Estados Unidos de Norteamé 7,233, la cual describe una bomba de infu ación para suministrar medicamento en una velo sión precisa; la Patente de los Estados Un américa No. 4,447,224, la cual describe un ap sión implantable de flujo variable para sumin co variable; la Patente de los Estados Un rcionar una inmunoglobulina que tiende a la agr ituir un residuo en un dominio conservado oglobulina que (i) tiene una tendencia a la ag ial de por lo menos 0.15, o (ii) tiene una ten regación espacial (esfera de radio 5Á) de más d dentro de 5Á de un residuo el cual tiene una t regación espacial de por lo menos 0.15, con un minoácidos que disminuye la tendencia de ag ial (esfera de radio 5Á) , y generar una for da, altamente concentrada de la inmunog icada en donde la concentración modific oglobulina es por lo menos 20 mg/ml, por lo , por lo menos 40 mg/ml, por lo menos 50 mg/ml, 75 mg/ml, por lo menos 100 mg/ml, por lo m ó por lo menos 150 mg/ml, y en donde la tend ación que se reduce es agregación entre la molé , por lo menos 50 mg/ml , por lo menos 75 mg/ml, 100 mg/ml, por lo menos 125 mg/ml, o por lo m . En ciertas modalidades, el uso del medicamento tratamiento de enfermedades autoinmuno medades inmunológicas , enfermedades infe medades inflamatorias, enfermedades neurológ medades oncológicas y neoplásticas que incluyen iertas modalidades, el uso del medicamento es miento de falla cardiaca congestiva (CHF por su nglés) , vasculitis, ros cea, acné, eczema, mioca afecciones del miocardio, lupus eritematoso si tes, espondilopatias , fibroblastos sinoviales, y médula ósea; pérdida ósea, enfermedad de clastoma; cáncer de mama; osteopania de trición; enfermedad periodontal, enfermedad de ocitosis de células de Langerhans, daño de l ío, linforna de Hodgkin, linforna no de Hodgkin urkitt, linforna linfocítico pequeño/leucemia lin -ea->—fungoides de micosis, linforna de células de rna folicular, linfoma de células B grandes rna de zona marginal, leucemia de célula ca mia linfoplamacítica) , tumores de células pre cíticas, que incluyen leucemia/linforna linfo de células B, y leucemia/linforna linfoblástica as T, timoma, tumores de las células T y NK madu yen leucemias de células T periféricas, leuc as T adultas/linfornas de células T y cítica granular grande, histocitosis de cél rhans, neoplasias mieloides como las l genas agudas, que incluyen AML con maduración, enciación, leucemia promielocítica aguda, monocítica aguda, y leucemias monocíticas es del sistema vascular (angiosarc giopericitoma) , osteoporosis , hepatitis, VIH, dil artritis, artritis reumatoide, enfe tinales inflamatorias (IBD por sus siglas en s y choque séptico, enfermedad de Croh, ps raderma, enfermedad de injerto contra huésped ( siglas en inglés) , rechazo de injerto de nades hematológicas , como el mieloma múltipl ome mielodisplástico ( DS por sus siglas en in mia mielogénea aguda (A L por sus siglas en mación asociada con tumores, daño nervioso perif medades desmielantes . En ciertas modalidades, el amento es para el tratamiento de soriasis d is ulcerativa, linfoma no de Hodgkin, cáncer r colorectal, artritis idiopática juvenil, dege lar, virus sincicial respiratorio, enfermedad d amento muestra por lo menos cinco por ciento, diez por ciento, por lo menos quince por ciento veinte por ciento, por lo menos veinticinco por o menos treinta por ciento, por lo menos treinta iento, por lo menos cuarenta por ciento, o por enta por ciento menos agregado después de vein de agregación acelerada como se compara oglobulina no mutada bajo las mismas condici as modalidades, la agregación se mide por SEC- as modalidades que pueden ser combinadas con cu las modalidades precedentes, el medicame ancialmente libre de cualquier aditivo que r ación de inmunoglobulinas . En ciertas modalid n ser combinadas con cualquiera de las mod dentes, el medicamento es substancialmente 1 idina libre, sacáridos y polioles. ado es el modelo de red, el cual se usa en n ios de agregación de proteína (Harrison et al. 1999, 286, 593-606; dima and Thirumalai. Prot 11, 1036-1049; Leonhard et al. Protein Sci, 2 69 ; Patro and Przybicien. Biophys . J. 1994, 6 Patro and Przybycien. Biophys. J. 1996, 70, 28 ia et al., Proc . Nati. Acad. Sci. U.S. A. 19 -12933; Istrail et al. Comput . Biol . 1999, 6, iarelli et al., Chem. Phys. 2000. 113, 50 o et al., J. Chem. Phys. 2001, 114, 561-569 ; Br h J. Chem. Phys. 2003, 118, 5185-5194; Combe and Phys 2003, 118, 9015-9022; Toma an cromolécules, 2000, 1, 232-238; Gupta et al. 1998, 7, 2642-2652; y Nguyen and Hall Bio g. 2002, 80; 823-834) . Aquí cada residuo es repr una perla que ocupa un sitio sencillo en s el modelo de resolución intermediario en el nan usualmente unos cuantos átomos en un lla, y pseudoenlaces son algunas veces intr mantener los ángulos de enlace de estructura pri os de isomerización (Smith and Hall, Mol. Biol 187-202; Smith and Hall. Proteins: Struct . . 2001, 44: 344-360; Smith and Hall, Proteins; . Genet. 2001, 44, 376-391; Nguyen et al., Prot 13, 2909-2924 ; Nguyen and Hall. J. Am. Ch 128, 1890-1901; Jang et al., Biophys J. 2004, ang et al., Protein Sci. 2004, 13, 40-53). Est ado exitosamente para simular la formación de fi r de sistemas que contienen entre 12 y 96 de pép lanina (16 residuos cada uno) que inicia a pa o aleatorio (Nguyen and Hall, Proc . Nati. Ac ., 2004, 101 (46), 16180-16185; Nguyen and Hall exactos que la red o los modelos de re mediaria. Los modelos atómicos han sido usados olvente explícito, o con un solvente implícito nte es tratado como un continuo. El modelo expl exacto que el modelo implícito, pero es tamb dante computacionalmente . El modelo atómico con cito es usado para estudiar las etapas tempr ación del heptapéptido GNNQQNY (SEQ ID N0:17), rte de la proteína de levadura Sup25 (Gsponer, Nati. Acad. Sci. U.S.A. 2003, 100, 5154-51 o similar es usado para la agregación de ide Abl6-22 (KLVFAE (SEQ ID NO: 18) en hoj aralelas (Klimov and Thirumalai, Structure 20 07) . Dokholyan and colaboradores (Khare, ins 2005, 61, 617-632) usa un modelo atómico e investigar la tendencia a la agregación ordena Un protocolo de simulación de dinámicas mol ares es desarrollo para obtener información est eta-agregación ordenada de polipéptidos amiloid hini et al., J. Mol. Biol .. 2006, 357, 1306-1 dimiento se basa en la descomposición de una c éptido en segmentos de traslape y simulaci icas moleculares de equilibrio de un número pe s de cada segmento. La tendencia a la beta-ag con la secuencia del péptido Abeta de Alzheime contrado para ser altamente heterogéneo con un m egmento V12HHQKLVFFAE22 (SEQ ID NO: 19) y mí o dipéptidos como de cambio. Usando esta téc io predicho en la tendencia de agregación de una oble punto del dominio N terminal del prion de es verificado in vitro usando el ensayo de e lavina T . El procedimiento para descomponer la c entó Fab ( oon, et al., PNAS, 2002, 99, 6466; S -Gill, Cell Biochemistry and Biophysics. 2005, 4 i trabajo descrito en la presente, son realiz aciones atómicas de una molécula de anticuerpo n solvente explícito. En base a estas simulació nes tendientes a la agregación en el anticu ificados usando el parámetro de "tendenci ación espacial" descrito en la presente. Estas endencia a la agregación son entonces mutad ar anticuerpos con estabilidad incrementa los descritos en la presente se refieren a mod culares, no limitantes de la invención. plo 1: Metodología de Simulación de Dinámicas Mol Las simulaciones de dinámicas molecula izadas para todos los anticuerpos usando un mod co. La estructura inicial para simulación para uerpo POC total es entonces obtenida por ali entos Fab y Fe usando la estructura 1HZH ado modelo. Con el fin de alinear los fragment ncia y orientación correctos, la RMSD (por sus s s de desviación de raíz de medios cuadrados) se los residuos CYS comunes de los fragmento ado de anticuerpo total (1HZH) . Los residuos dos ya que cada subdominio de anticuerpo (CHi, CH ene un enlace disulfuro, y de esta forma los son ampliamente distribuidos entre la estruc o entera. La estructura de cuerpo entera resul ees elegida para realizar simulaciones citas para 30 ns . Se usa un patrón de glicosil las simulaciones ya que esto es el pa silación más común observado en los anticuerpos.

Se usa el empaque de simulación CHARMM (B derivados para ser consistentes con el campo d M, después del campo de fuerza CSFF (Kuttel et t . Chem. , 2002, 23, 1236). Los estados de proton úos de histidina en pH son elegidos en bas midad espacial de los grupos electronegati ta el anticuerpo completo en una caja ortoro sto minimiza el número de moléculas de agua requ sta forma minimiza el tiempo computacional . Se ciones de enlace periódicas en todas las 3 dire cubierta de solvatación de agua de 8Á es usada ción del cuadro ortorombico. El tamaño de siste tante es 202130 átomos. Se agregan los iones suf neutralizar la carga total del sistema. Se req alidad de la carga por la técnica de suma Ewald calcular la contribución de las inter rostáticas en el sistema. de computar las propiedades de interés a part ación. Las configuraciones son guardadas cada te la simulación para análisis estadístico adici iripio 2: Cálculo de la Tendencia a la Agregación E (SAP por sus siglas en inglés) Con el fin de solucionar las desventajas de e un nuevo parámetro llamado tendencia a la ag ial como se describe anteriormente.

En este ejemplo la "tendencia a la ag ial" es calculada para regiones esféricas con el ado en cada átomo en el anticuerpo descrit ío 1. El valor de la tendencia a la agregación aluada entonces con un promedio de simulación 3 agmento Fe del anticuerpo para los dos radios di rches (R=3Á, 10Á) (un experto en la técnica aprec s etapas de tiempo para simulación pueden ser es (5Á) a radios superiores (10Á) elimina alguno ras que algunos otros picos son mejorados. Algun eliminados ya que en estas regiones un fóbico pequeño (con menos de un radio 5A) es parches hidrofílieos ; de esta forma, promediand OA lleva a una disminución efectiva en hidrof la región. Mientras que en algunas otras reg ncía a la agregación espacial en r=10Á se in o a los parches hidrofóbicos que rodean un fóbico similar.

Anteriormente, se calcula la tendencia ación espacial como un promedio durante la co ación de 30 ns . Los resultados calculados u ación son entonces comparados con la tendenc ación espacial de solo la estructura de rayos ación molecular. La tendencia a la agregación da de simulación dinámica. Sin embargo, esta com ra que un buen estimado inicial de la tendenc ación espacial, especialmente para radio bajo d uede ser obtenido de la estructura de rayos X .

Los valores de tendencia a la agregación es r de la simulación para R=5Á y 10Á son mapead ctura de anticuerpo. En ambos casos, la superf uerpo es colorida de acuerdo a los valores ncia a la agregación espacial. En ambos radios álculo de la tendencia a la agregación espacial se observa que la superficie es predomina fílica. Esto es otra vez como se espera ya ía de la superficie de la proteína es s fílica. Sin embargo, son notables unas cuantas fóbicas . El contraste entre las regiones hidrof e hidrofóbico significativo en el final del f que corresponde a la región donde se en uerpo a los antígenos. Las gráficas de tendenc ación espacial para R=5Á y 10Á respectivamente, ser observada la misma correlación de pi nes de interacción. Los sitios de interac ína son obtenidos de la estructura de rayo ejos de proteína, entradas PDB 1T89, 1FC2 ev, J. Biol.. Chem. 2001, 276(19) 16469: Deisen Hoppe Seyler's Z Physiol Chem. 1978, 359. nhoTer J. Biochemistry, 1981, 20, 2361-2370; son et al. Structure, 1995, 3, 265). Las inter fóbicas se correlacionan muy bien con lo ivos de tendencia a la agregación espacial acciones hidrofílicas se correlacionan bien negativos de la tendencia a la agregación espac interactuar con otras proteínas di iormente, se identifican los parches hidr onales sobre la superficie del anticuerpo (regi La región 5 en el fondo de Fe es significat fóbica, pero es algo encerrado dentro, con l fólica en sus límites. Similarmente las regione hidrofóbicas y expuestas a solvente, per ontando en el interior del anticuerpo. Las regi ueden todavía estar implicadas potencialm racciones con otras proteínas si son expuestas ios conformacionales significativos o desdobla cuerpo. Todos los parches hidrofóbicos (regiones en también ser observados en el radio de pa ño (R=5Á), aunque con menos contraste comparad de parche superior (R=10Á) .

Los valores de tendencia a la agregación ación espacial (rayos X) en base a s ctura de rayos X puede ser usada para obte descripción de la distribución de fóbicos en la superficie. Esto es importante simulación atómica de un anticuerpo to dante computacionalmente. Para proteínas que modelo estructural de rayos X, el mismo pará encia a la agregación espacial puede ser api structura generada a través de la modela logia o predicción de estructura ab-init uctura de homología es observada para ser muy la estructura de rayos , y sus valores de t agregación son también similares a la estruc s X.

De esta forma la tendencia a la ag cial identifica los parches hidrofóbicos iar los residuos hidrofóbicos en los fílicos. Los anticuerpos resultantes muestra rtamiento de agregación y estabilidad me te de identificar los residuos tendientes ación, se observa también que el méto tífica correctamente las regiones del an iente a enlace con otras proteínas. Por lo ta do puede ser aplicado ampliamente a tod eínas para identificar las regiones tendient gación o regiones de enlace con otras proteína Ejemplo 3: Selección de Sitios de anticuerpo p Modificación de Estabilidad Los residuos identificados como que encia a la agregación espacial (y por lo ta el centro de los patrones tendientes a la ag tificados por la presente invención) son indi BLA 1 patrones con tendencia a la agregación en dominios para toda la clase IgG de anticuerpo. diferencias entre IgG son subrayadas .

Patrones con tendencia a la agregaci nio Numero de Nombres de residuo residuos IgGl IgG2 IgG3 175 L L L 1 agrá 234 L P L 235 L V L 253 I I I 282 V V V 291 P P P 296 Y F Y H2 309 L V L 328 L L L 329 P P P 330 A A A lo tanto, la capacidad hidrofóbica del patrón p ta incluso con estas diferencias y por lo t clases con residuos hidrofóbicos en la misma también patrones de tendencia a la agregación. as excepciones para esto (A330S, V110K y la del los cuales no son patrones con tendenci ación. Aparte de estas excepciones, los ificados en la presente tienen capacidad hid sta similar y valores SAP superiores para toda e los anticuerpos.

La Tabla 2 muestra los residuos hidr izados en patrones con tendencia a la agregación molécula IgGl .

Dominio SAP5A>0.15 esidu con (SAP5A>0) de 5Á (SAP5 231 ALA 230 PR 232 PRO 231 AL 234 LEU 232 PR 235 LEU 234 LE 235 LE 253 ILE 252 ME 282 VAL 253 IL (238-345) 291 PRO 282 VA 296 TYR 291 PR 309 LEU 296 TY 329 PRO 308 VA 330 ALA 309 LE 238 LE 329 PR 330 AL 331 PR 395 PRO 395 PRO 398 LEU 396 PRO Ejemplo 4: Selección de Sitios de Anticuerpo pa Modificación de Estabilidad Con el fin de demostrar que los patro ncía a la agregación identificados por su SA cados en agregación y/o inestabilidad, las mu eneradas en las regiones identificadas, para cam úos hidrofóbicos en los residuos hidrofílicos . úos seleccionados son todos cambiados a lis al, los aminoácidos los cuales forman los ales pueden ser reemplazados por aminoácidos lo más hidrofílicos en la escala Black y o cular por Thr, Ser, Lys, Gln, Asn, His, Glu, As regiones seleccionados son como a continua K) , A2 (I235K), A3 (L309K) , A4 (L309K, L235 K, L235K) . Los anticuerpos mutantes resultantes comportamiento de agregación y estabilidad antis) , optimizado para alta expresión de tran ral. Las variantes de anticuerpo son g endo el protocolo Strategene para mutagénesis di . Todas las construcciones son confirmad nciación de ADN. El ADN de plásmido en la esca icado a partir de cultivos bacterianos con colu prep. (Invitrogen) . Los protocolos del fabric dos por crecimiento y transfección temporal de tyle HEK 293 (Invitrogen) . En resumen, para tran 1 de cultivo, se incuba 1 mg de ADN total (0.5 m res HC y LC cada uno) con 20 mi de solución Opt inutos ; en el mismo tiempo se cultiva 2 g del rea sfección la polietilenimina (PEI (Polysciences l) con 20 mi de solución OptiPro por 15 min ción PEI es entonces agregada a la solución lada por agitación, y se incuba por otros 15 min con Tris-HCl 1M pH 9.0. Este eluido es pasad columna Q Sepharose (GE Healthcare) para ezas cargadas negativamente. En pH 7.0 e i anticuerpos están cargados positivamente y pe lujo a través, mientras que las impurezas ivamente enlazan a la matriz cargada positiva columna Q Sepharose. La solución con an ficado es concentrado con filtros 30K MWCO (Mi y el amortiguador se intercambia con 20 tiguador His pH 6.5 para una concentración f g/ml .

Como un control de calidad, se anali otas de las muestras purificadas y concentra PAGE bajo condiciones no reductoras y reducto uotas de proteína de 4 µg por muestra son incu tiguador desnaturalizante con o sin DTT y resu Ensayo de Turbidez Se realiza un ensayo de turbidez en 65°C p ras. El anticuerpo A y las variantes están ntración de 150 mg/ml en 20 mM de His, pH 6. en 15 veces en amortiguador de fosfato de potasi .0 a 10 mg/ml para evaluación de turbidez. Ademá vaciones cualitativas, la turbidez es cuan és de diluir además las muestras a 1 mg/ml y reg valores de absorbancia en 320 nm como se muest 3. a 3 : Comparación del Ensayo de Turbidez del Anti del tipo silvestre y variantes. ante 0 HRS 1 HR 2 HRS 4 HRS ? 0.02 0.06 0.27* * **¦ 0.01 0.03 0.04 0.19* nuación: * denota un líquido turbio ante dilu a un gel claro ante dilución; y *** denota un ge dilución. Los valores sin asteriscos son líquido dilución. Los números representan absorbancia e és de la dilución de las muestras a 1 mg7ml . xclusión de Tamaño- Cromatografía de Líquidos de Resolución (SEC-HPLC) Como un segundo ensayo, preferido, se usa determinar la pérdida de monómero al paso del t imentos de agregación acelerada. El anticuerp silvestre y variantes son incubados en un ci co (BioRad) en 150 mg/ml en 58°C por hasta 2 cada punto de tiempo, las alícuotas de muestra iluyen 15 veces en amortiguador de fosfato de po pH 6.5 para una concentración final de 10 mg eros son resueltos a partir de las espe ocalorimetría de Barrido Diferencial ocal . ) . MAB tienen termogramas DSC. carácte tres transiciones, si no se traslapan: Fab, escu et al. J. Pharm . Sci, v. 97, 1414, 2008 ; l., J, Biol. Chem, V, 276, 45539, 2001) . iciones experimentales usadas en la prese cuerpo a Fab tiene una transición de fusión temperaturas de fusión CH2 y CH3 están en respectivamente. De esta forma, en el an H2 es el dominio de anticuerpo con la temper ?? más baja.

Se analiza el anticuerpo del tipo silv antes A1-A5 en una concentración de 2 mg/ml Iamortiguador His pH 6.5 y una veloci ntamiento de 1.0 grado por minuto. Los d tra son analizados por substracción de los la 4. Tml es la transición de fusión para el Tm2 es la transición de fusión para el domin Tm3 es la transición de fusión para el dominio resultados a partir de la turbidez, SEC rimentos DSC del anticuerpo del tipo silv antes se resume en la Tabla 5. a 5; Sumario de los resultados para el anticuer CH2 ~ CH3 L309K +++ +++ L235K ¾2 ++++ ++++ + L309K 5 L234 ¾2 ++++ +++ + L235K Cada uno de los tres mutantes sencillos Al, ran estabilidad mejorada por cada uno de l os analíticos. En el ensayo de turbidez, la dil uestra anticuerpo A wt estresada en 65 °C por ta en nebulización de la solución, mientras iones para todas las variantes permanece clara. ita de muestras estresadas en 58°C por 24 horas i mento de monómero a partir de 91% del tipo sil % para las variantes. En cuanto la población de ial es 99%, las especies no monómeros en las v ran una mejora sobre la variante Al solamente nte A4 (96% de monómero después de 24 horas de la variante A5 (93% de monómero después de 24 on, como la variante Al) .

Por la forma de confirmación, se generan mu ares en un segundo anticuerpo con la adi iones de residuos en las regiones CDR del ant las mutaciones en la región CDR no se realizan ce, sin embargo, esto puede haber sido ya nte no se expresa bien lo cual puede haber sido plicación y por lo tanto tiene mayor grado de ag el tipo silvestre incluso antes del anál ación acelerada. De esta forma, todas las mu das en regiones de cuadro y conservadas pro tado predicho, por lo miso probando que el algor obusto con la única posible excepción de las mu uerpo. Los sitios para mutación son en cciones SAP. Las mutaciones en cada varia tadas en la Tabla 6. a 6. Posición de Sitios Mutados en Variantes Adic Se usa SEC-HPLC para determinar la pér ero al paso del tiempo en experimentos de ag eros son resueltos de especies no monoméricas en una columna TSKgel Super SW3000 (TOSO Bios nido en 22 °C, con una fase móvil de 150 mM de fo io, pH 6.5, en una velocidad de flujo de 0.2 mi la el por ciento de monómero como el área d érico dividido por el área total de todos lo tados en 280 nm.

La variante A6 muestra un incremento de 9 ipo silvestre a 96% de monómero en 12 hora mento de 91% para el tipo silvestre para 92% de horas. La variante A7 muestra un incremento el tipo silvestre para 97.5% de monómero en 12 ncremento de 91% para el tipo silvestre para ero en 24 horas. La variante A8 muestra un incre para el tipo silvestre para 98.% de monómer y un incremento de 91% para el tipo silvestre minado en R-5 Á para el anticuerpo completo tan glicosilación . El SAP para el anticuer silación es determinada a partir de la simul icas moleculares de 30 ns del anticuerpo comp icosilación. La SAP para anticuerpo sin glicosil minada con la misa simulación, pero donde se re silación durante el análisis SAP. Las regiones S las regiones más tendientes a agregación. Se obs moción de la glicosilación incrementa significat SAP en la regiones cubiertas por glicos ialmente para residuos F241 y F243. Por lo t ión o desplazamiento de glicosilación llev mento significativo en las regiones tendient ación. Estas regiones pueden ya sea dire car agregación o disminuir la barrera de energí desdoblamiento que hace a la forma no glicosila Bio. 2003, 325, 979-89) . En la variante FY, lo úos de fenilalanina son reemplazados por los los cuales han sido sugeridos para tener tenden face superior de azúcar (Taroni et al . Prote , 13, 89-98) . Al mismo tiempo, otros fóbicos, por ejemplo Val264, permanecen no mod ta región. Ambos FY del tipo silvestre y variant oca si la hay sialilación de sus carbohidratos, casi 50% de las moléculas de la variante FAS ti ños un residuo de ácido siálico.

La estabilidad de FS y FY del tipo sil ntes es comparada con experimentos de ag rada y por microcalorimetría de barrido dif ) . Las muestras en 150 mg/ml se inducen para agre por hasta 36 horas, y los niveles de monó lven y cuantifican por cromatografía de líquidos ras . Las muestras de 36 horas no son corridas debido a la presencia de agregados visibles abu Los resultados DSC también se diferencian e ntes y tipo silvestre. La temperatura de fusión io CH2 disminuye de 73 °C para el tipo silvestre la variante FS . Las diferencias menores en la o mayor a 1°C, se observan para las transici n de Fab y CH3 también. Aunque el respaldo ición de fusión CH2 de la variante FY se traslapa tipo silvestre, la fijación del software nución de Tm de CH2 a 71°C, mientras que las o rmanecen sin cambiar.

Se realiza una variedad de experimentos adi comparar las variantes FS con el tipo silvestr der mejor la disminución observada en la estabil nte FS retiene la misma estructura rica en ho cosiladas variantes y del tipo silvestre, as diferencias persisten. Adicionalmente , la var ne la función de enlace FcR n total y FcTRia no pierde enlace a los receptores de FcYRH y FcyR Se hace constar que con relación a esta f método conocido por la solicitante para llev ica la citada invención, es el que resulta cia nte descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como ant ma como propiedad lo contenido en las si ndicaciones : 1. Una inmunoglobulina modificada o terizada porque tiene una tendencia reduci ación que comprende por lo menos una mutación r regación en un residuo en un dominio conserva oglobulina que (i) tiene una tendencia a la ag ial (radio de esfera 5Á) de por lo menos 0.15, una tendencia a la agregación espacial (radio d e más de 0.0 y está dentro de 5Á de un residuo tendencia a la agregación espacial (radio de es r lo menos 0.15, en donde la por lo menos una ducción de agregación es una substitución con un 3. La inmunoglobulina modificada o ais rmidad con la reivindicación 1, caracterizada s comprende una segunda mutación reductora de ag residuo que (i) tiene una tendencia a la ag ial (radio de esfera 5Á) de por lo menos 0.15, una tendencia a la agregación espacial (radio d de más de 0.0 y está dentro de 5Á de un residuo tendencia a la agregación espacial (radio de es or lo menos 0.15, en donde la segunda muta ción de agregación es una substitución con un re ácidos que disminuye la tendencia a la ag ial (radio de esfera 5Á) del residuo como se coi munoglobulina no mutada. 4. La inmunoglobulina modificada o ais rmidad con la reivindicación 3, caracterizada p ión reductora de agregación y la segunda terizada porque la por lo menos una mutación r agregación es una substitución con un res ácidos que es menos hidrofóbico que el residu oglobulina no modificada. 7. La inmunoglobulina modificada o ais rmidad con cualquiera de las reivindicacion terizada porque la mutación reductora de agreg substitución con un residuo de aminoácidos sele grupo el cual consiste de lisina, arginina, ?? mato, aspartato, glutamina, y asparagina 8. La inmunoglobulina modificada o ais rmidad con cualquiera de las reivindicacion terizada porque la mutación reductora de agreg substitución con un residuo de aminoácidos sele rupo el cual consiste de lisina, arginina e hist 9. La inmunoglobulina modificada o ais terizada porque la inmunoglobulina comprende una 12. La inmunoglobulina modificada o ais rmidad con cualquiera de las reivindicacione terizada porque comprende un dominio CH2 humano. 13. La inmunoglobulina modificada o ais rmidad con cualquiera de las reivindicacione terizada porque comprende un dominio CH2 humano. 14. La inmunoglobulina modificada o ais rmidad con cualquiera de las reivindicacione terizada porque comprende un dominio (¾ humano. 15. La inmunoglobulina modificada o ais rmidad con cualquiera de las reivindicacione terizada porque comprende un dominio CL humano. 16. La inmunoglobulina modificada o ais rmidad con cualquiera de las reivindicacione terizada porque la inmunoglobulina además compr oncentración de por lo menos 10 mg/ml, por lo , por lo menos 30 mg/ml, por lo menos 40 mg/ml, 50 mg/ml, por lo menos 75 mg/ml, por lo me , por lo menos 125 mg/ml, o por lo menos 150 mg/ 18. Una inmunoglobulina modificada o terizada porque tiene una tendencia a la agreg comprende por lo menos una mutación reduc ación en un residuo seleccionado del grupo ste de residuos de un patrón de agregación 1: 1 (CHi) / y 181 (CHi) ; un patrón de agregación grá) , 227 (bisagra) , 228 (bisagra) , 229 (bisag grá) , 231 (bisagra) y 232 (bisagra) ; un pa ación 3: 234 (bisagra) y 235 (bisagra); un p ación 4: 252 (CH2> y 253 ((¾) ; un patrón de ag 82 (CH2> ; un patrón de agregación 6: 291 (CH2> ; u gregación 7: 296 (¾2> ; un patrón de agregación icada y la tendencia a la agregación que es red ación entre las moléculas de inmunoglobulinas ión líquida, concentrada. 19. La inmunoglobulina modificada o ais rmidad con la reivindicación 18, caracterizada p o menos residuo de mutación reductora de agreg eleccionado del grupo el cual consiste de residu n de agregación 1: 175 (CHi) ; un patrón de agreg (bisagra) , 228 (bisagra) , y 230 (bisagra) ; un p ación 3: 234 (bisagra) y 235 (bisagra); un p ación 4: 253 (CH2) } un patrón de agregación 5: 2 trón de agregación 6: 291 (CH2) ; un patrón de ag 6 ((¾) ; un patrón de agregación 8: 309 {CH2) 1 u gregación 9: 329 (CH2) y 330 (CH2) ; un pa ación 10: 395 (CH3) y 398 (CH3) ; un patrón de ag 43 (CH3> ; un patrón de agregación 12: 110 (CL) ; u ciona del grupo que consiste de 234 (bisagr grá) , 253 (bisagra) y 309 (bisagra) . 22. La inmunoglobulina modificada o ais rmidad con la reivindicación 18, caracterizad or lo menos residuo de mutación de agrega ciona del grupo que consiste de 253 (bisagra grá) . 23. La inmunoglobulina modificada o ais rmidad con cualquiera de las reivindicaciones terizada porque además comprende una segunda tora de agregación en un residuo hidrofóbico q una tendencia a la agregación espacial de por , ó (ii) está dentro de 5Á de un residuo el cu ncia a la agregación espacial de por lo menos la segunda mutación de reducción de agregació itución con un residuo de aminoácidos que e ión reductora de agregación y la segunda tora de agregación están en diferentes patr ación. 26. La inmunoglobulina modificada o ais rmidad con cualquiera de las reivindicaciones terizada porque comprende por lo menos iones reductoras de agregación en donde cada tora de agregación se selecciona de un pa ación diferente . 27. La inmunoglobulina modificada o ais rmidad con cualquiera de las reivindicaciones terizada porque la mutación reductora de agreg substitución con un residuo de aminoácidos sele grupo el cual consiste de lisina, arginina, hi mato, aspartato, glutamina, y asparagina 28. La inmunoglobulina modificada o ais rmidad con cualquiera de las reivindicaciones terizada porque la inmunoglobulina es selecció el cual comprende IgGl, IgG2 , IgG3 y IgG4. 31. La inmunoglobulina modificada o ais rmidad con cualquiera de las reivindicaciones terizada porque la inmunoglobulina comprende una 32. La inmunoglobulina modificada o ais rmidad con cualquiera de las reivindicaciones terizada porque comprende un dominio CH2 humano. 33. La inmunoglobulina modificada o ais rmidad con cualquiera de las reivindicaciones terizada porque comprende un dominio CH2 humano. 34. La inmunoglobulina modificada o ais rmidad con cualquiera de las reivindicaciones terizada porque comprende un dominio CH3 humano. 35. La inmunoglobulina modificada o ais o cinco por ciento de la afinidad de enlac oglobulina no mutada para el antígeno objetivo. 37. La inmunoglobulina modificada o ais rmidad con cualquiera de las reivindicaciones terizada porque la solución líquida, concentrada oncentración de por lo menos 10 mg/ml, por lo , por lo menos 30 mg/ml, por lo menos 40 mg/ml, 50 mg/ml, por lo menos 75 mg/ml, por lo m , por lo menos 125 mg/ml, o por lo menos 150 mg/ 38. Una formulación de inmunoglobulina mo terizada porque comprende la inmunoglobul uiera de las reivindicaciones 1-37, en d oglobulina está en una concentración de por lo , por lo menos 20 mg/ml, por lo menos 30 mg/ml, 40 mg/ml, por lo menos 50 mg/ml, por lo menos 7 lo menos 100 mg/ml, por lo menos 125 mg/ml, o terizada porque por lo menos ochenta por ciento ochenta y cinco por ciento, por lo menos nov o, por lo menos-noventa y cinco por ciento, por ta y seis por ciento, por lo menos noventa y s o, por lo menos noventa y ocho por ciento, o noventa y nueve por ciento de la inmunog icada no es un monomero agregado. 41. La formulación de inmunoglobulina mo nformidad con cualquiera de las reivindicacione terizada porque además comprende un excipiente a céuticamente . 42. La formulación de inmunoglobulina mo onformidad con cualquiera de las reivindicacion terizada porque la formulación de inmunog ra por lo menos cinco por ciento, por lo me ciento, por lo menos quince por ciento, por 44. La formulación de inmunoglobulina mo onformidad con cualquiera de las reivindicacion terizada porque ™r —formulación de inmunoglobu ancialmente libre de cualquier aditivo que re ación de inmunoglobulinas . 45. La formulación de inmunoglobulina mo onformidad con cualquiera de las reivindicacion terizada porque la formulación de inmunoglobu ancialmente libre de histidina libre, sacá les . 46. Un polinucleótido aislado o reco terizado porque codifica la inmunoglobul rmidad con cualquiera de las reivindicaciones 1- 47. Un vector caracterizado porque compr ucleótido de conformidad con la reivindicación 4 48. El vector de conformidad con la reivin la célula hospedera de conformidad reivindicación 49; y b) colocar el medio de cultivo en condiciones cuales se expresa la inmunoglobulina. 51. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque además comprende (c) ai oglobulina . 52. Un método para reducir la tendenci ación de una inmunoglobulina en una for céutico concentrada caracterizado porque compren (a) proporcionar una inmunoglobulina que tien agregación; (b) substituir un residuo en un dominio conserva inmunoglobulina que (i) tiene una tendenci agregación espacial de por. lo menos 0.15, tiene una tendencia a la agregación espacial lo menos 40 mg/ml, por lo menos 50 mg/ml, menos 75 mg/ml, por lo menos 100 mg/ml, por 125 mg/ml ó por lo menos 150 mg/ml. y en donde la tendencia de agregación que se r ación entre la moléculas de inmunoglobulinas ión líquida, concentrada. 53. El uso de la inmunoglobulina modifi rmidad con cualquiera de las reivindicaciones reparación de un medicamento el cual compre lación líquida, altamente concentrada por lo , por lo menos 30 mg/ml, por lo menos 40 mg/ml, 50 mg/ml, por lo menos 75 mg/ml, por lo me , por lo menos 125 mg/ml, o por lo menos 150 mg/ 54. El uso de conformidad con la reivin en donde el medicamento es para el tratami medades autoinmunológicas , enfermedades inmuno médula ósea; pérdida ósea, enfermedad de clastoma; cáncer de mama; osteopania de enf trición; enfermedad periodontal, enfermedad de ocitosis de células de Langerhans, daño de l al, artritis séptica aguda, osteomalacia, sín ng, displasia fibrosa monoostótica, displasia stótica, reconstrucción periodontal, y fractura idosis; cánceres óseos osteolíticos , cáncer d r pulmonar, cáncer renal y cáncer rectal, me manejo del dolor óseo e hipercalcemia maligna dilitis anquilosante y otras espondiloartr zo de trasplante, infecciones virales, ne ológicas y afecciones similares neoplástic ío, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin urkitt, linfoma linfocítico pequeño/leucemia lin ca, fungoides de micosis, linfoma de células d asias mieloides como las leucemias mielógenas incluyen AML con maduración, A L sin diferen mia promielocítica aguda, leucemia mielomo , y leucemias monocíticas agudas, s displásticos , y trastornos mieloproliferativas c ncluyen leucemia mielógena crónica, tumores del oso central, por ejemplo tumores cerebrales blastoma, astrocitoma, meduloblastoma , epend oblastoma) , tumores · sólidos (cáncer nasof noma celular basal, cáncer pancreático, cáncer d r, sarcoma de Kaposi, cáncer testicular, uterino ales o cervicales, cáncer ovárico, cáncer rio o cáncer endometrial y tumores del sistema osarcoma y hemangiopericitoma) , osteoporosis , he SIDA, espóndil artritis, artritis reu medades intestinales inflamatorias (IBD por su en donde el medicamento es para el tratami asis de placa, colitis ulcerativa, linfom in, cáncer de mama, cáncer colorectal, ática juvenil, degeneración macular, virus s ratorio, enfermedad de Crohn, artritis reu tis psoriática, espondilitis anquilosante, osteo da ósea inducida por tratamiento, metástasi rna múltiple, enfermedad de Alzheimer, gla rosis múltiple. 57. El uso de conformidad con cualquiera ndicaciones 53-56, en donde el medicamento ende un excipiente aceptable farmacéuticamente. 58. El uso de conformidad con cualquiera ndicaciones 53-57, en donde la inmunoglobulin amento muestra por lo menos cinco por ciento, diez por ciento, por lo menos quince por ciento ^?ß . El uso de conformidad con cualquiera ndicaciones 53-59, en donde el medicame ancialmente libre de cualquier aditivo que re ación de inmunoglobulinas . 61. El uso de conformidad con cualquiera ndicaciones 53-59, en donde el medicame ancialmente libre de histidina libre, sacá les. 62. El uso de la inmunoglobulina modifi rmidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-grediente activo farmacéutico no agregado . 63. Una composición farmacéutica carac e comprende la inmunoglobulina de conformi uiera de las reivindicaciones 1-37 y un ex able farmacéuticamente. 64. La composición farmacéutica de conform a consigo misma en una solución líquida, con las mismas condiciones. 66. La composición farmacéutica de conform uiera de las reivindicaciones 63-65, carac e por lo menos ochenta por ciento, por lo menos eo por ciento, por lo menos noventa por ciento, noventa y cinco por ciento, por lo menos novent iento, por lo menos noventa y siete por ciento, noventa y ocho por ciento, o por lo menos n por ciento de la inmunoglobulina modificada n ero agregado . 67. La composición farmacéutica de conform uiera de las reivindicaciones 63-66, caracter lación de inmunoglobulina muestra por lo menos c o, por lo menos diez por ciento, por lo menos qu o, por lo menos veinte por ciento, por l 69. La composición farmacéutica de conform reivindicaciones 63-68, caracterizada por lación de inmunoglobulina es substancialmente uier aditivo que reduce la agregaci oglobulinas . 70. La composición farmacéutica de conform reivindicaciones 63-69, caracterizada por lación de inmunoglobulina es substancialmente dina libre, sacáridos y polioles. 71. Una inmunoglobulina modificada o terizada porque tiene tendencia reducida para ag terizada porque comprende por lo menos una tora de agregación en un residuo seleccionado d (bisagra), 241 (CH2) , 243 (CH2) , 282 (CH2) y 309 si el residuo 235 se selecciona, se muta a un g serina, si el residuo 282 es seleccionada se mu lo menos una mutación reductora de agregación ión del residuo 241 para serina, y además compr da mutación reductora de agregación del residuo a . 73. La inmunoglobulina modificada o ais rmidad con la reivindicación 71, caracterizada lo menos una mutación reductora de agregación ión del residuo 241 para tirosina, y además c egunda mutación reductora de agregación del res tirosina . 74. La inmunoglobulina modificada o ais rmidad con la reivindicación 71, caracterizada lo menos una mutación reductora de agregación ión del residuo 282 para serina, y además compr da mutación reductora de agregación del residuo a y la tercera mutación reductora de agregació rmidad con la reivindicación 75, caracterizada p da mutación reductora de agregación está en un (i) tiene una tendencia a la agregación espacial nos 0.15, ó (ii) está dentro de 5A de un residuo una tendencia a la agregación espacial de por ó (ii) está dentro de 5Á de un residuo que t ncía a la agregación espacial de por lo menos 0. 77. La inmunoglobulina modificada o ais rmidad con la reivindicación 75 o reivindicac terizada porque además comprende una tercera t tora de agregación está en un residuo que (i) t ncía a la agregación espacial de por lo menos está dentro de 5Á de un residuo el cual ti ncía a la agregación espacial de por lo menos la tercera mutación reductora de agregación itución con un residuo de aminoácidos que e rmidacl con cualquiera de las reivindicaciones terizada porque la mutación reductora de agregac da mutación reductora de agregación están en di nes de agregación. 80. La inmunoglobulina modificada o ais rmidad con cualquiera de las reivindicació terizada porque comprende por lo menos iones reductoras de agregación en donde cada r tora de agregación se selecciona de un pa ación diferente. 81. La inmunoglobulina modificada o ais rmidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 aracterizada porque la mutación reductora de ag una substitución con un residuo de ami cionado del grupo el cual consiste de' lisina, a dina, glutamato, aspartato, glutamina, asp terizada porque la inmunoglobulina es selecció el cual comprende IgGl, IgG2 , IgG3 y IgG4. 84. La inmunoglobulina modificada o ais rmidad con cualquiera de las reivindicaciones terizada porque la inmunoglobulina comprende una 85. La inmunoglobulina modificada o ais rmidad con cualquiera de las reivindicaciones terizada porque comprende un dominio CH2 humano. 86. La inmunoglobulina modificada o ais rmidad con cualquiera de las reivindicaciones terizada porque comprende un dominio CH2 humano. 87. La inmunoglobulina modificada o ais rmidad con cualquiera de las reivindicaciones terizada porque comprende un dominio CH3 humano. 88. La inmunoglobulina modificada o aisl rmidad con cualquiera de las reivindicaciones oglobulina no mutada para el antígeno objetivo. 90. La inmunoglobulina modificada o ais rmidad con cualquiera de las reivindicaciones terizada porque la solución líquida, concentrada concentración de por lo menos 10 mg/ml, por lo , por lo menos 30 mg/ml, por lo menos 40 mg/ml, 50 mg/ml, por lo menos 75 mg/ml, por lo m , por lo menos 125 mg/ml, o por lo menos 150 mg/ 91. La inmunoglobulina modificada carac e la inmunoglobulina de conformidad con cualq reivindicaciones 7-190, caracterizada por oglobulina está en una concentración de por lo r , por lo menos 20 mg/ml, por lo menos 30 mg/ml 40 mg/ml, por lo menos 50 mg/ml, por lo menos 7 lo menos 100 mg/ml, por lo menos 125 mg/ml, o 150 mg/ml. ochenta y cinco por ciento, por lo menos nov o, por lo menos noventa y cinco por ciento, por ta y seis por ciento, por lo menos noventa y s o, por lo menos noventa y ocho por ciento, o noventa y nueve por ciento de la inmunog icada no es un monomero agregado. 94. La formulación de inmunoglobulina mo nformidad con cualquiera de las reivindicacione terizada porque comprende un excipiente a céuticamente . 95. La formulación de inmunoglobulina mo nformidad con cualquiera de las reivindicacione terizada porque la formulación de inmunog ra por lo menos cinco por ciento, por lo menos o, por lo menos quince por ciento, por lo meno ciento, por lo menos veinticinco por ciento, nformidad con cualquiera de las reivindicaci aracterizada porque la formulación de inmunoglob ancialmente libre de cualquier aditivo que re ación de inmunoglobulinas. 98. La formulación de inmunoglobulina mo nformidad con cualquiera de las reivindicacione terizada la formulación es substancialmente l dina libre, sacáridos y polioles. 99. Un polinucleótido aislado o reco terizado porque codifica la inmunoglobul rmidad con cualquiera de las reivindicaciones 71 100. Un vector caracterizado porque compr ucleótido de conformidad con la reivindicación 9 101. El vector de conformidad con la reivin caracterizado porque comprende un promotor i ado operablemente al polinucleótido. b) colocar el medio de cultivo en condiciones cuales se expresa la inmunoglobulina . 104. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque además comprende (c) ai oglobulina . 105. El uso de la inmunoglobulina modifi rmidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 reparación de un medicamento el cual compre lación líquida altamente concentrada en d ntración de la inmunoglobulina modificada es 20 mg/ml, por lo menos 30 mg/ml, por lo menos lo menos 50 mg/ml, por lo menos 75 mg/ml, por g/ml, por lo menos 125 mg/ml, o por lo menos 150 106. El uso de conformidad con la reivin en donde el medicamento es para el tratami medades autoinmunológicas , enfermedades inmuno médula ósea; pérdida ósea, enfermedad de clastoma; cáncer de mama; osteopania de enf trición; enfermedad periodontal, enfermedad de ocitosis de células de Langerhans, daño de l al, artritis séptica aguda, osteomalacia, sín ng, displasia fibrosa monoostótica , displasia stótica, reconstrucción periodontal, y fractura idosis; cánceres óseos osteolíticos , cáncer d r pulmonar, cáncer renal y cáncer rectal, me , manejo del dolor óseo e hipercalcemia maligna dilitis anquilosante y otras espondiloartr zo de trasplante, infecciones virales, ne ológicas y afecciones similares neoplástic lo, linforna de Hodgkin, linforna no de Hodgkin urkitt, linforna linfocítico pequeño/leucemia lin ca, fungoides de micosis, linforna de células de asias mieloides como las leucemias mielógenas incluyen A L con maduración, AML sin diferen mia promielocítica aguda, leucemia mielomo , y leucemias monocíticas agudas, s displásticos , y trastornos mieloproliferativas c incluyen leucemia mielógena crónica, tumores del oso central, por ejemplo tumores cerebrales blastoma, astrocitoma, meduloblastoma, epend oblastoma) , tumores sólidos (cáncer nasof noma celular basal, cáncer pancreático, cáncer d r, sarcoma de Kaposi, cáncer testicular, uterino ales o cervicales, cáncer ovárico, cáncer rio o cáncer endometrial y tumores del sistema osarcoma y hemangiopericitoma) , osteoporosis , he SIDA, espóndil artritis, artritis reu medades intestinales inflamatorias (IBD por su en donde el medicamento es para el tratami asis de placa, colitis ulcerativa, linfom in, cáncer de mama, cáncer colorectal, ática juvenil, degeneración macular, virus s ratorio, enfermedad de Crohn, artritis reu tis psoriática, espondilitis anquilosante, osteo da ósea inducida por tratamiento, metástasi rna múltiple, enfermedad de Alzheimer, gla rosis múltiple. 109. El uso de conformidad con cualquiera ndicaciones 105-108, en donde el medicamento ende un excipiente aceptable farmacéuticamente. 110. El uso de conformidad con cualquiera ndicaciones 105-109, en donde la inmunoglobuli amento muestra por lo menos cinco por ciento, diez por ciento, por lo menos quince por ciento ndicaciones 105-111 en donde el medicame ancialmente libre de cualquier aditivo que re ación de inmunoglobulinas . 113. El uso de conformidad con cualquiera ndicaciones 105-111, en donde el medicame ancialmente libre de histidina libre, sacá les . 114. El uso de la inmunoglobulina modifi rmidad con cualquiera de las reivindicaciones un ingrediente activo farmacéutico no agregante. 115. Una composición farmacéutica carac e comprende la inmunoglobulina de conformi uiera de las reivindicaciones 71-90 y un ex able farmacéuticamente. 116. La composición farmacéutica de conform reivindicación 115, caracterizada porq a consigo misma en una solución líquida, con las mismas condiciones. 118. La composición farmacéutica de conform uiera de las reivindicaciones 115-117, carac e por lo menos ochenta por ciento, por lo menos eo por ciento, por lo menos noventa por ciento, noventa y cinco por ciento, por lo menos novent ciento, por lo menos noventa y siete por ciento, noventa y ocho por ciento, o por lo menos n por ciento de la inmunoglobulina modificada n ero agregado. 119. La composición farmacéutica de conform uiera de las reivindicaciones 115-118, caracter lación de inmunoglobulina muestra por lo menos c o, por lo menos diez por ciento, por lo menos qu o, por lo menos veinte por ciento, por l 121. La composición farmacéutica de conform reivindicaciones 115-120, caracterizada por lación de inmunoglobulina es substancialmente uier aditivo que reduce la agregaci oglobulinas . 122. La composición farmacéutica de conform reivindicaciones 115-121, caracterizada por lación de inmunoglobulina es substancialmente dina libre, sacáridos y polioles.