KR102614250B1 - 항hla-dq2.5 항체의 제제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 항HLA-DQ2.5 항체, 및 그것을 포함하는 제제에 관한 것이다. 본 발명은, 개변되어 있는 항HLA-DQ2.5 항체를 제공한다. 본 발명의 항HLA-DQ2.5 항체는, HLA-DQ2.5와 글루텐 펩티드에 의해 형성된 복합체에 대해서 결합 활성을 갖지만, HLA-DQ2.5와 무관계한 펩티드에 의해 형성된 복합체에 대해서는 결합 활성을 실질적으로 갖지 않는다. 더욱이 본 발명의 항체는, 글루텐 펩티드에 의한 T 세포 활성화에 대한 저해 효과를 가짐이 나타나 있다. 본 발명은 또한, 항HLA-DQ2.5 항체를 포함하는 제제, 특히 주사용 제제에 관한 것이다.

Description

항HLA-DQ2.5 항체의 제제
본 발명은, 항HLA-DQ2.5 항체 및 그것을 포함하는 제제에 관한 것이다.
셀리악병(celiac disease 또는 coeliac disease)은, 유전적 감수성 환자에 있어서 글루텐의 섭취가 소장에 대한 손상을 야기하는 자기면역 질환이다(비특허문헌 1∼5). 구미의 인구의 약 1%, 즉 미국 및 유럽연합에서는 800만명이 셀리악병으로 이환하고 있다고 생각된다; 그렇지만, 1940년대에 이 질환이 인식된 이후, 현저한 치료상의 진보는 달성되어 있지 않다.
주요 조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 II에 속하는 인간 백혈구 항원(HLA)은, HLA-DR, HLA-DP 및 HLA-DQ 분자, 예를 들어 HLA-DQ2.5 아이소폼(본 명세서에 있어서, 이후 「HLA-DQ2.5」라고 부른다)을 포함하고, 이들은 세포 표면 상에서 α쇄와 β쇄로 구성되는 헤테로2량체를 형성하고 있다. 셀리악병 환자의 대다수(＞90%)는 HLA-DQ2.5 하플로타입의 대립 유전자를 갖고 있다(비특허문헌 6). 이 아이소폼은, 글루텐 펩티드에 대해서, 보다 강한 어피니티를 갖는다고 생각된다. 다른 아이소폼과 마찬가지로, HLA-DQ2.5는, 외인성 원에서 유래하는 프로세싱된 항원을, T 세포 상의 T 세포 수용체(TCR)에 제시한다. 셀리악병 환자에서는, 빵 등의 고글루텐 식품의 소화의 결과로서, 면역원성의 글루텐 펩티드, 예를 들어 글리아딘 펩티드가 형성된다(비특허문헌 2). 해당 펩티드는 소장 상피를 통과하여 점막 고유층에 수송되고, 트랜스글루타미나제 2(TG2)와 같은 조직 트랜스글루타미나제에 의해 탈아마이드화된다. 탈아마이드화된 글리아딘 펩티드는 항원 제시 세포(APC)에 의해 프로세싱되고, APC가 그들을 HLA-DQ2.5에 로드한다. 로드된 펩티드는 HLA-DQ2.5 구속성 T 세포에 제시되어, 자연 면역 반응과 적응 면역 반응을 활성화한다. 이것은, 소장 점막의 염증성 손상 및 다양한 타입의 위장 장애, 영양 결핍증, 및 전신 증상을 포함하는 증상을 야기한다(비특허문헌 8, 9, 및 10). 항HLA DQ 중화 항체는 셀리악병 환자에서 유래하는 T 세포의 글루텐 펩티드 의존성 활성화를 저해함이 보고되어 있다(비특허문헌 7).
현재 실시 가능한 셀리악병 치료법은, 생애에 걸치는 글루텐 프리식(GFD)의 준수이다. 그러나, 현실적으로는, GFD를 이용했다고 해도 글루텐 폭로를 완전히 배제하는 것은 곤란하다. 이들 환자에 대한 허용 글루텐량은 불과 약 10∼50mg/일이다(비특허문헌 11). GFD 제조에서는 2차 오염이 광범위하게 생길 가능성이 있어, GFD를 충분히 준수하고 있는 환자에 있어서조차도, 미량의 글루텐이 셀리악병의 증상을 야기하는 경우가 있다. 이와 같은 의도하지 않는 글루텐 폭로의 위험의 존재하에서, GFD에 대한 보조 요법이 필요해지고 있다.
근년, 여러 가지 항체 제제가 개발되고 실용에 제공되고 있지만, 많은 항체 제제는 정맥 주사용 제제로서 이용되고 있다. 한편, 의료 현장의 요구에 의해, 항체 함유 제제를 자기 주사 가능한 피하 주사용 제제로서 개발하는 요망이 높아지고 있다. 특히, 프리필드 시린지에 봉입된 용액 제제가, 그 편리성으로부터 그 개발의 요망이 높다.
피하 주사용의 항체 함유 제제를 설계함에 있어서는, 1회당의 항체 투여량이 대량이 되는 한편으로(80∼200mg 정도), 피하 주사에서는 일반적으로 주사액량의 제한이 있으므로, 투여액 중의 항체의 고농도화가 필수가 되고 있다.
근년, 자기 주사용의 프리필드 시린지 제제로서, 내부에 약제가 충전된 통 형상의 주사기 본체와, 상기 주사기 본체의 선단에 장착된 주사바늘과, 착탈 가능하게 장착된 주사바늘을 덮는 시린지 캡과, 상기 주사기 본체 내에 삽입되어, 해당 주사기 본체의 축심 방향으로 슬라이드 이동 가능한 플런저를 구비한 프리필드 시린지가 의료 현장에서 사용되게 되었다.
프리필드 시린지를 사용할 때에는, 시린지 캡을 제거하고, 투여 부위에 바늘을 삽입 후, 플런저 로드로 플런저를 전방으로 이동시킴으로써, 약액을 배출·투여한다. 일반적으로, 본 플런저의 접동성을 확보하기 위해서, 프리필드 시린지의 내벽 및 플런저에 윤활제인 실리콘 오일 등을 도포하는 것이 행해지고 있다.
항체 함유 제제에 있어서는, 수용액 중에서의 입자의 형성이 문제가 된다. 형성하는 입자로서는, 2량체나 3량체와 같은 다량체보다도 큰 응집체이지만, 일반적으로 눈으로 보는 것은 곤란하다고 여겨지는, 1.5μm∼50μm 미만까지의 입경의 미립자인 서브비저블 입자(sub-visible particle, SVP)나, 표준 조도(2,000-3,000lx 정도)에서 목시(目視)에 의해 검출 가능한 가시 입자(visible particle: VP, 100μm보다 크다)가 알려져 있다. 한편, 의약 제제에 있어서의 가시 입자의 목시에 의한 검출률은 실시자에 의한 간차(間差)가 크지만, 일본 약국방에 규정되어 있는 표준 조도(2,000-3,000lx 정도)에 있어서는 100μm의 입경의 입자의 검출 감도가 40% 정도, 150μm의 입경의 입자의 검출 감도가 70% 정도, 200μm의 입경의 입자의 검출 감도가 거의 100%가 됨이 보고되어 있다(비특허문헌 12). 또한, 의약 제제를 관찰하는 조도를 높이거나, 관찰 시간을 길게 함으로써, 실제로는 최소 40μm 정도의 더욱 작은 입경의 입자까지 목시로 검출하는 것도 가능하다. 본 명세서에서는, 특히 이와 같은 40μm 이상∼100μm의 입자를 고조도에서만 목시에 의해 검출 가능한 입자라고 부른다. 또한, 40μm 이상의 입경을 갖는 입자는, 고조도에서 목시에 의해 검출 가능한 입자이며, 목시에 의해 검출 가능한 입자라고 칭한다.
일반적으로 항체는 기액 계면이나 고액 계면과 같은 계면에 흡착하여, 응집하는 성질을 갖고 있다. 이들 계면의 존재가 상기 목시에 의해 검출 가능한 입자의 형성에 기여하고 있을 가능성이 있다. 항체 용액을 충전한 시린지에 메커니컬 스트레스를 줌으로써, 계면의 존재에 기인하는 미립자의 현저한 증가가 보고되어 있다(비특허문헌 13). 시린지에 충전된 항체 용액은, 기포가 존재함으로써 기액 계면을 형성하고, 플런저 및 시린지 배럴과 접촉함으로써, 고액 계면을 형성한다. 또한, 프리필드 시린지의 플런저 및 배럴이 실리콘 도포되어 있는 경우, 항체 용액은 고상 표면의 실리콘과 접촉하여, 새로운 고액 계면을 형성한다. 또한, 고액 계면에 흡착하여, 응집된 단백질은 프리필드 시린지 중의 공기의 이동에 의해, 액 중에 박락되어, 가시 입자로서 나타나는 것도 보고되어 있다(비특허문헌 14).
각종 계면에서 받는 스트레스를 저감하는 방법으로서, 프리필드 시린지 내의 기포의 양을 줄이는 것을 들 수 있다. 기포의 양을 줄임으로써, 프리필드 시린지 중을 이동하는 공기의 양을 줄일 수 있고, 그 결과로서, 기액 계면이나 고액 계면에의 흡착이나 응집체의 탈착을 억제할 수 있다고 생각된다.
N Engl J Med 2007; 357:1731-1743 J Biomed Sci. 2012; 19(1): 88 N Engl J Med 2003; 348:2517-2524 Gut 2003; 52:960-965 Dig Dis Sci 2004; 49:1479-1484 Gastroenterology 2011; 141:610-620 Gut 2005; 54:1217-1223 Gastroenterology 2014; 146:1649-58 Nutrients 2013 Oct 5(10): 3975-3992 J Clin Invest. 2007; 117(1):41-49 Am J Clin Nutr 2007; 85: 160-6 James A. Melchore, AAPS PharmSciTech; 2011; 12(1): 215-221. Torisu et al., J. Pharm. Sci. 106 (2017) 2966-2978. Gerhardt et al., J. Pharm. Sci. 103 (2014) 1601-1612.
기술적 과제
보조 요법을 필요로 하는 상기의 상황하에 있어서, 본 발명은 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자, 및 그것을 포함하는 제제(특히, 주사용 제제)를 제공한다.
과제의 해결
본 발명의 항원 결합 분자는 개변되어 있고, HLA-DQ2.5와 글루텐 펩티드에 의해 형성된 2개 이상의 복합체에 결합할 수 있다.
보다 구체적으로는, 본 발명은 이하를 제공한다.
[1] (i) 글루텐 펩티드와의 복합체의 형태에 있는 HLA-DQ2.5에 대해서 결합 활성을 갖는 제 1 항원 결합 부분; 및
(ii) 글루텐 펩티드와의 복합체의 형태에 있는 HLA-DQ2.5에 대해서 결합 활성을 갖는 제 2 항원 결합 부분
을 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자로서,
해당 항원 결합 분자가, HLA-DQ2.5와 글루텐 펩티드의 2개 이상의 복합체에 결합하고,
제 1 항원 결합 부분이 결합하는 복합체 중의 글루텐 펩티드의 적어도 1개가, 제 2 항원 결합 부분이 결합하는 복합체 중의 글루텐 펩티드의 적어도 1개와는 상이하고; 및
해당 항원 결합 분자가, HLA-DQ2.5 양성 PBMC B 세포 및 HLA-DQ2.5를 발현하는 Ba/F3 세포의 어느 하나 또는 양쪽에 대해서 결합 활성을 실질적으로 갖지 않고,
해당 항원 결합 분자가, 인간화되어 있고, 또한
해당 다중 특이성 항원 결합 분자에 있어서의 제 1 항원 결합 부분 및/또는 제 2 항원 결합 부분의 중쇄 및/또는 경쇄 중의 1개 또는 복수의 아미노산이, 개변되어 있는,
다중 특이성 항원 결합 분자.
[1a] 상기 항원 결합 분자가, HLA-DQ2.2를 발현하는 Ba/F3 세포에 대해서 결합 활성을 실질적으로 갖지 않는, [1]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[1-1] 다중 특이성 항원 결합 분자에 있어서의 제 1 항원 결합 부분 및/또는 제 2 항원 결합 부분의 중쇄 및/또는 경쇄 중의 1개 또는 복수의 아미노산이, 치환되어 있는, [1] 또는 [1a]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[1-2] 중쇄의 가변 영역에 있어서의 적어도 1개의 아미노산 치환; 중쇄의 정상 영역에 있어서의 적어도 1개의 아미노산 치환; 경쇄의 가변 영역에 있어서의 적어도 1개의 아미노산 치환; 및 경쇄의 정상 영역에 있어서의 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함하는, [1-1]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[2] 글루텐 펩티드가, 셀리악병에 관련하는 면역 우성 펩티드인, [1]∼[1-2] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[3] 글루텐 펩티드가, 33mer 글리아딘 펩티드, α1 글리아딘 펩티드, α2 글리아딘 펩티드, γ1 글리아딘 펩티드, γ2 글리아딘 펩티드, ω1 글리아딘 펩티드, ω2 글리아딘 펩티드, BC 호르데인 펩티드, α3 글리아딘 펩티드, α1b 글리아딘 펩티드, γ4a 글리아딘 펩티드, γ4b 글리아딘 펩티드, 아베닌 1 펩티드, 아베닌 2 펩티드, 아베닌 3 펩티드, 호르데인 1 펩티드, 호르데인 2 펩티드, 세칼린 1 펩티드, 세칼린 2 펩티드, 및 26mer 글리아딘 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [1]∼[2] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[3-1] 글루텐 펩티드가, 33mer 글리아딘 펩티드, α1 글리아딘 펩티드, α2 글리아딘 펩티드, γ1 글리아딘 펩티드, γ2 글리아딘 펩티드, ω1 글리아딘 펩티드, ω2 글리아딘 펩티드, BC 호르데인 펩티드, α3 글리아딘 펩티드, α1b 글리아딘 펩티드, γ4a 글리아딘 펩티드, γ4b 글리아딘 펩티드, 아베닌 1 펩티드, 아베닌 2 펩티드, 아베닌 3 펩티드, 호르데인 1 펩티드, 호르데인 2 펩티드, 세칼린 1 펩티드, 세칼린 2 펩티드, 및 26mer 글리아딘 펩티드 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19개, 또는 모두인, [1]∼[2] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[3-2] 글루텐 펩티드가, 33mer 글리아딘 펩티드, α1 글리아딘 펩티드, α2 글리아딘 펩티드, γ1 글리아딘 펩티드, ω1 글리아딘 펩티드, ω2 글리아딘 펩티드, BC 호르데인 펩티드, α3 글리아딘 펩티드, α1b 글리아딘 펩티드, γ4a 글리아딘 펩티드, γ4b 글리아딘 펩티드, 아베닌 1 펩티드, 아베닌 2 펩티드, 아베닌 3 펩티드, 호르데인 1 펩티드, 호르데인 2 펩티드, 세칼린 1 펩티드, 세칼린 2 펩티드, 및 26mer 글리아딘 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [1]∼[2] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[3-3] 글루텐 펩티드가, 33mer 글리아딘 펩티드, α1 글리아딘 펩티드, α2 글리아딘 펩티드, γ1 글리아딘 펩티드, ω1 글리아딘 펩티드, ω2 글리아딘 펩티드, BC 호르데인 펩티드, α3 글리아딘 펩티드, α1b 글리아딘 펩티드, γ4a 글리아딘 펩티드, γ4b 글리아딘 펩티드, 아베닌 1 펩티드, 아베닌 2 펩티드, 아베닌 3 펩티드, 호르데인 1 펩티드, 호르데인 2 펩티드, 세칼린 1 펩티드, 세칼린 2 펩티드, 및 26mer 글리아딘 펩티드 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개, 또는 모두인, [1]∼[2] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4] 무관계한 펩티드와의 복합체의 형태에 있는 HLA-DQ2.5에 대해서 결합 활성을 실질적으로 갖지 않고, 해당 무관계한 펩티드가, CLIP 펩티드, B형 간염 바이러스 1 펩티드, 살모넬라균 펩티드, 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) 펩티드, 및 티로퍼옥시다제 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 펩티드인, [1]∼[3-3] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[4-1] 무관계한 펩티드와의 복합체의 형태에 있는 HLA-DQ2.5에 대해서 결합 활성을 실질적으로 갖지 않고, 해당 무관계한 펩티드가, CLIP 펩티드, B형 간염 바이러스 1 펩티드, 살모넬라균 펩티드, 마이코박테리움 보비스 펩티드, 및 티로퍼옥시다제 펩티드의 모두인, [1]∼[3-3] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[5] HLA-DP, HLA-DR, HLA-DQ5.1, HLA-DQ6.3, HLA-DQ7.3, HLA-DQ7.5, 및 HLA-DQ8에 대해서 결합 활성을 실질적으로 갖지 않는, [1]∼[4-1] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[6] (i) HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드 복합체와 HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드 구속성 CD4+ T 세포 사이의 상호작용; 및/또는 (ii) HLA-DQ2.2/글루텐 펩티드 복합체와 HLA-DQ2.2/글루텐 펩티드 구속성 CD4+ T 세포 사이의 상호작용을 블록하는, [1]∼[5] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[6-2] 글루텐 펩티드가, α1 글리아딘 펩티드, α1b 글리아딘 펩티드, α2 글리아딘 펩티드, ω1 글리아딘 펩티드, ω2 글리아딘 펩티드, γ1 글리아딘 펩티드, γ2 글리아딘 펩티드, γ3 글리아딘 펩티드, γ4a 글리아딘 펩티드, γ4d 글리아딘 펩티드, 및 BC 호르데인 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [6]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[7] 상기 인간화 및 개변 전과 비교하여, 상기 항원 결합 분자가, HLA-DQ2.5와 글루텐 펩티드에 의해 형성된 복합체에 대해서 증강된 결합 활성을 갖는, [1]∼[6-2] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[8] 상기 인간화 및 개변 전과 비교하여, 상기 항원 결합 분자가, 글루텐 펩티드에 대해서 증강된 교차 반응성을 갖는, [1]∼[7] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[8-1] 글루텐 펩티드가, ω2 글리아딘 펩티드, BC 호르데인 펩티드, γ1 글리아딘 펩티드, γ2 글리아딘 펩티드, γ4a 글리아딘 펩티드, 및 γ4d 글리아딘 펩티드인, [8]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[9] 항원 결합 분자의 중쇄 및 경쇄에 있어서의 이하의 (a)∼(d)에 나타나는 아미노산 잔기 세트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 또는 모든 아미노산 잔기 세트가, 서로 정전기적으로 반발하는 아미노산 잔기인, [1]∼[8-1] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자:
(a) EU 넘버링에 따른 175위인, 중쇄 정상 영역(CH1) 중의 아미노산 잔기, 및 Kabat 넘버링에 따른 131위인, 경쇄 정상 영역(CL) 중의 아미노산 잔기,
(b) EU 넘버링에 따른 175위인, CH1 중의 아미노산 잔기, 및 Kabat 넘버링에 따른 160위인, CL 중의 아미노산 잔기,
(c) EU 넘버링에 따른 175위인, CH1 중의 아미노산 잔기, 및 Kabat 넘버링에 따른 131위 및 160위인, CL 중의 아미노산 잔기,
(d) EU 넘버링에 따른 147위 및 175위인, CH1 중의 아미노산 잔기, 및 Kabat 넘버링에 따른 131위 및 160위인, CL 중의 아미노산 잔기.
[10] 추가로, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이의 경계면을 형성하는 2개 이상의 아미노산 잔기가, 서로 정전기적으로 반발하는 아미노산 잔기인, [9]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[11] 서로 정전기적으로 반발하는 아미노산 잔기가, 이하의 (a) 및 (b)의 아미노산 잔기 세트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개의 아미노산 잔기 세트인, [10]의 다중 특이성 항원 결합 분자:
(a) Kabat 넘버링에 따른 39위인, 중쇄 가변 영역 중의 아미노산 잔기, 및 Kabat 넘버링에 따른 38위인, 경쇄 가변 영역 중의 아미노산 잔기,
(b) Kabat 넘버링에 따른 45위인, 중쇄 가변 영역 중의 아미노산 잔기, 및 Kabat 넘버링에 따른 44위인, 경쇄 가변 영역 중의 아미노산 잔기.
[12] 서로 정전기적으로 반발하는 아미노산 잔기가, 이하의 (X) 또는 (Y)의 어느 하나의 세트에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는, [9]∼[11] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자:
(X) 글루탐산(E), 아스파르트산(D),
(Y) 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H).
[13] 천연형 인간 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, 인간 Fcγ 수용체에 대해서 저하된 결합 어피니티를 나타내는 Fc 도메인을 추가로 포함하는, [9]∼[12] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[14] Fc 도메인이, 235위의 Arg 및 236위의 Arg를 포함하고, 아미노산 위치가, EU 넘버링에 따라 번호 붙여져 있는, [13]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[15] Fc 도메인이, 안정된 회합이 가능한 제 1 Fc 영역 서브유닛과 제 2 Fc 영역 서브유닛으로 구성되는, [13] 또는 [14]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[16] Fc 도메인이, 이하의 (e1) 또는 (e2)를 포함하고, 아미노산 위치가, EU 넘버링에 따라 번호 붙여져 있는, [15]의 다중 특이성 항원 결합 분자:
(e1) 349위의 Cys, 366위의 Ser, 368위의 Ala, 및 407위의 Val을 포함하는 제 1 Fc 영역 서브유닛, 및 354위의 Cys 및 366위의 Trp를 포함하는 제 2 Fc 영역;
(e2) 439위의 Glu를 포함하는 제 1 Fc 영역 서브유닛, 및 356위의 Lys를 포함하는 제 2 Fc 영역.
[17] Fc 도메인이, 천연형 인간 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, 인간 FcRn에 대해서 보다 강한 FcRn 결합 어피니티를 추가로 나타내는, [13]∼[16] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[18] 제 1 및/또는 Fc 영역 서브유닛이, 428위의 Leu, 434위의 Ala, 438위의 Arg, 및 440위의 Glu를 포함하고, 아미노산 위치가, EU 넘버링에 따라 번호 붙여져 있는, [16]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[19] 이하의 (i)∼(xii)의 아미노산 잔기의 1개 또는 복수를 포함하는, [1]∼[8] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자:
(i) 중쇄 정상 영역 중의 175위(EU 넘버링)의 글루탐산 또는 리신;
(ii) 중쇄 정상 영역 중의 147위(EU 넘버링)의 글루탐산;
(iii) 경쇄 정상 영역 중의 131위(Kabat 넘버링)의 글루탐산 또는 리신;
(iv) 경쇄 정상 영역 중의 160위(Kabat 넘버링)의 글루탐산 또는 리신;
(v) 중쇄 정상 영역 중의 235위(EU 넘버링)의 아르기닌;
(vi) 중쇄 정상 영역 중의 236위(EU 넘버링)의 아르기닌;
(vii) 중쇄 정상 영역 중의 356위(EU 넘버링)의 리신;
(viii) 중쇄 정상 영역 중의 428위(EU 넘버링)의 류신;
(ix) 중쇄 정상 영역 중의 434위(EU 넘버링)의 알라닌;
(x) 중쇄 정상 영역 중의 438위(EU 넘버링)의 아르기닌;
(xi) 중쇄 정상 영역 중의 439위(EU 넘버링)의 글루탐산;
(xii) 중쇄 정상 영역 중의 440위(EU 넘버링)의 글루탐산.
[19-1] 이하를 포함하는 이중 특이성 항체인, [19]의 다중 특이성 항원 결합 분자:
175위(EU 넘버링)의 리신, 235위(EU 넘버링)의 아르기닌, 236위(EU 넘버링)의 아르기닌, 428위(EU 넘버링)의 류신, 434위(EU 넘버링)의 알라닌, 438위(EU 넘버링)의 아르기닌, 439위(EU 넘버링)의 글루탐산, 및 440위(EU 넘버링)의 글루탐산을 포함하는 제 1 중쇄;
131위(Kabat 넘버링)의 글루탐산 및 160위(Kabat 넘버링)의 글루탐산을 포함하는 제 1 경쇄;
147위(EU 넘버링)의 글루탐산, 175위(EU 넘버링)의 글루탐산, 235위(EU 넘버링)의 아르기닌, 236위(EU 넘버링)의 아르기닌, 356위(EU 넘버링)의 리신, 428위(EU 넘버링)의 류신, 434위(EU 넘버링)의 알라닌, 438위(EU 넘버링)의 아르기닌, 및 440위(EU 넘버링)의 글루탐산을 포함하는 제 2 중쇄; 및
131위(Kabat 넘버링)의 리신 및 160위(Kabat 넘버링)의 리신을 포함하는 제 2 경쇄.
[19-2] 제 1 중쇄가, 419위(EU 넘버링)의 글루탐산 및 445위(EU 넘버링)의 프롤린, 및 446위 및 447위(EU 넘버링)에서의 아미노산 결실을 추가로 포함하고; 또한
제 2 중쇄가, 196위(EU 넘버링)의 리신, 445위(EU 넘버링)의 프롤린, 및 446위 및 447위(EU 넘버링)에서의 아미노산 결실을 추가로 포함하는,
[19-1]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[19-3] 제 1 중쇄가, 16위(Kabat 넘버링)의 글리신, 32위(Kabat 넘버링)의 알라닌, 61위(Kabat 넘버링)의 리신, 35a위(Kabat 넘버링)의 발린, 50위(Kabat 넘버링)의 알라닌, 64위(Kabat 넘버링)의 글루탐산, 73위(Kabat 넘버링)의 트레오닌, 95위(Kabat 넘버링)의 글루탐산, 및 102위(Kabat 넘버링)의 발린을 추가로 포함하고;
제 1 경쇄가, 28위(Kabat 넘버링)의 글루탐산, 55위(Kabat 넘버링)의 티로신, 56위(Kabat 넘버링)의 글루탐산 또는 티로신, 92위(Kabat 넘버링)의 글루탐산, 94위(Kabat 넘버링)의 발린, 및 95a위(Kabat 넘버링)의 알라닌을 추가로 포함하고;
제 2 중쇄가, 28위(Kabat 넘버링)의 글루탐산, 30위(Kabat 넘버링)의 알라닌 또는 글루탐산, 31위(Kabat 넘버링)의 글루탐산, 32위(Kabat 넘버링)의 트립토판, 34위(Kabat 넘버링)의 페닐알라닌, 35위(Kabat 넘버링)의 메티오닌, 35a위(Kabat 넘버링)의 세린, 50위(Kabat 넘버링)의 세린, 61위(Kabat 넘버링)의 글루탐산 또는 글리신, 64위(Kabat 넘버링)의 글루탐산, 및 65위(Kabat 넘버링)의 글루탐산을 추가로 포함하고; 또한
제 2 경쇄가, 25위(Kabat 넘버링)의 트레오닌, 54위(Kabat 넘버링)의 리신, 56위(Kabat 넘버링)의 글루탐산, 67위(Kabat 넘버링)의 류신, 79위(Kabat 넘버링)의 글루타민, 및 94위(Kabat 넘버링)의 리신을 추가로 포함하는,
[19-1] 또는 [19-2]의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[19a] 글루텐 펩티드 그 자체에 대해서는 결합 활성을 실질적으로 갖지 않는, [1]∼[19-3] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[20] 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분을 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자로서,
제 1 항원 결합 부분이, 이하의 (a1)∼(a3) 중 어느 하나를 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자:
(a1) 서열 번호: 129의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 130의 CDR 2, 서열 번호: 131의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 132의 CDR 1, 서열 번호: 133의 CDR 2, 서열 번호: 134의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역;
(a2) 서열 번호: 164의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 165의 CDR 2, 서열 번호: 166의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 167의 CDR 1, 서열 번호: 168의 CDR 2, 서열 번호: 169의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 및
(a3) (a1) 또는 (a2)에 기술되는 제 1 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 1 아미노산 서열, 및 (a1) 또는 (a2)에 기술되는 제 2 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 2 아미노산 서열.
[21] 제 2 항원 결합 부분이, 이하의 (b1)∼(b8) 중 어느 하나를 포함하는, [20]의 다중 특이성 항원 결합 분자:
(b1) 서열 번호: 135의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 136의 CDR 2, 서열 번호: 137의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 138의 CDR 1, 서열 번호: 139의 CDR 2, 서열 번호: 140의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(b2) 서열 번호: 135의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 136의 CDR 2, 서열 번호: 137의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 141의 CDR 1, 서열 번호: 142의 CDR 2, 서열 번호: 143의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(b3) 서열 번호: 144의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 145의 CDR 2, 서열 번호: 146의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 141의 CDR 1, 서열 번호: 142의 CDR 2, 서열 번호: 143의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(b4) 서열 번호: 147의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 148의 CDR 2, 서열 번호: 149의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 150의 CDR 1, 서열 번호: 151의 CDR 2, 서열 번호: 152의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(b5) 서열 번호: 153의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 154의 CDR 2, 서열 번호: 155의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 150의 CDR 1, 서열 번호: 151의 CDR 2, 서열 번호: 152의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(b6) 서열 번호: 156의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 157의 CDR 2, 서열 번호: 158의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 150의 CDR 1, 서열 번호: 151의 CDR 2, 서열 번호: 152의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(b7) 서열 번호: 159의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 160의 CDR 2, 서열 번호: 161의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 141의 CDR 1, 서열 번호: 142의 CDR 2, 서열 번호: 143의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역; 및
(b8) (b1)∼(b7) 중 어느 하나에 기술되는 제 3 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 3 아미노산 서열, 및 (b1)∼(b7) 중 어느 하나에 기술되는 제 4 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 4 아미노산 서열.
[21-2] 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분을 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자로서,
제 2 항원 결합 부분이, 이하의 (b1)∼(b8) 중 어느 하나를 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자:
(b1) 서열 번호: 135의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 136의 CDR 2, 서열 번호: 137의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 138의 CDR 1, 서열 번호: 139의 CDR 2, 서열 번호: 140의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역;
(b2) 서열 번호: 135의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 136의 CDR 2, 서열 번호: 137의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 141의 CDR 1, 서열 번호: 142의 CDR 2, 서열 번호: 143의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역;
(b3) 서열 번호: 144의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 145의 CDR 2, 서열 번호: 146의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 141의 CDR 1, 서열 번호: 142의 CDR 2, 서열 번호: 143의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역;
(b4) 서열 번호: 147의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 148의 CDR 2, 서열 번호: 149의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 150의 CDR 1, 서열 번호: 151의 CDR 2, 서열 번호: 152의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역;
(b5) 서열 번호: 153의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 154의 CDR 2, 서열 번호: 155의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 150의 CDR 1, 서열 번호: 151의 CDR 2, 서열 번호: 152의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역;
(b6) 서열 번호: 156의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 157의 CDR 2, 서열 번호: 158의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 150의 CDR 1, 서열 번호: 151의 CDR 2, 서열 번호: 152의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역;
(b7) 서열 번호: 159의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 160의 CDR 2, 서열 번호: 161의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 141의 CDR 1, 서열 번호: 142의 CDR 2, 서열 번호: 143의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 및
(b8) (b1)∼(b7) 중 어느 하나에 기술되는 제 1 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 1 아미노산 서열, 및 (b1)∼(b7) 중 어느 하나에 기술되는 제 2 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 2 아미노산 서열.
[22] 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분을 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자로서,
제 1 항원 결합 부분이, 이하의 (c1)∼(c3):
(c1) 서열 번호: 129의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 130의 CDR 2, 서열 번호: 131의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 132의 CDR 1, 서열 번호: 133의 CDR 2, 서열 번호: 134의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역;
(c2) 서열 번호: 164의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 165의 CDR 2, 서열 번호: 166의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 167의 CDR 1, 서열 번호: 168의 CDR 2, 서열 번호: 169의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 및
(c3) (c1) 또는 (c2)에 기술되는 제 1 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 1 아미노산 서열, 및 (c1) 또는 (c2)에 기술되는 제 2 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 2 아미노산 서열
중 어느 하나를 포함하고,
제 2 항원 결합 부분이, 이하의 (d1)∼(d8):
(d1) 서열 번호: 135의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 136의 CDR 2, 서열 번호: 137의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 138의 CDR 1, 서열 번호: 139의 CDR 2, 서열 번호: 140의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(d2) 서열 번호: 135의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 136의 CDR 2, 서열 번호: 137의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 141의 CDR 1, 서열 번호: 142의 CDR 2, 서열 번호: 143의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(d3) 서열 번호: 144의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 145의 CDR 2, 서열 번호: 146의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 141의 CDR 1, 서열 번호: 142의 CDR 2, 서열 번호: 143의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(d4) 서열 번호: 147의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 148의 CDR 2, 서열 번호: 149의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 150의 CDR 1, 서열 번호: 151의 CDR 2, 서열 번호: 152의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(d5) 서열 번호: 153의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 154의 CDR 2, 서열 번호: 155의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 150의 CDR 1, 서열 번호: 151의 CDR 2, 서열 번호: 152의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(d6) 서열 번호: 156의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 157의 CDR 2, 서열 번호: 158의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 150의 CDR 1, 서열 번호: 151의 CDR 2, 서열 번호: 152의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(d7) 서열 번호: 159의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 160의 CDR 2, 서열 번호: 161의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 141의 CDR 1, 서열 번호: 142의 CDR 2, 서열 번호: 143의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역; 및
(d8) (d1)∼(d7) 중 어느 하나에 기술되는 제 3 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 3 아미노산 서열, 및 (d1)∼(d7) 중 어느 하나에 기술되는 제 4 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 4 아미노산 서열
중 어느 하나를 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자.
[22-2] 제 1 및 제 2 항체 가변 영역을 포함하는 제 1 항원 결합 부분 및 제 3 및 제 4 항체 가변 영역을 포함하는 제 2 항원 결합 부분을 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자로서, 이하의 (1)∼(15) 중 어느 하나를 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자:
(1) 서열 번호: 129의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 130의 CDR 2, 서열 번호: 131의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 132의 CDR 1, 서열 번호: 133의 CDR 2, 서열 번호: 134의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 135의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 136의 CDR 2, 서열 번호: 137의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 138의 CDR 1, 서열 번호: 139의 CDR 2, 서열 번호: 140의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(2) 서열 번호: 129의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 130의 CDR 2, 서열 번호: 131의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 132의 CDR 1, 서열 번호: 133의 CDR 2, 서열 번호: 134의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 135의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 136의 CDR 2, 서열 번호: 137의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 141의 CDR 1, 서열 번호: 142의 CDR 2, 서열 번호: 143의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(3) 서열 번호: 129의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 130의 CDR 2, 서열 번호: 131의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 132의 CDR 1, 서열 번호: 133의 CDR 2, 서열 번호: 134의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 144의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 145의 CDR 2, 서열 번호: 146의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 141의 CDR 1, 서열 번호: 142의 CDR 2, 서열 번호: 143의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(4) 서열 번호: 129의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 130의 CDR 2, 서열 번호: 131의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 132의 CDR 1, 서열 번호: 133의 CDR 2, 서열 번호: 134의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 147의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 148의 CDR 2, 서열 번호: 149의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 150의 CDR 1, 서열 번호: 151의 CDR 2, 서열 번호: 152의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(5) 서열 번호: 129의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 130의 CDR 2, 서열 번호: 131의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 132의 CDR 1, 서열 번호: 133의 CDR 2, 서열 번호: 134의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 153의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 154의 CDR 2, 서열 번호: 155의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 150의 CDR 1, 서열 번호: 151의 CDR 2, 서열 번호: 152의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(6) 서열 번호: 129의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 130의 CDR 2, 서열 번호: 131의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 132의 CDR 1, 서열 번호: 133의 CDR 2, 서열 번호: 134의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 156의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 157의 CDR 2, 서열 번호: 158의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 150의 CDR 1, 서열 번호: 151의 CDR 2, 서열 번호: 152의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(7) 서열 번호: 129의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 130의 CDR 2, 서열 번호: 131의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 132의 CDR 1, 서열 번호: 133의 CDR 2, 서열 번호: 134의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 159의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 160의 CDR 2, 서열 번호: 161의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 141의 CDR 1, 서열 번호: 142의 CDR 2, 서열 번호: 143의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역; 및
(8) 서열 번호: 164의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 165의 CDR 2, 서열 번호: 166의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 167의 CDR 1, 서열 번호: 168의 CDR 2, 서열 번호: 169의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 135의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 136의 CDR 2, 서열 번호: 137의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 138의 CDR 1, 서열 번호: 139의 CDR 2, 서열 번호: 140의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(9) 서열 번호: 164의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 165의 CDR 2, 서열 번호: 166의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 167의 CDR 1, 서열 번호: 168의 CDR 2, 서열 번호: 169의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 135의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 136의 CDR 2, 서열 번호: 137의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 141의 CDR 1, 서열 번호: 142의 CDR 2, 서열 번호: 143의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(10) 서열 번호: 164의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 165의 CDR 2, 서열 번호: 166의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 167의 CDR 1, 서열 번호: 168의 CDR 2, 서열 번호: 169의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 144의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 145의 CDR 2, 서열 번호: 146의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 141의 CDR 1, 서열 번호: 142의 CDR 2, 서열 번호: 143의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(11) 서열 번호: 164의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 165의 CDR 2, 서열 번호: 166의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 167의 CDR 1, 서열 번호: 168의 CDR 2, 서열 번호: 169의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 147의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 148의 CDR 2, 서열 번호: 149의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 150의 CDR 1, 서열 번호: 151의 CDR 2, 서열 번호: 152의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(12) 서열 번호: 164의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 165의 CDR 2, 서열 번호: 166의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 167의 CDR 1, 서열 번호: 168의 CDR 2, 서열 번호: 169의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 153의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 154의 CDR 2, 서열 번호: 155의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 150의 CDR 1, 서열 번호: 151의 CDR 2, 서열 번호: 152의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(13) 서열 번호: 164의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 165의 CDR 2, 서열 번호: 166의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 167의 CDR 1, 서열 번호: 168의 CDR 2, 서열 번호: 169의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 156의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 157의 CDR 2, 서열 번호: 158의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 150의 CDR 1, 서열 번호: 151의 CDR 2, 서열 번호: 152의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(14) 서열 번호: 164의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 165의 CDR 2, 서열 번호: 166의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 167의 CDR 1, 서열 번호: 168의 CDR 2, 서열 번호: 169의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 159의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 160의 CDR 2, 서열 번호: 161의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 141의 CDR 1, 서열 번호: 142의 CDR 2, 서열 번호: 143의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역; 및
(15) (1)∼(14) 중 어느 하나에 기술되는 제 1 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 1 아미노산 서열; (1)∼(14) 중 어느 하나에 기술되는 제 2 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 2 아미노산 서열; (1)∼(14) 중 어느 하나에 기술되는 제 3 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 3 아미노산 서열; 및 (1)∼(14) 중 어느 하나에 기술되는 제 4 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 4 아미노산 서열.
[23] 제 1 항원 결합 부분 및/또는 제 2 항원 결합 부분에 포함되는 항체 가변 영역이, 인간 항체 프레임워크 또는 인간화 항체 프레임워크를 포함하는, [20]∼[22-2] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자.
[24] 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분을 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자로서,
제 1 항원 결합 부분이, 이하의 (e1)∼(e3) 중 어느 하나를 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자:
(e1) 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역;
(e2) 서열 번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 및
(e3) (e1) 또는 (e2)에 기술되는 제 1 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 1 아미노산 서열, 및 (e1) 또는 (e2)에 기술되는 제 2 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 2 아미노산 서열.
[25] 제 2 항원 결합 부분이, 이하의 (f1)∼(f8) 중 어느 하나를 포함하는, [24]의 다중 특이성 항원 결합 분자:
(f1) 서열 번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 98의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(f2) 서열 번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(f3) 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(f4) 서열 번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(f5) 서열 번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(f6) 서열 번호: 96의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(f7) 서열 번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역; 및
(f8) (f1)∼(f7) 중 어느 하나에 기술되는 제 3 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 3 아미노산 서열, 및 (f1)∼(f7) 중 어느 하나에 기술되는 제 4 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 4 아미노산 서열.
[26] 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분을 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자로서,
제 1 항원 결합 부분이, 이하의 (e1)∼(e3):
(e1) 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역;
(e2) 서열 번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 및
(e3) (e1) 또는 (e2)에 기술되는 제 1 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 1 아미노산 서열, 및 (e1) 또는 (e2)에 기술되는 제 2 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 2 아미노산 서열
중 어느 하나를 포함하고, 또한
제 2 항원 결합 부분이, 이하의 (f1)∼(f8):
(f1) 서열 번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 98의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(f2) 서열 번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(f3) 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(f4) 서열 번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(f5) 서열 번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(f6) 서열 번호: 96의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(f7) 서열 번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역; 및
(f8) (f1)∼(f7) 중 어느 하나에 기술되는 제 3 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 3 아미노산 서열, 및 (f1)∼(f7) 중 어느 하나에 기술되는 제 4 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 4 아미노산 서열
중 어느 하나를 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자.
[26-2] 제 1 및 제 2 항체 가변 영역을 포함하는 제 1 항원 결합 부분 및 제 3 및 제 4 항체 가변 영역을 포함하는 제 2 항원 결합 부분을 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자로서, 이하의 (1)∼(15) 중 어느 하나를 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자:
(1) 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 98의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(2) 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(3) 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(4) 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(5) 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(6) 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 96의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(7) 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(8) 서열 번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 98의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(9) 서열 번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(10) 서열 번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(11) 서열 번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(12) 서열 번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(13) 서열 번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 96의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(14) 서열 번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(15) (1) 또는 (14)에 기술되는 제 1 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 1 아미노산 서열; (1) 또는 (14)에 기술되는 제 2 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 2 아미노산 서열; (1)∼(14) 중 어느 하나에 기술되는 제 3 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 3 아미노산 서열; 및 (1)∼(14) 중 어느 하나에 기술되는 제 4 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 4 아미노산 서열.
[27] 이하의 (A1)∼(A3)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2개의 폴리펩티드쇄의 조합을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자:
(A1) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄;
(A2) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄; 및
(A3) (A1) 또는 (A2)에 기술되는 제 1 중쇄 서열에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 1 아미노산 서열, 및 (A1) 또는 (A2)에 기술되는 제 1 경쇄 서열에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 2 아미노산 서열.
[27-2] 이하의 (A1)∼(A3)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2개의 폴리펩티드쇄의 조합을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자:
(A1) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄;
(A2) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄; 및
(A3) (A1) 또는 (A2)에 기술되는 제 1 중쇄 서열에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 1 아미노산 서열, 및 (A1) 또는 (A2)에 기술되는 제 1 경쇄 서열에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 2 아미노산 서열.
[28] 이하의 (B1)∼(B8)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2개의 폴리펩티드쇄의 조합을 추가로 포함하는, [27] 또는 [27-2]의 다중 특이성 항원 결합 분자:
(B1) 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(B2) 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(B3) 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(B4) 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(B5) 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(B6) 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(B7) 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄; 및
(B8) (B1)∼(B7) 중 어느 하나에 기술되는 제 2 중쇄 서열에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 3 아미노산 서열, 및 (B1)∼(B7) 중 어느 하나에 기술되는 제 2 경쇄 서열에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 4 아미노산 서열.
[28-2] 이하의 (B1)∼(B8)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2개의 폴리펩티드쇄의 조합을 추가로 포함하는, [27] 또는 [27-2]의 다중 특이성 항원 결합 분자:
(B1) 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(B2) 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(B3) 서열 번호: 57의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(B4) 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(B5) 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(B6) 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(B7) 서열 번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄; 및
(B8) (B1)∼(B7) 중 어느 하나에 기술되는 제 2 중쇄 서열에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 3 아미노산 서열, 및 (B1)∼(B7) 중 어느 하나에 기술되는 제 2 경쇄 서열에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 4 아미노산 서열.
[29] 이하의 (1)∼(15)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 4개의 폴리펩티드쇄의 조합을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자:
(1) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(2) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(3) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(4) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(5) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(6) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(7) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(8) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(9) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(10) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(11) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(12) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(13) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(14) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄; 및
(15) (1)∼(14) 중 어느 하나에 기술되는 제 1 중쇄 서열에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 1 아미노산 서열; (1)∼(14) 중 어느 하나에 기술되는 제 1 경쇄 서열에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 2 아미노산 서열; (1)∼(14) 중 어느 하나에 기술되는 제 2 중쇄 서열에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 3 아미노산 서열; 및 (1)∼(14) 중 어느 하나에 기술되는 제 2 경쇄 서열에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 4 아미노산 서열.
[29-2] 이하의 (1)∼(15)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 4개의 폴리펩티드쇄의 조합을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자:
(1) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(2) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(3) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 57의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(4) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(5) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(6) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(7) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(8) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(9) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 57의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(10) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(11) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(12) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(13) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(14) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄; 및
(15) (1)∼(14) 중 어느 하나에 기술되는 제 1 중쇄 서열에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 1 아미노산 서열; (1)∼(14) 중 어느 하나에 기술되는 제 1 경쇄 서열에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 2 아미노산 서열; (1)∼(14) 중 어느 하나에 기술되는 제 2 중쇄 서열에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 3 아미노산 서열; 및 (1)∼(14) 중 어느 하나에 기술되는 제 2 경쇄 서열에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 4 아미노산 서열.
[29a] 이하의 (i)∼(iii) 중 어느 하나의 조합:
(i) [20]의 (a1)∼(a3) 중 어느 하나에 기술되는 서열을 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자, 및 [21]의 (b1)∼(b8) 중 어느 하나에 기술되는 서열을 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자;
(ii) [24]의 (e1)∼(e3) 중 어느 하나에 기술되는 서열을 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자, 및 [25]의 (f1)∼(f8) 중 어느 하나에 기술되는 서열을 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자; 및
(iii) [27] 또는 [27-2]의 (A1)∼(A3) 중 어느 하나에 기술되는 서열을 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자, 및 [28] 또는 [28-2]의 (B1)∼(B8) 중 어느 하나에 기술되는 서열을 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자.
[30] [1]∼[29] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자를 코딩하는, 핵산.
[31] [30]의 핵산을 포함하는, 벡터.
[32] [30]의 핵산 또는 [31]의 벡터를 포함하는, 세포.
[33] 상기 다중 특이성 항원 결합 분자가 산생되도록 [32]의 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자를 산생하는 방법.
[34] 상기 세포의 배양물로부터 상기 다중 특이성 항원 결합 분자를 회수하는 공정을 추가로 포함하는, [33]의 방법.
[35] [1]∼[29] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 [29a]의 조합, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
[36] 셀리악병의 치료 및/또는 예방에 있어서의 사용을 위한 약학적 조성물인, [35]의 조성물.
[37] 의약품의 제조에 있어서의, [1]∼[29] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 [29a]의 조합의 사용.
[38] 상기 의약품이, 셀리악병의 치료 및/또는 예방을 위한 의약품인, [37]의 사용.
[39] 셀리악병을 갖는 개체를 치료하는 방법으로서, [1]∼[29] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 [29a]의 조합의 유효량을 해당 개체에게 투여하는 공정을 포함하는, 방법.
[40] 적어도 [1]∼[29] 중 어느 하나의 다중 특이성 항원 결합 분자 또는 [29a]의 조합, 및 사용 설명서를 포함하는, 셀리악병의 치료 및/또는 예방에 있어서의 사용을 위한 키트.
더욱이, 보다 구체적으로는, 본 발명은 이하를 제공한다.
[101] 항HLA-DQ2.5 항체를 유효 성분으로서 함유하는 용액이 용기에 충전된 주사용 제제로서,
상기 항체가, 이하의 (1)∼(3) 중 어느 하나를 포함하는, 주사용 제제:
(1) 서열 번호: 129의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 130의 CDR 2, 서열 번호: 131의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 132의 CDR 1, 서열 번호: 133의 CDR 2, 서열 번호: 134의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 153의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 154의 CDR 2, 서열 번호: 155의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 150의 CDR 1, 서열 번호: 151의 CDR 2, 서열 번호: 152의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(2) 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역; 또는,
(3) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄.
[102] 용기가 시린지 또는 카트리지인, [101]의 주사용 제제.
[103] 1기압, 25℃에 있어서의 용기 내의 기포의 용량이 40μL 이하인, [101] 또는 [102]의 주사용 제제.
[104] 1기압, 25℃에 있어서의 용기 내의 기포의 용량이 10μL 이하인, [103]의 주사용 제제.
[105] 용기가 프리필드 시린지인, [101]∼[104] 중 어느 하나의 주사용 제제.
[106] 용액 중의 상기 항체의 농도가 0.1mg/mL 이상인, [101]∼[105] 중 어느 하나의 주사용 제제.
[106a] 용액 중의 상기 항체의 농도가 50mg/mL 이상인, [101]∼[105] 중 어느 하나의 주사용 제제.
[107] 1mL 시린지 내에 포함되는 용액이 0.1∼1.2mL의 범위이거나, 또는 2.25mL 시린지 내에 포함되는 용액이 0.1∼2.5mL의 범위인, [101]∼[106a] 중 어느 하나의 주사용 제제.
[108] 상기 용액이 용기에 충전된 주사용 제제가, 내부에 의약 제제를 함유하는 시린지 또는 카트리지와 스토퍼를 포함하는, [101]∼[107] 중 어느 하나의 주사용 제제.
[109] 시린지 또는 카트리지가, 유리 또는 사이클로올레핀계의 수지제인, [101]∼[108] 중 어느 하나의 주사용 제제.
[110] 사이클로올레핀계의 수지가, 사이클로올레핀 폴리머(COP) 또는 사이클로올레핀 코폴리머(COC)인, [109]의 주사용 제제.
[111] 용액이, 당, 당 알코올, 완충제, 보존제, 담체, 산화 방지제, 킬레이트제, 천연 폴리머, 합성 폴리머, 동결 보호제, 계면활성제, 증량제, 안정화제 또는 이들의 조합을 포함하는, 1종 또는 복수의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, [101]∼[110] 중 어느 하나의 주사용 제제.
[112] 계면활성제가, 폴리소르베이트, 폴록사머 188, 라우릴 황산 나트륨, 폴리올, 폴리(에틸렌 글라이콜), 글리세롤, 프로필렌 글라이콜 또는 폴리(바이닐 알코올)인, [111]에 기재된 주사용 제제.
[113] 계면활성제가 폴리소르베이트 혹은 폴록사머 188인, [111] 또는 [112]에 기재된 주사용 제제.
[114] 용액 중의 계면활성제의 농도가 0.01mg/mL 이상인, [111]∼[113] 중 어느 하나의 주사용 제제.
[115] 용액의 pH가 5.5∼6.5의 범위인, [101]∼[114] 중 어느 하나의 주사용 제제.
[116] 0.01mg/mL의 계면활성제를 포함하는 주사용 제제의 5℃에서 1일 보관 후에 있어서의, 용액 중의 평균의 입자수가, 주사용 제제 내의 1기압, 25℃에 있어서의 기포의 용량이 120μL인 조건의 경우에 비해 감소하는, [101]∼[115] 중 어느 하나의 주사용 제제.
[117] 셀리악병 치료용 주사용 제제인, [101]∼[116] 중 어느 하나의 주사용 제제.
[118] [101]∼[117] 중 어느 하나의 주사용 제제를 조제하는 방법으로서,
얻어지는 주사용 제제에 있어서 용기 내의 1기압, 25℃에 있어서의 기포의 용량이 40μL 이하가 되도록, 용기 내에, 상기 항체를 유효 성분으로서 함유하는 용액을 충전하는 것을 포함하는, 방법.
[119] 얻어지는 주사용 제제에 있어서 용기 내의 1기압, 25℃에 있어서의 기포의 용량이 10μL 이하가 되도록, 용기 내에 상기 용액을 충전하는 것을 포함하는, [118]의 방법.
[120] 용기 내에의 용액의 충전에 있어서, 진공 스토퍼 배치법 또는 기계적 스토퍼 배치법에 의해 용기의 마개를 하는, [118] 또는 [119]에 기재된 방법.
[도 1a] 도 1a는, HLA 클래스 II를 발현하는 Ba/F3 세포주에 대한 항HLA-DQ 항체(배리언트 DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0722-F6)의 결합의 결과를 나타낸다(항체는 모두, 0.05마이크로그램(μg)/mL로 시험하고, 대조의 DQN0139bb(DQN0139bb-SG181)(WO2018/155692) 및 IC17dK는, 1μg/mL로 시험했다). 글루텐 펩티드가 나타나는 명칭에 있어서, 「a」, 「g」, 및 「w」는, 각각 「α」, 「γ」, 및 「ω」를 의미한다.
[도 1b] 도 1b는, HLA 클래스 II를 발현하는 Ba/F3 세포주에 대한 항HLA-DQ 항체(배리언트 DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0681-F6)의 결합의 결과를 나타낸다(항체는 모두, 0.05μg/mL로 시험하고, 대조의 DQN0139bb 및 IC17dK는, 1μg/mL로 시험했다).
[도 1c] 도 1c는, HLA 클래스 II를 발현하는 Ba/F3 세포주에 대한 항HLA-DQ 항체(배리언트 DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1352/L0681-F6)의 결합의 결과를 나타낸다(항체는 모두, 0.05μg/mL로 시험하고, 대조의 DQN0139bb 및 IC17dK는, 1μg/mL로 시험했다).
[도 1d] 도 1d는, HLA 클래스 II를 발현하는 Ba/F3 세포주에 대한 항HLA-DQ 항체(배리언트 DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1527/L0605-F6)의 결합의 결과를 나타낸다(항체는 모두, 0.05μg/mL로 시험하고, 대조의 DQN0139bb 및 IC17dK는, 1μg/mL로 시험했다).
[도 1e] 도 1e는, HLA 클래스 II를 발현하는 Ba/F3 세포주에 대한 항HLA-DQ 항체(배리언트 DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6)의 결합의 결과를 나타낸다(항체는 모두, 0.05μg/mL로 시험하고, 대조의 DQN0139bb 및 IC17dK는, 1μg/mL로 시험했다).
[도 1f] 도 1f는, HLA 클래스 II를 발현하는 Ba/F3 세포주에 대한 항HLA-DQ 항체(배리언트 DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0722-F6)의 결합의 결과를 나타낸다(항체는 모두, 0.05μg/mL로 시험하고, 대조의 DQN0139bb 및 IC17dK는, 1μg/mL로 시험했다).
[도 1g] 도 1g는, HLA 클래스 II를 발현하는 Ba/F3 세포주에 대한 항HLA-DQ 항체(배리언트 DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6)의 결합의 결과를 나타낸다(항체는 모두, 0.05μg/mL로 시험하고, 대조의 DQN0139bb 및 IC17dK는, 1μg/mL로 시험했다).
[도 1h] 도 1h는, HLA 클래스 II를 발현하는 Ba/F3 세포주에 대한 항HLA-DQ 항체(배리언트 DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6)의 결합의 결과를 나타낸다(항체는 모두, 0.05μg/mL로 시험하고, 대조의 DQN0139bb 및 IC17dK는, 1μg/mL로 시험했다).
[도 1i] 도 1i는, HLA 클래스 II를 발현하는 Ba/F3 세포주에 대한 항HLA-DQ 항체(배리언트 DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1352/L0681-F6)의 결합의 결과를 나타낸다(항체는 모두, 0.05μg/mL로 시험하고, 대조의 DQN0139bb 및 IC17dK는, 1μg/mL로 시험했다).
[도 1j] 도 1j는, HLA 클래스 II를 발현하는 Ba/F3 세포주에 대한 항HLA-DQ 항체(배리언트 DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1353/L0681-F6)의 결합의 결과를 나타낸다(항체는 모두, 0.05μg/mL로 시험하고, 대조의 DQN0139bb 및 IC17dK는, 1μg/mL로 시험했다).
[도 1k] 도 1k는, HLA 클래스 II를 발현하는 Ba/F3 세포주에 대한 항HLA-DQ 항체(배리언트 DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1251/L0605-F6)의 결합의 결과를 나타낸다(항체는, 0.05μg/mL로 시험하고, 대조의 DQN0139bb 및 IC17dK는, 1μg/mL로 시험했다; (#) HLA-DQ2.5 및 HLA-DQ2.5/hCLIP에 대해서는, 항체를 0.313μg/mL로 시험하고, 대조의 DQN0139bb 및 IC17dK는, 20μg/mL로 시험했다).
[도 1l] 도 1l은, HLA 클래스 II를 발현하는 Ba/F3 세포주에 대한 항HLA-DQ 항체(배리언트 DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1353/L0681-F6)의 결합의 결과를 나타낸다(항체는, 0.05μg/mL로 시험하고, 대조의 DQN0139bb 및 IC17dK는, 1μg/mL로 시험했다; (#) HLA-DQ2.5 및 HLA-DQ2.5/hCLIP에 대해서는, 항체를 0.313μg/mL로 시험하고, 대조의 DQN0139bb 및 IC17dK는, 20μg/mL로 시험했다).
[도 1m] 도 1m은, HLA 클래스 II를 발현하는 Ba/F3 세포주에 대한 항HLA-DQ 항체(배리언트 DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1255/L0605-F6)의 결합의 결과를 나타낸다(항체는, 0.05μg/mL로 시험하고, 대조의 DQN0139bb 및 IC17dK는, 1μg/mL로 시험했다; (#) HLA-DQ2.5 및 HLA-DQ2.5/hCLIP에 대해서는, 항체를 0.313μg/mL로 시험하고, 대조의 DQN0139bb 및 IC17dK는, 20μg/mL로 시험했다).
[도 1n] 도 1n은, HLA-DP, DR, DQ5.1, 및 DQ6.3에 대한 항HLA-DQ 항체(배리언트)의 결합의 결과를 나타낸다(항체는 모두, 0.05μg/mL로 시험하고, 대조의 DQN0139bb 및 IC17dK는, 1μg/mL로 시험했다).
[도 1o] 도 1o는, HLA 클래스 II를 발현하는 Ba/F3 세포주에 대한 DQN0139bb의 결합의 결과를 나타낸다(대조의 DQN0139bb를, 1μg/mL로 시험했다).
[도 1p] 도 1p는, HLA 클래스 II를 발현하는 Ba/F3 세포주에 대한 IC17dK의 결과를 나타낸다(대조의 IC17dK를, 1μg/mL로 시험했다).
[도 2] 도 2는, PBMC 유래의 CD19+ B 세포에 대한 항체 결합의 결과를 나타낸다(항체는, 0.05μg/mL로 시험하고, 대조의 DQN0139bb 및 IC17dK는, 1μg/mL로 시험했다; (#) HLA-DQ2.5 및 HLA-DQ2.5-CLIP에 대해서는, 항체를 0.313μg/mL로 시험하고; 대조의 DQN0139bb 및 IC17dK는, 20 ug/mL로 시험했다).
[도 3a] 도 3a는, HLA-DQ2.5/α1 글리아딘 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA-DQ 항체의 저해 효과를 나타낸다.
[도 3b] 도 3b는, HLA-DQ2.5/α2 글리아딘 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA-DQ 항체의 저해 효과를 나타낸다.
[도 3c] 도 3c는, HLA-DQ2.5/α1b 글리아딘 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA-DQ 항체의 저해 효과를 나타낸다.
[도 3d] 도 3d는, HLA-DQ2.5/ω1 글리아딘 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA-DQ 항체의 저해 효과를 나타낸다.
[도 3e] 도 3e는, HLA-DQ2.5/ω2 글리아딘 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA-DQ 항체의 저해 효과를 나타낸다.
[도 3f] 도 3f는, HLA-DQ2.5/BC 호르데인 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA-DQ 항체의 저해 효과를 나타낸다.
[도 3g] 도 3g는, HLA-DQ2.5/γ1 글리아딘 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA-DQ 항체의 저해 효과를 나타낸다.
[도 3h] 도 3h는, HLA-DQ2.5/γ2 글리아딘 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA-DQ 항체의 저해 효과를 나타낸다.
[도 3i] 도 3i는, HLA-DQ2.5/γ3 글리아딘 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA-DQ 항체의 저해 효과를 나타낸다.
[도 3j] 도 3j는, HLA-DQ2.5/γ4a 글리아딘 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA-DQ 항체의 저해 효과를 나타낸다.
[도 4a] 도 4a는, HLA-DQ2.5/α1 글리아딘 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA-DQ 항체의 저해 효과를 나타낸다.
[도 4b] 도 4b는, HLA-DQ2.5/α2 글리아딘 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA-DQ 항체의 저해 효과를 나타낸다.
[도 4c] 도 4c는, HLA-DQ2.5/α1b 글리아딘 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA-DQ 항체의 저해 효과를 나타낸다.
[도 4d] 도 4d는, HLA-DQ2.5/ω1 글리아딘 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA-DQ 항체의 저해 효과를 나타낸다.
[도 4e] 도 4e는, HLA-DQ2.5/ω2 글리아딘 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA-DQ 항체의 저해 효과를 나타낸다.
[도 4f] 도 4f는, HLA-DQ2.5/BC 호르데인 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA-DQ 항체의 저해 효과를 나타낸다.
[도 4g] 도 4g는, HLA-DQ2.5/γ1 글리아딘 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA-DQ 항체의 저해 효과를 나타낸다.
[도 4h] 도 4h는, HLA-DQ2.5/γ2 글리아딘 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA-DQ 항체의 저해 효과를 나타낸다.
[도 4i] 도 4i는, HLA-DQ2.5/γ3 글리아딘 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA-DQ 항체의 저해 효과를 나타낸다.
[도 4j] 도 4j는, HLA-DQ2.5/γ4a 글리아딘 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA-DQ 항체의 저해 효과를 나타낸다.
[도 5a] 도 5a는, 33mer 글리아딘에 의해 매개되는 HLA-DQ2.2/α1a 글리아딘 의존성 Jurkat T 세포 활성화를 나타낸다.
[도 5b] 도 5b는, 33mer 글리아딘에 의해 매개되는 HLA-DQ2.2/α2 글리아딘 의존성 Jurkat T 세포 활성화를 나타낸다.
[도 5c] 도 5c는, HLA-DQ2.2/α1a 글리아딘 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA-DQ 항체의 저해 효과를 나타낸다.
[도 5d] 도 5d는, HLA-DQ2.2/α2 글리아딘 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA-DQ 항체의 저해 효과를 나타낸다.
[도 6] 도 6은, 시린지 중의 기포가 (a) 120μL, (b) 40μL, (c) 10μL일 때의 사진이다.
[도 7] 도 7은, 시린지의 구성도의 일례이다.
태양의 설명
본 명세서에 기재 또는 언급되는 기술 및 순서는, 일반적으로 잘 이해되고 있고, 예를 들어 이하에 기재하는 널리 이용되는 방법론 등의 종래의 방법론을 이용하여 당업자에 의해 상용되고 있다: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); 및 Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).
본 명세서의 취지에서의 「억셉터 인간 프레임워크」는, 아래에서 정의하는 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크에서 유래하는, 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는, 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크에서 「유래하는」 억셉터 인간 프레임워크는, 그들의 동일한 아미노산 서열을 포함해도 되고, 또는 아미노산 서열의 변경을 포함하고 있어도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 아미노산의 변경의 수는, 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하이다. 몇몇 태양에 있어서, VL 억셉터 인간 프레임워크는, VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 서열이 동일하다.
「어피니티」는, 분자(예를 들어, 항체)의 결합 부위 1개와, 분자의 결합 파트너(예를 들어, 항원) 사이의, 비공유 결합적인 상호작용의 합계의 강도를 말한다. 특별히 나타내지 않는 한 본 명세서에서 이용되는 「결합 어피니티」는, 어느 결합쌍의 멤버(예를 들어, 항체와 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는, 고유의 결합 어피니티를 말한다. 분자 X의 그 파트너 Y에 대한 어피니티는, 일반적으로, 해리 상수(Kd)에 의해 나타낼 수 있다. 어피니티는, 본 명세서에 기재된 것을 포함하는, 당해 기술 분야에 있어서 알려진 통상의 방법에 따라 측정될 수 있다. 결합 어피니티를 측정하기 위한 구체적인 실례가 되는 및 예시적인 태양에 대해서는, 아래에서 말한다.
「어피니티 성숙」 항체는, 개변을 구비하지 않는 친(親)항체와 비교하여, 1개 또는 복수의 초가변 영역(hypervariable region: HVR) 중에 항체의 항원에 대한 어피니티의 개선을 가져오는 1개 또는 복수의 개변을 수반하는, 항체를 말한다.
용어 「항원 결합 부분」 또는 「항원 결합 도메인」은, 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고, 또한 그에 대한 상보성인 구역을 포함하는, 항체의 일부를 말한다. 항원 결합 부분/도메인은, 예를 들어, 1개 또는 복수의 항체 가변 도메인(항체 가변 영역이라고도 불린다)에 의해 제공될 수 있다. 바람직하게는, 항원 결합 부분/도메인은, 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 양쪽 모두 함유한다.
용어 「항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)」는, 충분한 어피니티로 HLA-DQ2.5 또는 HLA-DQ2.5와 글루텐 펩티드에 의해 형성된 하나 혹은 복수의 복합체와 결합할 수 있는 항원 결합 분자(항체)이며, 그 결과 그 항체가 HLA-DQ2.5를 표적화했을 때에 진단제 및/또는 치료제로서 유용한, 항원 결합 분자(항체)를 말한다. 일 태양에 있어서, 무관계한 항원으로의 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)의 결합의 정도는, 예를 들어, 방사 면역 측정법(radioimmunoassay: RIA)에 의해 측정했을 때, 항체의 HLA-DQ2.5 또는 HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드 복합체로의 결합의 약 10% 미만이다. 특정의 태양에 있어서, HLA-DQ2.5 또는 HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드 복합체에 대해서 「결합 활성」을 갖는 항체는, ≤1마이크로몰(μM), ≤100nM, ≤10nM, ≤1nM, ≤0.1nM, ≤0.01nM, 또는 ≤0.001nM(예를 들어 10-8M 이하, 예를 들어 10-8M∼10-13M, 예를 들어 10-9M∼10-13M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다.
본 명세서에서 사용하는 용어 「항원 결합 분자」는, 항원 결합 부위를 포함하는 임의의 분자 또는 항원으로의 결합 활성을 갖는 임의의 분자를 말하고, 더욱이, 약 5아미노산 이상의 길이를 갖는 펩티드 또는 단백질 등의 분자를 말하는 경우가 있다. 펩티드 및 단백질은 생물 유래의 것으로 한정되지 않고, 예를 들어, 그들은 인공적으로 설계된 서열로부터 산생된 폴리펩티드일 수 있다. 그들은, 천연에 존재하는 폴리펩티드, 합성 폴리펩티드, 재조합 폴리펩티드 등의 어느 것이어도 된다. 또한, 토대(scaffold)로서 α/β 배럴 등의 기지의 안정된 입체 구조를 포함하는 토대 분자(여기에서, 해당 분자의 일부는 항원 결합 부위가 된다)도, 본 명세서에 기재하는 항원 결합 분자의 일 태양이다. 몇몇 태양에 있어서, 「항원 결합 분자」는 항체이다. 본 명세서에 있어서 용어 「항원 결합 분자」 및 「항체」는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중 특이성 항체(예를 들어, 이중 특이성 항체), 및, 소망의 항원 결합 활성을 나타내는 한 항체 프래그먼트를 포함하지만 이들로 한정되지 않는, 다양한 항체 구조를 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, 해당 항체는 다중 특이성 항체이다. 몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항체는 이중 특이성 항체이다.
「항체 단편」은, 완전 항체가 결합하는 항원에 결합하는 당해 완전 항체의 일부분을 포함하는, 당해 완전 항체 이외의 분자를 말한다. 항체 단편의 예는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, Fv, Fab, Fab', Fab＇-SH, F(ab')2; 다이아보디; 선상 항체; 단쇄 항체 분자(예를 들어, scFv); 및, 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이성 항체를 포함한다.
참조 항체와 「동일한 에피토프에 결합하는 항체」는, 경합 어세이에 있어서 그 참조 항체가 자신의 항원에 하는 결합을 50% 이상 블록하는 항체를 말하고, 또 반대로 말하면, 참조 항체는, 경합 어세이에 있어서 전술한 항체가 자신의 항원에 하는 결합을 50% 이상 블록한다. 예시적인 경합 어세이가, 본 명세서에서 제공된다.
「자기면역 질환」은, 그 개체 자신의 조직으로부터 생기고 또한 그 개체 자신의 조직에 대해서 향해지는 비악성 질환 또는 장애를 말한다. 본 명세서에서, 자기면역 질환은, 악성 또는 암성의 질환 또는 상태를 명확하게 제외하는 것이고, 특히 B 세포 림프종, 급성 림프아구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia: ALL), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia: CLL), 헤어리 세포 백혈병, 및 만성 골수아구성 백혈병을 제외한다. 자기면역 질환 또는 장애의 예는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 이하의 것을 포함한다: 셀리악병, 건선 및 피부염(예를 들어, 아토피성 피부염)을 포함하는 염증성 피부 질환 등의 염증성 반응; 전신성 강피증 및 경화증; 염증성 장질환에 관련하는 반응(예를 들어, 크론병 및 궤양성 대장염); 호흡 궁박 증후군(성인 호흡 궁박 증후군; adult respiratory distress syndrome: ARDS를 포함한다); 피부염; 수막염; 뇌염; 포도막염; 대장염; 사구체신염; 예를 들어 습진 및 천식 및 T 세포의 침윤 및 만성 염증 반응을 수반하는 다른 상태 등의 알레르기성 상태; 아테롬 경화; 백혈구 접착 부전증; 관절 류머티즘; 전신성 에리테마토데스(systemic lupus erythematosus: SLE)(루푸스 신장염, 피부 루푸스를 포함하지만 이들로 한정되지 않는다); 당뇨병(예를 들어, I형 당뇨병 또는 인슐린 의존성 당뇨병); 다발성 경화증; 레이노 증후군; 자기면역성 갑상선염; 하시모토 갑상선염; 알레르기성 뇌척수염; 쇼그렌 증후군; 청년 발증 당뇨병; 및 전형적으로 결핵, 사르코이도시스, 다발성 근육염증, 육아종증, 및 혈관염에 있어서 보이는 사이토카인 및 T 림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연형 과민증에 관련하는 면역 반응; 악성 빈혈(애디슨병); 백혈구의 누출을 수반하는 질환; 중추 신경계(central nervous system: CNS) 염증성 장애; 다장기 손상 증후군; 용혈성 빈혈(크리오글로불린혈증 또는 쿰스 양성 빈혈을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다); 중증 근무력증; 항원-항체 복합체 개재성 질환; 항사구체 기저막 질환; 항인지질 증후군; 알레르기성 신경염; 그레이브스병; 램버트-이튼 근무력 증후군; 수포성류 천포창; 천포창; 자기면역성 다선성 내분비 장애; 라이터병; 스티프맨 증후군; 베쳇병; 거세포성 동맥염; 면역 복합체성 신장염; IgA 신부전; IgM 다발성 뉴로파시; 면역성 혈소판 감소성 자반병(immune thrombocytopenic purpura: ITP) 또는 자기면역성 혈소판 감소증.
용어 「셀리악병」은, 식품에 포함되는 글루텐을 섭취했을 때에 소장에서의 손상에 의해 야기되는 유전성의 자기면역 질환을 말한다. 셀리악병의 증상에는, 복통, 설사, 위식도 역류 등의 위장 장애, 비타민 결핍, 미네랄 결핍, 피로감 및 불안 우울증 등의 중추 신경계(CNS)의 증상, 골연화증 및 골다공증 등의 뼈의 증상, 피부염 등의 피부의 증상, 빈혈 및 림프구 감소증 등의 혈액의 증상, 및, 불임증, 성선 기능 저하증, 및 아이의 성장 장애와 저신장 등의 다른 증상이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.
용어 「키메라」 항체는, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정의 공급원 또는 종에서 유래하는 한편으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지의 부분이 상이한 공급원 또는 종에서 유래하는 항체를 말한다.
항체의 「클래스」는, 항체의 중쇄에 구비되는 정상 도메인 또는 정상 영역의 타입을 말한다. 항체에는 5개의 주요한 클래스가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이다. 그리고, 이 중 몇몇은 추가로 서브클래스(아이소타입)로 나눠져도 된다. 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2이다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 대응하는 중쇄 정상 도메인을, 각각, α, δ, ε, γ, 및 μ라고 부른다.
어느 제제(예를 들어, 약학적 제제)의 「유효량」은, 소망의 치료적 또는 예방적 결과를 달성하기 위해서 유효한, 필요한 용량에 있어서의 및 필요한 기간에 걸쳐서의, 양을 말한다.
본 명세서에서 용어 「Fc 영역」은, 적어도 정상 영역의 일부분을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C말단 영역을 정의하기 위해서 이용된다. 이 용어는, 천연형 서열의 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일 태양에 있어서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226으로부터, 또는 Pro230으로부터, 중쇄의 카복실 말단까지 연장된다. 단, Fc 영역의 C말단의 리신(Lys447) 또는 글리신-리신(잔기 Gly446-Lys447)은, 존재하고 있어도 존재하고 있지 않아도 된다. 본 명세서에서는 특별히 특정하지 않는 한, Fc 영역 또는 정상 영역 중의 아미노산 잔기의 번호 붙이기는, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991에 기재된, EU 넘버링 시스템(EU 인덱스라고도 불림)에 따른다.
「프레임워크」 또는 「FR」은, 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의, 가변 도메인 잔기를 말한다. 가변 도메인의 FR은, 통상 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3, 및 FR4로 이루어진다. 그에 따라서, HVR 및 FR의 서열은, 통상 다음의 순서로 VH(또는 VL)에 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 「전장(全長; full-length) 항체」, 「완전 항체」, 및 「전부 항체」는, 본 명세서에서는 서로 교환 가능하게 이용되고, 천연형 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는, 또는 본 명세서에서 정의하는 Fc 영역을 포함하는 중쇄를 갖는 항체를 말한다.
본 명세서에서는, 용어 「글루텐」은, 밀 및 다른 관련 곡물에 있어서 발견되는, 프로라민으로 불리는 저장 단백질의 복합물을 집합적으로 가리킨다. 장관 내강에 있어서, 글루텐은 이른바 글루텐 펩티드로 분해된다. 글루텐 펩티드에는, 밀 유래의 글리아딘, 보리 유래의 호르데인, 및 호밀 유래의 세칼린, 및 귀리 유래의 아베닌이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.
셀리악병에 있어서, 글루텐 펩티드는 T 세포에 의해 인식되는 항원성 펩티드이며, 이 병의 원인이 된다. 그런데, 면역 우성(immune dominance)이란, 면역 응답이 비교적 소수의 항원성 펩티드에 의해 주로 야기되는 현상이다. 그와 같은 항원성 펩티드는 「면역 우성 펩티드」라고 불린다. 셀리악병에서는, 그와 같은 면역 우성 펩티드에는, 예를 들어, α1 글리아딘(「α1a 글리아딘」이라고도 불릴 수 있다) 및 α2 글리아딘(모두 33mer 글리아딘의 서열에 포함된다), 및, ω1 글리아딘, ω2 글리아딘, 및 BC 호르데인(합계 5종의 펩티드)이 포함된다(Science Translational Medicine 21 Jul 2010: Vol. 2, Issue 41, pp. 41 ra51). 혹은, 면역 우성 펩티드에는, α1 글리아딘, α2 글리아딘, ω1 글리아딘, ω2 글리아딘, BC 호르데인, γ1 글리아딘, 및 γ2 글리아딘(합계 7종의 펩티드)이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 본 명세서에서는, 그와 같은 면역 우성 펩티드를 「셀리악병에 관련하는 면역 우성 펩티드」라고 부르는 경우가 있다. 그들이 셀리악병에 우성으로 관련하고 있는 한, 해당 펩티드의 종류와 총수는 특별히 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용하는 어구 「결합 활성이 실질적으로 없는」은, 비특이적 결합 또는 백그라운드 결합을 포함하지만 특이적 결합을 포함하지 않는 결합 레벨로, 목적이 아닌 항원에 결합하는 항체의 활성을 말한다. 바꾸어 말하면, 그와 같은 항체는, 목적이 아닌 항원에 대해서 「특이적/유의한 결합 활성을 갖지 않는다」. 특이성은, 본 명세서에 기재된 또는 당 기술 분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 측정할 수 있다. 상기의 비특이적 결합 또는 백그라운드 결합의 레벨은, 제로여도 되고, 제로는 아니지만 제로에 가까워도 되고, 또는 당업자가 기술적으로 무시하기에 충분할 만큼 매우 낮아도 된다. 예를 들어, 당업자가, 적절한 결합 어세이에 있어서 항체와 목적이 아닌 항원 사이의 결합에 대해서 어떠한 유의한(또는 비교적 강한) 시그널도 검출 또는 관찰할 수 없는 경우, 해당 항체는, 목적이 아닌 항원에 대해서 「결합 활성을 실질적으로 갖지 않는」, 또는 「특이적/유의한 결합 활성을 갖지 않는」다고 말할 수 있다. 혹은, 「결합 활성이 실질적으로 없는」 또는 「특이적/유의한 결합 활성이 없는」은, (목적이 아닌 항원에) 「특이적으로/유의하게/실질적으로 결합하지 않는」으로 바꾸어 말할 수 있다. 때로는, 「결합 활성이 없는」이라는 어구는, 당 기술 분야에서는 「결합 활성이 실질적으로 없는」 또는 「특이적/유의한 결합 활성이 없는」이라고 하는 어구와 실질적으로 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서에 있어서, 「HLA-DR/DP」는, 「HLA-DR 및 HLA-DP」 또는 「HLA-DR 또는 HLA-DP」를 의미한다. 이들 HLA는, 인간에 있어서의 MHC 클래스 II 유전자자리 상의 대응하는 하플로타입의 대립 유전자에 의해 코딩되는 MHC 클래스 II 분자이다. 「HLA-DQ」는, HLA-DQ2.5, HLA-DQ7.5, HLA-DQ5.1, HLA-DQ6.3, HLA-DQ7.3, 및 HLA-DQ8을 포함하는 HLA-DQ 아이소폼을 집합적으로 가리킨다. 본 발명에 있어서, HLA-DQ2.5에 더하여, HLA-DQ 분자는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, HLA-DQ2.2, HLA-DQ2.3, HLA-DQ4.3, HLA-DQ4.4, HLA-DQ5.1, HLA-DQ5.2, HLA-DQ5.3, HLA-DQ5.4, HLA-DQ6.1, HLA-DQ6.2, HLA-DQ6.3, HLA-DQ6.4, HLA-DQ6.9, HLA-DQ7.2, HLA-DQ7.3, HLA-DQ7.4, HLA-DQ7.5, HLA-DQ7.6, HLA-DQ8, HLA-DQ9.2, 및 HLA-DQ9.3 등의, 공지된 서브타입(아이소폼)의 HLA-DQ 분자를 포함한다. 마찬가지로, 「HLA-DR(DP)」은 HLA-DR(DP) 아이소폼을 말한다.
용어 「숙주 세포」, 「숙주 세포주」, 및 「숙주 세포 배양물」은, 서로 교환 가능하게 이용되고, 외래 핵산이 도입된 「세포」(그와 같은 세포의 자손을 포함한다)을 말한다. 숙주 세포는 「형질 전환체」 및 「형질 전환 세포」를 포함하고, 이것에는 초대의 형질 전환 세포 및 계대수에 상관 없이 그 세포에서 유래하는 자손을 포함한다. 자손은, 친세포와 핵산의 내용에 있어서 완전히 동일하지 않아도 되고, 변이를 포함하고 있어도 된다. 오리지널의 형질 전환 세포가 스크리닝되거나 또는 선택되었을 때에 이용된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 자손도, 본 명세서에서는 포함된다.
「인간 항체」는, 인간 혹은 인간 세포에 의해 산생된 항체 또는 인간 항체 레퍼터리 혹은 다른 인간 항체 코드 서열을 이용하는 비인간 공급원에서 유래하는 항체의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 구비하는 항체이다. 이 인간 항체의 정의는, 비인간의 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를, 명확하게 제외하는 것이다.
「인간 컨센서스 프레임워크」는, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택군에 있어서 가장 공통되게 생기는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 당해 프레임워크를 가리키기 위해서, 용어 「인간 항체 프레임워크」가 사용되어도 된다. 통상, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은, 가변 도메인 서열의 서브그룹으로부터이다. 통상, 서열의 서브그룹은, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3에 있어서의 서브그룹이다. 일 태양에 있어서, VL에 대해, 서브그룹은 상기의 Kabat 등에 의한 서브그룹 κI이다. 일 태양에 있어서, VH에 대해, 서브그룹은 상기의 Kabat 등에 의한 서브그룹 III이다.
「인간화」 항체는, 비인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는, 키메라 항체를 말한다. 어느 태양에 있어서, 인간화 항체는, 적어도 1개, 전형적으로는 2개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함하고, 당해 가변 영역에 있어서는, 모든 혹은 실질적으로 모든 HVR(예를 들어 CDR)은 비인간 항체의 것에 대응하고, 또한, 모든 혹은 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것에 대응한다. 인간화 항체는, 임의로, 인간 항체에서 유래하는 항체 정상 영역의 적어도 일부분을 포함해도 된다. 항체(예를 들어, 비인간 항체)의 「인간화된 형태」는, 인간화를 거친 항체를 말한다.
본 명세서에서 이용되는 용어 「초가변 영역」 또는 「HVR」은, 서열에 있어서 초가변이고(「상보성 결정 영역」 또는 「CDR」(complementarity determining region)), 및/또는 구조적으로 정해진 루프(「초가변 루프」)를 형성하고, 및/또는 항원 접촉 잔기(「항원 접촉」)를 포함하는, 항체의 가변 도메인의 각 영역을 말한다. 통상, 항체는 6개의 HVR을 포함한다: VH에 3개(H1, H2, H3), 및 VL에 3개(L1, L2, L3)이다. 본 명세서에서의 예시적인 HVR는, 이하의 것을 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2), 및 96-101(H3)의 장소에 생기는 초가변 루프(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3), 31-35b(H1), 50-65(H2), 및 95-102(H3)의 장소에 생기는 CDR(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) 아미노산 잔기 27c-36(L1), 46-55(L2), 89-96(L3), 30-35b(H1), 47-58(H2), 및 93-101(H3)의 장소에 생기는 항원 접촉(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 및,
(d) HVR 아미노산 잔기 46-56(L2), 47-56(L2), 48-56(L2), 49-56(L2), 26-35(H1), 26-35b(H1), 49-65(H2), 93-102(H3), 및 94-102(H3)을 포함하는, (a), (b), 및/또는 (c)의 조합.
일 태양에 있어서, HVR 잔기는 본 명세서에 있어서 나타난 것을 포함한다.
특별히 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인 중의 다른 잔기(예를 들어, FR 잔기)는, 본 명세서에서는 상기의 Kabat 등에 따라 번호 붙여진다.
「이뮤노컨주게이트」는, 1개 또는 복수의 이종의 분자에 컨주게이트된 항체이다.
「개체」 또는 「피험체(subject)」는 포유동물이다. 포유동물은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 사육 동물(예를 들어, 소, 양, 고양이, 개, 말), 영장류(예를 들어, 인간, 및 원숭이 등의 비인간 영장류), 토끼, 및, 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함한다. 특정의 태양에 있어서, 개체 또는 피험체는, 인간이다.
본 발명에 있어서, HLA-DQ2.5, HLA-DQ2.2, 및 HLA-DQ7.5 등의 HLA-DQ 분자에 대한 항HLA-DQ2.5 항체의 결합을 평가할 경우에, 상기에서 언급된 적절한 HLA-DQ 분자와 함께 CLIP 펩티드를 이용해도 된다.
「단리된」 항체는, 그 원래의 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 몇몇 태양에 있어서, 항체는, 예를 들어, 전기영동(예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 분리법(isoelectric focusing: IEF), 캐필러리 전기영동) 또는 크로마토그래프(예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)로 측정하고, 95% 또는 99%를 초과하는 순도까지 정제된다. 항체의 순도의 평가를 위한 방법의 총설로서, 예를 들어, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)을 참조할 것.
「단리된」 핵산은, 그 원래의 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 말한다. 단리된 핵산은, 그 핵산 분자를 통상 포함하는 세포 중에 포함된 핵산 분자를 포함하지만, 그 핵산 분자는 염색체 외에 존재하고 있거나 또는 본래의 염색체 상의 위치와는 상이한 염색체 상의 위치에 존재하고 있다.
「항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)를 코딩하는 단리된 핵산」(또한, 간단히 「항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)를 코딩하는 핵산」이라고도 불린다)은, 항체의 중쇄 및 경쇄(또는 그 단편)를 코딩하는 1개 또는 복수의 핵산 분자를 말하고, 1개의 벡터 또는 다른 벡터에 타고 있는 핵산 분자, 및, 숙주 세포 중의 1개 또는 복수의 위치에 존재하고 있는 핵산 분자를 포함한다.
본 명세서에서 말하는 용어 「모노클로날 항체」는, 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 얻어지는 항체를 말한다. 즉, 그 집단을 구성하는 개개의 항체는, 생길 수 있는 변이 항체(예를 들어, 자연적으로 생기는 변이를 포함하는 변이 항체, 또는 모노클로날 항체 조제물의 제조 중에 발생하는 변이 항체. 그와 같은 변이체는 통상 약간량 존재하고 있다.)를 제외하고, 동일하고 및/또는 동일한 에피토프에 결합한다. 상이한 결정기(에피토프)에 대한 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 조제물과는 대조적으로, 모노클로날 항체 조제물의 각 모노클로날 항체는, 항원 상의 단일한 결정기에 대한 것이다. 따라서, 수식어 「모노클로날」은, 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 얻어지는 것이라고 하는 항체의 특징을 나타내고, 어떠한 특정의 방법에 따르는 항체의 제조를 요구하는 것이라고 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 이용되는 모노클로날 항체는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 하이브리도마법, 재조합 DNA법, 파지 디스플레이법, 인간 면역글로불린 유전자자리의 전부 또는 일부를 포함하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하는, 다양한 수법에 의해 제작되어도 되고, 모노클로날 항체를 제작하기 위한 그와 같은 방법 및 다른 예시적인 방법은, 본 명세서에 기재되어 있다.
「나(裸) 항체」는, 이종의 부분 또는 방사성 표지에 컨주게이트되어 있지 않은 항체를 말한다. 나 항체는, 약학적 제제 중에 존재하고 있어도 된다.
「천연형 항체」는, 천연에 생기는 다양한 구조를 수반하는 면역글로불린 분자를 말한다. 예를 들어, 천연형 IgG 항체는, 다이설파이드 결합하고 있는 2개의 동일한 경쇄와 2개의 동일한 중쇄로 구성되는 약 150,000돌턴의 헤테로4량체 당단백질이다. N말단으로부터 C말단을 향해, 각 중쇄는, 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역(VH)을 갖고, 추가로 3개의 정상 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)이 계속된다. 마찬가지로, N말단으로부터 C말단을 향해, 각 경쇄는, 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이라고도 불리는 가변 영역(VL)을 갖고, 추가로 정상 경쇄(CL) 도메인이 계속된다. 항체의 경쇄는, 그 정상 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, κ 및 λ로 불리는, 2개의 타입의 하나에 귀속되어도 된다.
용어 「핵산 분자」 또는 「폴리뉴클레오티드」에는, 뉴클레오티드의 폴리머를 포함하는 임의의 화합물 및/또는 물질이 포함된다. 각 뉴클레오티드는, 염기, 구체적으로는 퓨린 또는 피리미딘 염기(즉, 시토신(C), 구아닌(G), 아데닌(A), 티민(T) 또는 우라실(U)), 당(즉, 데옥시리보스 또는 리보스), 및 인산기로 구성되어 있다. 많은 경우, 핵산 분자는 염기의 서열에 의해 기술되고, 여기에서, 이들 염기는 핵산 분자의 1차 구조(선형 구조)를 나타내고 있다. 염기의 서열은 통상, 5'로부터 3'로 표시된다. 본 명세서에서는, 핵산 분자라고 하는 용어는, 예를 들어 상보적 DNA(cDNA) 및 게놈 DNA를 포함하는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 특히 메신저 RNA(mRNA), DNA 또는 RNA의 합성 형태, 및 이들 분자의 2개 이상을 포함하는 혼합 폴리머를 포함한다. 핵산 분자는 선상 또는 환상일 수 있다. 더욱이, 핵산 분자라고 하는 용어는, 센스쇄와 안티센스쇄의 양쪽, 및 1본쇄 및 2본쇄 형태를 포함한다. 더욱이, 본 명세서에 기재되는 핵산 분자는, 천연에 존재하는 뉴클레오티드 또는 천연에 존재하지 않는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 천연에 존재하지 않는 뉴클레오티드의 예에는, 유도체화된 당 혹은 인산 골격 결합 또는 화학적으로 수식된 잔기를 포함하는 수식 뉴클레오티드 염기가 포함된다. 핵산 분자에는 또한, 인비트로 및/또는 인비보로, 예를 들어 숙주 또는 환자에 있어서, 본 발명의 항체를 직접 발현시키기 위한 벡터로서 적절한, DNA 및 RNA 분자가 포함된다. 그와 같은 DNA(예를 들어, cDNA) 또는 RNA(예를 들어, mRNA) 벡터는, 수식되어 있지 않아도, 수식되어 있어도 된다. 예를 들어, mRNA를 화학적으로 수식하여, RNA 벡터의 안정성 및/또는 코딩된 분자의 발현을 높일 수 있고, 그 결과로서, mRNA를 대상에게 주입하여 인비보로 항체를 산생시킬 수 있다(예를 들어, Stadler et al, Nature Medicine 2017, 2017년 6월 12일 온라인 공개, doi:10.1038/nm.4356 또는 EP 2 101 823 B1을 참조할 것).
참조 폴리펩티드 서열에 대한 「퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성」은, 최대의 퍼센트 서열 동일성을 얻도록 서열을 정렬시키고 또한 필요하면 갭을 도입한 후의, 또한, 어떠한 보존적 치환도 서열 동일성의 일부라고 생각하지 않는다고 했을 때의, 참조 폴리펩티드 서열 중의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 중의 아미노산 잔기의, 백분율비로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적의 얼라인먼트는, 당해 기술 분야에 있어서의 기술의 범위 내에 있는 여러 가지 방법, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN, Megalign(DNASTAR) 소프트웨어, 또는 GENETYX(등록상표)(주식회사 제네틱스) 등의, 공적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하는 것에 의해 달성할 수 있다. 당업자는, 비교되는 서열의 전장에 걸쳐서 최대의 얼라인먼트를 달성하기 위해서 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 서열의 얼라인먼트를 취하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은, 제넨테크사의 저작이며, 그 소스 코드는 미국 저작권청(U.S. Copyright Office, Wasington D.C., 20559)에 사용자용 서류와 함께 제출되어 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로서 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은, 제넨테크사(Genentech, Inc., South San Francisco, California)로부터 공적으로 입수 가능하고, 소스 코드로부터 컴파일해도 된다. ALIGN-2 프로그램은, Digital UNIX V4.0D를 포함하는 UNIX operating system 상에서의 사용을 위해서 컴파일된다. 모든 서열 비교 파라미터는, ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 변동되지 않는다. 아미노산 서열 비교에 ALIGN-2가 이용되는 상황에서는, 소여의 아미노산 서열 A의, 소여의 아미노산 서열 B로의, 또는 그것과의, 또는 그에 대한 %아미노산 서열 동일성(혹은, 소여의 아미노산 서열 B로의, 또는 그것과의, 또는 그에 대한, 어느 %아미노산 서열 동일성을 갖거나 또는 포함하는 소여의 아미노산 서열 A라고 할 수도 있다)은, 다음과 같이 계산된다:
분율 X/Y의 100배.
여기에서, X는 서열 얼라인먼트 프로그램 ALIGN-2에 의해, 당해 프로그램의 A 및 B의 얼라인먼트에 있어서 동일한 일치로서 스코어링된 아미노산 잔기의 수이며, Y는 B 중의 아미노산 잔기의 전체 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A의 B로의 %아미노산 서열 동일성은, B의 A로의 %아미노산 서열 동일성과 동일하지 않은 것이, 이해될 것이다. 특히 특별히 명시하지 않는 한, 본 명세서에서 이용되는 모든 %아미노산 서열 동일성치는, 직전의 단락에서 기술한 바와 같이 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 얻어지는 것이다.
용어 「약학적 제제」 또는 「약학적 조성물」은, 그 중에 포함된 유효 성분의 생물학적 활성이 효과를 발휘할 수 있는 형태에 있는 조제물이며, 또한 제제/조성물이 투여되는 피험체에 허용할 수 없는 정도로 독성이 있는 추가의 요소를 포함하지 않은, 조제물을 말한다.
「약학적으로 허용되는 담체」는, 피험체에 대해서 무독인, 약학적 제제/조성물 중의 유효 성분 이외의 성분을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 완충액, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함한다.
본 명세서에서 말하는 용어 「HLA-DQ2.5」는, 특별히 나타내지 않는 한, 영장류(예를 들어, 인간) 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트) 등의 포유동물을 포함하는, 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연형 HLA-DQ2.5를 말한다. 이 용어는, 「전장」의 프로세싱을 받고 있지 않은 HLA-DQ2.5도, 세포 중에서의 프로세싱의 결과 생기는 어떠한 형태의 HLA-DQ2.5도 포함한다. 이 용어는 또한, 자연적으로 생기는 HLA-DQ2.5의 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체나 대립 유전자 변이체도 포함한다. 예시적인 HLA-DQ2.5의 아미노산 서열은, Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) Protein Data Bank (PDB) 억세션 코드 4OZG 및 IPD-IMGT/데이터베이스에 있어서 공적으로 입수 가능하다
본 명세서에 있어서, 「TCR」은 「T 세포 수용체」를 의미하고, 이것은, T 세포(예를 들어, HLA-DQ2.5 구속성 CD4+ T 세포)의 표면에 위치하는 막단백질이며, 또한 HLA-DQ2.5를 포함하는 MHC 분자 상에 제시된 항원 단편(예를 들어, 글루텐 펩티드)을 인식한다.
본 명세서에서 이용되는 「치료」(및, 그 문법상의 파생어, 예를 들어 「치료하는」, 「치료하는 것」 등)는, 치료되는 개체의 자연 경과를 개변하는 것을 기도한 임상적 개입을 의미하고, 예방을 위해서도, 임상적 병태의 경과 동안에도 실시될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 질환의 발생 또는 재발의 방지, 증상의 경감, 질환에 의한 임의의 직접적 또는 간접적인 병리적 영향의 감약, 전이의 방지, 질환의 진행 속도의 저감, 질환 상태의 회복 또는 완화, 및 관해(寬解) 또는 개선된 예후를 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항체는, 질환의 발증을 늦추거나, 또는 질환의 진행을 느리게 하기 위해서 이용된다.
용어 「가변 영역」 또는 「가변 도메인」은, 항체를 항원으로 결합시키는 것에 관여하는, 항체의 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 말한다. 천연형 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은, 통상, 각 도메인이 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함하는, 유사한 구조를 갖는다. (예를 들어, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 참조.) 1개의 VH 또는 VL 도메인으로, 항원 결합 특이성을 주는 데 충분할 것이다. 더욱이, 어느 특정의 항원에 결합하는 항체는, 당해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 각각 VL 또는 VH 도메인의 상보적 라이브러리를 스크리닝하고, 단리되어도 된다. 예를 들어 Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991) 참조.
본 명세서에서 이용되는 용어 「벡터」는, 그것이 연결된 또 하나의 핵산을 증가시킬 수 있는, 핵산 분자를 말한다. 이 용어는, 자기 복제 핵산 구조로서의 벡터, 및, 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈 중에 짜넣어지는 벡터를 포함한다. 어느 벡터는, 자신이 동작적으로 연결된 핵산의, 발현을 가져올 수 있다. 그와 같은 벡터는, 본 명세서에서는 「발현 벡터」라고도 칭해진다.
아미노산 개변
본 발명의 항원 결합 분자(또는 항체)는, 1개 또는 복수의 개변을 포함해도 된다. 그와 같은 개변에는, 예를 들어, 항체의 아미노산 서열로부터의 결실, 및/또는 아미노산 서열 중으로의 삽입, 및/또는 아미노산 서열 내의 잔기의 치환이 포함된다. 최종 구축물이 소망의 특징, 예를 들어 항원 결합을 구비한다고 하는 조건에서, 최종 구축물에 이르도록, 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이 될 수 있다.
본 발명의 항원 결합 분자(또는 항체)는, 아미노산 치환을 포함해도 된다. 보존적 치환을, 표 1-1에 있어서 「바람직한 치환」이라고 하는 표제하에 나타낸다. 보다 실질적인 변경을, 표 1-1에 있어서 「예시적인 치환」이라고 하는 표제하에, 및 아미노산 측쇄 클래스에 관해서 이하에 추가로 기재되는 바와 같이 제공한다. 아미노산 치환이, 목적하는 항체 중에 도입되어도 되고, 생성물이, 소망의 활성, 예를 들어 항원 결합에 대해 스크리닝되어도 된다.
(표 1-1)
Figure 112022135454077-pct00001
본 명세서에 있어서, 아미노산의 개변을 나타내는 표현으로서, 특정의 위치를 나타내는 숫자의 전 및 후에, 각각 개변 전 및 개변 후의 아미노산의 1문자 코드 또는 3문자 코드를 나타내는 표현이, 적절히 이용되어도 된다. 예를 들어, 항체 가변 영역에 함유되는 아미노산을 치환하는 경우에 이용되는 개변 N100bL 또는 Asn100bLeu는, (Kabat 넘버링에 따른) 100b위의 Asn의 Leu로의 치환을 나타낸다. 즉, 숫자는, Kabat 넘버링에 따르는 아미노산 위치를 나타내고, 숫자 앞에 쓰여진 1문자 또는 3문자의 아미노산 코드는, 치환 전의 아미노산을 나타내고, 숫자 뒤에 쓰여진 1문자 또는 3문자의 아미노산 코드는, 치환 후의 아미노산을 나타낸다. 마찬가지로, 항체 정상 영역에 함유되는 Fc 영역의 아미노산을 치환하는 경우에 이용되는 개변 P238D 또는 Pro238Asp는, (EU 넘버링에 따라) 238위의 Pro의 Asp로의 치환을 나타낸다. 즉, 숫자는, EU 넘버링에 따르는 아미노산 위치를 나타내고, 숫자 앞에 쓰여진 1문자 또는 3문자의 아미노산 코드는, 치환 전의 아미노산을 나타내고, 숫자 뒤에 쓰여진 1문자 또는 3문자의 아미노산 코드는, 치환 후의 아미노산을 나타낸다.
다중 특이성 항원 결합 분자/항체
용어 「다중 특이성 항원 결합 분자(항체)」는, 1개보다 많은 항원(예를 들어, 펩티드) 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 분자(항체)를 말한다. 몇몇 태양에 있어서, 항원 결합 분자(항체)는, 적어도, 1개 또는 복수의 항원(예를 들어, 펩티드)에 결합할 수 있는 제 1 항원 결합 부분/도메인, 및 1개 또는 복수의 항원(예를 들어, 펩티드)에 결합할 수 있는 제 2 항원 결합 부분/도메인을 갖는다. 제 1 항원 결합 부분/도메인이 결합하는 항원의 일부 또는 모두는, 제 2 항원 결합 부분/도메인이 결합하는 항원의 일부 또는 모두와는 상이해도 된다. 혹은, 제 1 항원 결합 부분/도메인이 결합하는 항원의 일부는, 제 2 항원 결합 부분/도메인이 결합하는 항원의 일부와 동일해도 된다.
본 발명의 문맥에 있어서, 「다중 특이성 항원 결합 분자(항체)」는, 상이한 타입의 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 보다 구체적으로는, 다중 특이성 항원 결합 분자(항체)는, 적어도 2개의 상이한 타입의 항원 또는 에피토프에 대해서 특이성을 갖는 것이고, 상이한 항원을 인식하는 분자/항체에 더하여, 동일한 항원 상의 상이한 에피토프를 인식하는 분자/항체도 포함된다. 예를 들어, 보통은, 그와 같은 분자는, 2개의 항원 또는 에피토프에 결합한다(「이중 특이성 항원 결합 분자(항체)」; 「듀얼 특이성 항원 결합 분자(항체)」와 동일한 의미를 갖도록 본 기재에서 이용된다)가, 보다 많은 항원 또는 에피토프(예를 들어, 3개 이상의 타입의 항원)에 대한 특이성까지도 갖고 있어도 된다.
본 명세서에 있어서, 「다중 특이성」 및 「이중 특이성」 등의 용어는, 어느 항원 결합 도메인/영역의 특이성이 다른 항원 결합 도메인/영역의 특이성과는 상이함을 의미한다. 즉, 이들 용어는, 1개의 항원 결합 분자에 2개 이상의 특이성이 있음을 의미한다. 예를 들어, 「이중 특이성」 항원 결합 분자(항체)에 있어서, 제 1 항원 결합 부분/도메인은, HLA-DQ2.5와 글루텐 펩티드에 의해 형성된 복합체의 제 1 그룹에 결합할 수 있고, 제 2 항원 결합 부분/도메인은, HLA-DQ2.5와 글루텐 펩티드에 의해 형성된 복합체의 제 2 그룹에 결합할 수 있다. 2개의 그룹의 멤버(즉, 복합체)는, 중복되어 있어도 되지만, 동일하지 않아도 된다. 즉, 몇몇 복합체는, 그룹의 양쪽에 포함되어 있어도 된다. 「다중 특이성」 및 「이중 특이성」 등의 용어는, 이 상황을 포함할 수 있다. 동일한 것이, 제 1/제 2 항원 결합 부분/도메인이 결합하지 않는 복합체의 제 1 및 제 2 그룹에 적용된다.
용어 「이중 특이성」은, 항원 결합 분자가, 적어도 2개의 별개의 항원 결정기에 특이적으로 결합할 수 있음을 의미한다. 본 발명의 「다중 특이성 항원 결합 분자」의 바람직한 태양의 예에는, 다중 특이성 항체가 포함된다. 저하된 Fcγ 수용체 결합 활성을 갖는 Fc 영역이, 다중 특이성 항체 Fc 영역으로서 이용되는 경우에는, 다중 특이성 항체에서 유래하는 Fc 영역이, 적절히 이용되어도 된다. 이중 특이성 항체는, 본 발명의 다중 특이성 항체로서 특히 바람직하다. 이 경우, 이중 특이성 항체는, 2개의 상이한 특이성을 갖는 항체이다. IgG 타입의 이중 특이성 항체는, IgG 항체를 산생하는 2타입의 하이브리도마를 융합시키는 것에 의해 산생되는 하이브리드 하이브리도마(쿼드로마)로부터 분비시킬 수 있다(Milstein et al., Nature (1983) 305, 537-540).
다중 특이성 항원 결합 분자(항체)는, 적어도 2개의 항원 결합 부분/도메인을 포함할 수 있다. 이중 특이성 항원 결합 분자(항체)는, 제 1 항원 결합 부분/도메인 및 제 2 항원 결합 부분/도메인을 포함할 수 있다.
이중 특이성 항원 결합 분자(또는 이중 특이성 항체)는, 제 1 항원 결합 부분/도메인 및 제 2 항원 결합 부분/도메인을 포함할 수 있다. 제 1 항원 결합 부분/도메인은, 제 1 항체 가변 영역 및 제 2 항체 가변 영역을 포함할 수 있다. 제 1 항체 가변 영역은, 제 2 항체 가변 영역과 회합한다. 제 1 항체 가변 영역과 제 2 항체 가변 영역 사이의 회합에 의해, 제 1 항원 결합 부분/도메인의 제 1 항원/에피토프에 대한 결합이 가능하게 된다. 마찬가지로, 제 2 항원 결합 부분/도메인은, 제 3 항체 가변 영역 및 제 4 항체 가변 영역을 포함할 수 있다. 제 3 항체 가변 영역은, 제 4 항체 가변 영역과 회합한다. 제 3 항체 가변 영역과 제 4 항체 가변 영역 사이의 회합에 의해, 제 2 항원 결합 부분/도메인의 제 2 항원/에피토프에 대한 결합이 가능하게 된다. 몇몇 태양에 있어서, 제 1 항체 가변 영역은, 중쇄(H쇄) 가변 영역(VH)(「제 1 중쇄(H쇄) 가변 영역(VH)」이라고 불릴 수 있다)이며, 제 2 항체 가변 영역은, 경쇄(L쇄) 가변 영역(VL)(「제 1 경쇄(L쇄) 가변 영역(VL)」이라고 불릴 수 있다)이다. 몇몇 태양에 있어서, 제 3 항체 가변 영역은, 중쇄(H쇄) 가변 영역(VH)(「제 2 중쇄(H쇄) 가변 영역(VH)」이라고 불릴 수 있다)이며, 제 4 항체 가변 영역은, 경쇄(L쇄) 가변 영역(VL)(「제 2 경쇄(L쇄) 가변 영역(VL)」이라고 불릴 수 있다)이다. 제 1 중쇄(H쇄) 가변 영역(VH)은, 제 1 항원/에피토프에 대한 결합을 위해서, 제 1 경쇄(L쇄) 가변 영역(VL)과 회합한다. 제 2 중쇄(H쇄) 가변 영역(VH)은, 제 2 항원/에피토프에 대한 결합을 위해서, 제 2 경쇄(L쇄) 가변 영역(VL)과 회합한다. 가변 영역 사이의(즉, VH와 VL 사이의) 회합(혹은 「상호작용」이라고 칭해진다)은, 당 기술 분야에 있어서 공지와 같이 VH/VL 경계면 상의 구조(예를 들어, 아미노산 잔기)에 의거한다. 본 발명에 있어서, 바람직하게는, 이중 특이성 항원 결합 분자(항체)는, 2개 이상의 글루텐 펩티드(또는 HLA-DQ2.5와 글루텐 펩티드에 의해 형성된 복합체)에 결합할 수 있다. 몇몇 태양에 있어서, 이중 특이성 항원 결합 분자(항체)는, HLA-DQ2.5와 글루텐 펩티드에 의해 형성된 1개 또는 복수의 복합체에 결합하는 제 1 항원 결합 부분/도메인(제 1 항체 가변 영역 및 제 2 항체 가변 영역을 포함한다(상기)), 및 HLA-DQ2.5와 글루텐 펩티드에 의해 형성된 1개 또는 복수의 복합체에 결합하는 제 2 항원 결합 부분/도메인(제 3 항체 가변 영역 및 제 4 항체 가변 영역을 포함한다(상기))을 포함한다. 이 문맥에 있어서, 바람직하게는, 제 1 항원 결합 부분/도메인이 결합하는 복합체 중의 적어도 1개의 글루텐 펩티드는, 제 2 항원 결합 부분/도메인이 결합하는 복합체 중의 적어도 1개의 글루텐 펩티드와는 상이하다. 바꾸어 말하면, 제 1 항원 결합 부분/도메인이 결합하는 복합체 중의 글루텐 펩티드의 멤버와 제 2 항원 결합 부분/도메인이 결합하는 복합체 중의 글루텐 펩티드의 멤버는, 중복되어 있어도 되지만, 완전히 동일하지 않아도 된다. 제 1/제 2 항원 결합 부분/도메인이 결합하는 복합체 중의 글루텐 펩티드는, 본 명세서에 기재된 임의의 글루텐 펩티드로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 제 1/제 2 항원 결합 부분/도메인은, 1타입의 글루텐 펩티드, 또는 2타입 이상의 글루텐 펩티드에 결합할 수 있다.
본 개시의 문맥에 있어서, 간단하게 하기 위해서, 「항원 결합 분자」라고 말하는 것보다도 오히려, 용어 「항체」가 이용되어도 된다. 그러나, 당업자는, 용어 「항체」가, 적용 가능한 경우에는 「항원 결합 분자」로 치환될 수 있음을 이해할 수 있다.
일 국면에 있어서, 본 발명은, T 세포에 글루텐 펩티드를 제시하는 HLA-DQ2.5에 대한 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)의 결합에, 일부 기초하는 것이다. 특정의 태양에 있어서, HLA-DQ2.5에 결합하는 항체가 제공된다.
일 국면에 있어서, 본 발명은, HLA-DQ2.5, 또는 HLA-DQ2.5와 글루텐 펩티드에 의해 형성된 하나 혹은 복수의 복합체에 대해서 결합 활성을 갖는, 항원 결합 분자 또는 항체를 제공한다. 특정의 태양에 있어서, 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)는, 하술하는 기능/특징을 갖는다.
항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)는, 글루텐 펩티드와의 복합체의 형태에 있는 HLA-DQ2.5(즉, HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드 복합체)에 대해서 결합 활성을 갖는다. 보다 바람직하게는, 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)는, 글루텐 펩티드와의 복합체의 형태에 있는 HLA-DQ2.5(즉, HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드 복합체)에 대해서 특이적인 결합 활성을 갖는다.
항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)는, HLA-DQ5.1/DQ6.3/DQ7.3/DQ7.5/DQ8/DR/DP 등의, 목적이 아닌 항원에 대해서 결합 활성을 실질적으로 갖지 않고, 즉, 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)는, 목적이 아닌 항원에 실질적으로 결합하지 않는다. 예를 들어, 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)는, HLA-DR/DP에 대해서 특이적인 결합 활성을 갖지 않거나, 또는 HLA-DR/DP에 대해서 유의한 결합 활성을 갖지 않는다. 즉, 항체는, HLA-DR/DP에 특이적으로 결합하지 않거나, 또는 HLA-DR/DP에 유의하게 결합하지 않는다. 마찬가지로, 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)는, HLA-DQ7.5, HLA-DQ8, HLA-DQ5.1, HLA-DQ6.3, 및 HLA-DQ7.3 등의 HLA-DQ 분자에 대해서 결합 활성을 실질적으로 갖지 않고, 즉, 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)는, HLA-DQ7.5, HLA-DQ8, HLA-DQ5.1, HLA-DQ6.3, 및 HLA-DQ7.3 등의 HLA-DQ 분자에 실질적으로 결합하지 않는다. 바꾸어 말하면, 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)는, HLA-DQ7.5, HLA-DQ8, HLA-DQ5.1, HLA-DQ6.3, 및 HLA-DQ7.3 등의 HLA-DQ 분자에 대해서 특이적인/유의한 결합 활성을 갖지 않는다. 즉, 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)는, HLA-DQ7.5, HLA-DQ8, HLA-DQ5.1, HLA-DQ6.3, 및 HLA-DQ7.3 등의 HLA-DQ 분자에 특이적으로/유의하게 결합하지 않는다.
이들 비표적 MHC 클래스 II 분자에 대한 어떠한 실질적인 저해 효과를 방지하기 위해, 또한 HLA-DQ2.5를 갖는 셀리악병 환자의 항체 PK를 개선하기 위해서, 이들 특징(「결합 활성이 실질적으로 없는」)은 바람직하다.
「결합 활성이 실질적으로 없는」이라고 하는 특성은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 FACS 결과를 이용하여 정의할 수 있다. 특정의 항원에 대해서 「결합 활성을 실질적으로 갖지 않는」 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)는, 본 명세서에 기재된 측정 조건하에서, 음성 대조의 MFI(평균 형광 강도)치의 250% 이하, 바람직하게는 200% 이하, 보다 바람직하게는 150% 이하인 MFI치를 가질 수 있다.
어느 국면에 있어서, 이중 특이성 항원 결합 분자(항체)에 대해, 특정의 항원에 대해서 「결합 활성을 실질적으로 갖지 않는」 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)는, 본 명세서에 기재된 측정 조건하에서, IC17dK의 MFI치를 0%로 하고, DQN0139bb의 MFI치를 100%로 했을 때, 2% 이하, 보다 바람직하게는 1% 이하인 MFI치를 갖는다. DQN0139bb는, 예를 들어, WO2018/155692에 개시되어 있다.
항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)는, 본 명세서에 기재된 글루텐 펩티드와의 복합체에 있는 HLA-DQ2.5에 대해서 결합 활성을 갖는다. 본 명세서에 있어서, HLA-DQ2.5 분자와 글루텐 펩티드 사이에 형성된 복합체는, 「HLA-DQ2.5와 글루텐 펩티드에 의해 형성된 복합체」, 「HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드 복합체」, 또는 「HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드」라고 불린다. 그것은 또한, 예를 들어, 「글루텐 펩티드가 부하된 HLA-DQ2.5」, 「글루텐 펩티드 부하 HLA-DQ2.5」, 「글루텐 펩티드가 결합한 HLA-DQ2.5」, 「글루텐 펩티드와의 복합체의 형태에 있는 HLA-DQ2.5」, 및 「HLA-DQ2.5와 글루텐 펩티드의 복합체」라고 바꾸어 말할 수도 있다. 상기의 문언(예를 들어, 「HLA-DQ2.5와···［펩티드］에 의해 형성된 복합체」)은 또한, 이하와 같은 펩티드에도 적용된다: 33mer 글리아딘 펩티드, α1 글리아딘 펩티드(「α1a 글리아딘 펩티드」라고도 불릴 수 있다), α2 글리아딘 펩티드, γ1 글리아딘 펩티드, γ2 글리아딘 펩티드, ω1 글리아딘 펩티드, ω2 글리아딘 펩티드, BC 호르데인 펩티드, α3 글리아딘 펩티드, α1b 글리아딘 펩티드, γ4a 글리아딘 펩티드, γ4b 글리아딘 펩티드, 아베닌 1 펩티드, 아베닌 2 펩티드, 아베닌 3 펩티드, 호르데인 1 펩티드, 호르데인 2 펩티드, 세칼린 1 펩티드, 세칼린 2 펩티드, 및 26mer 글리아딘 펩티드, 14mer 1 펩티드, CLIP(hCLIP) 펩티드, B형 간염 바이러스 1(HBV1) 펩티드, 살모넬라균 펩티드, 마이코박테리움 보비스(M. 보비스) 펩티드, 티로퍼옥시다제(TPO) 펩티드, 등.
한편, 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)는, 「무관계한」 펩티드에 대해서 결합 활성을 실질적으로 갖지 않는다. 본 명세서에 있어서, 「무관계한」 펩티드로는, HLA-DQ2.5 상에 제시될 수 있음이 보고되어 있지만, 셀리악병과는 무관계하거나, 또는 본 발명과는 무관계한 것, 즉, 전술한 목적의 글루텐 펩티드는 아닌 것이 포함된다. 예를 들어, 무관계한 펩티드에는, CLIP(hCLIP) 펩티드, B형 간염 바이러스 1(HBV1) 펩티드, 살모넬라균 펩티드, 마이코박테리움 보비스(M. 보비스) 펩티드, 티로퍼옥시다제(TPO) 펩티드 등이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.
이들 비표적 MHC 클래스 II 분자 및 무관계한 펩티드와의 복합체의 형태에 있는 HLA-DQ2.5에 대한 어떠한 실질적인 저해 효과를 방지하기 위해, 또한 셀리악병 환자의 항체 PK를 개선하기 위해서, 이들 특징(「결합 활성이 실질적으로 없는」)은 바람직하다.
「결합 활성」이라고 하는 특성은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 FACS 결과를 이용하여 정의할 수 있다. 특정의 항원에 대해서 「결합 활성」을 갖는 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)는, 본 명세서에 기재된 측정 조건하에서, 음성 대조의 MFI(평균 형광 강도)치의 300% 이상, 바람직하게는 500% 이상, 보다 바람직하게는 1000% 이상인 MFI치를 가질 수 있다.
어느 국면에 있어서, 이중 특이성 항원 결합 분자(항체)에 대해, 특정의 항원에 대해서 「결합 활성」을 갖는 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)는, 본 명세서에 기재된 측정 조건하에서, IC17dK의 MFI치를 0%로 하고, DQN0139bb의 MFI치를 100%로 했을 때, 3% 이상, 바람직하게는 6% 이상, 바람직하게는 10% 이상, 보다 바람직하게는 20% 이상인 MFI치를 갖는다.
결합의 특이성에 특히 언급하는 경우, 「결합 활성」은, 「특이적 결합 활성」이라고 바꿔 말할 수 있다.
본 발명의 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)는, 본 명세서에 기재된 HLA-DQ2.5와 글루텐 펩티드에 의해 형성된 1개 또는 복수의 복합체에 대한 결합에 대해, 5×10-7M 이하, 바람직하게는 4×10-7M 이하, 바람직하게는 3×10-7M 이하, 바람직하게는 2×10-7M 이하, 바람직하게는 1×10-7M 이하, 바람직하게는 9×10-8M 이하, 바람직하게는 8×10-8M 이하, 바람직하게는 7×10-8M 이하, 바람직하게는 6×10-8M 이하, 바람직하게는 5×10-8M 이하, 바람직하게는 4×10-8M 이하, 바람직하게는 3×10-8M 이하, 바람직하게는 2×10-8M 이하, 바람직하게는 1×10-8M 이하, 바람직하게는 9×10-9M 이하, 바람직하게는 8×10-9M 이하, 바람직하게는 7×10-9M 이하, 바람직하게는 6×10-9M 이하, 바람직하게는 5×10-9M 이하, 바람직하게는 4×10-9M 이하, 바람직하게는 3×10-9M 이하, 바람직하게는 2×10-9M 이하의 해리 상수(Kd)를 갖는다.
본 발명의 적절한 다중 특이성 항원 결합 분자는, 이하를 포함한다:
(1) 글루텐 펩티드와의 복합체의 형태에 있는 HLA-DQ2.5에 대해서 결합 활성을 갖는 항체 가변 영역을 포함하는 부분/도메인;
(2) 글루텐 펩티드와의 복합체의 형태에 있는 HLA-DQ2.5에 대해서 결합 활성을 갖는 항체 가변 영역을 포함하는 부분/도메인; 및
(3) 그 구조로 한정되지 않는, 전술한 저하된 Fcγ 수용체 결합 활성을 갖는 Fc 영역을 포함하는 부분/도메인.
본 발명에 있어서, 전술한 도메인의 각각을, 펩티드 결합에 의해 직접 연결할 수 있다. 예를 들어, (1) 및 (2)의 항체 가변 영역을 포함하는 도메인으로서 F(ab')2, 및 (3)의 저하된 Fcγ 수용체 결합 활성을 갖는 Fc 영역을 포함하는 도메인으로서 이들 Fc 영역을 이용하는 경우에는, (1) 및 (2)의 항체 가변 영역 함유 도메인과, (3)의 Fc 영역 함유 도메인을 펩티드 결합에 의해 연결하는 것에 의해 형성된 폴리펩티드는, 항체 구조를 형성할 것이다. 그와 같은 항체는, 전술한 하이브리도마 배양 배지로부터의 정제에 의해, 및 또한 항체를 구성하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 안정되게 보유하는 소망의 숙주 세포의 배양 배지로부터 항체를 정제하는 것에 의해서도, 산생시킬 수 있다.
글루텐 펩티드와의 복합체의 형태에 있는 HLA-DQ2.5에 대해서 결합 활성을 갖는 항체 가변 영역에 함유되는 본 발명의 바람직한 항체 H쇄 가변 영역의 예에는, 본 명세서에 기재된 항체 H쇄 가변 영역, 또는 그의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열이, 본 명세서에 기재된 H쇄 가변 영역에 함유되는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열과 동일한 CDR 서열을 갖는 항체 H쇄 가변 영역, 또는 전술한 가변 영역과 기능적으로 등가인 항체 H쇄 가변 영역의 어느 것이 포함된다.
본 발명의 T 세포 수용체 복합체 결합 활성을 갖는 바람직한 항체 가변 영역의 예에는, 글루텐 펩티드와의 복합체의 형태에 있는 HLA-DQ2.5에 대해서 결합 활성을 갖는 항체 가변 영역이 포함된다. 그와 같은 항체 가변 영역에 함유되는 항체 H쇄 가변 영역의 예에는, 본 명세서에 기재된 항체 H쇄 가변 영역, 그 CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열이, 본 명세서에 기재된 항체 H쇄 가변 영역에 함유되는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열과 동일한 CDR 서열을 갖는 항체 H쇄 가변 영역, 및 전술한 가변 영역과 기능적으로 등가인 항체 H쇄 가변 영역이 포함된다.
본 발명에 있어서, 어구 「기능적으로 등가」는, 다중 특이성 항원 결합 분자로서 이용되는 경우에, 항원에 대한 결합 어피니티가 등가인 것을 의미하거나, 또는 대체적으로, HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드를 발현하는 세포(또는 이들 세포를 함유하는 조직)에 대한 중화 활성이 등가인 것을 의미한다. 결합 어피니티 및 중화 활성은, 본 명세서에 있어서의 기재에 기초하여 측정할 수 있다. 활성의 측정을 위해서 이용되는 세포는, HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드를 발현하는 소망의 것(또는 이들 세포를 함유하는 소망의 조직)이어도 되고, 임의의 적합한 세포주를 이용할 수 있다. 항체 정상 영역에 관해서, 이 어구는, Fcγ 수용체 결합 활성의 감소가 등가인 것을 의미할 수 있다.
예를 들어, 본 명세서에 기재된 항체 H쇄 가변 영역(즉, 원래의 H쇄 가변 영역)과 기능적으로 등가인 항체 H쇄 가변 영역은, 이 영역이, 원래의 H쇄와 페어를 형성하는 본 명세서에 기재된 항체 L쇄 가변 영역과 조합하는 경우에, 동일한 결합 어피니티를 갖는 것, 또는 대체적으로, 영역이, 다중 특이성 항원 결합 분자에 이용되었을 경우에, HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드를 발현하는 세포(또는 이들 세포를 함유하는 조직)에 대해서 동일한 중화 활성을 갖는 것을 의미한다. 더욱이, 본 명세서에 기재된 항체 L쇄 가변 영역(즉, 원래의 L쇄 가변 영역)과 기능적으로 등가인 항체 L쇄 가변 영역은, 이 영역이, 원래의 L쇄와 페어를 형성하는 본 명세서에 기재된 항체 H쇄 가변 영역과 조합하는 경우에, 동일한 결합 어피니티를 갖는 것, 또는 대체적으로, 영역이, 다중 특이성 항원 결합 분자에 이용되었을 경우에, HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드를 발현하는 세포(또는 이들 세포를 함유하는 조직)에 대해서 동일한 중화 활성을 갖는 것을 의미한다.
용어 「등가」는, 반드시 동일한 정도의 활성을 의미하지 않으면 안 되는 것은 아니고, 활성이 증강되고 있어도 된다. 구체적으로는, 항원 결합 어피니티에 대해, 예로는, 대조로서 작용하는 항체 가변 영역의 결합 어피니티(친KD치)와의 비교에 의해 얻어진 값(KD치/친KD치)이 1.5 이하인 경우가 포함된다. KD치/친KD치의 값은, 바람직하게는 1.3 이하, 보다 바람직하게는 1.2 이하, 1.1 이하, 1.0 이하, 0.9 이하, 0.8 이하, 0.7 이하, 0.6 이하, 또는 0.5 이하이다. 하한은 없지만, 예로는, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 또는 10-6이 포함된다. 보다 구체적으로는, 본 발명에 있어서, KD치/친KD치의 값은, 바람직하게는 10-6∼1.5×10-0, 보다 바람직하게는 10-6∼10-1, 한층 보다 바람직하게는 10-6∼10-2, 더 한층 보다 바람직하게는 10-6∼10-3이다.
HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드에 대해서 결합 활성을 갖는 항체 가변 영역을 포함하는 부분/도메인에 관해서, HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드에 대한 KD치는, 예를 들어, 2×10-8M 이하, 1×10-8M 이하, 9×10-9M 이하, 8×10-9M 이하, 7×10-9M 이하, 6×10-9M 이하, 5×10-9M 이하, 4×10-9M 이하, 3×10-9M 이하, 2×10-9M 이하, 또는 1×10-9M 이하일 수 있다.
본 발명에 있어서, 「기능적으로 등가」인 항체 가변 영역은, 그들이 상기의 조건을 만족시키는 항체 H쇄 및/또는 항체 L쇄의 가변 영역인 한, 특별히 한정되지 않는다. 그와 같은 항체 가변 영역의 예에는, 전술한 표 1∼3의 가변 영역의 아미노산 서열 중에 1개 또는 복수의 아미노산(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 10개의 아미노산)의 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입을 도입하는 것에 의해 산생되는 영역이 포함된다. 아미노산 서열 중에 1개 또는 복수의 아미노산 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입을 도입하기 위한 당업자에게 주지된 방법은, 단백질 중에 변이를 도입하는 방법이다. 예를 들어, 당업자는, 부위 특이적 변이 도입 등의 방법을 이용하여 아미노산 서열 중에 변이를 적절히 도입하는 것에 의해, 전술한 기능을 갖는 항체 가변 영역과 기능적으로 등가인 가변 영역을 조제할 수 있다(Hashimoto-Gotoh, T., Mizuno, T., Ogasahara, Y., and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275; Zoller, M.J., and Smith, M. (1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W., Drutsa, V., Jansen, H.W., Kramer, B., Pflugfelder, M., and Fritz, H.J. (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer, W., and Fritz, H.J. (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367; 및 Kunkel, T.A. (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad. Sci. U S A. 82, 488-492).
아미노산 잔기를 개변하는 경우, 아미노산을, 바람직하게는, 아미노산 측쇄의 특성을 보존하는 상이한 아미노산으로 변이시킨다. 아미노산 측쇄의 특성의 예는, 이하이다: 소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, 및 V), 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, 및 T), 지방족 측쇄를 함유하는 아미노산(G, A, V, L, I, 및 P), 수산기 함유 측쇄를 함유하는 아미노산(S, T, 및 Y), 황 원자 함유 측쇄를 함유하는 아미노산(C 및 M), 카복실산 함유 또한 아마이드 함유 측쇄를 함유하는 아미노산(D, N, E, 및 Q), 염기성 측쇄를 함유하는 아미노산(R, K, 및 H), 및 방향족 측쇄를 함유하는 아미노산(H, F, Y, 및 W)(아미노산을 괄호 중에 1문자 코드에 의해 나타낸다). 이들 그룹의 각각 내에서의 아미노산 치환은, 보존적 치환으로 불린다. 소여의 아미노산 서열에 있어서의 1개 또는 복수의 아미노산 잔기가, 결실하고 있는, 부가되어 있는, 및/또는 다른 아미노산으로 치환되어 있는 개변된 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드가, 원래의 생물학적 활성을 유지할 수 있음은 기지이다(Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA; (1984) 81: 5662-6; Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic Acids Res. (1982) 10: 6487-500; Wang, A. et al., Science (1984) 224: 1431-3; Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79: 6409-13). 그와 같은 아미노산 개변을 함유하는 본 발명의 가변 영역은, 개변 전의 가변 영역의 CDR 서열, FR 서열, 또는 전체 가변 영역의 아미노산 서열과 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 75%, 한층 보다 바람직하게는 적어도 80%, 좀 더 보다 바람직하게는 적어도 85%, 더 보다 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 본 명세서에 있어서, 서열 동일성은, 서열을 정렬시키고, 필요하면 서열 동일성을 최대로 하기 위해서 갭을 적절히 도입한 후에 결정된, H쇄 가변 영역 또는 L쇄 가변 영역의 원래의 아미노산 서열 중의 잔기와 동일한 잔기의 백분율비로서 정의된다. 아미노산 서열의 동일성은, 하기의 방법에 의해 결정할 수 있다.
더욱이, 「기능적으로 등가인 항체 가변 영역」은, 예를 들어, 전술한 표 1∼3에 있어서의 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산과, 스트린전트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산으로부터 얻을 수 있다. 가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산과, 스트린전트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산을 단리하기 위한 스트린전트한 하이브리다이제이션 조건에는, 예를 들어, 6M 요소, 0.4% SDS, 0.5×SSC, 및 37℃의 조건, 또는 그것과 등가의 스트린전시를 갖는 하이브리다이제이션 조건이 포함된다. 훨씬 보다 높은 상동성을 갖는 핵산의 단리는, 보다 스트린전트한 조건, 예를 들어, 6M 요소, 0.4% SDS, 0.1×SSC, 및 42℃의 조건에서 기대할 수 있다. 하이브리다이제이션 후의 세정 조건은, 예를 들어, 60℃에서 0.5×SSC(1×SSC는, pH 7.0의 0.15M NaCl 및 0.015M 시트르산 나트륨) 및 0.1% SDS를 이용한 세정, 보다 바람직하게는 60℃에서 0.2×SSC 및 0.1% SDS를 이용한 세정, 한층 보다 바람직하게는 62℃에서 0.2×SSC 및 0.1% SDS를 이용한 세정, 더 한층 보다 바람직하게는 65℃에서 0.2×SSC 및 0.1% SDS를 이용한 세정, 좀 더 보다 바람직하게는 65℃에서 0.1×SSC 및 0.1% SDS를 이용한 세정이다. 단리된 핵산의 서열은, 하기의 공지된 방법에 의해 결정할 수 있다. 단리된 핵산의 전체적인 뉴클레오티드 서열 상동성은, 적어도 50% 또는 그 이상, 바람직하게는 70% 또는 그 이상, 보다 바람직하게는 90% 또는 그 이상(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상)의 서열 동일성이다.
가변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 대해서 스트린전트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산은 또한, 하이브리다이제이션 수법을 이용한 상기의 방법 대신에, 가변 영역 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 정보에 기초하여 합성된 프라이머를 이용하는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 등의 유전자 증폭법의 사용에 의해, 단리할 수도 있다.
1개의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열의 다른 것에 대한 동일성은, Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 5873-7)에 의한 알고리즘 BLAST를 이용하여 결정할 수 있다. BLASTN 및 BLASTX로 불리는 프로그램이, 이 알고리즘에 기초하여 개발되었다(Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215: 403-10). BLAST에 기초하는 BLASTN에 따라 뉴클레오티드 서열을 해석하기 위해서는, 파라미터를, 예를 들어, score=100 및 wordlength=12로 설정한다. 다른 한편, BLAST에 기초하는 BLASTX에 의한 아미노산 서열의 해석에 이용되는 파라미터에는, 예를 들어, score=50 및 wordlength=3이 포함된다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우에는, 각 프로그램에 대한 디폴트 파라미터를 이용한다. 그와 같은 해석을 위한 구체적 수법은, 당 기술 분야에 있어서 공지이다(National Center for Biotechnology Information (NCBI), Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)의 웹 사이트; http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조할 것).
본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자에 포함되는 Fc 영역은, 그것이 저하된 Fcγ 수용체 결합 활성을 갖는 Fc 영역인 한, 특별히 한정되지 않고, 본 발명의 바람직한 Fc 영역의 예에는, 본 명세서에 기재된 Fc 영역 부분의 조합이 포함된다.
본 발명의 바람직한 다중 특이성 항원 결합 분자의 예에는, 글루텐 펩티드와의 복합체의 형태에 있는 HLA-DQ2.5에 대해서 결합 활성을 갖는 제 1 항체 가변 영역, 및 글루텐 펩티드와의 복합체의 형태에 있는 HLA-DQ2.5에 대해서 결합 활성을 갖는 제 2 항체 가변 영역을 포함하는 이중 특이성 항체가 포함된다. 그와 같은 이중 특이성 항체의 예에는, 본 명세서에 기재된 H쇄 및 L쇄를 포함하는 이중 특이성 항체, 및 상기의 항체가 결합하는 에피토프와 중복되는 에피토프에 결합하고, 또한 저하된 Fcγ 수용체 결합 활성을 갖는 Fc 영역을 함유하는 이중 특이성 항체가 포함된다.
항체가, 다른 항체가 인식하는 에피토프와 중복되는 에피토프를 인식하는지 여부는, 에피토프에 대한 2개의 항체 사이의 경합에 의해 확인할 수 있다. 항체 사이의 경합은, 효소 결합 면역 흡착 측정법(ELISA), 형광 에너지 이동법(FRET), 및 형광 미량 어세이 기술(FMAT(등록상표)) 등의 수단을 이용한 경합 결합 어세이에 의해 평가할 수 있다. 항원에 결합한 항체의 양은, 중복되는 에피토프에 경합적으로 결합하는 후보 경합 항체(시험 항체)의 결합능과 간접적으로 상관된다. 바꾸어 말하면, 중복되는 에피토프에 대한 시험 항체의 양 또는 어피니티가 증가함에 따라, 항원에 결합한 항체의 양은 감소하고, 항원에 결합한 시험 항체의 양은 증가한다. 구체적으로는, 적절히 표지된 항체 및 평가되어야 할 항체를, 항원에 동시에 첨가하고, 결과로서 결합한 항체를, 표지를 이용하여 검출한다. 항원에 결합한 항체의 양은, 미리 항체를 표지하는 것에 의해, 용이하게 결정할 수 있다. 이 표지는, 특별히 한정되지 않고, 표지법은, 이용되는 어세이 수법에 따라 선택된다. 구체적으로는, 표지법에는, 형광 표지, 방사성 표지, 효소 표지 등이 포함된다.
예를 들어, 형광 표지 항체 및 미표지 항체 또는 시험 항체를, HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드가 고정화된 비즈에 동시에 첨가하고, 표지 항체를, 형광 미량 어세이 기술에 의해 검출한다.
본 명세서에 있어서, 「중복되는 에피토프에 결합하는 항체」는, 결합한 표지 항체의 양을, 결합한 표지 항체의 양의 50%를 비표지 항체가 저하시키는 농도(IC50)보다도 통상 100배 높은, 바람직하게는 80배 높은, 보다 바람직하게는 50배 높은, 한층 보다 바람직하게는 30배 높은, 좀 더 보다 바람직하게는 10배 높은 농도에서, 적어도 50% 저하시킬 수 있는 시험 항체를 말한다.
전술한 항체가 결합하는 에피토프와 중복되는 에피토프에 결합하는 항체의 항원 결합 부위를 갖는 다중 특이성 항원 결합 분자는, 우수한 결합 활성 또는 중화 활성을 발생시킬 수 있다.
본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자는, 본 명세서에서 진술되는 재조합 항체를 산생하기 위한 방법과 동일한 수법에 의해 산생된다.
특정의 태양에 있어서, 상기에서 제공되는 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)의 임의의 1개 또는 복수의 아미노산은, 중쇄 및/또는 경쇄 정상 및/또는 가변 영역 또는 도메인의 어느 것에 있어서 치환되어 있다.
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 치환은, 보존적 치환이다.
인간 항체
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체는, 인간 항체이다. 인간 항체는, 당해 기술 분야에 있어서 알려진 여러 가지 수법에 의해 제조될 수 있다. 인간 항체는, van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)에 개설되어 있다.
인간 항체는, 항원 챌린지(부하)에 응답하여 완전 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 수반하는 완전 항체를 산생하도록 개변된 트랜스제닉 동물에 면역원을 투여하는 것에 의해, 조제되어도 된다. 그와 같은 동물은, 전형적으로는 인간 면역글로불린 유전자자리의 전부 혹은 일부분을 포함하고, 인간 면역글로불린 유전자자리의 전부 혹은 일부분은, 내인성의 면역글로불린 유전자자리를 치환하거나, 또는, 염색체 외에 혹은 당해 동물의 염색체 내에 랜덤하게 거둬들여진 상태로 존재한다. 그와 같은 트랜스제닉 마우스에 있어서, 내인성의 면역글로불린 유전자자리는, 통상 불활성화되어 있다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 얻는 방법의 총설로서, Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)를 참조할 것. 또한, 예를 들어, XENOMOUSETM 기술을 기재한 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호; HUMAB(등록상표) 기술을 기재한 미국 특허 제5,770,429호; K-M MOUSE(등록상표) 기술을 기재한 미국 특허 제7,041,870호; 및, VELOCIMOUSE(등록상표) 기술을 기재한 미국 특허출원공개 제2007/0061900호를, 아울러 참조할 것. 이와 같은 동물에 의해 생성된 완전 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들어, 다른 인간 정상 영역과 조합하는 등을 하여, 추가로 수식되어도 된다.
인간 항체는, 하이브리도마에 기초한 방법으로도 만들 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 제조를 위한, 인간 미엘로마 및 마우스-인간 헤테로미엘로마 세포주는, 이미 기술되어 있다. (예를 들어, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991) 참조.) 인간 B 세포 하이브리도마 기술을 개재시켜 생성된 인간 항체도, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)에 진술되어 있다. 추가적인 방법으로서는, 예를 들어, 미국 특허 제7,189,826호(하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체의 제조를 기재), 및, Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)(인간-인간 하이브리도마를 기재)에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술(트리오마 기술)도, Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)에 기재되어 있다.
인간 항체는, 인간 유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써도 생성할 수 있다. 이와 같은 가변 도메인 서열은, 다음에 소망의 인간 정상 도메인과 조합할 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하는 수법을, 이하에 기술한다.
키메라 및 인간화 항체
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체는, 키메라 항체이다. 특정의 키메라 항체가, 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호; 및, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)에 기재되어 있다. 일례에서는, 키메라 항체는, 비인간 가변 영역(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 원숭이 등의 비인간 영장류에서 유래하는 가변 영역) 및 인간 정상 영역을 포함한다. 추가적인 예에 있어서, 키메라 항체는, 친항체의 것으로부터 클래스 또는 서브클래스가 변경된 「클래스 스위치」 항체이다. 키메라 항체는, 그의 항원 결합 단편도 포함한다.
특정의 태양에 있어서, 키메라 항체는, 인간화 항체이다. 전형적으로는, 비인간 항체는, 친비인간 항체의 특이성 및 어피니티를 유지한 채로 인간으로의 면역원성을 감소시키기 위해서, 인간화된다. 통상, 인간화 항체는 1개 또는 복수의 가변 도메인을 포함하고, 당해 가변 도메인 중, HVR(예를 들어 CDR(또는 그의 부분))은 비인간 항체에서 유래하고, FR(또는 그의 부분)은 인간 항체 서열에서 유래한다. 인간화 항체는, 임의로, 인간 정상 영역의 적어도 일부분을 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, 인간화 항체 중의 몇몇 FR 잔기는, 예를 들어, 항체의 특이성 또는 어피니티를 회복 또는 개선하기 위해서, 비인간 항체(예를 들어, HVR 잔기의 유래가 된 항체)로부터의 대응하는 잔기로 치환되어 있다.
인간화 항체 및 그의 제작 방법은, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)에 있어서 총설되어 있고, 또한, 예를 들어, Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat＇l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 미국 특허 제5,821,337호, 제7,527,791호, 제6,982,321호, 및 제7,087,409호; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)(특이성 결정 영역 (specificity determining region: SDR) 그래프팅을 기재); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)(「리서페이싱」을 기재); Dall＇Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)(「FR 셔플링」을 기재); 및, Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 셔플링을 위한 「가이드 셀렉션」 어프로치를 기재)에 있어서, 더 기재되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은, 이들로 한정되는 것은 아니지만: 「베스트 피트」법(Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993) 참조)을 이용하여 선택된 프레임워크 영역; 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정의 서브그룹의 인간 항체의 컨센서스 서열에서 유래하는 프레임워크 영역(Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992) 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993) 참조); 인간 성숙(체세포 변이) 프레임워크 영역 또는 인간 생식 세포계 프레임워크 영역(예를 들어, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) 참조); 및, FR 라이브러리의 스크리닝에서 유래하는 프레임워크 영역(Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996) 참조)을 포함한다.
상기 태양의 임의의 것에 있어서, 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)는, 인간화되어 있다. 일 태양에 있어서, 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)는, 상기 태양의 임의의 것에 있어서의 HVR을 포함하고, 또한 추가로, 억셉터 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 포함한다. 다른 태양에 있어서, 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)는, 상기 태양의 임의의 것에 있어서의 HVR을 포함하고, 또한 추가로, 본 명세서에 나타나는 FR1, FR2, FR3, 또는 FR4 서열을 포함한다. 본 명세서에 있어서, 「인간 프레임워크」는, 항체가 인간화되는 사실에 초점을 맞추어 「인간화 프레임워크」라고도 불릴 수 있다.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자는,
(i) 글루텐 펩티드와의 복합체의 형태에 있는 HLA-DQ2.5에 대해서 결합 활성을 갖는 제 1 항원 결합 부분; 및
(ii) 글루텐 펩티드와의 복합체의 형태에 있는 HLA-DQ2.5에 대해서 결합 활성을 갖는 제 2 항원 결합 부분
을 포함하고,
해당 항원 결합 분자는, HLA-DQ2.5와 글루텐 펩티드의 2개 이상의 복합체에 결합하고,
제 1 항원 결합 부분이 결합하는 복합체 중의 글루텐 펩티드의 적어도 1개는, 제 2 항원 결합 부분이 결합하는 복합체 중의 글루텐 펩티드의 적어도 1개와는 상이하고; 및
해당 항원 결합 분자는, HLA-DQ2.5 양성 PBMC B 세포 및 HLA-DQ2.5 또는 HLA-DQ2.2를 발현하는 Ba/F3 세포의 어느 하나 또는 양쪽에 대해서 결합 활성을 실질적으로 갖지 않고,
해당 항원 결합 분자는, 인간화되어 있고, 또한
해당 다중 특이성 항원 결합 분자에 있어서의 제 1 항원 결합 부분 및/또는 제 2 항원 결합 부분에 있어서의 중쇄 및/또는 경쇄 정상 및/또는 가변 영역 중의 1개 또는 복수의 아미노산은, 개변되어 있다.
몇몇 태양에서는, 다중 특이성 항원 결합 분자에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자에 있어서의 제 1 항원 결합 부분 및/또는 제 2 항원 결합 부분의 중쇄 및/또는 경쇄 중의 1개 또는 복수의 아미노산은, 치환되어 있다.
몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, 중쇄의 가변 영역 중의 적어도 1개의 아미노산 치환; 중쇄의 정상 영역 중의 적어도 1개의 아미노산 치환; 경쇄의 가변 영역 중의 적어도 1개의 아미노산 치환; 및 경쇄의 정상 영역 중의 적어도 1개의 아미노산 치환을 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 글루텐 펩티드는, 셀리악병에 관련하는 면역 우성 펩티드이다.
몇몇 태양에 있어서, 글루텐 펩티드는, 33mer 글리아딘 펩티드, α1 글리아딘 펩티드, α2 글리아딘 펩티드, γ1 글리아딘 펩티드, γ2 글리아딘 펩티드, ω1 글리아딘 펩티드, ω2 글리아딘 펩티드, BC 호르데인 펩티드, α3 글리아딘 펩티드, α1b 글리아딘 펩티드, γ4a 글리아딘 펩티드, γ4b 글리아딘 펩티드, 아베닌 1 펩티드, 아베닌 2 펩티드, 아베닌 3 펩티드, 호르데인 1 펩티드, 호르데인 2 펩티드, 세칼린 1 펩티드, 세칼린 2 펩티드, 및 26mer 글리아딘 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
몇몇 태양에 있어서, 글루텐 펩티드는, 33mer 글리아딘 펩티드, α1 글리아딘 펩티드, α2 글리아딘 펩티드, γ1 글리아딘 펩티드, γ2 글리아딘 펩티드, ω1 글리아딘 펩티드, ω2 글리아딘 펩티드, BC 호르데인 펩티드, α3 글리아딘 펩티드, α1b 글리아딘 펩티드, γ4a 글리아딘 펩티드, γ4b 글리아딘 펩티드, 아베닌 1 펩티드, 아베닌 2 펩티드, 아베닌 3 펩티드, 호르데인 1 펩티드, 호르데인 2 펩티드, 세칼린 1 펩티드, 세칼린 2 펩티드, 및 26mer 글리아딘 펩티드 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19개, 또는 모두이다.
몇몇 태양에 있어서, 글루텐 펩티드는, 33mer 글리아딘 펩티드, α1 글리아딘 펩티드, α2 글리아딘 펩티드, γ1 글리아딘 펩티드, ω1 글리아딘 펩티드, ω2 글리아딘 펩티드, BC 호르데인 펩티드, α3 글리아딘 펩티드, α1b 글리아딘 펩티드, γ4a 글리아딘 펩티드, γ4b 글리아딘 펩티드, 아베닌 1 펩티드, 아베닌 2 펩티드, 아베닌 3 펩티드, 호르데인 1 펩티드, 호르데인 2 펩티드, 세칼린 1 펩티드, 세칼린 2 펩티드, 및 26mer 글리아딘 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
몇몇 태양에 있어서, 글루텐 펩티드는, 33mer 글리아딘 펩티드, α1 글리아딘 펩티드, α2 글리아딘 펩티드, γ1 글리아딘 펩티드, ω1 글리아딘 펩티드, ω2 글리아딘 펩티드, BC 호르데인 펩티드, α3 글리아딘 펩티드, α1b 글리아딘 펩티드, γ4a 글리아딘 펩티드, γ4b 글리아딘 펩티드, 아베닌 1 펩티드, 아베닌 2 펩티드, 아베닌 3 펩티드, 호르데인 1 펩티드, 호르데인 2 펩티드, 세칼린 1 펩티드, 세칼린 2 펩티드, 및 26mer 글리아딘 펩티드 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개, 또는 모두이다.
몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, 글루텐 펩티드 그 자체 또는 글루텐 펩티드 그들 자체에 대해서 결합 활성을 실질적으로 갖지 않는다. 이 문맥에 있어서, 용어 「그 자체」 및 「그들 자체」는, 글루텐 펩티드가 HLA-DQ2.5와의 복합체를 형성하지 않는 상태를 말한다.
몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, 무관계한 펩티드와의 복합체의 형태에 있는 HLA-DQ2.5에 대해서 결합 활성을 실질적으로 갖지 않고, 해당 무관계한 펩티드는, CLIP(hCLIP) 펩티드, B형 간염 바이러스 1 펩티드, 살모넬라균 펩티드, 마이코박테리움 보비스 펩티드, 및 티로퍼옥시다제 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 펩티드이다.
몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, 무관계한 펩티드와의 복합체의 형태에 있는 HLA-DQ2.5에 대해서 결합 활성을 실질적으로 갖지 않고, 해당 무관계한 펩티드는, CLIP(hCLIP) 펩티드, B형 간염 바이러스 1 펩티드, 살모넬라균 펩티드, 마이코박테리움 보비스 펩티드, 및 티로퍼옥시다제 펩티드의 모두이다.
몇몇 태양에 있어서, 항원 결합 분자는, 상기 인간화 및 개변 전과 비교하여, HLA-DQ2.5와 글루텐 펩티드에 의해 형성된 복합체에 대해서 증강된 결합 활성을 갖는다. 이 문맥에 있어서, 「증강된 결합 활성」은, 항원 결합 분자가, 수식, 즉, 인간화 및 개변 전의 사전 항체보다도 강하게, HLA-DQ2.5와 글루텐 펩티드에 의해 형성된 복합체에 결합하는 것을 의미한다.
몇몇 태양에 있어서, 항원 결합 분자는, 상기 인간화 및 개변 전과 비교하여, 글루텐 펩티드에 대해서 증강된 교차 반응성을 갖는다. 몇몇 태양에 있어서, 글루텐 펩티드는, ω2 글리아딘 펩티드, BC 호르데인 펩티드, γ1 글리아딘 펩티드, γ2 글리아딘 펩티드, γ4a 글리아딘 펩티드, 및 γ4d 글리아딘 펩티드이다. 이 문맥에 있어서, 「글루텐 펩티드에 대해서 증강된 교차 반응성」은, 항원 결합 분자가, 수식, 즉, 인간화 및 개변 전의 사전 항체보다도 많은 글루텐 펩티드에 대해서, 결합하거나 또는 중화 활성을 나타냄을 의미한다.
다른 국면에 있어서, 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)는, 본 명세서에 개시되는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열의 아미노산 서열에 대해서 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함한다. 특정의 태양에 있어서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 서열은, 참조(즉, 원래의) 서열에 대해서 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 포함하지만, 당해 서열을 포함하는 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)는, HLA-DQ2.5에 결합하는 능력을 유지한다. 특정의 태양에 있어서, 합계 1개∼10개의 아미노산이, 참조(즉, 원래의) 서열에 대해서 치환, 삽입, 및/또는 결실되어 있다. 특정의 태양에 있어서, 치환, 삽입, 또는 결실은, HVR의 외측의 영역(즉, FR 중)에서 생긴다. 임의로, 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)는, 본 명세서에 개시되는 VH 서열, 또는 그 번역 후 수식을 포함하는 서열을 포함한다. 어느 특정의 태양에 있어서, VH는, (a) 본 명세서에 개시되는 HVR-H1, (b) 본 명세서에 개시되는 HVR-H2, 및 (c) 본 명세서에 개시되는 HVR-H3으로부터 선택되는, 1, 2, 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역 후 수식은, 중쇄 또는 경쇄의 N말단의 글루타민 또는 글루탐산의 파이로글루타밀화에 의한 파이로글루탐산으로의 수식을 포함하지만, 이것으로 한정되지 않는다.
본 발명의 아미노산 서열에 함유되는 아미노산은, 번역 후 수식되어 있어도 된다(예를 들어, N말단 글루타민의 파이로글루타밀화에 의한 파이로글루탐산으로의 수식은, 당업자에게 잘 알려져 있다). 당연히, 그와 같은 번역 후 수식된 아미노산은, 본 발명에 있어서의 아미노산 서열에 포함된다.
다른 국면에 있어서, 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)가 제공되고, 해당 분자/항체는, 본 명세서에 개시되는 경쇄 가변 도메인(VL)의 아미노산 서열에 대해서 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 특정의 태양에 있어서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은, 참조(즉, 원래의) 서열에 대해서 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 당해 서열을 포함하는 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)는, HLA-DQ2.5에 결합하는 능력을 유지한다. 특정의 태양에 있어서, 합계 1개∼10개의 아미노산이, 참조(즉, 원래의) 서열에 대해서 치환, 삽입, 및/또는 결실되어 있다. 특정의 태양에 있어서, 치환, 삽입, 또는 결실은, HVR의 외측의 영역(즉, FR 중)에서 생긴다. 임의로, 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)는, 본 명세서에 개시되는 VL 서열, 또는 그 번역 후 수식을 포함하는 서열을 포함한다. 어느 특정의 태양에 있어서, VL은, (a) 본 명세서에 개시되는 HVR-L1; (b) 본 명세서에 개시되는 HVR-L2; 및 (c) 본 명세서에 개시되는 HVR-L3로부터 선택되는, 1, 2, 또는 3개의 HVR을 포함한다. 번역 후 수식은, 중쇄 또는 경쇄의 N말단의 글루타민 또는 글루탐산의 파이로글루타밀화에 의한 파이로글루탐산으로의 수식을 포함하지만, 이것으로 한정되지 않는다.
다른 국면에 있어서, 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)가 제공되고, 해당 분자/항체는, 상기에서 제공되는 태양의 임의의 것에 있어서의 VH, 및 상기에서 제공되는 태양의 임의의 것에 있어서의 VL을 포함한다. 일 태양에 있어서, 분자/항체는, 본 명세서에 개시되는 VH 서열 또는 그 번역 후 수식을 포함하는 서열, 및 본 명세서에 개시되는 VL 서열 또는 그 번역 후 수식을 포함하는 서열을 포함한다. 번역 후 수식은, 중쇄 또는 경쇄의 N말단의 글루타민 또는 글루탐산의 파이로글루타밀화에 의한 파이로글루탐산으로의 수식을 포함하지만, 이것으로 한정되지 않는다.
추가적인 국면에 있어서, 본 발명은, 본 명세서에서 제공되는 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)와 동일한 에피토프에 결합하는 항원 결합 분자(항체)를 제공한다. 예를 들어, 특정의 태양에 있어서, 본 명세서에 기재된 분자/항체의 어느 것과 동일한 에피토프에 결합하는 분자/항체가 제공된다. 특정의 태양에 있어서, 약 8개∼17개의 아미노산으로 이루어지는 HLA-DQ2.5의 단편 내의, 또는 HLA-DQ2.5와 글루텐 펩티드에 의해 형성된 복합체 내의, 에피토프에 결합하는 분자/항체가 제공된다. 이 문맥에 있어서, 글루텐 펩티드는, 본 명세서에 기재된 글루텐 펩티드의 어느 것일 수 있다.
추가적인 국면에 있어서, 본 발명은, HLA-DQ2.5 또는 HLA-DQ2.5와 글루텐 펩티드에 의해 형성된 복합체에 대한 결합에 대해, 다른 항원 결합 분자(항체)와 경합하는 항원 결합 분자(항체)를 제공한다. 예를 들어, 특정의 태양에 있어서, HLA-DQ2.5 또는 HLA-DQ2.5와 글루텐 펩티드에 의해 형성된 복합체에 대한 결합에 대해, 본 명세서에 기재된 분자/항체의 어느 것과 경합하는 분자/항체가 제공된다. 이 문맥에 있어서, 글루텐 펩티드는, 본 명세서에 기재된 글루텐 펩티드의 어느 것일 수 있다.
본 발명의 추가적인 국면에 있어서, 상기의 태양의 임의의 것에 의한 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)는, 키메라, 인간화, 또는 인간 항원 결합 분자(항체)를 포함하는, 모노클로날 항원 결합 분자(항체)이다. 바람직한 태양에 있어서, 본 발명의 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)는, 인간화 항원 결합 분자(항체)이다. 일 태양에 있어서, 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)는, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', scFv, 다이아 보디, 또는 F(ab')2 단편의, 항체 단편이다. 다른 태양에 있어서, 항체는, 예를 들어, 완전 IgG1 항체, 또는 본 명세서에서 정의된 다른 항체 클래스 혹은 아이소타입의, 전장 항체이다.
추가적인 국면에 있어서, 상기의 태양의 임의의 것에 의한 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)는, 단독 또는 조합의 어느 것이어도, 하기의 특성의 임의의 것을 갖고 있어도 된다.
항체의 어피니티
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체는, ≤1마이크로몰(μM), ≤100nM, ≤10nM, ≤1nM, ≤0.1nM, ≤0.01nM 또는 ≤0.001nM(예를 들어, 10-8M 이하, 예를 들어 10-8M∼10-13M, 예를 들어 10-9M∼10-13M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다.
일 태양에 있어서, Kd는, 방사성 표지 항원 결합 측정법(radiolabeled antigen binding assay: RIA)에 의해 측정된다. 일 태양에 있어서, RIA는, 목적하는 항체의 Fab 버전 및 그의 항원을 이용하여 실시된다. 예를 들어, 항원에 대한 Fab의 용액 중 결합 어피니티는, 비표지 항원의 점증량 계열의 존재하에서 최소 농도의 (125I) 표지 항원에 의해 Fab를 평형화시키고, 그 다음에 결합한 항원을 항Fab 항체로 코팅된 플레이트에 의해 포착하는 것에 의해 측정된다. (예를 들어, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)을 참조). 측정 조건을 구축하기 위해서, MICROTITER(등록상표) 멀티웰 플레이트(Thermo Scientific)를 50mM 탄산 나트륨(pH 9.6) 중 5마이크로그램(μg)/ml의 포착용 항Fab 항체(Cappel Labs)로 하룻밤 코팅하고, 그 후에 실온(대략 23℃)에서 2∼5시간, PBS 중 2%(w/v) 소 혈청 알부민으로 블록한다. 비흡착 플레이트(Nunc #269620)에 있어서, 100pM 또는 26pM의 [125I]-항원을, (예를 들어, Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)에 있어서의 항VEGF 항체, Fab-12의 평가와 동일하게) 목적하는 Fab의 단계 희석물과 혼합한다. 그 다음에, 목적하는 Fab를 하룻밤 인큐베이트하지만, 이 인큐베이션은, 평형이 확실히 달성되도록, 보다 장시간(예를 들어, 약 65시간) 계속될 수 있다. 그 후, 혼합물을, 실온에서의 인큐베이션(예를 들어, 1시간)을 위해서 포착 플레이트로 옮긴다. 그 다음에 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중 0.1%의 폴리소르베이트 20(TWEEN-20(등록상표))으로 8회 세정한다. 플레이트가 건조하면, 150마이크로리터(μL)/웰의 신틸런트(MICROSCINT-20TM, Packard)를 첨가하고, TOPCOUNTTM 감마 카운터(Packard)에 있어서 플레이트를 10분간 카운트한다. 최대 결합의 20% 이하를 주는 각 Fab의 농도를, 경합 결합 어세이에 있어서 사용하기 위해서 선택한다.
다른 태양에 의하면, Kd는, BIACORE(등록상표) 표면 플라즈몬 공명 어세이를 이용하여 측정된다. 예를 들어, BIACORE(등록상표)-2000 또는 BIACORE(등록상표)-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 이용하는 측정법이, 대략 10반응 단위 (response unit: RU)의 항원이 고정화된 CM5 칩을 이용하여 25℃에서 실시된다. 일 태양에 있어서, 카복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, BIACORE, Inc.)은, 공급원의 지시에 따라 N-에틸-N＇-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)를 이용하여 활성화된다. 항원은, 대략 10반응 단위(RU)의 단백질의 결합을 달성하도록, 5μL/분의 유속으로 주입되기 전에, 10mM 아세트산 나트륨, pH 4.8을 이용하여 5μg/ml(대략 0.2μM)로 희석된다. 항원의 주입 후, 미반응기를 블록하기 위해서 1M 에탄올 아민이 주입된다. 키네틱스의 측정을 위해서, 25℃, 대략 25μL/분의 유속으로, 0.05% 폴리소르베이트 20(TWEEN-20TM) 계면활성제 함유 PBS(PBST) 중의 Fab의 2배 단계 희석물(0.78nM∼500nM)이 주입된다. 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)는, 단순한 1대1 랭뮤어 결합 모델(BIACORE(등록상표) 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여, 결합 및 해리의 센서그램을 동시에 피팅하는 것에 의해 계산된다. 평형 해리 상수(Kd)는, koff/kon비로서 계산된다. 예를 들어, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)을 참조할 것. 상기의 표면 플라즈몬 공명 어세이에 의해 온(on) 속도가 106M-1s-1을 초과하는 경우, 온 속도는, 분광계(예를 들어 스톱-플로식 분광 광도계(Aviv Instruments) 또는 교반 큐벳을 이용하는 8000 시리즈의 SLM-AMINCOTM 분광 광도계(ThermoSpectronic))에 있어서 측정되는, 점증 농도의 항원의 존재하에서의 PBS, pH 7.2 중 20nM의 항항원 항체(Fab 형태)의 25℃에서의 형광 발광 강도(여기=295nm; 발광=340nm, 밴드 패스 16nm)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 소광 기술을 이용하는 것에 의해 결정될 수 있다.
항체 단편
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체는, 항체 단편이다. 항체 단편은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, Fab, Fab＇, Fab＇-SH, F(ab＇)2, Fv, 및 scFv 단편, 및, 후술하는 다른 단편을 포함한다. 특정의 항체 단편에 대한 총설로서, Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)를 참조할 것. scFv 단편의 총설로서, 예를 들어, Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); 더하여, WO93/16185; 및 미국 특허 제5,571,894호 및 제5,587,458호를 참조할 것. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하는 인비보(in vivo)에 있어서의 반감기가 길어진 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 논설로서, 미국 특허 제5,869,046호를 참조할 것.
다이아보디는, 2가 또는 이중 특이적이어도 되는, 항원 결합 부위를 2개 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP404,097호; WO1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) 참조. 트리아보디(triabody)나 테트라보디(tetrabody)도, Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)에 기재되어 있다.
싱글 도메인 항체는, 항체의 중쇄 가변 도메인의 모두 혹은 일부분, 또는 경쇄 가변 도메인의 모두 혹은 일부분을 포함하는, 항체 단편이다. 특정의 태양에 있어서, 싱글 도메인 항체는, 인간 싱글 도메인 항체이다(Domantis, Inc., Waltham, MA; 예를 들어, 미국 특허 제6,248,516호 B1 참조).
항체 단편은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 본 명세서에 기재된, 완전 항체의 단백질 분해적 소화, 재조합 숙주 세포(예를 들어, 대장균 (E. coli) 또는 파지)에 의한 산생을 포함하는, 여러 가지 수법에 의해 만들 수 있다.
Fc 영역 변이체
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체의 Fc 영역에 1개 또는 복수의 아미노산 수식을 도입하고, 그것에 의해 Fc 영역 변이체를 생성해도 된다. Fc 영역 변이체는, 1개 또는 복수의 아미노산 포지션의 장소에서 아미노산 수식(예를 들어, 치환)을 포함하는, 인간 Fc 영역 서열(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 Fc 영역)을 포함해도 된다.
증가한 반감기, 및 신생아형 Fc 수용체(FcRn: 모체의 IgG류를 태아에게 이행 시키는 역할을 담당한다(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)))에 대한 증가한 결합성을 수반하는 항체가, 미국 특허출원공개 제2005/0014934호 A1(Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는, Fc 영역의 FcRn으로의 결합성을 증가시키는 1개 또는 복수의 치환을 그 중에 수반하는 Fc 영역을 포함한다. 이와 같은 Fc 변이체는, Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 또는 434의 1개 또는 복수의 장소에서의 치환(예를 들어, Fc 영역 잔기 434의 치환(미국 특허 제 7,371,826호))을 수반하는 것을 포함한다.
Fc 영역 변이체의 다른 예에 대해서는, Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); 미국 특허 제5,648,260호; 미국 특허 제5,624,821호; 및 WO94/29351도 참조할 것.
Fc 영역
본 명세서에서는, 용어 「Fc 영역」 또는 「Fc 도메인」은, 정상 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C말단 영역을 정의하기 위해서 사용된다. 이 용어에는, 천연 서열의 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역이 포함된다. 일 태양에 있어서, 인간 IgG 중쇄의 Fc 영역은, Cys226으로부터, 또는 Pro230으로부터, 중쇄의 카복실 말단까지 연장되어 있다. 단, Fc 영역의 C말단 리신(Lys447) 또는 글리신-리신(잔기 446∼447)은, 존재하고 있어도 존재하고 있지 않아도 된다. 본 명세서에서 특별히 지정하지 않는 한, Fc 영역 또는 정상 영역의 아미노산 잔기의 번호 붙이기는, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에 기재된, EU 인덱스라고도 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
Fc 수용체
용어 「Fc 수용체」 또는 「FcR」은, 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 말한다. 어느 태양에 있어서, FcR는 천연의 인간 FcR이다. 어느 태양에 있어서, FcR는, IgG 항체에 결합하는 것(γ 수용체)이고, FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체를 포함하고, 이것에는, 이들 수용체의 대립 유전자 변이체 및 선택적 스플라이스 형태도 포함된다. FcγRII 수용체에는, FcγRIIA(「활성화 수용체」) 및 FcγRIIB(「저해 수용체」)가 포함되고, 이들은, 주로 그 세포질 도메인에 있어서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는, 그 세포질 도메인에 면역 수용체 티로신 베이스 활성화 모티프(ITAM)를 포함한다. 저해 수용체 FcγRIIB는, 그 세포질 도메인에 면역 수용체 티로신 베이스 저해 모티프(ITIM)를 포함한다(예를 들어, Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)를 참조할 것). FcR은, 예를 들어, Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)에 리뷰되어 있다. 금후 동정되는 것을 포함하여, 다른 FcR은, 본 명세서에 있어서의 용어 「FcR」에 포함된다.
용어 「Fc 수용체」 또는 「FcR」은 또한, 신생아 수용체 FcRn도 포함하고, 이것은 모체 IgG의 태아로의 이행(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) 및 면역글로불린의 항상성의 조절에 관여하고 있다. FcRn으로의 결합을 측정하는 방법은, 공지이다(예를 들어, Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al.)를 참조할 것).
인비보에서의 인간 FcRn으로의 결합, 및 인간 FcRn 고어피니티 결합 폴리펩티드의 혈장 반감기는, 예를 들어, 인간 FcRn을 발현하는 트랜스제닉 마우스 혹은 트랜스펙트된 인간 세포주에 있어서, 또는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드가 투여된 영장류에 있어서, 어세이할 수 있다. WO 2000/42072(Presta)는, FcR에 대한 결합이 증가 또는 감소한 항체 변이체를 기재하고 있다. 예를 들어, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)도 참조할 것.
Fcγ 수용체
Fcγ 수용체는, 모노클로날 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체의 Fc 도메인에 결합할 수 있는 수용체를 말하고, Fcγ 수용체 유전자에 의해 실질적으로 코딩되는 단백질의 패밀리에 속하는 모든 멤버를 포함한다. 인간에서는, 이 패밀리는, FcγRI(CD64), 예를 들어, 아이소폼 FcγRIa, FcγRIb, 및 FcγRIc; FcγRII(CD32), 예를 들어, 아이소폼 FcγRIIa(알로타입 H131 및 R131을 포함한다), FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함한다), 및 FcγRIIc; 및 FcγRIII(CD16), 예를 들어, 아이소폼 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158을 포함한다), 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2를 포함한다); 및 모든 미동정의 인간 Fcγ 수용체, Fcγ 수용체 아이소폼, 및 그들의 알로타입을 포함한다. 그러나, Fcγ 수용체는 이들 예로 한정되지 않는다. 이들로 한정되지 않고, Fcγ 수용체에는, 인간, 마우스, 래트, 토끼, 및 원숭이 유래의 것이 포함된다. Fcγ 수용체는, 어떠한 생물에서 유래해도 된다. 마우스 Fcγ 수용체에는, FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16), 및 FcγRIII-2(CD16-2), 및, 모든 미동정의 마우스 Fcγ 수용체, Fcγ 수용체 아이소폼, 및 그들의 알로타입이 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. 그와 같은 바람직한 Fcγ 수용체에는, 예를 들어, 인간 FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32), FcγRIIB(CD32), FcγRIIIA(CD16), 및/또는 FcγRIIIB(CD16)가 포함된다. Fcγ 수용체가 모노클로날 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체의 Fc 도메인으로의 결합 활성을 갖는지 여부는, 전술한 FACS 및 ELISA 포맷에 더하여, ALPHA screen(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay: 증폭형 루미네센스 프록시미티 호모지니어스 어세이), 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 기초하는 BIACORE법 등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005-4010)에 의해, 평가할 수 있다.
한편, 「Fc 리간드」 또는 「이펙터 리간드」는, 항체 Fc 도메인에 결합하여 Fc/Fc 리간드 복합체를 형성하는 분자, 바람직하게는 폴리펩티드를 말한다. 해당 분자는, 어떠한 생물에서 유래해도 된다. Fc 리간드의 Fc로의 결합은, 바람직하게는, 1개 또는 복수의 이펙터 기능을 유도한다. 그와 같은 Fc 리간드에는, Fc 수용체, Fcγ 수용체, Fcα 수용체, Fcβ 수용체, FcRn, C1q, 및 C3, 만난 결합 렉틴, 만노스 수용체, 포도상구균(Staphylococcus) 프로틴 A, 포도상구균 프로틴 G, 및 바이러스 Fcγ 수용체가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다. Fc 리간드에는, Fc 수용체 호몰로그(FcRH)(Davis et al., (2002) Immunological Reviews 190, 123-136)도 포함되고, 이들은 Fcγ 수용체에 상동인 Fc 수용체의 패밀리이다. Fc 리간드에는, Fc에 결합하는 미동정의 분자도 포함된다.
Fcγ 수용체 결합 활성
Fcγ 수용체 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA, 및/또는 FcγRIIIB의 어느 것으로의 Fc 도메인의 결합 활성의 저하는, 전술한 FACS 및 ELISA 포맷, 및 ALPHA screen(증폭형 루미네센스 프록시미티 호모지니어스 어세이) 및 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 기초하는 BIACORE법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005-4010)을 이용하는 것에 의해 평가할 수 있다.
ALPHA screen은, 도너 비즈와 억셉터 비즈의 2종류의 비즈를 이용하는, 후술하는 원리에 기초한 ALPHA 기술에 의해, 행해진다. 도너 비즈에 연결된 분자가 억셉터 비즈에 연결된 분자와 생물학적으로 상호작용하는 경우 또한 이들 2개의 비즈가 근접하여 배치되고 있는 경우에만, 발광 시그널이 검출된다. 레이저 빔으로 여기되면, 도너 비즈 내의 광증감제가, 비즈의 주위의 산소를 여기 일중항 산소로 변환한다. 일중항 산소가 도너 비즈의 주위로 확산하여, 근접하여 배치된 억셉터 비즈에 도달하면, 억셉터 비즈 내에서 화학 발광 반응이 유도된다. 이 반응은 최종적으로 발광을 가져온다. 도너 비즈에 연결된 분자가 억셉터 비즈에 연결된 분자와 상호작용하지 않으면 도너 비즈에 의해 생성된 일중항 산소는 억셉터 비즈에 도달하지 않아, 화학 발광 반응은 일어나지 않는다.
예를 들어, 비오틴 표지한 항원 결합 분자 또는 항체를 도너 비즈에 고정화하고, 글루타티온 S-트랜스페라제(GST) 태그 부착 Fcγ 수용체를 억셉터 비즈에 고정화한다. 경합하는 변이체 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자 및 항체의 비존재하에서는, Fcγ 수용체는 야생형 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자 또는 항체와 상호작용하여, 결과로서 520∼620nm의 시그널을 유도한다. 태그 부착되지 않은 변이체 Fc 도메인을 갖는 항원 결합 분자 또는 항체는, Fcγ 수용체와의 상호작용에 대해, 야생형 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자 또는 항체와 경합한다. 상대적인 결합 어피니티는, 경합의 결과로서의 형광의 감소를 정량화하는 것에 의해 측정할 수 있다. 항원 결합 분자 또는 항체, 예를 들어 항체를, 설포-NHS-비오틴 등을 이용하여 비오틴화하는 방법은 공지이다. GST 태그를 Fcγ 수용체에 부가하기 위한 적절한 방법에는, Fcγ 수용체를 코딩하는 폴리펩티드와 GST를 인프레임으로 융합시키는 것, 융합된 유전자를 담지하는 벡터를 도입한 세포를 이용하여 해당 유전자를 발현시키는 것, 및 그 후, 글루타티온 컬럼을 이용하여 정제하는 것을 포함하는 방법이 포함된다. 유도된 시그널은, 바람직하게는, 예를 들어, GRAPHPAD PRISM(GraphPad; San Diego) 등의 소프트웨어를 이용하여, 비선형 회귀 분석에 기초하는 1부위 경합 모델에 피팅시키는 것에 의해, 해석할 수 있다.
그들의 상호작용을 관찰하기 위한 물질 중 한쪽은, 리간드로서 센서 칩의 금박층 상에 고정화된다. 금박층과 유리의 계면에서 전반사가 일어나도록 센서 칩의 이면에 광을 쪼이면, 특정의 부위에서 반사광의 강도가 부분적으로 저하된다(SPR 시그널). 그들의 상호작용을 관찰하기 위한 다른 한쪽의 물질은, 분석물로서 센서 칩의 표면에 주입된다. 고정화된 리간드 분자의 질량은, 분석물이 해당 리간드에 결합하면 증가한다. 이것에 의해, 센서 칩의 표면 상의 용매의 굴절률이 변화한다. 굴절률의 변화는, SPR 시그널의 위치 시프트를 일으킨다(반대로, 해리에 의해 시그널이 원래의 위치로 되돌아간다). Biacore 시스템에서는, 상기의 시프트량(즉, 센서 칩 표면에서의 질량의 변화)을 세로축에 플로팅하고, 따라서 질량의 경시 변화가 실측 데이터(센서그램)로서 표시된다. 속도론적 파라미터(회합 속도 상수(ka) 및 해리 속도 상수(kd))는 센서그램의 곡선으로부터 결정되고, 어피니티(KD)는 이들 2개의 상수 사이의 비율로부터 결정된다. 저해 어세이는, BIACORE법에 있어서 사용하는 것이 바람직하다. 그와 같은 저해 어세이의 예는, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005-4010에 기재되어 있다.
저하된 Fcγ 수용체 결합 활성을 갖는 Fc 영역
본 명세서에 있어서, 「저하된 Fcγ 수용체 결합 활성」이란, 예를 들어, 상기의 해석 방법에 기초하여, 시험 항원 결합 분자 또는 항체의 경합 활성이, 대조 항원 결합 분자 또는 항체의 경합 활성에 비해, 50% 이하, 바람직하게는 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 20% 이하, 또는 15% 이하, 특히 바람직하게는 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하인 것을 의미한다.
모노클로날 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체의 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자 또는 항체는, 대조 항원 결합 분자 또는 항체로서 적절히 사용할 수 있다. Fc 도메인 구조는, RefSeq 억세션 번호 AAC82527.1, RefSeq 억세션 번호 AAB59393.1, RefSeq 억세션 번호 CAA27268.1, 및 RefSeq 억세션 번호 AAB59394.1에 나타난다. 더욱이, 특정의 아이소타입의 항체의 Fc 도메인 변이체를 포함하는 항원 결합 분자 또는 항체를 시험 물질로서 사용하는 경우, Fcγ 수용체 결합 활성에 대한 해당 변이체의 변이의 영향은, 대조로서, 동일한 아이소타입의 Fc 도메인을 포함하는 항원 결합 분자 또는 항체를 이용하여 평가된다. 전술한 바와 같이, Fcγ 수용체 결합 활성이 저하되어 있다고 판단된 Fc 도메인 변이체를 포함하는 항원 결합 분자 또는 항체가 호적하게 조제된다.
그와 같은 기지의 변이체에는, 예를 들어, 아미노산 231A-238S(EU 넘버링)의 결실을 갖는 변이체(WO2009/011941), 및 변이체 C226S, C229S, P238S, (C220S)(J. Rheumatol (2007) 34, 11); C226S 및 C229S(Hum. Antibod. Hybridomas (1990) 1(1), 47-54); C226S, C229S, E233P, L234V, 및 L235A(Blood (2007) 109, 1185-1192)가 포함된다.
구체적으로는, 바람직한 항원 결합 분자 또는 항체에는, 특정의 아이소타입의 항체의 Fc 도메인을 형성하는 아미노산에 있어서의 아미노산 위치: 220, 226, 229, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 264, 265, 266, 267, 269, 270, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 325, 327, 328, 329, 330, 331, 또는 332(EU 넘버링)로부터 선택되는 적어도 1개의 아미노산의 변이(치환 등)를 갖는 Fc 도메인을 포함하는 것이 포함된다. Fc 도메인의 유래가 되는 항체의 아이소타입은 특별히 한정되지 않고, 모노클로날 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체에서 유래하는 적절한 Fc 도메인을 사용하는 것이 가능하다. IgG1 항체에서 유래하는 Fc 도메인을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, SG181이, Fcγ 수용체에 대한 Fc 결합을 약하게 하는 Fcγ 수용체 사일런싱 Fc로서 이용되어도 된다. 몇몇 태양에 있어서, SG181.S3n(서열 번호: 101) 및 SG181.S3p(서열 번호: 102)가, 중쇄 정상 영역 서열로서 이용되어도 된다. 이들 중쇄 정상 영역 서열을, 저하된 Fcγ 수용체 결합을 위해서 본 발명의 항원 결합 분자 또는 항체에 포함해도 된다.
다른 바람직한 항원 결합 분자 또는 항체에는, 예를 들어, IgG1 항체의 Fc 도메인을 형성하는 아미노산에 있어서의 위치 233, 234, 235, 236, 237, 327, 330, 또는 331(EU 넘버링)의 임의의 아미노산이, 대응하는 IgG2 또는 IgG4 중의 EU 넘버링에 있어서 대응하는 위치의 아미노산으로 치환되어 있는 Fc 도메인을 포함하는 것이 포함된다.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자는, 천연형 인간 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, 인간 Fcγ 수용체에 대해서 저하된 결합 어피니티를 나타내는 Fc 도메인을 추가로 포함한다. 몇몇 태양에서는, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자에 있어서, Fc 도메인은, 235위의 Arg 및 236위의 Arg를 포함하고, 아미노산 위치는, EU 넘버링에 따라 번호 붙여져 있다.
H쇄/L쇄의 회합 및 다른 특성의 조절
본 발명의 다른 태양은, 중쇄와 경쇄의 회합이 조절되어 있는 항원 결합 분자, 중쇄와 경쇄의 회합이 조절되어 있는 항원 결합 분자를 제조하는 방법, 및 항원 결합 분자에 있어서 중쇄와 경쇄의 회합을 조절하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 항원 결합 분자는, 중쇄와 경쇄의 회합이 조절되어 있는, 항원 결합 분자를 구성하는 중쇄 및 경쇄가 목적하는 중쇄와 경쇄의 조합인, 및 중쇄의 정상 영역(CH1) 및 경쇄의 정상 영역(CL)에 있어서의 소여의 장소의 아미노산 잔기가, 서로 전기적으로 반발하는 아미노산 잔기(동일한 전하를 갖는)인, 항원 결합 분자에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 중쇄와 경쇄의 바람직하지 않은 조합의 CH1 및 CL에 있어서의 소여의 장소의 아미노산 잔기를, 서로 전기적으로 반발하는(즉, 동일한 전하를 갖는) 아미노산 잔기로 하는 것에 의해, 중쇄와 경쇄의 바람직하지 않은 조합의 형성을, 이 전하 반발의 이용에 의해 저지할 수 있고, 결과로서, 중쇄와 경쇄의 바람직한 조합을 형성할 수 있다.
본 발명에 있어서, 어구 「회합을 조절하는 것」 및 「회합이 조절되는」은, 소망의 회합 조건을 달성하기 위한 조절을 말하고, 보다 구체적으로는, 중쇄와 경쇄 사이에 바람직하지 않은 회합이 형성되지 않는 조절을 말한다.
본 발명에 있어서, 용어 「경계면」은, 통상, 회합(상호작용)에 기인하는 회합면을 말하고, 경계면을 형성하는 아미노산 잔기는, 보통은, 회합에 관련되는 폴리펩티드 영역에 포함되는 1개 또는 복수의 아미노산 잔기이며, 보다 바람직하게는, 회합 중에 서로 접근하여, 상호작용에 관여하는 아미노산 잔기이다. 보다 구체적으로는, 이 상호작용에는, 예를 들어, 아미노산 잔기가, 서로 수소 결합, 정전 상호작용, 또는 염다리를 형성하도록 회합 중에 가까워지는 경우가 포함된다.
본 발명에 있어서, 어구 「경계면을 형성하는 아미노산 잔기」는, 보다 구체적으로는, 경계면을 구성하는 폴리펩티드 영역에 포함되는 아미노산 잔기를 말한다. 예를 들어, 경계면을 구성하는 폴리펩티드 영역은, 예를 들어 항원 결합 분자(예를 들어, 항체), 리간드, 수용체, 또는 기질에 있어서의, 분자 사이의 선택적 결합을 담당하는 폴리펩티드 영역을 말한다. 보다 구체적으로는, 항원 결합 분자에 있어서, 그와 같은 예에는, 중쇄 정상 영역, 중쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역, 및 경쇄 가변 영역이 포함된다.
본 발명의 항원 결합 분자의 바람직한 태양에 있어서, 항원 결합 분자는, 회합 조절 전의 중쇄와 경쇄의 바람직하지 않은 조합의 CH1 및 CL 중의 소여의 장소에, 전기적으로 반발하는(동일한 전하를 갖는) 아미노산 잔기를 갖는다.
전술한 항원 결합 분자에 있어서의 아미노산 잔기를 개변하여, 서로 전기적으로 반발하는(동일한 전하를 갖는) 아미노산 잔기로 하는 것에 의해, 이들 아미노산 잔기의 회합은, 전하의 반발력에 의해 저해된다고 생각된다.
따라서, 전술한 항원 결합 분자에 있어서, 개변되는 아미노산 잔기는, 바람직하게는, 경계면을 형성하는 폴리펩티드 영역에 있어서, 회합 시에 서로 접근하는 아미노산 잔기이다.
회합 중에 접근하는 아미노산 잔기는, 예를 들어, 폴리펩티드의 삼차원 구조를 해석하는 것, 및 폴리펩티드 회합 중에 경계면을 형성하는 폴리펩티드 영역의 아미노산 서열을 조사하는 것에 의해, 결정할 수 있다. 서로 접근하는 경계면의 아미노산 잔기는, 서로, 본 발명의 항원 결합 분자에 있어서의 「개변」의 바람직한 표적이다.
몇몇 아미노산은, 하전되어 있는 것이 공지이다. 일반적으로, 리신(K), 아르기닌(R), 및 히스티딘(H)은, 양전하를 갖는 아미노산(양하전 아미노산)인 것이 공지이다. 아스파르트산(D), 글루탐산(E) 등은, 음전하를 갖는 아미노산(음하전 아미노산)인 것이 공지이다. 더하여, 알라닌(A), 아스파라긴(N), 시스테인(C), 글루타민(Q), 글리신(G), 아이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 프롤린(P), 세린(S), 트레오닌(T), 트립토판(W), 티로신(Y), 발린(V) 등은, 전하를 갖지 않는 아미노산, 또는 비극성 아미노산인 것이 공지이다.
따라서, 본 발명에 있어서의 서로 전기적으로 반발하는(동일한 전하를 갖는) 아미노산은, 이하를 말한다:
(1) 아미노산의 한쪽이 양하전 아미노산이며, 다른 쪽의 아미노산도 양하전 아미노산인, 아미노산, 및
(2) 아미노산의 한쪽이 음하전 아미노산이며, 다른 쪽의 아미노산도 음하전 아미노산인, 아미노산.
아미노산 개변의 예에는, 비하전 아미노산 또는 비극성 아미노산의 양하전 아미노산으로의 개변, 비하전 아미노산 또는 비극성 아미노산의 음하전 아미노산으로의 개변, 양하전 아미노산의 음하전 아미노산으로의 개변, 및 음하전 아미노산의 양하전 아미노산으로의 개변이 포함된다. 더욱이, 비하전 아미노산 또는 비극성 아미노산의 상이한 비하전 또는 비극성 아미노산으로의 개변, 양하전 아미노산의 상이한 양하전 아미노산으로의 개변, 및 음하전 아미노산의 상이한 음하전 아미노산으로의 개변도 또한, 본 발명의 아미노산 개변에 포함된다.
본 발명에 있어서의 아미노산을 개변하는 것은, 중쇄 및 경쇄의 각각에 있어서 1개의 개변을 행하는 것, 또는 중쇄 및 경쇄의 각각에 대해서 복수의 개변을 행하는 것을 포함한다. 더하여, 중쇄 및 경쇄에 가해지는 개변의 수는, 동일해도 되고, 또는 상이해도 된다.
본 발명에 있어서의 아미노산을 개변하는 것은, 중쇄 또는 경쇄의 어느 것 상에서 양하전 아미노산으로의 복수의 개변을 행하는 것, 및 다른 쪽의 쇄 상에서 음하전 아미노산으로의 복수의 개변을 행하는 것을 포함한다. 더욱이, 양하전 아미노산으로의 복수의 개변 및 음하전 아미노산으로의 복수의 개변은, 동일한 중쇄 또는 경쇄 상에서 행해져도 된다. 이들 개변에 있어서, 비하전 아미노산 또는 비극성 아미노산으로의 개변 및 비하전 아미노산 또는 비극성 아미노산의 개변도 또한, 호적하게 조합되어도 된다.
본 발명의 개변에 있어서, 예를 들어, 쇄의 한쪽 상의 아미노산을, 개변되지 않는 상태로 이용할 수 있고, 그와 같은 경우에는, 중쇄 및 경쇄는, 양쪽 모두 개변될 필요는 없고, 쇄의 한쪽만이 개변되어도 된다.
본 발명의 항원 결합 분자의 경쇄 정상 영역은, 바람직하게는 인간 경쇄 정상 영역이다. 항체 경쇄 정상 영역의 예에는, IgK(κ), IgL1, IgL2, IgL3, IgL6, 및 IgL7(λ) 타입의 정상 영역이 포함된다. 본 발명의 항원 결합 분자의 경쇄 정상 영역은, 특별히 한정되지 않고; 복수 타입의 경쇄를 이용하는 경우에는, 경쇄는, 상이한 타입의 경쇄, 예를 들어, κ 및 λ여도 된다. 유전자다형에 의해 얻어지는 몇몇 알로타입 서열이, 인간 IgK(κ) 정상 영역 및 인간 IgL7(λ) 정상 영역으로서 Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH Publication No. 91-3242에 기재되어 있고, 이들 중 임의의 것이, 본 발명에 있어서 이용되어도 된다.
항체 정상 영역, 특히, 중쇄 정상 영역은, 항원 결합 분자의 기능 또는 안정성을 개선하기 위해서, 필요에 따라서 개변되어도 된다. 항원 결합 분자의 기능을 개선하기 위한 개변의 예에는, 항원 결합 분자와 Fcγ 수용체(「FcγR」) 사이의 결합을 강하게 하거나 또는 약하게 하는 개변, 항원 결합 분자와 FcRn 사이의 결합을 강하게 하거나 또는 약하게 하는 개변, 항원 결합 분자의 세포 상해 활성(예를 들어 ADCC 활성 및 CDC 활성)을 강하게 하거나 또는 약하게 하는 개변 등이 포함된다. 더하여, 항원 결합 분자의 불균일성을 개선하는 개변, 및 비면역원성 및/또는 약물동태를 개선하는 개변도 또한, 포함될 수 있다.
더욱이, IgG 항체의 중쇄 C말단 서열의 불균일성으로서, C말단 아미노산인 리신 잔기의 결실에 의한, 또는 2개의 C말단 아미노산인 글리신 및 리신의 결실에 의한 C말단 카복실기의 아마이드화가 보고되어 있다(Anal. Biochem. 2007 Jan 1:360(1):75-83).
따라서, 본 발명에 있어서, 중쇄 C말단의 불균일성을 낮게 하기 위해서, C말단의 리신 또는 C말단의 리신 및 글리신이 결실되어 있는 IgG를 이용하는 것이 바람직하다.
인간 유래의 서열을 이용하는 키메라 항체 및 인간화 항체는, 인간 신체에 있어서의 그들의 항원성이 약하게 되어 있기 때문에, 치료적 목적 등으로 인간에게 투여되는 경우에 유용할 것이 기대된다.
본 발명의 항원 결합 분자의 바람직한 예는, 2타입 이상의 CH1 및 2타입 이상의 CL을 갖는 헤테로머 다량체이다. 이 헤테로머 다량체는, 바람직하게는, 2타입 이상의 에피토프에 결합하고, 그 예는, 다중 특이성 항체이다.
본 발명의 다중 특이성 항체의 바람직한 예는, 이중 특이성 항체이다. 따라서, 본 발명의 항원 결합 분자의 바람직한 태양의 예는, 2타입의 중쇄(제 1 중쇄 및 제 2 중쇄) 및 2타입의 경쇄(제 1 경쇄 및 제 2 경쇄)로 구성되는 이중 특이성 항체이다.
본 발명의 항원 결합 분자의 바람직한 태양의 「이중 특이성 항체」를 보다 정확하게 설명하면, 전술한 「제 1 중쇄」는, 항체를 형성하는 2개의 중쇄(H쇄) 중 한쪽을 말하고, 「제 2 H쇄」는, 제 1 H쇄와는 상이한 다른 쪽의 H쇄를 말한다. 즉, 2개의 H쇄에 대해, 그 중의 한쪽을 임의로 제 1 H쇄로서 정의할 수 있고, 다른 쪽을 제 2 H쇄로서 정의할 수 있다. 마찬가지로, 「제 1 경쇄」는, 이중 특이성 항체를 형성하는 2개의 경쇄(L쇄) 중 한쪽을 말하고, 「제 2 L쇄」는, 제 1 L쇄와는 상이한 다른 쪽의 L쇄를 말한다. 2개의 L쇄에 대해, 그 중의 한쪽을 임의로 제 1 L쇄로서 정의할 수 있고, 다른 쪽을 제 2 L쇄로서 정의할 수 있다. 보통은, 제 1 L쇄 및 제 1 H쇄는, 특정의 항원(또는 에피토프)에 결합하는 동일한 항체에서 유래하고, 제 2 L쇄 및 제 2 H쇄도 또한, 특정의 항원(또는 에피토프)에 결합하는 동일한 항체에서 유래한다. 본 명세서에 있어서, 제 1 H쇄와 L쇄에 의해 형성된 L쇄-H쇄 페어는, 제 1 페어로 불리고, 제 2 H쇄와 L쇄에 의해 형성된 L쇄-H쇄 페어는, 제 2 페어로 불린다. 제 2 페어가 유래하는 항체를 산생하기 위해서 이용되는 항원(또는 에피토프)은, 바람직하게는, 제 1 페어가 유래하는 항체를 산생하기 위해서 이용되는 항원과는 상이하다. 보다 구체적으로는, 제 1 페어 및 제 2 페어에 의해 인식되는 항원은, 동일해도 되지만, 바람직하게는, 페어는, 상이한 항원(또는 에피토프)에 결합한다. 이 경우에는, 제 1 페어 및 제 2 페어의 H쇄와 L쇄는, 바람직하게는, 서로와는 상이한 아미노산 서열을 갖는다. 제 1 페어 및 제 2 페어가 상이한 에피토프에 결합하는 경우, 제 1 페어 및 제 2 페어는, 완전히 상이한 항원을 인식해도 되고, 또는, 동일한 항원 상의 상이한 부위(상이한 에피토프)를 인식해도 된다. 더욱이, 그들 중 한쪽은, 단백질, 펩티드, 유전자, 또는 당 등의 항원을 인식해도 되고, 다른 쪽은, 방사성 물질, 화학요법제, 또는 세포 유래 독소 등의 세포 상해성 물질을 인식해도 된다. 그러나, H쇄와 L쇄의 특정의 조합에 의해 형성되는 페어를 갖는 항체를 산생할 것을 바라는 경우, 그들 특정의 H쇄 및 L쇄가, 제 1 페어 및 제 2 페어라고 임의로 결정되어도 된다.
보다 상세한 설명을, 2타입의 중쇄 정상 영역 CH1(CH1-A 및 CH1-B) 및 2타입의 경쇄 정상 영역(CL-A 및 CL-B)을 갖는 IgG 타입의 이중 특이성 항체의 경우에 대해 이하에 제공한다; 그러나, 본 발명은, 다른 항체에도 마찬가지로 적용될 수 있다.
제 1 CH1-A 및 제 1 CL-A에 의해 1개의 에피토프를 인식하고, 제 2 CH1-B 및 제 2 CL-B에 의해 다른 에피토프에 결합하는 이중 특이성 항체를 얻는 것을 바라는 경우, 이론적으로, 그 항체를 산생하기 위해서 4타입의 쇄의 각각을 발현시키면, 10타입의 항체 분자가 산생될 수 있을 가능성이 있다.
이 경우에, 예를 들어, CH1-A와 CL-B의 및/또는 CH1-B와 CL-A의 사이의 회합이 저해되도록 회합이 조절된다면, 소망의 항체 분자를 우선적으로 획득할 수 있다.
예는, CH1-A와 CL-B 사이의 경계면을 형성하는 아미노산 잔기를 개변하여, 양하전 아미노산 잔기로 하는 것, 및 CH1-B와 CL-A 사이의 경계면을 형성하는 아미노산 잔기를 개변하여, 음하전 아미노산 잔기로 하는 것이다. 이들 개변의 결과로서, CH1-A와 CL-B 사이의 의도되지 않는 회합은, 경계면을 형성하는 아미노산 잔기가 양쪽 모두 양으로 하전되어 있기 때문에 저해되고, 또한 CH1-B와 CL-A 사이의 회합도 또한, 경계면을 형성하는 아미노산 잔기가 양쪽 모두 음으로 하전되어 있기 때문에 저해된다. 이와 같이, 의도되지 않는 CH1-A와 CL-B 사이의 회합 및 CH1-B와 CL-A 사이의 회합은, 경계면을 형성하는 아미노산 잔기가 서로 동일한 전하를 갖기 때문에 저해된다. 결과로서, CH1-A와 CL-A 사이의 의도된 회합 및 CH1-B와 CL-B 사이의 의도된 회합을 갖는 항체를, 효율적으로 획득할 수 있다. 더욱이, CH1-A와 CL-A 사이의 의도된 회합은, 경계면을 형성하는 아미노산 잔기가 서로와는 상이한 타입의 전하를 갖기 때문에 촉진되고; 또한 CH1-B와 CL-B 사이의 의도된 회합도 또한, 경계면을 형성하는 아미노산 잔기가 서로와는 상이한 타입의 전하를 갖기 때문에 촉진된다. 결과로서, 의도된 회합을 갖는 항체를, 효율적으로 얻을 수 있다.
다른 예는, CL-A와 CH1-B 사이의 경계면을 형성하는 아미노산 잔기가, 서로 비하전 아미노산 또는 비극성 아미노산인 경우에, CH1-A와 CL-B 사이의 경계면을 형성하는 아미노산 잔기를 개변하여, 양하전 아미노산 잔기로 하는 것이다. 이 개변의 결과로서, CH1-A와 CL-B 사이의 의도되지 않는 회합은, 경계면을 형성하는 아미노산 잔기가 양쪽 모두 양으로 하전되어 있기 때문에 저해된다. 한편, 경계면을 형성하는 아미노산 잔기가, 서로 전기적으로 반발하지 않는 아미노산이기 때문에, CH1-A와 CL-A 사이의 의도된 회합 및 CH1-B와 CL-B 사이의 의도된 회합은, 아미노산이 전기적으로 반발하는 경우보다도 용이하게 일어난다고 생각된다. 결과로서, CH1-A와 CL-A 사이의 의도된 회합 및 CH1-B와 CL-B 사이의 의도된 회합을 갖는 항체를, 효율적으로 얻을 수 있다. 한편, 이 예에 있어서, CL-A와 CH1-B 사이의 경계면을 형성하는 아미노산 잔기가, 서로 비하전 아미노산 또는 비극성 아미노산이 아닌 경우에는, 그들은, 서로 비하전 아미노산 또는 비극성 아미노산이 되도록 개변되어도 된다.
더욱이, 다른 예에 있어서, CL-B와 CH1-B 사이의 경계면을 형성하는 아미노산 잔기가, CH1-B에 있어서 비하전 아미노산 또는 비극성 아미노산인 경우에는, CH1-A와 CL-A 사이의 경계면을 형성하는 아미노산 잔기의 한쪽을 개변하여 양하전 아미노산 잔기로 함과 동시에, 다른 쪽을 개변하여 음하전 아미노 잔기로 하고; 또한 CL-B에 있어서의 CL-B와 CH1-B 사이의 경계면을 형성하는 아미노산 잔기를, CH1-A에 대해서 행해진 개변과 동일한 전하를 갖도록 개변한다. 이 개변의 결과로서, CH1-A와 CL-A 사이의 의도된 회합은, 경계면을 형성하는 아미노산 잔기가 양전하와 음전하의 조합이기 때문에 촉진되지만, CH1-B와 CL-B 사이의 의도된 회합은, 경계면을 형성하는 아미노산 잔기가 서로 전기적으로 반발하지 않는 아미노산이기 때문에 저해되지 않는다. 결과로서, CH1-A와 CL-A 사이의 의도된 회합, 및 CH1-B와 CL-B 사이의 의도된 회합을 갖는 항체를, 효율적으로 얻을 수 있다. 한편, 이 예에 있어서, CL-B와 CH1-B 사이의 경계면을 형성하는 아미노산 잔기가, CH1-B에 있어서 비하전 아미노산 또는 비극성 아미노산이 아닌 경우에는, 그들은, 비하전 아미노산 또는 비극성 아미노산이 되도록 개변되어도 된다.
더하여, 본 발명의 회합 조절의 사용에 의해, CH1(CH1-A와 CH1-B) 사이의 회합, 또는 CL(CL-A와 CL-B) 사이의 회합을 억제하는 것이 가능하게 된다.
당업자는, 본 발명에 의한 회합의 조절이 바람직한 소망의 폴리펩티드에 있어서, CH1과 CL의 경계면에서 회합 중에 가까워지는 아미노산 잔기의 타입을 호적하게 결정할 수 있을 것이다.
더욱이, 당업자는 또한, 공적 데이터베이스 등을 이용하는 것에 의해, 인간, 원숭이, 마우스, 토끼 등과 같은 생물에 있어서의 항체의 CH1 또는 CL로서 이용될 수 있는 서열도, 호적하게 획득할 수 있다. 보다 구체적으로는, CH1 또는 CL의 아미노산 서열 정보를, 하기의 실시예에 기재되는 수단에 의해 획득할 수 있다.
예를 들어, 이하의 실시예에 기재되는 이중 특이성 항체에 관해서, 회합 시에 CH1과 CL의 경계면에서 가까워지는(대면하거나 또는 접촉하는) 아미노산 잔기의 구체예에는, 이하에 나타나는 조합이 포함된다:
- CH1 중의 EU 넘버링에 따른 175위의 글루타민(Q), 및 대면하는(접촉하는) CL 중의 Kabat 넘버링에 따른 160위의 글루타민(Q) 또는 글루탐산(E);
- CH1 중의 EU 넘버링에 따른 175위의 글루타민(Q), 및 대면하는(접촉하는) CL 중의 Kabat 넘버링에 따른 131위의 트레오닌(T) 또는 세린(S);
- CH1 중의 EU 넘버링에 따른 175위의 글루타민(Q), 및 대면하는(접촉하는) CL 중의 Kabat 넘버링에 따른 131위의 세린(S) 또는 트레오닌(T) 및 160위의 글루타민(Q) 또는 글루탐산(E); 및,
- CH1 중의 EU 넘버링에 따른 147위의 리신(K) 및 175위의 글루타민(Q), 및 대면하는(접촉하는) CL 중의 Kabat 넘버링에 따른 131위의 세린(S) 또는 트레오닌(T) 및 160위의 글루타민(Q) 또는 글루탐산(E).
본 발명에 있어서 EU 넘버링으로 기재되는 숫자는, EU 넘버링(Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No. 91-3242)에 따라 나타난다. 본 발명에 있어서, 어구 「EU 넘버링에 따른 X위의 아미노산 잔기」 및 「EU 넘버링에 따른 X위의 아미노산」(X는 임의의 숫자이다)은 또한, 「EU 넘버링에 따른 X위에 대응하는 아미노산 잔기」 및 「EU 넘버링에 따른 X위에 대응하는 아미노산」이라고 읽을 수도 있다. 하기의 실시예에 나타나는 바와 같이, 소망의 항원 결합 분자는, 이들 아미노산 잔기를 개변하는 것, 및 본 발명의 방법을 실시하는 것에 의해, 우선적으로 획득할 수 있다.
어느 태양에 있어서, 본 발명은, 중쇄와 경쇄의 회합이 조절되어 있는 항원 결합 분자로서, 해당 항원 결합 분자의 중쇄 및 경쇄에 있어서의 이하의 (a)∼(c)에 나타나는 아미노산 잔기 세트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개 또는 그 이상의 아미노산 잔기 세트가, 서로 전기적으로 반발하는 아미노산 잔기인, 항원 결합 분자를 제공한다:
(a) EU 넘버링에 따른 175위의, CH1에 함유되는 아미노산 잔기, 및 Kabat 넘버링에 따른 160위의, CL에 함유되는 아미노산 잔기;
(b) EU 넘버링에 따른 175위의, CH1에 함유되는 아미노산 잔기, 및 Kabat 넘버링에 따른 131위의, CL에 함유되는 아미노산 잔기;
(c) EU 넘버링에 따른 147위 및 175위의, CH1에 함유되는 아미노산 잔기, 및 Kabat 넘버링에 따른 131위 및 160위의, CL에 함유되는 아미노산 잔기; 및
(d) EU 넘버링에 따른 175위의, CH1에 함유되는 아미노산 잔기, 및 Kabat 넘버링에 따른 131위 및 160위의, CL에 함유되는 아미노산 잔기.
전술한 항원 결합 분자에 있어서, 「서로 전기적으로 반발하는 아미노산 잔기」 또는 「동일한 전하를 갖는 아미노산 잔기」는, 바람직하게는, 예를 들어, 이하의 (X) 또는 (Y) 세트의 어느 하나에 함유되는 아미노산 잔기로부터 선택된다:
(X) 글루탐산(E) 혹은 아스파르트산(D); 또는
(Y) 리신(K), 아르기닌(R), 혹은 히스티딘(H).
전술한 항원 결합 분자에 있어서, 서로 전기적으로 반발하는 아미노산 잔기 세트의 구체예에는, 이하의 아미노산 잔기 세트가 포함된다:
(a) EU 넘버링에 따른 175위의, CH1에 함유되는 아미노산 잔기, 및 EU 넘버링에 따른 160위의, CL에 함유되는 아미노산 잔기;
(b) EU 넘버링에 따른 175위의, CH1에 함유되는 아미노산 잔기, 및 Kabat 넘버링에 따른 131위의, CL에 함유되는 아미노산 잔기;
(c) EU 넘버링에 따른 147위 및 175위의, CH1에 함유되는 아미노산 잔기, 및 Kabat 넘버링에 따른 131위 및 160위의, CL에 함유되는 아미노산 잔기;
(d) EU 넘버링에 따른 175위의, CH1에 함유되는 아미노산 잔기, 및 Kabat 넘버링에 따른 131위 및 160위의, CL에 함유되는 아미노산 잔기.
몇몇 태양에서는, 다중 특이성 항원 결합 분자에 있어서, 항원 결합 분자의 중쇄 및 경쇄에 있어서의 이하의 (a)∼(d)에 나타나는 아미노산 잔기 세트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개, 2개, 3개, 또는 모든 아미노산 잔기 세트는, 서로 정전기적으로 반발하는 아미노산 잔기이다:
(a) EU 넘버링에 따른 175위인, 중쇄 정상 영역(CH1) 중의 아미노산 잔기, 및 Kabat 넘버링에 따른 131위인, 경쇄 정상 영역(CL) 중의 아미노산 잔기,
(b) EU 넘버링에 따른 175위인, CH1 중의 아미노산 잔기, 및 Kabat 넘버링에 따른 160위인, CL 중의 아미노산 잔기,
(c) EU 넘버링에 따른 175위인, CH1 중의 아미노산 잔기, 및 Kabat 넘버링에 따른 131위 및 160위인, CL 중의 아미노산 잔기,
(d) EU 넘버링에 따른 147위 및 175위인, CH1 중의 아미노산 잔기, 및 Kabat 넘버링에 따른 131위 및 160위인, CL 중의 아미노산 잔기.
본 발명은, 항원 결합 분자의 중쇄 및 경쇄에 있어서의 이하의 (a1)∼(c2)에 나타나는 아미노산 잔기 세트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개 또는 그 이상의 아미노산 잔기 세트가, 서로 전기적으로 반발하는 아미노산 잔기인, 항원 결합 분자를 제공한다:
(a1) 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)인, EU 넘버링에 따른 175위의, CH1에 함유되는 아미노산 잔기, 및 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)인, EU 넘버링에 따른 160위의, CL에 함유되는 아미노산 잔기;
(a2) 리신(K), 히스티딘(H), 또는 아르기닌(R)인, EU 넘버링에 따른 175위의, CH1에 함유되는 아미노산 잔기, 및 리신(K), 히스티딘(H), 또는 아르기닌(R)인, EU 넘버링에 따른 160위의, CL에 함유되는 아미노산 잔기;
(b1) 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)인, EU 넘버링에 따른 175위의, CH1에 함유되는 아미노산 잔기, 및 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)인, EU 넘버링에 따른 131위의, CL에 함유되는 아미노산 잔기;
(b2) 리신(K), 히스티딘(H), 또는 아르기닌(R)인, EU 넘버링에 따른 175위의, CH1에 함유되는 아미노산 잔기, 및 리신(K), 히스티딘(H), 또는 아르기닌(R)인, EU 넘버링에 따른 131위의, CL에 함유되는 아미노산 잔기;
(c1) 각각 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)인, EU 넘버링에 따른 147위 및 175위의, CH1에 함유되는 아미노산 잔기, 및 각각 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)인, EU 넘버링에 따른 131위 및 160위의, CL에 함유되는 아미노산 잔기;
(c2) 각각 리신(K), 히스티딘(H), 또는 아르기닌(R)인, EU 넘버링에 따른 147위 및 175위의, CH1에 함유되는 아미노산 잔기, 및 각각 리신(K), 히스티딘(H), 또는 아르기닌(R)인, EU 넘버링에 따른 131위 및 160위의, CL에 함유되는 아미노산 잔기.
전술한 항원 결합 분자에 있어서, 서로 전기적으로 반발하는 아미노산 잔기의 구체예에는, 이하의 아미노산 잔기가 포함된다:
(a1) 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)인, EU 넘버링에 따른 175위의, CH1에 함유되는 아미노산 잔기, 및 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)인, EU 넘버링에 따른 160위의, CL에 함유되는 아미노산 잔기;
(a2) 리신(K), 히스티딘(H), 또는 아르기닌(R)인, EU 넘버링에 따른 175위의, CH1에 함유되는 아미노산 잔기, 및 리신(K), 히스티딘(H), 또는 아르기닌(R)인, EU 넘버링에 따른 160위의, CL에 함유되는 아미노산 잔기;
(b1) 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)인, EU 넘버링에 따른 175위의, CH1에 함유되는 아미노산 잔기, 및 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)인, EU 넘버링에 따른 131위의, CL에 함유되는 아미노산 잔기;
(b2) 리신(K), 히스티딘(H), 또는 아르기닌(R)인, EU 넘버링에 따른 175위의, CH1에 함유되는 아미노산 잔기, 및 리신(K), 히스티딘(H), 또는 아르기닌(R)인, EU 넘버링에 따른 131위의, CL에 함유되는 아미노산 잔기;
(c1) 각각 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)인, EU 넘버링에 따른 147위 및 175위의, CH1에 함유되는 아미노산 잔기, 및 각각 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)인, EU 넘버링에 따른 131위 및 160위의, CL에 함유되는 아미노산 잔기;
(c2) 각각 리신(K), 히스티딘(H), 또는 아르기닌(R)인, EU 넘버링에 따른 147위 및 175위의, CH1에 함유되는 아미노산 잔기, 및 각각 리신(K), 히스티딘(H), 또는 아르기닌(R)인, EU 넘버링에 따른 131위 및 160위의, CL에 함유되는 아미노산 잔기;
(d1) 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)인, EU 넘버링에 따른 175위의, CH1에 함유되는 아미노산 잔기, 및 각각 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)인, EU 넘버링에 따른 131위 및 160위의, CL에 함유되는 아미노산 잔기;
(d2) 리신(K), 히스티딘(H), 또는 아르기닌(R)인, EU 넘버링에 따른 175위의, CH1에 함유되는 아미노산 잔기, 및 각각 리신(K), 히스티딘(H), 또는 아르기닌(R)인, EU 넘버링에 따른 131위 및 160위의, CL에 함유되는 아미노산 잔기.
상기에 더하여, CH1과 CL 사이의 경계면 상에 전하 반발을 도입하는 것에 의해, 목적이 아닌 회합한 CH1/CL을 저해하기 위한 수법(WO 2013/065708)을, 본 발명의 항원 결합 분자에 추가로 적용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 본 발명은, CH1 및 CL을 갖는 항원 결합 분자로서, 이하의 (a)∼(d)에 나타나는 아미노산 잔기 세트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개 또는 그 이상의 아미노산 잔기 세트가, 서로 전기적으로 반발하는, 항원 결합 분자를 제공한다:
(a) EU 넘버링에 따른 147위의, 중쇄 정상 영역(CH1)에 함유되는 아미노산 잔기, 및 EU 넘버링에 따른 160위의, 경쇄 정상 영역(CL)에 함유되는 아미노산 잔기;
(b) EU 넘버링에 따른 147위의, CH1에 함유되는 아미노산 잔기, 및 EU 넘버링에 따른 131위의, CL에 함유되는 아미노산 잔기;
(c) EU 넘버링에 따른 175위의, CH1에 함유되는 아미노산 잔기, 및 EU 넘버링에 따른 160위의, CL에 함유되는 아미노산 잔기;
(d) EU 넘버링에 따른 213위의, CH1에 함유되는 아미노산 잔기, 및 EU 넘버링에 따른 123위의, CL에 함유되는 아미노산 잔기.
중쇄 사이의 바람직하지 않은 회합을 억제하도록, 중쇄의 제 2 정상 영역(CH2) 혹은 중쇄의 제 3 정상 영역(CH3)의 경계면 중에 전기적 반발을 도입하기 위한 수법, 중쇄와 경쇄 사이의 의도되지 않는 회합을 억제하도록, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 경계면 중에 전기적 반발을 도입하기 위한 수법, 또는, 중쇄와 경쇄 사이의 의도되지 않는 회합을 억제하도록, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 경계면에 존재하는 소수성 코어를 형성하는 아미노산 잔기를 개변하여, 전하를 갖는 극성 아미노산으로 하기 위한 수법을, 본 발명의 항원 결합 분자에 추가로 적용할 수 있다(WO 2006/106905를 참조).
CH2 또는 CH3의 경계면에 전기적 반발을 도입하는 것에 의해 중쇄 사이의 의도되지 않는 회합을 억제하는 수법에 있어서, 중쇄의 다른 정상 영역의 경계면에서 접촉하는 아미노산 잔기의 예에는, CH3 영역에 있어서의 356위(EU 넘버링) 및 439위(EU 넘버링), 357위(EU 넘버링) 및 370위(EU 넘버링), 및 399위(EU 넘버링) 및 409위(EU 넘버링)가 포함된다. 항체 정상 영역의 번호 붙이기에 대해서는, Kabat등에 의한 간행물(Kabat, E.A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH)을 참조해도 되고; 중쇄 정상 영역의 번호 붙이기에 대해서는, EU 넘버링이 나타난다.
보다 구체적으로는, 예를 들어, 2타입의 중쇄 CH3 영역을 함유하는 항원 결합 분자에 있어서, 이하의 (1)∼(3)의 아미노산 잔기 세트로부터 선택되는 제 1 중쇄 CH3 영역에 있어서의 1개에서 3개의 아미노산 잔기 세트는, 서로 전기적으로 반발하도록 제작되어도 된다:
(1) EU 넘버링에 따른 356위 및 439위의, 중쇄 CH3 영역에 함유되는 아미노산 잔기;
(2) EU 넘버링에 따른 357위 및 370위의, 중쇄 CH3 영역에 함유되는 아미노산 잔기; 및
(3) EU 넘버링에 따른 399위 및 409위의, 중쇄 CH3 영역에 함유되는 아미노산 잔기.
더욱이, 항체는, 전술한 제 1 중쇄 CH3 영역과는 별개의, 제 2 중쇄 CH3 영역에 있어서의 아미노산 잔기 세트를 갖는 항체일 수 있고, 해당 아미노산 잔기 세트는, 상기의 (1)∼(3)에 나타나는 아미노산 잔기 세트로부터 선택되고, 또한, 제 1 중쇄 CH3 영역에 있어서 서로 전기적으로 반발하는, 상기의 (1)∼(3)에 나타나는 아미노산 잔기 세트에 대응하는 1개∼3개의 아미노산 잔기 세트는, 제 1 중쇄 CH3 영역에 있어서의 대응하는 아미노산 잔기와는 전기적으로 반발하지 않는다.
상기의 (1)∼(3)에 기재되는 아미노산 잔기는, 회합 시에 서로 접근한다. 당업자는, 시판되고 있는 소프트웨어를 이용한 호몰로지 모델링 등에 의해, 소망의 중쇄 CH3 영역 또는 중쇄 정상 영역을 위한 전술한 (1)∼(3)에 기재되는 아미노산 잔기에 대응하는 부위를 발견하고, 또한 그들 부위의 아미노산 잔기를 호적하게 개변할 수 있을 것이다.
전술한 항원 결합 분자에 있어서, 「전기적으로 반발하는」, 「동일한 전하를 갖는」, 또는 「동일한 전하를 보유하는」이란, 예를 들어, 임의의 2개 이상의 아미노산 잔기가, 본 명세서에서 진술되는 (X) 및 (Y) 중 어느 하나의 군에 함유되는 아미노산 잔기를 갖는 것을 의미한다.
전술한 항원 결합 분자의 바람직한 태양에 있어서, 제 1 중쇄 CH3 영역과 제 2 중쇄 CH3 영역은, 다이설파이드 결합에 의해 가교되어도 된다.
본 발명에 있어서, 「개변」에 제공되는 아미노산 잔기는, 전술한 항원 결합 분자 가변 영역 또는 항체 정상 영역의 아미노산 잔기로 한정되지 않는다. 당업자는, 시판되고 있는 소프트웨어를 이용한 호몰로지 모델링 등에 의해, 폴리펩티드 배리언트 또는 헤테로머 다량체에 있어서 경계면을 형성하는 아미노산 잔기를 발견하고, 또한 회합을 조절하기 위해서 그들 부위의 아미노산 잔기를 개변할 수 있을 것이다. 호몰로지 모델링은, 시판되고 있는 소프트웨어를 이용하여 단백질의 삼차원 구조를 예측하기 위한 수법이다. 미지의 삼차원 구조를 갖는 단백질의 구조를 구축하는 경우, 최초에, 단백질에 대해서 높은 상동성의 삼차원 구조를 갖는다고 판정되고 있는 단백질을 검색한다. 다음에, 이 삼차원 구조를 주형으로서 이용하여, 미지의 구조를 갖는 단백질의 구조를 구축하고, 분자 동력학법 등에 의해 구조를 추가로 최적화하여, 미지의 단백질의 삼차원 구조를 예측한다.
중쇄와 경쇄의 바람직하지 않은 회합을 억제하도록, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 경계면 중에 전기적 반발을 도입하기 위한 수법에 있어서, 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 가변 영역(VL)의 경계면에서 접촉하는 아미노산 잔기의 예에는, VH(FR2 영역) 중의 Kabat 넘버링에 따른 39위의 글루타민(Q), 및 대면하는(접촉하는) VL(FR2 영역) 중의 Kabat 넘버링에 따른 38위의 글루타민(Q)이 포함된다. 더욱이, 바람직한 예는, VH(FR2) 중의 Kabat 넘버링에 따른 45위의 류신(L), 및 대면하는 VL(FR2) 중의 Kabat 넘버링에 따른 44위의 프롤린(P)이다. Kabat 등에 의한 간행물(Kabat, E.A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH)을, 이들 부위의 번호 붙이기를 위해서 참조했다.
이들 아미노산 잔기는, 인간 및 마우스에 있어서 고도로 보존되어 있음이 공지이기(J. Mol. Recognit. 2003; 16: 113-120) 때문에, 항원 결합 분자의 가변 영역의 회합을, 전술한 아미노산 잔기에 대응하는 아미노산 잔기를 개변하는 것에 의해, 실시예에 나타나는 것 이외의 항원 결합 분자의 VH-VL 회합을 위해서 조절할 수 있다.
몇몇 태양에서는, 다중 특이성 항원 결합 분자에 있어서, 더욱이, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이의 경계면을 형성하는 2개 이상의 아미노산 잔기는, 서로 정전기적으로 반발하는 아미노산 잔기이다.
구체예는, VH와 VL의 경계면을 형성하는 2개 이상의 아미노산 잔기가, 서로 전기적으로 반발하는 아미노산 잔기인, 항원 결합 분자이다. 보다 구체적으로는, 예에는, 이하의 (a) 또는 (b)에 나타나는 아미노산 잔기 세트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개의 아미노산 잔기 세트 또는 2개의 아미노산 잔기 세트를 갖는 항원 결합 분자가 포함된다:
(a) Kabat 넘버링에 따른 39위의, VH에 함유되는 아미노산 잔기, 및 Kabat 넘버링에 따른 38위의, VL에 함유되는 아미노산 잔기; 또는
(b) Kabat 넘버링에 따른 45위의, VH에 함유되는 아미노산 잔기, 및 Kabat 넘버링에 따른 44위의, VL에 함유되는 아미노산 잔기.
몇몇 태양에서는, 다중 특이성 항원 결합 분자에 있어서, 서로 정전기적으로 반발하는 아미노산 잔기는, 이하의 (a) 및 (b)의 아미노산 잔기 세트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개의 아미노산 잔기 세트이다:
(a) Kabat 넘버링에 따른 39위인, 중쇄 가변 영역 중의 아미노산 잔기, 및 Kabat 넘버링에 따른 38위인, 경쇄 가변 영역 중의 아미노산 잔기,
(b) Kabat 넘버링에 따른 45위인, 중쇄 가변 영역 중의 아미노산 잔기, 및 Kabat 넘버링에 따른 44위인, 경쇄 가변 영역 중의 아미노산 잔기.
전술한 (a) 또는 (b)에 기재되는 아미노산 잔기의 각각은, 회합 시에 서로 접근한다. 당업자는, 시판되고 있는 소프트웨어를 이용한 호몰로지 모델링 등에 의해, 소망의 VH 또는 VL에 있어서의 전술한 (a) 또는 (b)에 기재되는 아미노산 잔기에 대응하는 부위를 발견하고, 또한 그들 부위의 아미노산 잔기를 호적하게 개변할 수 있을 것이다.
몇몇 태양에서는, 다중 특이성 항원 결합 분자에 있어서, 서로 정전기적으로 반발하는 아미노산 잔기는, 이하의 (X) 또는 (Y)의 어느 하나의 세트에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택된다:
(X) 글루탐산(E), 아스파르트산(D),
(Y) 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H).
중쇄와 경쇄의 의도되지 않는 회합을 억제하도록, VH와 VL의 경계면에 존재하는 소수성 코어를 형성하는 아미노산 잔기를 개변하여, 전하를 갖는 극성 아미노산으로 하기 위한 수법에 있어서, VH와 VL의 경계면에서 소수성 코어를 형성할 수 있는 아미노산 잔기의 바람직한 예에는, VH(FR2) 중의 Kabat 넘버링에 따른 45위의 류신(L), 및 대면하는 VL(FR2) 중의 Kabat 넘버링에 따른 44위의 프롤린(P)이 포함된다. 이들 부위의 번호 붙이기에 대해서는, Kabat 등(Kabat, E.A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH)을 참조로서 이용했다.
일반적으로, 용어 「소수성 코어」는, 회합한 폴리펩티드의 내부에 소수성 아미노산 측쇄의 집합에 의해 형성되는 부분을 말한다. 소수성 아미노산의 예에는, 알라닌, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 및 발린이 포함된다. 더욱이, 소수성 아미노산 이외의 아미노산 잔기(예를 들어, 티로신)가, 소수성 코어의 형성에 관여할 수 있다. 이 소수성 코어는, 친수성 아미노산 측쇄가 외부에 폭로되어 있는 친수성 표면과 함께, 수용성 폴리펩티드의 회합을 촉진하기 위한 구동력이 된다. 2개의 상이한 도메인의 소수성 아미노산이, 분자 표면 상에 존재하고, 또한 물 분자에 폭로되는 경우에는, 엔트로피가 증대하고, 또한 자유 에너지가 증대할 것이다. 따라서, 2개의 도메인은, 자유 에너지를 감소시켜 안정되게 되기 위해서 서로와 회합하여, 경계면의 소수성 아미노산은, 소수성 코어를 형성하도록 분자의 내부 중에 묻히게 된다.
폴리펩티드 회합이 일어나는 경우에, 소수성 코어를 형성하는 소수성 아미노산을 개변하여, 전하를 갖는 극성 아미노산으로 하는 것에 의해, 소수성 코어의 형성이 저해된다고 생각되고; 결과로서, 펩티드 회합이 저해된다고 생각된다.
당업자는, 소망의 항원 결합 분자에 대한 아미노산 서열을 해석하는 것에 의해, 소수성 코어의 유무, 형성 부위(영역) 등을 인식할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 항원 결합 분자는, 경계면에서 소수성 코어를 형성할 수 있는 아미노산 잔기가 개변되어, 전하를 갖는 아미노산 잔기가 되어 있는 것을 특징으로 하는 항원 결합 분자이다. 보다 구체적으로는, 예로는, 이하의 (1) 또는 (2)의 어느 것에 나타나는 아미노산 잔기가, 전하를 갖는 아미노산 잔기인, 항원 결합 분자가 포함된다. 이하의 (1) 및 (2)에 나타나는 아미노산 잔기의 측쇄는, 서로 인접하여, 소수성 코어를 형성할 수 있다:
(1) Kabat 넘버링에 따른 45위의, VH에 함유되는 아미노산 잔기; 및
(2) Kabat 넘버링에 따른 44위의, VL에 함유되는 아미노산 잔기.
전술한 항원 결합 분자에 있어서의 전하를 갖는 아미노산 잔기의 바람직한 예에는, 글루탐산(E), 아스파르트산(D), 리신(K), 아르기닌(R), 및 히스티딘(H)이 포함된다. 보다 바람직한 예에는, 글루탐산(E) 및 리신(K)이 포함된다.
일반적으로, 인간 및 마우스에 있어서의 전술한 (1) 및 (2)에 기재되는 아미노산 잔기는, 각각 이하이다:
(1) 류신(L), 및
(2) 프롤린(P).
따라서, 본 발명의 바람직한 태양에 있어서, 이들 아미노산 잔기는, 개변(예를 들어, 전하를 갖는 아미노산으로의 치환)에 제공된다. 더욱이, (1) 및 (2)의 전술한 아미노산 잔기의 타입은, 반드시 전술한 아미노산 잔기로 한정되지 않지만, 이들 아미노산 잔기와 등가의 다른 아미노산이어도 된다.
다른 공지된 수법을, 본 발명의 항원 결합 분자에 적용할 수 있다. 예를 들어, 제 1 VH(VH1)와 제 1 VL(VL1) 및/또는 제 2 VH(VH2)와 제 2 VL(VL2)의 회합을 촉진하기 위해서, H쇄의 한쪽의 가변 영역 중에 존재하는 아미노산 측쇄를, 보다 큰 측쇄(노브(knob))로 치환할 수 있고, 다른 쪽의 H쇄의 서로 마주 보는 가변 영역 중에 존재하는 아미노산 측쇄를, 보다 작은 측쇄(홀(hole))로 치환할 수 있으며, 이것에 의해, 노브가 홀 중에 배치되어도 되고, VH1과 VL1 및/또는 VH2와 VL2의 회합이 촉진되고; 또한 결과로서, VH1과 VL2 및/또는 VH2와 VL1의 회합을, 더 억제할 수 있다.
예를 들어, 인간 IgG1의 경우에, 한쪽의 H쇄의 CH3 영역 중의 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(노브)로 하기 위해서, Y349C 및 T366W의 개변이 행해지고, 다른 쪽의 H쇄의 CH3 영역 중의 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄로 하기 위해서, D356C, T336S, L368A, 및 Y407V의 개변이 행해진다.
몇몇 태양에서는, 다중 특이성 항원 결합 분자에 있어서, Fc 도메인은, 안정된 회합이 가능한 제 1 Fc 영역 서브유닛 및 제 2 Fc 영역 서브유닛으로 구성된다.
몇몇 태양에서는, 다중 특이성 항원 결합 분자에 있어서, Fc 도메인은, 이하의 (e1) 또는 (e2)를 포함한다:
(e1) 349위의 Cys, 366위의 Ser, 368위의 Ala, 및 407위의 Val을 포함하는 제 1 Fc 영역 서브유닛, 및 354위의 Cys 및 366위의 Trp를 포함하는 제 2 Fc 영역;
(e2) 439위의 Glu를 포함하는 제 1 Fc 영역 서브유닛, 및 356위의 Lys를 포함하는 제 2 Fc 영역
(아미노산 위치는, EU 넘버링에 따라 번호 붙여져 있다).
예를 들어, 노브·인투·홀(knob-into-hole) 기술은, 예를 들어, US 5731168; US 7695936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) 및 Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)에 기재되어 있다. 일반적으로, 방법은, 제 1 폴리펩티드의 경계면에 돌기(「노브」)를, 및 제 2 폴리펩티드의 경계면에 대응하는 공동(「홀」)을, 헤테로2량체의 형성을 촉진하고, 호모2량체의 형성을 방해하기 위해서, 돌기가 공동 중에 위치할 수 있도록 도입하는 것을 포함한다. 돌기는, 제 1 폴리펩티드의 경계면 유래의 작은 아미노산 측쇄를, 보다 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 치환하는 것에 의해 구축한다. 돌기와 동일 또는 유사한 사이즈의 대상적 공동은, 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 것(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)으로 치환하는 것에 의해, 제 2 폴리펩티드의 경계면에 만들어 낸다.
추가로 다른 공지된 수법을, 본 발명의 항원 결합 분자에 적용할 수 있다. 항원 결합 분자의 한쪽의 H쇄의 CH3의 일부분을, 그 부분에 대응하는 IgA에서 유래하는 서열로 변경하고, 다른 쪽의 H쇄의 CH3의 상보적 부분에, 그 부분에 대응하는 IgA에서 유래하는 서열을 도입하는, 쇄 교환 조작 도메인 CH3을 이용한 CH3의 상보적 회합에 의해, 표적 항원 결합 분자를 효율적으로 조제할 수 있다(Protein Engineering Design & Selection, 23: 195-202, 2010).
추가로 다른 공지된 수법을, 본 발명의 항원 결합 분자에 적용할 수 있다. 이중 특이성 항체를 산생하는 경우에는, 예를 들어, 2타입의 H쇄의 가변 영역의 각각에 상이한 아미노산 개변을 행하는 것에 의해 등전점의 차이를 주는 것, 및 이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제를 위해서 그 등전점의 차이를 이용하는 것에 의해, 표적 이중 특이성 항체를 조제할 수 있다(WO 2007/114325).
IgG와 프로틴 A 사이의 결합에 관련하는 부위인, EU 넘버링에 따른 435위의 아미노산 잔기를 개변하여, 프로틴 A에 대해서 상이한 결합 강도를 갖는 아미노산, 예를 들어 Arg로 하는 수법도 또한, 전술한 수법과 조합하여 본 발명의 항원 결합 분자에 대해서 이용되어도 된다. 이 수법을 이용하는 것에 의해, H쇄와 프로틴 A 사이의 상호작용을 변경할 수 있어, 헤테로2량체 항원 결합 분자만을, 프로틴 A 컬럼을 이용하여 효율적으로 정제할 수 있다. 이 수법은 또한, 전술한 수법과 조합하지 않고 독립하여 이용할 수도 있다.
본 발명의 개변을, 이하의 것, 예를 들어, 제 1 VH(VH1)와 제 1 VL(VL1) 및/또는 제 2 VH(VH2)와 제 2 VL(VL2)의 회합을 촉진하기 위해서, VH1이 제 1 CH1을 통해 Fc 영역에 연결되고, VL1이 제 1 CL에 연결되어 있는, 또한 VH2가 제 2 CL을 통해 다른 Fc 영역에 연결되고, VL2가 제 2 CH1에 연결되어 있는 구조를 갖는 항원 결합 분자 등의, 항원 결합 분자에 대해서 이용할 수 있다(WO 09/80254).
복수의, 예를 들어, 2개 이상의 전술한 공지된 수법을, 본 발명의 항원 결합 분자를 위해서 조합하여 이용할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항원 결합 분자는, 전술한 공지된 수법의 개변이 행해지고 있는 항체에 기초하여 조제되어도 된다.
더하여, 본 발명은, 중쇄와 경쇄 사이의 회합이 조절되어 있는, 항원 결합 분자를 산생하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 산생 방법의 바람직한 태양은, 이하의 공정을 포함하는, 중쇄와 경쇄 사이의 회합이 조절되어 있는 항원 결합 분자를 산생하기 위한 방법이다:
(1) 이하의 (a)∼(c)에 나타나는 아미노산 잔기 세트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개의 아미노산 잔기 세트 또는 2개 이상의 아미노산 잔기 세트가, 서로 정전기적으로 반발하는 아미노산 잔기이도록, CH1 및 CL을 코딩하는 핵산을 개변하는 공정:
(a) EU 넘버링에 따른 175위인, 중쇄 정상 영역(CH1) 중의 아미노산 잔기, 및 Kabat 넘버링에 따른 131위인, 경쇄 정상 영역(CL) 중의 아미노산 잔기,
(b) EU 넘버링에 따른 175위인, CH1 중의 아미노산 잔기, 및 Kabat 넘버링에 따른 160위인, CL 중의 아미노산 잔기,
(c) EU 넘버링에 따른 175위인, CH1 중의 아미노산 잔기, 및 Kabat 넘버링에 따른 131위 및 160위인, CL 중의 아미노산 잔기,
(d) EU 넘버링에 따른 147위 및 175위인, CH1 중의 아미노산 잔기, 및 Kabat 넘버링에 따른 131위 및 160위인, CL 중의 아미노산 잔기,
(2) 개변된 핵산을 숙주 세포 중에 도입하는 공정, 및 해당 핵산이 발현되도록 숙주 세포를 배양하는 공정; 및
(3) 숙주 세포의 세포 배양물로부터 항원 결합 분자를 회수하는 공정.
더하여, 본 발명은, 전술한 공정(1)에 있어서, 서로 전기적으로 반발하는 아미노산 잔기가, 전술한 (X) 및 (Y)의 군의 어느 것에 함유되는 아미노산 잔기 중에서 선택되도록, 핵산을 개변하는 것을 포함하는, 산생 방법에 관한 것이다.
더욱이, 본 발명은, 전술한 공정(1)에 있어서, VH와 VL의 경계면을 형성하는 2개 이상의 아미노산 잔기가, 서로 전기적으로 반발하는 아미노산 잔기이도록, 핵산을 개변하는 것을 포함하는, 산생 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 서로 전기적으로 반발하는 아미노산 잔기는, 예를 들어, 이하의 (a) 및 (b)에 나타나는 아미노산 잔기 세트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 임의의 아미노산 잔기 세트이다:
(a) Kabat 넘버링에 따른 39위의, VH에 함유되는 아미노산 잔기, 및 Kabat 넘버링에 따른 38위의, VL에 함유되는 아미노산 잔기; 또는
(b) Kabat 넘버링에 따른 45위의, VH에 함유되는 아미노산 잔기, 및 Kabat 넘버링에 따른 44위의, VL에 함유되는 아미노산 잔기.
서로 전기적으로 반발하는 전술한 아미노산 잔기는, 바람직하게는, 전술한 (X) 및 (Y)의 어느 하나의 세트에 함유되는 아미노산 잔기로부터 선택된다.
더하여, 본 발명은, 항원 결합 분자의 중쇄와 경쇄의 회합을 조절하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 회합을 조절하기 위한 방법의 바람직한 태양은, 이하의 (a)∼(c)에 나타나는 아미노산 잔기 세트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개의 아미노산 잔기 세트 또는 2개 이상의 아미노산 잔기 세트가, 서로 정전기적으로 반발하는 아미노산 잔기이도록, 핵산을 개변하는 공정을 포함하는, 항원 결합 분자의 중쇄와 경쇄의 회합을 조절하기 위한 방법이다:
(a) EU 넘버링에 따른 175위인, 중쇄 정상 영역(CH1) 중의 아미노산 잔기, 및 EU 넘버링에 따른 131위인, 경쇄 정상 영역(CL) 중의 아미노산 잔기,
(b) EU 넘버링에 따른 175위인, CH1 중의 아미노산 잔기, 및 EU 넘버링에 따른 160위인, CL 중의 아미노산 잔기,
(c) EU 넘버링에 따른 175위인, CH1 중의 아미노산 잔기, 및 EU 넘버링에 따른 131위 및 160위인, CL 중의 아미노산 잔기,
(d) EU 넘버링에 따른 147위 및 175위인, CH1 중의 아미노산 잔기, 및 EU 넘버링에 따른 131위 및 160위인, CL 중의 아미노산 잔기.
더하여, 본 발명은, 전술한 공정(1)에 있어서, 서로 정전기적으로 반발하는 아미노산 잔기가, (X) 또는 (Y)의 어느 것의 전술한 군에 함유되는 아미노산 잔기로부터 선택되도록, 핵산을 개변하는 것을 포함하는, 회합을 조절하기 위한 방법에 관한 것이다.
더욱이, 본 발명은, 전술한 공정(1)에 있어서, VH-VL 경계면을 형성하는 2개 이상의 아미노산 잔기가, 서로 정전기적으로 반발하는 아미노산 잔기이도록, 핵산을 개변하는 것을 포함하는, 회합을 조절하기 위한 방법에 관한 것이다. 여기에서, 서로 정전기적으로 반발하는 아미노산 잔기는, 바람직하게는, 예를 들어, 이하의 (a) 및 (b)에 나타나는 아미노산 잔기 세트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 임의의 하나의 아미노산 잔기 세트이다:
(a) Kabat 넘버링에 따른 39위인, VH 중의 아미노산 잔기, 및 Kabat 넘버링에 따른 38위인, VL 중의 아미노산 잔기,
(b) Kabat 넘버링에 따른 45위인, VH 중의 아미노산 잔기, 및 Kabat 넘버링에 따른 44위인, VL 중의 아미노산 잔기.
본 발명의 회합을 조절하기 위한 방법에 따라, 소망의 이중 특이성 항체를, 이전에 기재된 바와 같이 우선적으로 또한 효율적으로 얻을 수 있다. 즉, 이중 특이성 항체의 형태에 있는 소망의 헤테로머 다량체를, 단량체 혼합물로부터 효율적으로 형성시킬 수 있다.
본 발명의 전술한 방법에 있어서의 어구 「핵산을 개변하는」은, 핵산을, 본 발명의 「개변」에 의해 유도되는 아미노산 잔기에 그들이 대응하도록 개변하는 것을 말한다. 보다 구체적으로는, 이것은, 원래의(개변 전의) 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산을 개변하여, 개변에 의해 유도되어야 할 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산으로 하는 것을 말한다. 보통은, 이것은, 목적하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈이 형성되도록, 원래의 핵산에 대해서 적어도 1개의 뉴클레오티드 삽입, 결실, 또는 치환을 결과로서 가져올 유전자 조작 또는 변이 처리를 행하는 것을 의미한다. 보다 구체적으로는, 원래의 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈을, 개변에 의해 유도되어야 할 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈으로 치환한다. 그와 같은 핵산 개변은, 부위 특이적 변이 도입 및 PCR 변이 도입 등의 공지된 수법을 이용하여, 당업자가 호적하게 행할 수 있다. 더하여, 본 발명은, 본 발명의 항원 결합 분자를 코딩하는 핵산을 제공한다. 더욱이, 핵산을 보유하는 벡터도 또한, 본 발명에 포함된다.
몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인은, 면역글로불린 분자의 중쇄 도메인을 포함하는 폴리펩티드쇄의 페어로 이루어진다. 예를 들어, 면역글로불린 G(IgG) 분자의 Fc 도메인은, 2량체이며, 그 각 서브유닛은, CH2 및 CH3 IgG 중쇄 정상 도메인을 포함한다. Fc 도메인의 2개의 서브유닛은, 서로 안정된 회합이 가능하다. 일 태양에 있어서, 본 명세서에 기재된 다중 특이성 항원 결합 분자는, 1개 이하의 Fc 도메인을 포함한다.
본 명세서에 기재된 일 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자의 Fc 도메인은, IgG Fc 도메인이다. 어느 특정의 태양에 있어서, Fc 도메인은, IgG1 Fc 도메인이다. 다른 태양에 있어서, Fc 도메인은, IgG1 Fc 도메인이다. 추가적인 특정의 태양에 있어서, Fc 도메인은, 인간 IgG1 Fc 영역이다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시는, 천연형 인간 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, 인간 Fcγ 수용체에 대해서 저하된 결합 어피니티를 나타내는 Fc 도메인을 추가로 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자를 제공하고, 해당 Fc 도메인은, 천연형 인간 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, 인간 FcRn에 대해서 보다 강한 FcRn 결합 어피니티를 추가로 나타낸다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시는, 천연형 인간 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, 인간 Fcγ 수용체에 대해서 저하된 결합 어피니티를 나타내는 Fc 도메인을 추가로 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자를 제공하고, 해당 Fc 도메인에 포함되는 제 1 및/또는 Fc 영역 서브유닛은, 428위의 Leu, 434위의 Ala, 438위의 Arg, 및 440위의 Glu를 포함하고, 아미노산 위치는, EU 넘버링에 따라 번호 붙여져 있다.
몇몇 태양에서는, 다중 특이성 항원 결합 분자에 있어서, Fc 도메인은, 천연형 인간 IgG1 Fc 도메인과 비교하여, 인간 FcRn에 대해서 보다 강한 FcRn 결합 어피니티를 추가로 나타낸다.
몇몇 태양에서는, 다중 특이성 항원 결합 분자에 있어서, 제 1 및/또는 Fc 영역 서브유닛은, 428위의 Leu, 434위의 Ala, 438위의 Arg, 및 440위의 Glu를 포함하고, 아미노산 위치는, EU 넘버링에 따라 번호 붙여져 있다.
IgG 타입의 이중 특이성 항체는, 목적하는 2타입의 IgG를 구성하는 L쇄 및 H쇄의 유전자, 즉 합계로 4개의 유전자를 세포 중에 도입하는 것, 및 그들을 공발현시키는 것에 의해 분비된다. 그러나, 이들 방법에 의해 산생될 수 있는 IgG의 H쇄와 L쇄의 조합의 수는, 이론적으로는 10개의 조합이다. 따라서, 10타입의 IgG로부터, 소망의 H쇄와 L쇄의 조합을 포함하는 IgG를 정제하는 것은, 곤란하다. 더욱이, 이론적으로는, 소망의 조합을 갖는 IgG의 분비량은, 현저하게 감소한다고 생각되고, 따라서, 대규모 배양이 필요하여, 생산 비용이 더 증가할 것이다.
따라서, 소망의 조합을 갖는 H쇄 사이 및 L쇄와 H쇄 사이의 회합을 촉진하기 위한 수법을, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자에 적용할 수 있다.
예를 들어, 항체 H쇄의 제 2 정상 영역 또는 제 3 정상 영역(CH2 또는 CH3)의 경계면에 정전 반발을 도입하는 것에 의해 바람직하지 않은 H쇄 회합을 억제하기 위한 수법을, 다중 특이성 항체 회합에 적용할 수 있다(WO2006/106905).
본 발명에 있어서, 개변에 제공되는 아미노산 잔기는, 항체 가변 영역 또는 항체 정상 영역의 전술한 아미노산 잔기로 한정되지 않는다. 당업자는, 시판되고 있는 소프트웨어를 이용한 호몰로지 모델링 등에 의해, 변이체 폴리펩티드 또는 헤테로 다량체에 있어서 경계면을 형성하는 아미노산 잔기를 특정할 수 있고; 그 다음에, 이들 위치의 아미노산 잔기를, 회합을 조절하기 위해서 개변에 제공할 수 있다.
다른 공지된 수법도 또한, 본 발명의 다중 특이성 항체의 회합을 위해서 이용할 수 있다. 항체의 H쇄 Fc 영역의 한쪽 중에 존재하는 아미노산 측쇄를, 보다 큰 측쇄(노브)로 치환하고, 또한 다른 쪽의 H쇄의 대응하는 Fc 영역 중에 존재하는 아미노산 측쇄를, 보다 작은 측쇄(홀)로 치환하여, 홀 내로의 노브의 배치를 가능하게 하는 것에 의해, 상이한 아미노산을 포함하는 Fc 영역 함유 폴리펩티드를, 서로 효율적으로 회합시킬 수 있다. 노브·인투·홀법은, 본 명세서의 다른 개소에서 논의된다.
더하여, 다른 공지된 수법도 또한, 본 발명의 다중 특이성 항체의 형성을 위해서 이용할 수 있다. 항체의 H쇄 CH3의 한쪽의 일부를, 대응하는 IgA 유래의 서열로 변경하는 것, 및 대응하는 IgA 유래의 서열을, 다른 쪽의 H쇄 CH3의 상보적 부분 중에 도입하는 것에 의해 산생되는, 쇄 교환 조작 도메인 CH3을 이용한 CH3의 상보적 회합에 의해, 상이한 서열을 갖는 폴리펩티드의 회합을, 효율적으로 유도할 수 있다(Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010). 이 공지된 수법도 또한, 목적하는 다중 특이성 항체를 효율적으로 형성하기 위해서 이용할 수 있다.
더하여, WO 2011/028952, WO2014/018572, 및 Nat Biotechnol. 2014 Feb; 32(2):191-8에 기재되어 있는 바와 같은, 항체 CH1과 CL의 회합 및 VH와 VL의 회합을 이용한 항체 산생을 위한 기술; WO2008/119353 및 WO2011/131746에 기재되어 있는 바와 같은, 따로따로 조제된 모노클로날 항체를 조합하여 이용하여 이중 특이성 항체를 산생하기 위한 기술(Fab 암(arm) 교환); WO2012/058768 및 WO2013/063702에 기재되어 있는 바와 같은, 항체 중쇄 CH3의 사이의 회합을 조절하기 위한 기술; WO2012/023053에 기재되어 있는 바와 같은, 2타입의 경쇄 및 1타입의 중쇄로 구성되는 이중 특이성 항체를 산생하기 위한 기술; Christoph et al. (Nature Biotechnology Vol. 31, p 753-758 (2013))에 의해 기재되어 있는 바와 같은, 단일의 H쇄 및 단일의 L쇄를 포함하는 항체의 쇄의 한쪽을 개개로 발현하는 2개의 세균 세포주를 이용하여 이중 특이성 항체를 산생하기 위한 기술 등이, 다중 특이성 항체의 형성을 위해서 이용되어도 된다.
혹은, 목적하는 다중 특이성 항체를 효율적으로 형성시킬 수 없는 경우에도, 산생된 항체로부터 목적하는 다중 특이성 항체를 분리하는 것 및 정제하는 것에 의해, 본 발명의 다중 특이성 항체를 얻을 수 있다. 예를 들어, 2타입의 H쇄의 가변 영역 중에 아미노산 치환을 도입하는 것에 의해 등전점의 차이를 주는 것에 의해, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 2타입의 호모머 형태 및 목적하는 헤테로머 항체의 정제를 가능하게 하기 위한 방법이, 보고되어 있다(WO2007114325). 현재까지, 헤테로머 항체를 정제하기 위한 방법으로서 프로틴 A를 이용하여, 프로틴 A에 결합하는 마우스 IgG2a H쇄와 프로틴 A에 결합하지 않는 래트 IgG2b H쇄를 포함하는 헤테로2량체 항체를 정제하는 방법이, 보고되어 있다(WO98050431 및 WO95033844). 더욱이, 헤테로2량체 항체는, IgG-프로틴 A 결합 부위인 EU 넘버링 435위 및 436위의 아미노산 잔기의, 상이한 프로틴 A 어피니티를 일으키는 아미노산인 Tyr, His 등으로의 치환을 포함하는 H쇄를 이용하는 것, 또는 H쇄의 각각과 프로틴 A의 상호작용을 변화시키기 위해서, 참고 실시예 5의 방법에 따라 얻어진 상이한 프로틴 A 어피니티를 갖는 H쇄를 이용하는 것, 및 그 다음에, 프로틴 A 컬럼을 이용하는 것에 의해, 그 자체로 효율적으로 정제할 수 있다.
더욱이, 그 Fc 영역 C말단의 불균일성이 개선되어 있는 Fc 영역을, 본 발명의 Fc 영역으로서 적절히 이용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 본 발명은, EU 넘버링에 의해 지정되는 446위의 글리신 및 447위의 리신을, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4에서 유래하는 Fc 영역을 구성하는 2개의 폴리펩티드의 아미노산 서열로부터 결실시키는 것에 의해 산생되는 Fc 영역을 제공한다.
복수의, 예를 들어 2개 이상의 이들 기술을, 조합하여 이용할 수 있다. 더욱이, 이들 기술을, 회합되어야 할 2개의 H쇄에 적절히 또한 따로따로 적용할 수 있다. 더욱이, 이들 수법을, Fcγ 수용체에 대해서 저하된 결합 활성을 갖는 전술한 Fc 영역과 조합하여 이용할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항원 결합 분자는, 상기의 개변에 제공된 항원 결합 분자에 기초하여, 동일한 아미노산 서열을 갖도록 따로따로 산생된 분자여도 된다.
몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, 이하의 (i)∼(xii)의 아미노산 잔기의 1개 또는 복수를 포함한다:
(i) 중쇄 정상 영역 중의 175위(EU 넘버링)의 글루탐산 또는 리신;
(ii) 중쇄 정상 영역 중의 147위(EU 넘버링)의 글루탐산;
(iii) 경쇄 정상 영역 중의 131위(Kabat 넘버링)의 글루탐산 또는 리신;
(iv) 경쇄 정상 영역 중의 160위(Kabat 넘버링)의 글루탐산 또는 리신;
(v) 중쇄 정상 영역 중의 235위(EU 넘버링)의 아르기닌;
(vi) 중쇄 정상 영역 중의 236위(EU 넘버링)의 아르기닌;
(vii) 중쇄 정상 영역 중의 356위(EU 넘버링)의 리신;
(viii) 중쇄 정상 영역 중의 428위(EU 넘버링)의 류신;
(ix) 중쇄 정상 영역 중의 434위(EU 넘버링)의 알라닌;
(x) 중쇄 정상 영역 중의 438위(EU 넘버링)의 아르기닌;
(xi) 중쇄 정상 영역 중의 439위(EU 넘버링)의 글루탐산;
(xii) 중쇄 정상 영역 중의 440위(EU 넘버링)의 글루탐산.
몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, 이하를 포함하는 이중 특이성 항체이다:
175위(EU 넘버링)의 리신, 235위(EU 넘버링)의 아르기닌, 236위(EU 넘버링)의 아르기닌, 428위(EU 넘버링)의 류신, 434위(EU 넘버링)의 알라닌, 438위(EU 넘버링)의 아르기닌, 439위(EU 넘버링)의 글루탐산, 및 440위(EU 넘버링)의 글루탐산을 포함하는 제 1 중쇄;
131위(Kabat 넘버링)의 글루탐산 및 160위(Kabat 넘버링)의 글루탐산을 포함하는 제 1 경쇄;
147위(EU 넘버링)의 글루탐산, 175위(EU 넘버링)의 글루탐산, 235위(EU 넘버링)의 아르기닌, 236위(EU 넘버링)의 아르기닌, 356위(EU 넘버링)의 리신, 428위(EU 넘버링)의 류신, 434위(EU 넘버링)의 알라닌, 438위(EU 넘버링)의 아르기닌, 및 440위(EU 넘버링)의 글루탐산을 포함하는 제 2 중쇄; 및
131위(Kabat 넘버링)의 리신산 및 160위(Kabat 넘버링)의 리신을 포함하는 제 2 경쇄.
몇몇 태양에서는, 다중 특이성 항원 결합 분자에 있어서:
제 1 중쇄는, 419위(EU 넘버링)의 글루탐산 및 445위(EU 넘버링)의 프롤린, 및 446위 및 447위(EU 넘버링)에서의 아미노산 결실을 추가로 포함하고; 또한
제 2 중쇄는, 196위(EU 넘버링)의 리신, 445위(EU 넘버링)의 프롤린, 및 446위 및 447위(EU 넘버링)에서의 아미노산 결실을 추가로 포함한다.
몇몇 태양에서는, 다중 특이성 항원 결합 분자에 있어서:
제 1 중쇄는, 16위(Kabat 넘버링)의 글리신, 32위(Kabat 넘버링)의 알라닌, 35a위(Kabat 넘버링)의 발린, 50위(Kabat 넘버링)의 알라닌, 61위(Kabat 넘버링)의 리신, 64위(Kabat 넘버링)의 글루탐산, 73위(Kabat 넘버링)의 트레오닌, 95위(Kabat 넘버링)의 글루탐산, 및 102위(Kabat 넘버링)의 발린을 추가로 포함하고;
제 1 경쇄는, 28위(Kabat 넘버링)의 글루탐산, 55위(Kabat 넘버링)의 티로신, 56위(Kabat 넘버링)의 글루탐산 또는 티로신, 92위(Kabat 넘버링)의 글루탐산, 94위(Kabat 넘버링)의 발린, 및 95a위(Kabat 넘버링)의 알라닌을 추가로 포함하고;
제 2 중쇄는, 28위(Kabat 넘버링)의 글루탐산, 30위(Kabat 넘버링)의 알라닌 또는 글루탐산, 31위(Kabat 넘버링)의 글루탐산, 32위(Kabat 넘버링)의 트립토판, 34위(Kabat 넘버링)의 페닐알라닌, 및 35위(Kabat 넘버링)의 메티오닌, 35a위(Kabat 넘버링)의 세린, 50위(Kabat 넘버링)의 세린, 61위(Kabat 넘버링)의 글루탐산 또는 글리신, 64위(Kabat 넘버링)의 글루탐산, 및 65위(Kabat 넘버링)의 글루탐산을 추가로 포함하고; 또한
제 2 경쇄는, 25위(Kabat 넘버링)의 트레오닌, 54위(Kabat 넘버링)의 리신, 56위(Kabat 넘버링)의 글루탐산, 67위(Kabat 넘버링)의 류신, 79위(Kabat 넘버링)의 글루타민, 및 94위(Kabat 넘버링)의 리신을 추가로 포함한다.
라이브러리 유래 항체
본 발명의 항체는, 소망의 1개 또는 복수의 활성을 수반하는 항체에 대해 컴비나토리얼 라이브러리를 스크리닝하는 것에 의해 단리해도 된다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리의 생성이나, 소망의 결합 특징을 구비하는 항체에 대해 그와 같은 라이브러리를 스크리닝하기 위한, 다양한 방법이 당해 기술 분야에 있어서 알려져 있다. 그와 같은 방법은, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)에 있어서 총설되어 있고, 더욱이 예를 들어, McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)에 기재되어 있다.
특정의 파지 디스플레이법에 있어서, VH 및 VL 유전자의 레퍼터리는, 폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR)에 의해 따로따로 클로닝되어, 무작위로 파지 라이브러리 중에서 재결합되고, 당해 파지 라이브러리는, Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)에 기술되어 있는 바와 같이 하여, 항원 결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는, 전형적으로는, 단쇄 Fv(scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서의 어느 것으로, 항체 단편을 제시한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는, 하이브리도마를 구축하는 것을 요하지 않고서, 면역원에 대한 고어피니티 항체를 제공한다. 혹은, Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)에 기재되는 바와 같이, 나이브 레퍼터리를 (예를 들어, 인간으로부터) 클로닝하고, 면역화하지 않고서, 광범위한 비자기 및 자기 항원으로의 항체의 단일의 공급원을 제공할 수도 있다. 마지막으로, 나이브 라이브러리는, Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)에 기재되는 바와 같이, 줄기세포로부터 재조합 전의 V-유전자 세그먼트를 클로닝하고, 초가변 CDR3 영역을 코딩하고 또한 인비트로(in vitro)로 재구성을 달성하기 위한 무작위 서열을 포함하는 PCR 프라이머를 이용하는 것에 의해, 합성적으로 만들 수도 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재한 특허문헌은, 예를 들어: 미국 특허 제5,750,373호, 및, 미국 특허출원공개 제2005/0079574호, 2005/0119455호, 제2005/0266000호, 제2007/0117126호, 제2007/0160598호, 제2007/0237764호, 제2007/0292936호, 및 제2009/0002360호를 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은, 본 명세서에서는 인간 항체 또는 인간 항체 단편이라고 간주한다.
글리코실화 변이체
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체는, 항체가 글리코실화 되는 정도를 증가시키도록 또는 감소시키도록 개변되어 있다. 항체로의 글리코실화 부위의 추가 또는 삭제는, 1개 또는 복수의 글리코실화 부위를 만들어 내도록 또는 제거하도록 아미노산 서열을 개변하는 것에 의해, 간편하게 달성 가능하다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 거기에 부가되는 탄수화물이 개변되어도 된다. 포유동물 세포에 의해 산생되는 천연형 항체는, 전형적으로는, 분기한 2분기의 올리고당을 포함하고, 당해 올리고당은 통상 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-링키지에 의해 부가되어 있다. 예를 들어, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997) 참조. 올리고당은, 예를 들어, 만노스, N-아세틸글루코사민(GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산 등의 여러 가지 탄수화물, 또한, 2분기의 올리고당 구조의 「줄기」 중의 GlcNAc에 부가된 푸코스를 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항체 중의 올리고당의 수식은, 특정의 개선된 특성을 수반하는 항체 변이체를 만들어 내기 위해서 행해져도 된다.
일 태양에 있어서, Fc 영역에 (직접적 또는 간접적으로) 부가된 푸코스를 결여하는 탄수화물 구조체를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 그와 같은 항체에 있어서의 푸코스의 양은, 1%∼80%, 1%∼65%, 5%∼65% 또는 20%∼40%일 수 있다. 푸코스의 양은, 예를 들어 WO2008/077546에 기재되는 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분석에 의해 측정되는, Asn297에 부가된 모든 당 구조체(예를 들어, 복합, 하이브리드, 및 고(高)만노스 구조체)의 합에 대한, Asn297에 있어서의 당쇄 내의 푸코스의 평균량을 계산하는 것에 의해 결정된다. Asn297은, Fc 영역의 297위의 근처에 위치하는 아스파라긴 잔기를 나타낸다(Fc 영역 잔기의 EU 넘버링). 그러나, 복수의 항체 사이의 근소한 서열의 다양성에 기인하여, Asn297은, 297위의 ±3아미노산 상류 또는 하류, 즉 294위∼300위 사이 근처에 위치하는 경우도 있을 수 있다. 그와 같은 푸코실화 변이체는, 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허출원공개 제2003/0157108호(Presta, L.); 제2004/0093621호(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)를 참조. 「탈푸코실화」 또는 「푸코스 결손」 항체 변이체에 관한 간행물의 예는, US2003/0157108; WO2000/61739; WO2001/29246; US2003/0115614; US2002/0164328; US2004/0093621; US2004/0132140; US2004/0110704; US2004/0110282; US2004/0109865; WO2003/085119; WO2003/084570; WO2005/035586; WO2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)를 포함한다. 탈푸코실화 항체를 산생할 수 있는 세포주의 예는, 단백질의 푸코실화를 결여하는 Lec13 CHO 세포(Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 미국 특허출원공개 제US2003/0157108호 A1, Presta, L; 및 WO2004/056312 A1, Adams et al., 특히 실시예 11) 및 녹아웃 세포주, 예를 들어 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자 FUT8 녹아웃 CHO 세포(예를 들어, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 및 WO2003/085107을 참조)를 포함한다.
예를 들어 항체의 Fc 영역에 부가된 2분지형 올리고당이 GlcNAc에 의해 2분되어 있는, 2분된 올리고당을 갖는 항체 변이체가 추가로 제공된다. 그와 같은 항체 변이체는, 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 그와 같은 항체 변이체의 예는, 예를 들어, WO2003/011878(Jean-Mairet et al.); 미국 특허 제6,602,684호(Umana et al.); 및 US2005/0123546(Umana et al.)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부가된 올리고당 중에 적어도 1개의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체도 제공된다. 그와 같은 항체 변이체는, 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 그와 같은 항체 변이체는, 예를 들어, WO1997/30087(Patel et al.); WO1998/58964(Raju, S.); 및 WO1999/22764(Raju, S.)에 기재되어 있다.
바람직한 태양에 있어서, 전술한 항체는, 다이설파이드 결합에 의해 가교 된, 그들의 제 1 H쇄 CH3 영역 및 제 2 H쇄 CH3 영역을 가질 수 있다.
본 명세서에 기재되는 바와 같이 조제된 다중 특이성 항원 결합 분자는, 고속 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 어피니티 크로마토그래피, 사이즈 배제 크로마토그래피 등과 같은 당 기술 분야에서 공지된 수법에 의해 정제되어도 된다. 특정의 단백질을 정제하기 위해서 이용되는 실제의 조건은, 알짜 전하, 소수성, 친수성 등의 인자에 일부 의존한다고 생각되고, 당업자에게 분명할 것이다. 어피니티 크로마토그래피 정제를 위해서는, 다중 특이성 항원 결합 분자가 결합하는 항체, 리간드, 수용체, 또는 항원을 이용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자의 어피니티 크로마토그래피 정제를 위해서는, 프로틴 A 또는 프로틴 G를 갖는 매트릭스가 이용되어도 된다. 연속한 프로틴 A 또는 G 어피니티 크로마토그래피 및 사이즈 배제 크로마토그래피를, 다중 특이성 항원 결합 분자를 단리하기 위해서 이용할 수 있다. 다중 특이성 항원 결합 분자의 순도는, 겔 전기영동, 고압 액체 크로마토그래피 등을 포함하는 다양한 주지된 분석법의 어느 것에 의해 결정할 수 있다.
시스테인 개변 항체 변이체
특정의 태양에 있어서, 항체의 1개 또는 복수의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된, 시스테인 개변 항체(예를 들어, 「thioMAbs」)를 만들어 내는 것이 바람직할 것이다. 특정의 태양에 있어서, 치환을 받는 잔기는, 항체의, 액세스 가능한 부위에 생긴다. 그들 잔기를 시스테인으로 치환하는 것에 의해, 반응성의 싸이올기가 항체의 액세스 가능한 부위에 배치되고, 당해 반응성의 싸이올기는, 당해 항체를 다른 부분(약제 부분 또는 링커-약제 부분 등)에 컨주게이트하여 본 명세서에서 더 상술하는 바와 같이 이뮤노컨주게이트를 만들어 내는 데 사용되어도 된다. 특정의 태양에 있어서, 이하의 잔기의 임의의 1개 또는 복수가, 시스테인으로 치환되어도 된다: 경쇄의 V205(Kabat 넘버링); 중쇄의 A118(EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 넘버링). 시스테인 개변 항체는, 예를 들어, 미국 특허 제7,521,541호에 기재되는 바와 같이 하여 생성되어도 된다.
항체 유도체
특정의 태양에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 항체는, 당해 기술 분야에 있어서 알려져 있고 또한 용이하게 입수 가능한 추가의 비단백질 부분을 포함하도록, 추가로 수식되어도 된다. 항체의 유도체화에 적합한 부분은, 이것으로 한정되는 것은 아니지만, 수용성 폴리머를 포함한다. 수용성 폴리머의 비한정적인 예는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 에틸렌 글라이콜/프로필렌 글라이콜의 코폴리머, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리바이닐알코올, 폴리바이닐피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔레인, 폴리-1,3,6-트라이옥세인, 에틸렌/무수 말레산 코폴리머, 폴리아미노산(호모폴리머 또는 랜덤 코폴리머의 어느 것도), 및, 덱스트란 또는 폴리(n-바이닐피롤리돈) 폴리에틸렌 글라이콜, 폴리프로필렌 글라이콜 호모폴리머, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 코폴리머, 폴리옥시에틸화 폴리올류(예를 들어 글리세롤), 폴리바이닐알코올, 및, 이들의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글라이콜 프로피온알데하이드는, 그 물에 대한 안정성 때문에, 제조에 있어서 유리할 것이다. 폴리머는, 어떠한 분자량이어도 되고, 분기하고 있어도 분기하고 있지 않아도 된다. 항체에 부가되는 폴리머의 수에는 폭이 있어도 되고, 2개 이상의 폴리머가 부가된다면 그들은 동일한 분자여도 되고, 상이한 분자여도 된다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 폴리머의 수 및/또는 타입은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 개선되어야 할 항체의 특정의 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정의 조건하에서의 요법에 사용되는지 여부 등에 대한 고려에 기초하여 결정할 수 있다.
다른 태양에 있어서, 항체와, 방사선에 폭로하는 것에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질 부분의 컨주게이트가 제공된다. 일 태양에 있어서, 비단백질 부분은, 카본 나노튜브이다(Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). 방사선은 어떠한 파장이어도 되고, 또한 이들로 한정되는 것은 아니지만, 통상의 세포에는 해를 주지 않지만 항체-비단백질 부분에 근접한 세포를 사멸시키는 온도까지 비단백질 부분을 가열하는 파장을 포함한다.
재조합의 방법 및 구성
예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호에 기재되는 바와 같이, 항체는 재조합의 방법이나 구성을 이용하여 제조할 수 있다. 일 태양에 있어서, 본 명세서에 기재된 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)를 코딩하는, 단리된 핵산이 제공된다. 그와 같은 핵산은, 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열(예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩해도 된다. 추가적인 태양에 있어서, 이와 같은 핵산을 포함하는 1개 또는 복수의 벡터(예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가적인 태양에 있어서, 이와 같은 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이와 같은 태양의 하나에서는, 숙주 세포는, (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는, (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터와 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터를 포함한다(예를 들어, 형질 전환되어 있다). 일 태양에 있어서, 숙주 세포는, 진핵성이다(예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포) 또는 림프계의 세포(예를 들어, Y0, NS0, Sp2/0 세포)). 일 태양에 있어서, 항HLA-DQ2.5 항체의 발현에 적합한 조건하에서, 전술한 바와 같이 당해 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 것, 및 임의로, 당해 항체를 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 회수하는 것을 포함하는, 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)를 제작하는 방법이 제공된다.
항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)의 재조합 제조를 위해서, (예를 들어, 전술한 것 등의) 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가적인 클로닝 및/또는 숙주 세포 중에서의 발현을 위해서, 1개 또는 복수의 벡터에 삽입한다. 그와 같은 핵산은, 종래의 수순을 이용하여 용이하게 단리 및 서열 결정될 것이다(예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써).
항체를 코딩하는 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는, 본 명세서에 기재된 원핵세포 또는 진핵세포를 포함한다. 예를 들어, 항체는, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요해지지 않는 경우는, 세균으로 제조해도 된다. 세균에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 관해서, 예를 들어, 미국 특허 제5,648,237호, 제5,789,199호, 및 제5,840,523호를 참조할 것. (더하여, 대장균에 있어서의 항체 단편의 발현에 대해 기재한 Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254도 참조할 것.) 발현 후, 항체는 세균 세포 페이스트로부터 가용성 획분 중에 단리되어도 되고, 또한 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물에 더하여, 부분적인 또는 완전한 인간의 글리코실화 패턴을 수반하는 항체의 산생을 가져오는, 글리코실화 경로가 「인간화」되어 있는 균류 및 효모의 주를 포함하는, 사상균 또는 효모 등의 진핵성의 미생물은, 항체 코드 벡터의 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004) 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)를 참조할 것.
다세포 생물(무척추 생물 및 척추 생물)에서 유래하는 것도 또한, 글리코실화된 항체의 발현을 위해서 적합한 숙주 세포이다. 무척추 생물 세포의 예는, 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 곤충 세포와의 접합, 특히 Spodoptera frugiperda 세포의 형질 전환에 이용되는, 수많은 바큘로바이러스주가 동정되어 있다.
식물 세포 배양물도, 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,959,177호, 제6,040,498호, 제6,420,548호, 제7,125,978호, 및 제6,417,429호(트랜스제닉 식물로 항체를 산생하기 위한, PLANTIBODIES(상표) 기술을 기재)를 참조.
척추 동물 세포도 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 부유 상태에서 증식하도록 적응된 포유동물 세포주는, 유용할 것이다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는, SV40으로 형질 전환된 원숭이 신장 CV1주(COS-7); 인간 태아성 신주(Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977) 등에 기재된 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980) 등에 기재된 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색개구리 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁 경부암 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK); Buffalo계 래트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유방암(MMT 060562); TRI 세포(예를 들어, Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)에 기재); MRC5 세포; 및, FS4 세포 등이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는, DHFR-CHO 세포(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 Y0, NS0, 및 Sp2/0 등의 골수종 세포주를 포함한다. 항체 산생에 호적한 특정의 포유동물 숙주 세포주의 총설로서, 예를 들어, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)을 참조할 것.
측정법(어세이)
본 명세서에서 제공되는 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)는, 당해 기술 분야에 있어서 알려져 있는 여러 가지 측정법에 의해, 동정되거나, 스크리닝되거나, 또는 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 특징 결정되어도 된다.
결합 측정법 및 그 외의 측정법
일 국면에 있어서, 본 발명의 항체는, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯 등의 공지된 방법에 의해, 그 항원 결합 활성에 관해서 시험된다.
다른 국면에 있어서, HLA-DQ2.5(또는 HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드 복합체)로의 결합에 관해서, 예를 들어, 전술한 항체의 어느 것과 경합하는 항체를 동정하기 위해서, 경합 어세이가 사용될 수 있다. 특정의 태양에 있어서, 그와 같은 경합 항체는, 전술한 항체가 결합하는 것과 동일한 에피토프(예를 들어, 선상 또는 입체 구조 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 매핑하는, 상세한 예시적 방법은, Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)에 제공되어 있다.
예시적인 경합 어세이에 있어서, 고정화된 HLA-DQ2.5(또는 HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드 복합체)는, HLA-DQ2.5(또는 HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드 복합체)에 결합하는 제 1 표지된 항체 및 HLA-DQ2.5(또는 HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드 복합체)로의 결합에 관해서 제 1 항체와 경합하는 능력에 관해서 시험되는 제 2 미표지의 항체를 포함하는 용액 중에서 인큐베이트된다. 제 2 항체는, 하이브리도마 상청에 존재할 수 있다. 대조로서, 고정화된 HLA-DQ2.5(또는 HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드 복합체)가, 제 1 표지된 항체를 포함하지만 제 2 미표지의 항체를 포함하지 않는 용액 중에서 인큐베이트된다. 제 1 항체의 HLA-DQ2.5(또는 HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드 복합체)에 대한 결합을 허용하는 조건하에서의 인큐베이션 후, 여분의 미결합의 항체가 제거되고, 고정화된 HLA-DQ2.5(또는 HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드 복합체)에 결합한 표지의 양이 측정된다. 고정화된 HLA-DQ2.5(또는 HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드 복합체)에 결합한 표지의 양이 대조 샘플과 비교하여 시험 샘플에 있어서 실질적으로 감소하고 있는 경우, 그것은 제 2 항체가 HLA-DQ2.5(또는 HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드 복합체)로의 결합에 관해서 제 1 항체와 경합하고 있음을 나타낸다. Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)를 참조할 것.
동물, 예를 들어, 토끼, 마우스, 래트, 및 면역화에 적절한 그 외의 동물은, 항원(예를 들어, HLA-DQ2.5 또는 HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드 복합체)에 의해 면역화 된다. 해당 항원은, 예를 들어 본 명세서에서 기술되는 바와 같이, 임의의 방법을 이용하여 재조합 단백질로서 조제할 수 있다. 면역화한 동물로부터 혈액 및 비장 등의 항체 함유 샘플을 채취한다. B 세포의 선별을 위해서, 예를 들어, 비오틴화 항원을 조제하고, 해당 비오틴화 항원에 항원 결합성 B 세포를 결합시키고, 그리고 선별을 위해서 해당 세포를 셀 소팅 및 배양에 제공한다. 해당 세포의 해당 항원으로의 특이적 결합은, ELISA법 등의 임의의 적절한 방법에 의해 평가할 수 있다. 이 방법은 또한, 목적이 아닌 항원에 대한 교차 반응성의 결여를 평가하기 위해서도 사용할 수 있다. 선택된 항체를 단리하기 위해서 또는 그 서열을 결정하기 위해서, 예를 들어, 세포로부터 RNA를 정제하고, 항체의 영역을 코딩하는 DNA를 RNA의 역전사 및 PCR 증폭에 의해 조제한다. 더욱이, 추가적인 분석을 위해서, 클로닝된 항체 유전자를 적절한 세포에 있어서 발현시키고, 해당 항체를 배양 상청으로부터 정제할 수 있다.
항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)가 목적하는 항원(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것 등의 HLA-DQ2.5와 글루텐 펩티드에 의해 형성된 복합체)에 결합하는지 여부를 시험하기 위해서, 결합을 평가하기 위한 임의의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, FACS에 기초하는 셀 소팅 방법을 사용하는 경우에는, 항원을 발현하는 세포를 시험 항체와 인큐베이트하고, 다음에 시험 항체(즉, 1차 항체)에 대한 적절한 2차 항체를 첨가하여 인큐베이트한다. 항원과 시험 항체 사이의 결합은, 예를 들어 2차 항체에 부착시킨 발색/형광 표지를 사용하여, FACS 분석에 의해 검출된다(예를 들어, 본 명세서에서 기재되는 바와 같이). 혹은, 본 명세서 중의 「항체의 어피니티」에서 기술된 측정 방법의 어느 것을 이용할 수 있다. 예를 들어, BIACORE 표면 플라즈몬 공명 어세이에 의한 Kd의 측정은, 시험 항체와 본 명세서에서 기술되는 목적하는 항원 사이의 결합을 평가하기 위해서 사용할 수 있다.
특정의 태양에 있어서, 본 발명의 방법은, 항체가 HLA-DQ2.5(또는 HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드 복합체)와 TCR 사이의 결합(또는 HLA-DQ2.5(또는 HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드 복합체)와 HLA-DQ2.5 구속성 CD4+ T 세포 사이의 상호작용)에 대해서 중화 활성을 갖는지 여부를 시험하는 공정; 및 해당 중화 활성을 갖는 항체를 선택하는 공정을 추가로 포함한다. 특정의 태양에 있어서, 본 발명의 방법은, 항체가 HLA-DQ2.2(또는 HLA-DQ2.2/글루텐 펩티드 복합체)와 TCR 사이의 결합(또는 HLA-DQ2.2(또는 HLA-DQ2.2/글루텐 펩티드 복합체)와 HLA-DQ2.2 구속성 CD4+ T 세포 사이의 상호작용)에 대해서 중화 활성을 갖는지 여부를 시험하는 공정; 및 해당 중화 활성을 갖는 항체를 선택하는 공정을 추가로 포함한다. 이들 공정은, 본 명세서에 기재된 것 등의 글루텐 펩티드의 존재하에서, 즉 해당 펩티드에 결합한 HLA-DQ2.5 또는 HLA-DQ2.2를 사용하여, 실시할 수 있다. 중화 활성은, 예를 들어 본 명세서에서 기술되는 바와 같이, 평가할 수 있다. 간단히 설명하면, 플레이트 상으로의 고정화를 위해, 비즈, 예를 들어 스트렙트아비딘으로 코팅된 황색 입자를 적절히 조제하고, 펩티드에 결합한 가용성 HLA-DQ를 해당 비즈에 첨가한다. 해당 플레이트를 세정하여 블록하고, 거기에 항체를 첨가하여 인큐베이트한다. HLA-DQ2.5(또는 HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드 복합체)와 TCR 사이의 결합을 평가하는 경우에는, 예를 들어, D2 TCR 4량체-PE를 첨가하여 인큐베이트할 수 있다. 이 2개 사이의 결합은, HLA-DQ2.5(또는 HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드 복합체)에 결합된 TCR의 발색/형광 표지에 기초하여 평가될 수 있다.
몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드 복합체와 HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드 구속성 CD4+ T 세포 사이의 상호작용을 블록한다. 몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, HLA-DQ2.2/글루텐 펩티드 복합체와 HLA-DQ2.2/글루텐 펩티드 구속성 CD4+ T 세포 사이의 상호작용을 블록한다. 이 문맥에 있어서, 글루텐 펩티드는, 상기의 항원 결합 분자/도메인의 어느 것이 결합하는 복합체 중의 펩티드이다.
몇몇 태양에 있어서, 글루텐 펩티드가, α1 글리아딘 펩티드, α1b 글리아딘 펩티드, α2 글리아딘 펩티드, ω1 글리아딘 펩티드, ω2 글리아딘 펩티드, γ1 글리아딘 펩티드, γ2 글리아딘 펩티드, γ3 글리아딘 펩티드, γ4a 글리아딘 펩티드, γ4d 글리아딘 펩티드, 및 BC 호르데인 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, HLA-DP, HLA-DR, HLA-DQ5.1, HLA-DQ6.3, HLA-DQ7.3, HLA-DQ7.5, 및 HLA-DQ8에 대해서 결합 활성을 실질적으로 갖지 않는다.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자는, HLA-DQ2.5와 글루텐 펩티드에 의해 형성된 복합체에 대해서 증강된 결합 활성을 갖는다. 이 문맥에 있어서, 글루텐 펩티드는, 상기의 글루텐 펩티드의 어느 것일 수 있다. 증강의 정도는, HLA-DQ2.5와 무관계한 펩티드에 의해 형성된 복합체에 대한, 또는 목적하는 복합체를 갖지 않는 세포, 예를 들어, HLA-DQ2.5 양성 PBMC B 세포 및/또는 HLA-DQ2.5 혹은 HLA-DQ2.2를 발현하는 Ba/F3 세포에 대한 결합 활성과 비교하여 결정되어도 된다.
본 발명의 이중 특이성 항체는, 제 1 암/반항체(half-antibody)의 중쇄 및 경쇄, 및 제 2 암/반항체의 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 용어 「암」 또는 「반항체」는, 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 포함하는 항체의 일부분을 말한다. 몇몇 태양에 있어서, 이중 특이성 항체는, 제 1 암/반항체의 VH(중쇄 가변 영역) 및 VL(경쇄 가변 영역), 및 제 2 암/반항체의 VH 및 VL을 포함한다. 몇몇 태양에 있어서, 이중 특이성 항체는, 제 1 암/반항체의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3, 및 제 2 암/반항체의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 이중 특이성 항체에 대해, 제 1 암/반항체는, 본 명세서에 기재된 DQN0344xx(DQN0344Hx/DQN0344Lx)에서 유래하고, 제 2 암/반항체는, 본 명세서에 기재된 DQN0385ee(DQN0385He/DQN0385Le)에서 유래한다. 본 발명의 이중 특이성 항체의 VH, VL, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3, 대열 전장 중(H)쇄 및 경(L)쇄의 서열 ID 번호(서열 번호)를, 표 2-3∼2-6(하기)에 나타낸다.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항체는, 서열 번호: 129 또는 164의 서열을 포함하는 HCDR1; 서열 번호: 130 또는 165의 서열을 포함하는 HCDR2; 및 서열 번호: 131 또는 166의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항체는, 서열 번호: 132 또는 167의 서열을 포함하는 LCDR1; 서열 번호: 133 또는 168의 서열을 포함하는 LCDR2; 및 서열 번호: 134 또는 169의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항체는, 서열 번호: 88 또는 89의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항체는, 서열 번호: 105 또는 162의 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역을 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항체는, 서열 번호: 90 또는 91의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항체는, 서열 번호: 106의 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역을 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항체는, 서열 번호: 41, 42, 44, 또는 45의 서열을 포함하는 (전장) 중쇄를 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항체는, 서열 번호: 43 또는 46의 서열을 포함하는 (전장) 경쇄를 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항체는, 서열 번호: 135, 144, 147, 153, 156, 또는 159의 서열을 포함하는 HCDR1; 서열 번호: 136, 145, 148, 154, 157, 또는 160의 서열을 포함하는 HCDR2; 및 서열 번호: 137, 146, 149, 155, 158, 또는 161의 서열을 포함하는 HCDR3을 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항체는, 서열 번호: 138, 141, 또는 150의 서열을 포함하는 LCDR1; 서열 번호: 139, 142, 또는 151의 서열을 포함하는 LCDR2; 및 서열 번호: 140, 143, 또는 152의 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항체는, 서열 번호: 92, 93, 94, 95, 96, 또는 97의 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항체는, 서열 번호: 104 또는 163의 서열을 포함하는 중쇄 정상 영역을 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항체는, 서열 번호: 98, 99, 또는 100의 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항체는, 서열 번호: 107의 서열을 포함하는 경쇄 정상 영역을 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항체는, 서열 번호: 53, 54, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 또는 67의 서열을 포함하는 (전장) 중쇄를 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항체는, 서열 번호: 55, 56, 또는 61의 서열을 포함하는 (전장) 경쇄를 포함한다.
(본 발명의 이중 특이성 항체에 포함되는) 암/반항체의 전장 H쇄 및 L쇄의 구체적 서열을, 표 1-2에 나타낸다.
(표 1-2)
Figure 112022135454077-pct00002
Figure 112022135454077-pct00003
Figure 112022135454077-pct00004
Figure 112022135454077-pct00005
Figure 112022135454077-pct00006
몇몇 태양에 있어서, 본 개시는, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분을 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자로서,
제 1 항원 결합 부분이, 이하의 (a1)∼(a3) 중 어느 하나를 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자를 제공한다:
(a1) 서열 번호: 129의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 130의 CDR 2, 서열 번호: 131의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 132의 CDR 1, 서열 번호: 133의 CDR 2, 서열 번호: 134의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역;
(a2) 서열 번호: 164의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 165의 CDR 2, 서열 번호: 166의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 167의 CDR 1, 서열 번호: 168의 CDR 2, 서열 번호: 169의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 및
(a3) (a1) 또는 (a2)에 기술되는 제 1 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 1 아미노산 서열, 및 (a1) 또는 (a2)에 기술되는 제 2 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 2 아미노산 서열.
몇몇 태양에 있어서, 제 2 항원 결합 부분을 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자에 있어서, 제 2 항원 결합 부분이, 이하의 (b1)∼(b8) 중 어느 하나를 포함한다:
(b1) 서열 번호: 135의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 136의 CDR 2, 서열 번호: 137의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 138의 CDR 1, 서열 번호: 139의 CDR 2, 서열 번호: 140의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(b2) 서열 번호: 135의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 136의 CDR 2, 서열 번호: 137의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 141의 CDR 1, 서열 번호: 142의 CDR 2, 서열 번호: 143의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(b3) 서열 번호: 144의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 145의 CDR 2, 서열 번호: 146의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 141의 CDR 1, 서열 번호: 142의 CDR 2, 서열 번호: 143의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(b4) 서열 번호: 147의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 148의 CDR 2, 서열 번호: 149의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 150의 CDR 1, 서열 번호: 151의 CDR 2, 서열 번호: 152의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(b5) 서열 번호: 153의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 154의 CDR 2, 서열 번호: 155의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 150의 CDR 1, 서열 번호: 151의 CDR 2, 서열 번호: 152의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(b6) 서열 번호: 156의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 157의 CDR 2, 서열 번호: 158의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 150의 CDR 1, 서열 번호: 151의 CDR 2, 서열 번호: 152의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(b7) 서열 번호: 159의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 160의 CDR 2, 서열 번호: 161의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 141의 CDR 1, 서열 번호: 142의 CDR 2, 서열 번호: 143의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역; 및
(b8) (b1)∼(b7) 중 어느 하나에 기술되는 제 3 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 3 아미노산 서열, 및 (b1)∼(b7) 중 어느 하나에 기술되는 제 4 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 4 아미노산 서열.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시는, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분을 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자로서,
제 1 항원 결합 부분이, 이하의 (c1)∼(c3):
(c1) 서열 번호: 129의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 130의 CDR 2, 서열 번호: 131의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 132의 CDR 1, 서열 번호: 133의 CDR 2, 서열 번호: 134의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역;
(c2) 서열 번호: 164의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 165의 CDR 2, 서열 번호: 166의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 167의 CDR 1, 서열 번호: 168의 CDR 2, 서열 번호: 169의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 및
(c3) (c1) 또는 (c2)에 기술되는 제 1 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 1 아미노산 서열, 및 (c1) 또는 (c2)에 기술되는 제 2 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 2 아미노산 서열
중 어느 하나를 포함하고,
제 2 항원 결합 부분이, 이하의 (d1)∼(d8):
(d1) 서열 번호: 135의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 136의 CDR 2, 서열 번호: 137의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 138의 CDR 1, 서열 번호: 139의 CDR 2, 서열 번호: 140의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(d2) 서열 번호: 135의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 136의 CDR 2, 서열 번호: 137의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 141의 CDR 1, 서열 번호: 142의 CDR 2, 서열 번호: 143의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(d3) 서열 번호: 144의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 145의 CDR 2, 서열 번호: 146의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 141의 CDR 1, 서열 번호: 142의 CDR 2, 서열 번호: 143의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(d4) 서열 번호: 147의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 148의 CDR 2, 서열 번호: 149의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 150의 CDR 1, 서열 번호: 151의 CDR 2, 서열 번호: 152의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(d5) 서열 번호: 153의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 154의 CDR 2, 서열 번호: 155의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 150의 CDR 1, 서열 번호: 151의 CDR 2, 서열 번호: 152의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(d6) 서열 번호: 156의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 157의 CDR 2, 서열 번호: 158의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 150의 CDR 1, 서열 번호: 151의 CDR 2, 서열 번호: 152의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(d7) 서열 번호: 159의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 160의 CDR 2, 서열 번호: 161의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 141의 CDR 1, 서열 번호: 142의 CDR 2, 서열 번호: 143의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역; 및
(d8) (d1)∼(d7) 중 어느 하나에 기술되는 제 3 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 3 아미노산 서열, 및 (d1)∼(d7) 중 어느 하나에 기술되는 제 4 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 4 아미노산 서열
중 어느 하나를 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자를 제공한다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시는, 제 1 및 제 2 항체 가변 영역을 포함하는 제 1 항원 결합 부분 및 제 3 및 제 4 항체 가변 영역을 포함하는 제 2 항원 결합 부분을 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자로서, 이하의 (1)∼(15) 중 어느 하나를 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자를 제공한다:
(1) 서열 번호: 129의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 130의 CDR 2, 서열 번호: 131의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 132의 CDR 1, 서열 번호: 133의 CDR 2, 서열 번호: 134의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 135의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 136의 CDR 2, 서열 번호: 137의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 138의 CDR 1, 서열 번호: 139의 CDR 2, 서열 번호: 140의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(2) 서열 번호: 129의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 130의 CDR 2, 서열 번호: 131의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 132의 CDR 1, 서열 번호: 133의 CDR 2, 서열 번호: 134의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 135의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 136의 CDR 2, 서열 번호: 137의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 141의 CDR 1, 서열 번호: 142의 CDR 2, 서열 번호: 143의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(3) 서열 번호: 129의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 130의 CDR 2, 서열 번호: 131의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 132의 CDR 1, 서열 번호: 133의 CDR 2, 서열 번호: 134의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 144의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 145의 CDR 2, 서열 번호: 146의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 141의 CDR 1, 서열 번호: 142의 CDR 2, 서열 번호: 143의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(4) 서열 번호: 129의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 130의 CDR 2, 서열 번호: 131의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 132의 CDR 1, 서열 번호: 133의 CDR 2, 서열 번호: 134의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 147의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 148의 CDR 2, 서열 번호: 149의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 150의 CDR 1, 서열 번호: 151의 CDR 2, 서열 번호: 152의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(5) 서열 번호: 129의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 130의 CDR 2, 서열 번호: 131의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 132의 CDR 1, 서열 번호: 133의 CDR 2, 서열 번호: 134의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 153의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 154의 CDR 2, 서열 번호: 155의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 150의 CDR 1, 서열 번호: 151의 CDR 2, 서열 번호: 152의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(6) 서열 번호: 129의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 130의 CDR 2, 서열 번호: 131의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 132의 CDR 1, 서열 번호: 133의 CDR 2, 서열 번호: 134의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 156의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 157의 CDR 2, 서열 번호: 158의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 150의 CDR 1, 서열 번호: 151의 CDR 2, 서열 번호: 152의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(7) 서열 번호: 129의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 130의 CDR 2, 서열 번호: 131의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 132의 CDR 1, 서열 번호: 133의 CDR 2, 서열 번호: 134의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 159의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 160의 CDR 2, 서열 번호: 161의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 141의 CDR 1, 서열 번호: 142의 CDR 2, 서열 번호: 143의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역; 및
(8) 서열 번호: 164의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 165의 CDR 2, 서열 번호: 166의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 167의 CDR 1, 서열 번호: 168의 CDR 2, 서열 번호: 169의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 135의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 136의 CDR 2, 서열 번호: 137의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 138의 CDR 1, 서열 번호: 139의 CDR 2, 서열 번호: 140의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(9) 서열 번호: 164의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 165의 CDR 2, 서열 번호: 166의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 167의 CDR 1, 서열 번호: 168의 CDR 2, 서열 번호: 169의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 135의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 136의 CDR 2, 서열 번호: 137의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 141의 CDR 1, 서열 번호: 142의 CDR 2, 서열 번호: 143의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(10) 서열 번호: 164의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 165의 CDR 2, 서열 번호: 166의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 167의 CDR 1, 서열 번호: 168의 CDR 2, 서열 번호: 169의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 144의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 145의 CDR 2, 서열 번호: 146의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 141의 CDR 1, 서열 번호: 142의 CDR 2, 서열 번호: 143의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(11) 서열 번호: 164의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 165의 CDR 2, 서열 번호: 166의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 167의 CDR 1, 서열 번호: 168의 CDR 2, 서열 번호: 169의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 147의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 148의 CDR 2, 서열 번호: 149의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 150의 CDR 1, 서열 번호: 151의 CDR 2, 서열 번호: 152의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(12) 서열 번호: 164의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 165의 CDR 2, 서열 번호: 166의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 167의 CDR 1, 서열 번호: 168의 CDR 2, 서열 번호: 169의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 153의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 154의 CDR 2, 서열 번호: 155의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 150의 CDR 1, 서열 번호: 151의 CDR 2, 서열 번호: 152의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(13) 서열 번호: 164의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 165의 CDR 2, 서열 번호: 166의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 167의 CDR 1, 서열 번호: 168의 CDR 2, 서열 번호: 169의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 156의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 157의 CDR 2, 서열 번호: 158의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 150의 CDR 1, 서열 번호: 151의 CDR 2, 서열 번호: 152의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(14) 서열 번호: 164의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 165의 CDR 2, 서열 번호: 166의 CDR 3을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 167의 CDR 1, 서열 번호: 168의 CDR 2, 서열 번호: 169의 CDR 3을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 159의 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열 번호: 160의 CDR 2, 서열 번호: 161의 CDR 3을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 141의 CDR 1, 서열 번호: 142의 CDR 2, 서열 번호: 143의 CDR 3을 포함하는 제 4 항체 가변 영역; 및
(15) (1)∼(14) 중 어느 하나에 기술되는 제 1 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 1 아미노산 서열, (1)∼(14) 중 어느 하나에 기술되는 제 2 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 2 아미노산 서열, (1)∼(14) 중 어느 하나에 기술되는 제 3 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 3 아미노산 서열, 및 (1)∼(14) 중 어느 하나에 기술되는 제 4 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 4 아미노산 서열.
몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자에 있어서, 제 1 항원 결합 부분 및/또는 제 2 항원 결합 부분에 포함되는 항체 가변 영역이, 인간 항체 프레임워크 또는 인간화 항체 프레임워크를 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시는, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분을 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자로서,
제 1 항원 결합 부분이, 이하의 (e1)∼(e3) 중 어느 하나를 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자를 제공한다:
(e1) 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역;
(e2) 서열 번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 및
(e3) (e1) 또는 (e2)에 기술되는 제 1 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 1 아미노산 서열, 및 (e1) 또는 (e2)에 기술되는 제 2 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 2 아미노산 서열.
몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자에 있어서, 제 2 항원 결합 부분이, 이하의 (f1)∼(f8) 중 어느 하나를 포함한다:
(f1) 서열 번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 98의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(f2) 서열 번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(f3) 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(f4) 서열 번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(f5) 서열 번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(f6) 서열 번호: 96의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(f7) 서열 번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역; 및
(f8) (f1)∼(f7) 중 어느 하나에 기술되는 제 3 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 3 아미노산 서열, 및 (f1)∼(f7) 중 어느 하나에 기술되는 제 4 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 4 아미노산 서열.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시는, 제 1 항원 결합 부분 및 제 2 항원 결합 부분을 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자로서,
제 1 항원 결합 부분이, 이하의 (e1)∼(e3):
(e1) 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역;
(e2) 서열 번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 및
(e3) (e1) 또는 (e2)에 기술되는 제 1 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 1 아미노산 서열, 및 (e1) 또는 (e2)에 기술되는 제 2 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 2 아미노산 서열
중 어느 하나를 포함하고, 또한
제 2 항원 결합 부분이, 이하의 (f1)∼(f8):
(f1) 서열 번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 98의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(f2) 서열 번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(f3) 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(f4) 서열 번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(f5) 서열 번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(f6) 서열 번호: 96의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(f7) 서열 번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역, 및 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역; 및
(f8) (f1)∼(f7) 중 어느 하나에 기술되는 제 3 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 3 아미노산 서열, 및 (f1)∼(f7) 중 어느 하나에 기술되는 제 4 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 4 아미노산 서열
중 어느 하나를 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자를 제공한다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시는, 제 1 및 제 2 항체 가변 영역을 포함하는 제 1 항원 결합 부분 및 제 3 및 제 4 항체 가변 영역을 포함하는 제 2 항원 결합 부분을 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자로서, 이하의 (1)∼(15) 중 어느 하나를 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자를 제공한다:
(1) 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 98의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(2) 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(3) 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(4) 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(5) 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(6) 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 96의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(7) 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(8) 서열 번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 98의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(9) 서열 번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 92의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(10) 서열 번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(11) 서열 번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 94의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(12) 서열 번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(13) 서열 번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 96의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(14) 서열 번호: 89의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 91의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 97의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 99의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역;
(15) (1) 또는 (14)에 기술되는 제 1 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 1 아미노산 서열; (1) 또는 (14)에 기술되는 제 2 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 2 아미노산 서열; (1)∼(14) 중 어느 하나에 기술되는 제 3 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 3 아미노산 서열; 및 (1)∼(14) 중 어느 하나에 기술되는 제 4 항체 가변 영역에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 4 아미노산 서열.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시는, 이하의 (A1)∼(A3)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2개의 폴리펩티드쇄의 조합을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자를 제공한다:
(A1) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄;
(A2) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄, 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄; 및
(A3) (A1) 또는 (A2)에 기술되는 제 1 중쇄 서열에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 1 아미노산 서열, 및 (A1) 또는 (A2)에 기술되는 제 1 경쇄 서열에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 2 아미노산 서열.
몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, 이하의 (B1)∼(B8)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2개의 폴리펩티드쇄의 조합을 추가로 포함한다:
(B1) 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(B2) 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(B3) 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(B4) 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(B5) 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(B6) 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(B7) 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄; 및
(B8) (B1)∼(B7) 중 어느 하나에 기술되는 제 2 중쇄 서열에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 3 아미노산 서열, 및 (B1)∼(B7) 중 어느 하나에 기술되는 제 2 경쇄 서열에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 4 아미노산 서열.
몇몇 태양에 있어서, 다중 특이성 항원 결합 분자는, 이하의 (B1)∼(B8)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2개의 폴리펩티드쇄의 조합을 추가로 포함한다:
(B1) 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(B2) 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(B3) 서열 번호: 57의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(B4) 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(B5) 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(B6) 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(B7) 서열 번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄, 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄; 및
(B8) (B1)∼(B7) 중 어느 하나에 기술되는 제 2 중쇄 서열에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 3 아미노산 서열, 및 (B1)∼(B7) 중 어느 하나에 기술되는 제 2 경쇄 서열에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 4 아미노산 서열.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시는, 이하의 (1)∼(15)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 4개의 폴리펩티드쇄의 조합을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자를 제공한다:
(1) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(2) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(3) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(4) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(5) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(6) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(7) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(8) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(9) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(10) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(11) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(12) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 67의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(13) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(14) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄; 및
(15) (1)∼(14) 중 어느 하나에 기술되는 제 1 중쇄 서열에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 1 아미노산 서열; (1)∼(14) 중 어느 하나에 기술되는 제 1 경쇄 서열에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 2 아미노산 서열; (1)∼(14) 중 어느 하나에 기술되는 제 2 중쇄 서열에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 3 아미노산 서열; 및 (1)∼(14) 중 어느 하나에 기술되는 제 2 경쇄 서열에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 4 아미노산 서열.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시는, 이하의 (1)∼(15)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 4개의 폴리펩티드쇄의 조합을 포함하는, 다중 특이성 항원 결합 분자를 제공한다:
(1) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(2) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(3) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 57의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(4) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(5) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(6) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(7) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(8) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(9) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 57의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(10) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(11) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(12) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 56의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(13) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄;
(14) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄; 및
(15) (1)∼(14) 중 어느 하나에 기술되는 제 1 중쇄 서열에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 1 아미노산 서열; (1)∼(14) 중 어느 하나에 기술되는 제 1 경쇄 서열에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 2 아미노산 서열; (1)∼(14) 중 어느 하나에 기술되는 제 2 중쇄 서열에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 3 아미노산 서열; 및 (1)∼(14) 중 어느 하나에 기술되는 제 2 경쇄 서열에 대해서 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 서열 동일성을 갖는 제 4 아미노산 서열.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시는, 이하의 (i)∼(iii) 중 어느 하나의 조합을 제공한다:
(i) 상기의 (a1)∼(a3) 중 어느 하나에 기술되는 서열을 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자, 및 상기의 (b1)∼(b8) 중 어느 하나에 기술되는 서열을 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자;
(ii) 상기의 (e1)∼(e3) 중 어느 하나에 기술되는 서열을 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자, 및 상기의 (f1)∼(f8) 중 어느 하나에 기술되는 서열을 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자; 및
(iii) 상기의 (A1)∼(A3) 중 어느 하나에 기술되는 서열을 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자, 및 상기의 (B1)∼(B8) 중 어느 하나에 기술되는 서열을 포함하는 다중 특이성 항원 결합 분자.
몇몇 태양에 있어서, 본 발명의 항원 결합 분자는, 이중 특이성 항원 결합 분자이다.
몇몇 태양에 있어서, 이중 특이성 항원 결합 분자는, 이중 특이성 항체이다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시는, 본 발명의 항원 결합 분자를 코딩하는 핵산을 제공한다. 몇몇 태양에 있어서, 핵산은, 단리된 핵산이다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시는, 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시는, 그 중에 핵산이 도입되어 있는 벡터를 제공한다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시는, 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 몇몇 태양에 있어서, 세포는 숙주 세포이다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시는, 다중 특이성 항원 결합 분자가 산생되도록 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자를 산생하는 방법을 제공한다. 몇몇 태양에 있어서, 방법은, 세포의 배양물로부터 다중 특이성 항원 결합 분자를 회수하는 공정을 추가로 포함한다.
핵산, 벡터, 세포, 및 방법은, 본 개시 및 당 기술 분야에 있어서의 기술적 지식을 고려하여, 호적하게 제작/실시할 수 있다.
이뮤노컨주게이트
본 발명은 또한, 1개 또는 복수의 세포 상해제(예를 들어 화학요법제 또는 화학요법약, 증식 저해제, 독소(예를 들어 세균, 진균, 식물 혹은 동물 기원의 단백질 독소, 효소적으로 활성인 독소, 혹은 그들의 단편) 또는 방사성 동위체)에 컨주게이트된 본 명세서의 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)를 포함하는 이뮤노컨주게이트를 제공한다.
일 태양에 있어서, 이뮤노컨주게이트는, 항체가, 이들로 한정되는 것은 아니지만 이하를 포함하는 1개 또는 복수의 약제에 컨주게이트된, 항체-약제 컨주게이트(antibody-drug conjugate: ADC)이다: 메이탄시노이드(미국 특허 제5,208,020호, 제5,416,064호, 및 유럽 특허 제0,425,235호 B1 참조); 예를 들어 모노메틸오리스타틴 약제 부분 DE 및 DF(MMAE 및 MMAF)(미국 특허 제5,635,483호 및 제5,780,588호 및 제7,498,298호 참조) 등의 오리스타틴; 돌라스타틴; 칼리케아마이신 또는 그의 유도체(미국 특허 제5,712,374호, 제5,714,586호, 제5,739,116호, 제5,767,285호, 제5,770,701호, 제5,770,710호, 제5,773,001호, 및 제5,877,296호; Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); 및 Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998) 참조); 다우노마이신 또는 독소루비신 등의 안트라사이클린(Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., BioconJ. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); 및 미국 특허 제6,630,579호 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀, 및 오르타탁셀 등의 탁산; 트리코테센; 및 CC1065.
다른 태양에 있어서, 이뮤노컨주게이트는, 이들로 한정되는 것은 아니지만 이하를 포함하는 효소적으로 활성인 독소 또는 그 단편에 컨주게이트된, 본 명세서에 기재된 항체를 포함한다: 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 유동나무(Aleurites fordii) 단백질, 다이안틴 단백질, 미국자리공(Phytolacca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 여주(momordica charantia) 저해제, 쿠르신(curcin), 크로틴, 비누풀(saponaria officinalis) 저해제, 겔로닌, 미토겔린(mitogellin), 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센.
다른 태양에 있어서, 이뮤노컨주게이트는, 방사성 컨주게이트를 형성하기 위해서 방사성 원자에 컨주게이트된 본 명세서에 기재된 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위체가 방사성 컨주게이트의 제조에 이용 가능하다. 예는, 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 212Pb 및 Lu의 방사성 동위체를 포함한다. 방사성 컨주게이트를 검출을 위해서 사용하는 경우, 방사성 컨주게이트는, 신티그래피 검사용의 방사성 원자(예를 들어 Tc-99m 혹은 123I), 또는, 핵자기 공명(NMR) 이미징(자기 공명 이미징, MRI로서도 알려짐)용의 스핀 표지(예를 들어 여기에서도 아이오딘-123, 아이오딘-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망가니즈, 또는 철)를 포함할 수 있다.
항체 및 세포 상해제의 컨주게이트는, 다양한 2작용성 단백질 연결제를 이용하여 제작될 수 있다. 예를 들어 N-석신이미딜-3-(2-피리딜다이싸이오)프로피오네이트(SPDP), 석신이미딜-4-(N-말레이미드메틸)사이클로헥세인-1-카복실레이트 (SMCC), 이미노싸이올레인(IT), 이미도에스터의 2작용성 유도체(예를 들어, 아디프이미드산 다이메틸 HCl), 활성 에스터(예를 들어, 수베르산 다이석신이미딜), 알데하이드(예를 들어, 글루타르알데하이드), 비스-아자이도 화합물(예를 들어, 비스(p-아자이도벤조일)헥세인다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예를 들어, 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이아이소사이아네이트(예를 들어, 톨루엔 2,6-다이아이소사이아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예를 들어, 1,5-다이플루오로-2,4-다이나이트로벤젠)이다. 예를 들어, 리신 면역 독소는, Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)에 기재되는 바와 같이 하여 조제될 수 있다. 탄소-14 표지된 1-아이소싸이오사이아네이토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민 5아세트산 (MX-DTPA)은, 항체로의 방사성 핵종의 컨주게이션을 위한 예시적인 킬레이트제이다. WO94/11026을 참조할 것. 링커는, 세포 내에서의 세포 상해약의 방출을 촉진하는 「절단 가능한 링커」일 수 있다. 예를 들어, 산불안정성 링커, 펩티다제 감수성 링커, 광불안정성 링커, 다이메틸 링커, 또는 다이설파이드 함유 링커(Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); 미국 특허 제5,208,020호)가 사용될 수 있다.
본 명세서의 이뮤노컨주게이트 또는 ADC는, (예를 들어, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A로부터) 시판되고 있는 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB(석신이미딜-(4-바이닐설폰)벤조에이트)를 포함하지만 이들로 한정되지 않는 가교 시약을 이용하여 조제되는 컨주게이트를 명시적으로 고려하지만, 이들로 한정되지 않는다.
약학적 조성물/제제
본 명세서에 기재된 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)의 약학적 조성물/제제는, 소망의 순도를 갖는 항체를, 1개 또는 복수의 임의의 약학적으로 허용되는 담체(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합하는 것에 의해, 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로, 조제된다. 약학적으로 허용되는 담체는, 대체로, 이용될 때의 용량 및 농도에서는 레시피언트에 대해서 비독성이며, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 이하의 것을 포함한다: 인산염, 시트르산염, 및 다른 유기산 등의 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는, 항산화제; 보존료(옥타데실다이메틸벤질 염화 암모늄; 염화 헥사메토늄; 염화 벤잘코늄; 염화 벤제토늄; 페놀, 뷰틸, 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤 등의 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르신올; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸 등); 저분자(약 10잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린 등의 단백질; 폴리바이닐피롤리돈 등의 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신 등의 아미노산; 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는, 단당, 이당, 및 다른 탄수화물; EDTA 등의 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스, 소르비톨 등의, 설탕류; 나트륨 등의 염 형성 짝이온류; 금속 착체(예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG) 등의 비이온계 표면 활성제. 본 명세서의 예시적인 약학적으로 허용되는 담체는, 추가로 가용성 중성 활성형 하이알루로니다제 당단백질(sHASEGP)(예를 들어, rHuPH20 (HYLENEX(등록상표), Baxter International, Inc.) 등의 인간 가용성 PH-20 하이알루로니다제 당단백질) 등의 간질성 약제 분산제를 포함한다. 특정의 예시적 sHASEGP 및 그의 사용 방법은(rHuPH20을 포함한다), 미국 특허출원공개 제2005/0260186호 및 제2006/0104968호에 기재되어 있다. 일 국면에 있어서, sHASEGP는, 콘드로이티나제 등의 1개 또는 복수의 추가적인 글리코사미노글리카나제와 조합된다.
예시적인 동결건조 항체 제제는, 미국 특허 제6,267,958호에 기재되어 있다. 수용액 항체 제제는, 미국 특허 제6,171,586호 및 WO2006/044908에 기재된 것을 포함하고, 후자의 제제는 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함하고 있다.
본 명세서의 조성물/제제는, 치료되는 특정의 적응증을 위해서 필요하면 하나보다 많은 유효 성분을 포함해도 된다. 서로 악영향을 서로 주지 않는 상보적인 활성을 수반하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)와 조합할 수 있는 약제를 추가로 제공하는 것이 바람직하다. 이와 같은 유효 성분은, 의도된 목적을 위해서 유효한 양으로, 호적하게 조합하여 존재한다.
유효 성분은, 예를 들어 액적 형성(코아세르베이션) 수법에 의해 또는 계면중합에 의해 조제된 마이크로캡슐(각각, 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴 마이크로캡슐, 및 폴리(메타크릴산 메틸) 마이크로캡슐)에 포함되어도 되고, 콜로이드상 약제 송달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 소구체, 마이크로에멀션, 나노입자, 및 나노캡슐)에 포함되어도 되고, 매크로에멀션에 포함되어도 된다. 이와 같은 수법은, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 개시되어 있다.
서방성 제제를 조제해도 된다. 서방성 제제의 호적한 예는, 항체를 포함하는 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 당해 매트릭스는 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 등의 조형품의 형태이다.
생체내(in vivo) 투여를 위해서 사용되는 조성물/제제는, 통상 무균이다. 무균 상태는, 예를 들어 멸균 여과막을 통과시켜 여과하는 것 등에 의해, 용이하게 달성된다.
치료적 방법 및 치료용 조성물
본 명세서에서 제공되는 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)의 어느 것도, 치료적인 방법에 있어서 사용되어도 된다. 일 국면에 있어서, 의약품으로서의 사용을 위한, 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)가 제공된다. 추가적인 국면에 있어서, 셀리악병의 치료에 있어서의 사용을 위한, 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)가 제공된다. 특정의 태양에 있어서, 치료 방법에 있어서의 사용을 위한, 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)가 제공된다. 특정의 태양에 있어서, 본 발명은, 셀리악병을 갖는 개체를 치료하는 방법으로서, 당해 개체에게 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)의 유효량을 투여하는 공정을 포함하는 방법에 있어서의 사용을 위한, 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)를 제공한다. 이와 같은 태양의 하나에 있어서, 방법은, 당해 개체에 적어도 하나의(예를 들어 후술하는 바와 같은) 추가 치료제의 유효량을 투여하는 공정을, 추가로 포함한다.
추가적인 국면에 있어서, 본 발명은 의약품의 제조 또는 조제에 있어서의 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)의 사용을 제공한다. 일 태양에 있어서, 의약품은, 셀리악병의 치료를 위한 것이다. 추가적인 태양에 있어서, 의약품은, 셀리악병을 치료하는 방법으로서, 셀리악병을 갖는 개체에게 의약품의 유효량을 투여하는 공정을 포함하는 방법에 있어서의 사용을 위한 것이다. 이와 같은 태양의 하나에 있어서, 방법은, 당해 개체에 적어도 하나의(예를 들어 후술하는 바와 같은) 추가 치료제의 유효량을 투여하는 공정을, 추가로 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시는, 의약품의 제조에 있어서의 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자의 사용을 제공한다. 몇몇 태양에 있어서, 의약품은, 셀리악병의 치료 및/또는 예방을 위한 의약품이다.
추가적인 국면에 있어서, 본 발명은, 셀리악병을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 일 태양에 있어서, 방법은, 셀리악병을 갖는 개체에게 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)의 유효량을 투여하는 공정을 포함한다. 그와 같은 일 태양에 있어서, 방법은, 하기와 같은, 적어도 하나의 추가 치료제의 유효량을 개체에게 투여하는 공정을, 추가로 포함한다. 상기 태양의 임의의 것에 의한 「개체」는, 인간이어도 된다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시는, 셀리악병을 갖는 개체를 치료하는 방법으로서, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자의 유효량을 해당 개체에게 투여하는 공정을 포함하는 방법을 제공한다. 몇몇 태양에 있어서, 본 개시는, 셀리악병을 갖는 개체를 치료하기 위한, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자의 사용을 제공한다.
추가적인 국면에 있어서, 본 발명은, 예를 들어, 셀리악병에 대한 상기의 치료적 방법의 어느 것에 있어서의 사용을 위한, 본 명세서에서 제공되는 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)의 어느 것을 포함하는, 약학적 조성물/제제를 제공한다. 일 태양에 있어서, 약학적 조성물/제제는, 본 명세서에서 제공되는 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)의 어느 것과, 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 다른 태양에 있어서, 약학적 조성물/제제는, 본 명세서에서 제공되는 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)의 어느 것과, 예를 들어 하기와 같은, 적어도 하나의 추가 치료제를 포함한다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시는, 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자와, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약학적 조성물/제제를 제공한다. 몇몇 태양에 있어서, 조성물/제제는, 셀리악병의 치료 및/또는 예방에 있어서의 사용을 위한, 약학적 조성물/제제이다.
본 발명의 항체는, 요법에 있어서, 단독 또는 다른 제제와의 조합의 어느 것으로도 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는, 적어도 하나의 추가의 치료제와 동시 투여되어도 된다. 특정의 태양에 있어서, 추가 치료제는, 동시 투여에 적합하고 당업자가 입수 가능한, 임의의 제제이다.
본 발명의 항체는, 요법에 있어서, 단독 또는 다른 항체와의 조합의 어느 것으로도 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는, 적어도 1개의 본 발명의 추가의 항체와 동시 투여되어도 된다. 특정의 태양에 있어서, 이들 항체는, 병행 혹은 동시에, 또는 그 후에 투여된다. 특정의 태양에 있어서, 동시 투여에 적합한 이들 항체의 혼합물, 칵테일, 또는 조합이 투여된다. 이들 항체는, 본 명세서에 개시되는 임의의 항체여도 된다. 몇몇 태양에 있어서, 이들 항체는, 본 명세서에 개시되는 2개 이상의 호모머 항체, 예를 들어, DQN0344xx 및 DQN0385ee, 또는 DQN0344xx 및 DQN0385ee의 임의의 최적화 배리언트 및/혹은 인간화 배리언트이다.
전술한 바와 같은 병용 요법은, 병용 투여(2개 이상의 치료제가, 동일 또는 별도의 제제에 포함된다), 및 개별 투여를 포함하고, 개별 투여의 경우, 본 발명의 항체의 투여가 추가 치료제의 투여에 앞서, 와 동시에, 및/또는 계속해서, 행해질 수 있다. 일 태양에 있어서, 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체)의 투여 및 추가 치료제의 투여는, 서로, 약 1개월 이내, 또는 약 1, 2, 또는 3주간 이내, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6일 이내에 행해진다.
본 발명의 항체(및, 임의의 추가 치료제)는, 비경구 투여, 폐내 투여, 및 경비 투여, 또한 국소적 처치를 위해서 요망되는 경우는 병소내 투여를 포함하는, 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은, 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은, 투여가 단기나 장기인가에 일부 따르고, 예를 들어, 정맥내 주사 또는 피하 주사 등의 주사에 의하는 등, 임의의 호적한 경로에 의해 이루어질 수 있다. 이들로 한정되는 것은 아니지만, 단회 투여 또는 여러 가지 시점에 걸치는 반복 투여, 볼러스 투여, 및 펄스 주입을 포함하는, 여러 가지 투약 스케줄이 본 명세서의 고려 내에 있다.
본 발명의 항체의 2개 이상(즉, 본 발명의 2개 이상의 치료제)은, 치료의 과정에서 투여될 수 있다. 그들은 별개로 또는 동시에 투여해도 된다. 그들은 병용하여 투여해도 된다. 병용 투여에서는, 2개 이상의 항체를 동시에 투여해도, 별개로 투여해도 된다. 경우에 따라서는, 어느 항체/약제를 최초에 투여하고, 증상을 모니터하여, 증상에 따라서, 필요가 있으면, 다른 항체/약제를 추가로 투여해도 된다. 혹은, 본 발명의 2개 이상의 항체를, 복합약/복합제 중에 포함시키는 것도 가능하다. 그와 같은 복합약/복합제는, 본 명세서에 기재되는 바와 같이 투여할 수 있다. 포함되는 각 항체의 용량/투여량은, 본 명세서에 기재되는 바와 같이 적절히 결정될 수 있다.
본 발명의 항체는, 우량 의료 규범(good medical practice)에 일치한 방식으로, 제제화되고, 투약되고, 또한 투여된다. 이 관점에서 고려되어야 할 인자는, 치료되고 있는 그 특정의 장애, 치료되고 있는 그 특정의 포유동물, 개개의 환자의 임상 증상, 장애의 원인, 제제를 송달하는 부위, 투여 방법, 투여의 스케줄, 및 의료 종사자에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 항체는, 반드시 그렇지 않아도 되지만, 임의로, 문제의 장애를 예방하거나 또는 치료하기 위해서 실제로 사용되고 있는 1개 또는 복수의 제제와 함께, 제제화된다. 그와 같은 다른 제제의 유효량은, 제제 중에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 타입, 및 위에서 논한 다른 인자에 의존한다. 이들은 통상, 본 명세서에서 기술한 것과 동일한 용량 및 투여 경로로, 또는 본 명세서에서 기술한 용량의 약 1∼99%로, 또는 경험적/임상적으로 적절하다고 판단되는 임의의 용량 및 임의의 경로로, 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해서, 본 발명의 항체의 적절한 용량(단독으로 이용될 때 또는 1개 또는 복수의 다른 추가 치료제와 함께 이용될 때)은, 치료되는 질환의 타입, 항체의 타입, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방적 목적으로 투여되는지 치료적 목적으로 투여되는지, 약력, 환자의 임상력 및 항체에 대한 응답, 및, 주치의의 재량에 의존할 것이다. 항체는, 환자에 대해서, 1회로, 또는 일련의 처치에 걸쳐서, 호적하게 투여된다. 질환의 타입 및 중증도에 따라서, 예를 들어, 1회 또는 복수회의 별개의 투여에 의한다고 해도 연속 주입에 의한다고 해도, 약 1μg/kg∼15mg/kg(예를 들어, 0.1mg/kg∼10mg/kg)의 항체가, 환자에 대한 투여를 위한 최초의 후보 용량이 될 수 있다. 하나의 전형적인 1일 용량은, 전술한 인자에 의존하여, 약 1μg/kg으로부터 100mg/kg 이상까지, 폭이 있어도 된다. 수일 또는 보다 장시간에 걸친 반복된 투여의 경우, 상황에 따라, 치료는 통상 질환 증상의 소망하는 억제가 일어날 때까지 유지된다. 항체의 하나의 예시적인 용량은, 약 0.05mg/kg 내지 약 10mg/kg의 범위 내이다. 따라서, 약 0.5mg/kg, 2.0mg/kg, 4.0mg/kg, 혹은 10mg/kg의 1개 또는 복수의 용량(또는 이들의 임의의 조합)이, 환자에게 투여되어도 된다. 이와 같은 용량은, 단속적으로, 예를 들어 1주간마다 또는 3주간마다(예를 들어, 환자가 약 2∼약 20, 또는 예를 들어 약 6용량의 항체를 받도록), 투여되어도 된다. 높은 초회 부하 용량 후에, 1회 또는 복수회의 저용량이 투여되어도 된다. 이 요법의 경과는, 종래의 수법 및 측정법에 의해, 용이하게 모니터링된다.
전술한 제제 또는 치료적 방법의 어느 것에 대해서도, 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체) 대신에 또는 그것에 추가하여, 본 발명의 이뮤노컨주게이트를 이용하여 실시해도 됨이, 이해될 것이다.
키트/제품
본 발명의 다른 국면에 있어서, 전술한 장애의 치료, 예방, 및/또는 진단에 유용한 기재를 포함하는 키트 또는 제품이, 제공된다. 키트 또는 제품은, 용기, 및 당해 용기 상의 라벨 또는 당해 용기에 부속되는 첨부 문서를 포함한다. 바람직한 용기로서는, 예를 들어, 보틀, 바이알, 시린지, IV 용액 백 등이 포함된다. 용기류는, 유리나 플라스틱 등의, 다양한 재료로부터 형성되어 있어도 된다. 용기는 조성물을 단체(單體)로 보유해도 되고, 증상의 치료, 예방, 및/또는 진단을 위해서 유효한 다른 조성물과 조합하여 보유해도 되고, 또한, 무균적인 액세스 포토를 갖고 있어도 된다(예를 들어, 용기는, 피하 주사바늘에 의해 꿰뚫을 수 있는 스토퍼를 갖는 정맥내 투여용 용액 백 또는 바이알이어도 된다). 조성물 중의 적어도 하나의 유효 성분은, 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 첨부 문서는, 조성물이 선택된 증상을 치료하기 위해서 사용되는 것임을 나타낸다. 더욱이, 키트 또는 제품은, (a) 제 1 용기로서, 그 속에 수납된 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 갖는, 제 1 용기; 및, (b) 제 2 용기로서, 그 속에 수납된 추가적인 세포 상해제 또는 그 이외로 치료적인 제제를 포함하는 조성물을 갖는, 제 2 용기를 포함해도 된다. 본 발명의 이 태양에 있어서의 키트 또는 제품은, 추가로, 조성물이 특정의 증상을 치료하기 위해서 사용될 수 있음을 나타내는, 첨부 문서를 포함해도 된다. 혹은 또는 더하여, 키트 또는 제품은 추가로, 주사용 제균수(BWFI), 인산 완충 생리 식염수, 링거 용액, 및 덱스트로스 용액 등의, 약학적으로 허용되는 완충액을 포함하는, 제 2(또는 제 3) 용기를 포함해도 된다. 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 및 시린지 등의, 다른 상업적 관점 또는 유저의 입장으로부터 바람직한 기재를 추가로 포함해도 된다.
키트 또는 제품의 어느 것에 대해서도, 항HLA-DQ2.5 항원 결합 분자(항체) 대신에 또는 그것에 추가하여, 본 발명의 이뮤노컨주게이트를 포함해도 됨이 이해될 것이다.
몇몇 태양에 있어서, 본 개시는, 적어도 본 발명의 다중 특이성 항원 결합 분자와, 사용 설명서를 포함하는, 셀리악병의 치료 및/또는 예방에 있어서의 사용을 위한 키트를 제공한다.
항원 결합 분자의 사용 방법
본 개시의 항원 결합 분자는, 다양한 기존의 의학적 사용의 기술과 조합할 수 있다. 본 개시의 항원 결합 분자와 조합할 수 있는 기술의 비한정적인 예에는, 항원 결합 분자를 코딩하는 핵산을, 바이러스 벡터 등을 이용하여 생체 내에 짜넣어 해당 항원 결합 분자를 직접 발현시키는 방법이 포함된다. 그와 같은 바이러스 벡터의 예로서는, 아데노바이러스를 들 수 있지만, 이것으로 한정되지 않는다. 혹은, 항원 결합 분자를 코딩하는 핵산을, 예를 들어 일렉트로포레이션법 또는 핵산을 직접 투여하는 방법 등에 의해, 바이러스 벡터를 이용하지 않고 직접 생체 내에 짜넣는 것도 가능하다. 혹은, 항원 결합 분자를 분비/발현하도록 유전자 개변된 세포를 생체에 투여하여, 해당 항원 결합 분자를 해당 생체 내에서 연속적으로 분비시키는 것도 가능하다.
항체를 포함하는 주사용 제제
(1) 목시에 의해 검출 가능한 입자를 형성할 리스크의 판정
본 명세서에 있어서, 목시에 의해 검출 가능한 입자란, 고조도에서 목시에 의해 검출 가능한 입자이며, 40μm 이상의 입경을 갖는다. 이 중, 일본 약국방에 규정되어 있는 표준 조도(2,000-3,000lx 정도)에서 목시에 의해 검출 가능한 입자를 「가시 입자」 또는 「불용성 가시성 입자」라고 부른다. 가시 입자는 일반적으로 100μm보다 큰 입경을 갖는다(비특허문헌 12). 가시 입자보다도 작은 사이즈로, 일본 약국방에 규정되어 있는 표준 조도(2,000-3,000lx 정도)에서는 눈으로 보이지 않지만 조도를 높이거나, 관찰 시간을 길게 함으로써 목시에 의해 검출 가능한 입자는 「고조도에서만 목시에 의해 검출 가능한 입자」이며, 40μm∼100μm의 입경을 갖는다. 가시 입자는, 조명하, 표준 조도(2,000-3,000lx 정도)에 있어서, 흑색 배경 또는 백색 배경의 앞에서 용기를 완만하게 선회 또는 전도시키고 5초 이상, 육안으로 목시 검사하는 것에 의해 확인된다. 고조도에서만 목시에 의해 검출 가능한 입자는, 조명하, 고조도(6,000lx 이상)에 있어서, 흑색 배경의 앞에서 용기를 완만하게 선회 또는 전도시키고 30초 이상, 육안으로 목시 검사하는 것에 의해 확인된다. 고조도에 있어서의 검사에서는 가시 입자도 확인 가능하다. 용액 중의 단백질 분자 이외로부터 생긴 입자는, 사이즈에 관계 없이 「목시에 의해 검출 가능한 입자」로서 고려하지 않는다. 목시에 의해 검출 가능한 입자가 단백질 분자에 의한 것임은, 현미 라만 분광 측정에 의해 확인할 수 있다. 용액 중에 단백질로서 포함되는 것은 의약 유효 성분(API)뿐이며, 목시에 의해 검출 가능한 입자는 API로부터 생긴 것이다. 목시에 의해 검출 가능한 입자의 입경이나 수는, 광차폐 입자 계수법, 현미경 입자 계수법, 플로 사이트 입자 화상 해석법, 목시 검사, 입자를 단리한 후에 현미 적외 분광(infrared spectroscopy; IR) 측정이나 현미 라만 분광 측정함으로써 측정 가능하고, 바람직하게는 목시 검사와 현미 적외 분광 또는 현미 라만 분광 측정의 조합에 의해 측정된다.
본 명세서에 있어서, 의약 제제의 용액 중에서 「입자를 형성할 리스크가 높은」이란, 용액 중의 단백질 분자가 응집하여 목시에 의해 검출 가능한 입자를 형성하기 쉬움을 가리킨다. 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질의 예로서, 적절한 양의 계면활성제 첨가 후에 있어서도, 목시에 의해 검출 가능한 입자가 형성되는 단백질을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「기포」란, 용기 내의 액체와 용기의 벽면 사이 또는 액체 내의 기체의 공간을 가리킨다. 그것은 육안 또는 광학 현미경 검사에 의해 볼 수 있는 사이즈의 것이다. 「용기 내」란, 예를 들어 바늘 부가 프리필드 시린지의 경우, 리지드 니들 실드(RNS) 및 스토퍼로 시전(施栓)된 공간 전체를 포함하고, 구체적으로는 바늘 내부, 및 배럴 내부의 공간을 가리킨다. 용기가 수직위(垂直位)에 있을 때에 용기의 직경 전체에는 미치지 않고, 액체의 모두는 아니지만 일부가 용기의 덮개부(예를 들어, 스토퍼)의 저면과 접촉하고 있다. 어느 태양에 있어서, 기포는 구형이다. 어느 태양에 있어서, 기포는 구형은 아니다. 그와 같은 어떤 태양에 있어서, 기포는 난형(卵形)이다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 기포의 용량, 예를 들어 1기압(=101325Pa), 25℃에 있어서의 기포의 용량은, 120μL 이하, 110μL 이하, 100μL 이하, 90μL 이하, 80μL 이하, 70μL 이하, 60μL 이하, 50μL 이하, 40μL 이하, 30μL 이하, 20μL 이하, 10μL 이하여도 된다(도 6 참조). 본 발명의 하나의 태양에 있어서, 기포의 용량은, 용기에 포함되는 기포의 모두가 일체화되었을 때의 기포의 용량으로서 측정된다. 기포의 용량은, 「이미 용액이 포함되는 피펫 등의 적당한 눈금 있는 용기에 바늘 끝으로부터 기체, 용액의 순서로 배출하여 기포의 용량을 실측한다」, 「화상을 취득하여, 기포 부분의 면적으로부터 기포의 용량을 산출한다」, 「기지의 배럴 내경 정보를 기본으로, 기포 부분의 높이로부터 기포의 용량을 산출한다」 등의 수법에 의해 측정하는 것이 가능하다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 용액 중에서 입자를 형성할 리스크가 높은 단백질을 판정하기 위해서 「호몰로지 모델링」이 사용된다. 「호몰로지 모델링」이란, 특정의 서열을 갖는 단백질에 대해, 기지의 삼차원 구조를 갖는 1 이상의 단백질과의 서열의 유사성에 기초하여 삼차원 구조를 추정하는 방법이다. 특정의 아미노산 서열에 대한 호몰로지 모델링은 통상, 이하의 공정을 포함한다. 1) Protein Data Bank 중의 기지의 구조의 호몰로그를 특정한다, 2) 대상의 서열을 템플레이트 구조에 대응시켜 배치한다, 3) 그 얼라인먼트에 기초하여 모델을 구축한다, 4) 모델의 평가 및 정치화를 행한다(Xiang, Curr Protein Pept Sci. 2006 June; 7(3):217-227). 호몰로지 모델링 기능을 탑재한 삼차원 구조 추정을 행하는 소프트웨어로서, Molecular Operating Environment(MOE; Chemical Computing Group Inc. (CCG)(캐나다), Web Antibody Modelling(WAM; http://antibody.bath.ac.uk), Rosetta(https://www.rosettacommons.org/software), Prime(Schrodinger), MODELLER(Eswar, et al., Comparative Protein Structure Modeling With MODELLER. Current Protocols in Bioinformatics, John Wiley & Sons, Inc., Supplement 15, 5.6.1-5.6.30, 200.), SEGMOD/ENCAD(Levitt M. J Mol Biol 1992;226:507-533), SWISS-MODEL(Schwede T, Kopp J, Guex N, Peitsch M C. Nucleic Acids Research 2003; 31 :3381-3385.), 3D-JIGSAW(Bates et al., Proteins: Structure, Function and Genetics, Suppl 2001; 5:39-46), NEST(Xiang, Curr Protein Pept Sci. 2006 June; 7(3): 217-227), 및 BUILDER(Koehl and Delarue, Curr Opin Struct Biol 1996; 6(2): 222-226) 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 바람직한 소프트웨어로서 MOE를 들 수 있다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 「항체 모델링」이란, 모노클로날 항체에 특화된 삼차원 구조 추정 기능 및 데이타베이스이다. 항체 모델링에 있어서, 단편의 구조에 기초하여 전체의 구조를 조립할 수 있다. 예를 들어, 항체 Fab 프래그먼트를 Fc 프래그먼트 결정 구조에 추가하거나, Fab 프래그먼트를 추정 단백질 구조로서 형성하여 Fc 프래그먼트 결정 구조에 추가하거나 할 수 있다. 예를 들어, MOE에 탑재된 기능을 이용하여 실시할 수 있다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 「패치」란 단백질 또는 항체의 삼차원 구조에 있어서 특정의 물리화학적 특성을 나타내는 잔기 클러스터의 표면 영역을 가리킨다. 패치로서 소수성 패치 및 전하 패치를 들 수 있다. 소수성 패치는 소수성 잔기가 클러스터상으로 집적하고 있는 부분의 표면 영역이다. 소수성 잔기가 클러스터상으로 집적하고 있는 부분은 소수성 잔기 이외의 잔기도 포함할 수 있다. 전하 패치는 전하를 갖는 잔기가 클러스터상으로 집적하고 있는 부분의 표면 영역이다. 전하를 갖는 잔기가 클러스터상으로 집적하고 있는 부분은 전하를 갖지 않는 잔기도 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, MOE의 Protein properties 기능으로 단백질의 패치 면적에 관한 특징량을 계산 가능하고, 특정의 단백질 표면의 패치의 면적에 관해서, 소수성 패치의 면적에 의한 랭킹으로 상위 5위까지의 소수성 패치의 면적의 합을 X(Å2), 전하 패치 총면적을 Y(Å2)로 했을 때, X＋Y×1.5에 기초하여 단백질의 입자 형성 리스크가 판단된다. 하나의 태양에 있어서, X＋Y×1.5의 값이 1700 이상인 단백질이 입자 형성 리스크가 높은 단백질로 판정된다. 다른 태양에 있어서, X＋Y×1.5의 값이 2000 이상, 2500 이상, 3000 이상, 3500 이상, 또는 4000 이상인 단백질이 입자 형성 리스크가 높은 단백질로 판정된다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, MOE의 Protein properties 기능으로 단백질의 패치 면적에 관한 특징량을 계산 가능하고, 특정의 단백질 표면의 패치의 면적에 관해서, 전하 패치 총면적 Y(Å2)에 기초하여 단백질의 입자 형성 리스크가 판단된다. 하나의 태양에 있어서, Y의 값이 600 이상인 단백질이 입자 형성 리스크가 높은 단백질로 판정된다. 다른 태양에 있어서, Y의 값이 700 이상, 800 이상, 900 이상, 1000 이상, 1500 이상, 2000 이상, 2500 이상, 3000 이상, 또는 4000 이상인 단백질이 입자 형성 리스크가 높은 단백질로 판정된다.
여기에서, 소수성 패치의 면적에 의한 랭킹이란, 단백질 표면에 인정되는 소수성 패치를 면적의 순서로 늘어놓은 리스트이며, 각 소수성 패치는 단백질 표면에 독립적으로 존재하는 일정한 크기의 소수성 잔기 클러스터로 이루어지는 소수성 패치를 의미한다. 랭킹의 상위 5위까지의 소수성 패치의 면적(Å2)의 합을 X로서 산출한다. 여기에서, 상위 5위까지의 소수성 패치의 면적의 합이란, 상위 5위까지의 소수성 패치의 면적의 합계치를 가리킨다. 단, 분자 중의 소수성 패치가 4개 이하인 경우에는 실재하는 모든 소수성 패치의 면적의 합계치를 가리킨다.
전하 패치 총면적이란, 단백질 표면에 존재하는 양 또는 음으로 하전된 전하 패치 모두의 면적(Å2)의 합을 의미한다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 「분자력장」이란 분자 중에 존재하는 각 원자가, 어떠한 힘을 받고 있는지를 함수로서 파라미터화한 것이다. 분자력장에 기초하는 분자 역학 계산이나 분자 동력학 계산에서는, 원자 사이에 작용하는 힘을, 원자 사이의 결합을 나타내는 파라미터(결합 거리나 결합각 등)를 변수로 하여, 원자의 종류나 결합 양식에 의해 정해지는 포텐셜 함수로 수치로서 나타낸다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 이용할 수 있는 분자력장은, 특별히 제한 없이, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있고, 예를 들어, Amber계의 분자력장, CHARMm계의 분자력장, OPLS계의 분자력장 등을 들 수 있다. Amber계의 분자력장으로서는, 예를 들어, Amber10/14:EHT, Amber ff99SB-ILDN, Amber 12SB 등을 들 수 있다. CHARMm계의 분자력장으로서는, 예를 들어, CHARMm36 등을 들 수 있다. 이들 중, MOE를 이용하는 경우는 Amber10:EHT가 바람직하다.
(2) 입자의 형성의 저감
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 「입자의 형성을 저감시키는」이란, 소정의 조건에 있어서 목시에 의해 검출 가능한 입자가 형성되는 의약 제제의 용액에 있어서, 기포의 용량을 조정하는 것에 의해 목시에 의해 검출 가능한 입자가 형성되지 않게 하거나, 또는 형성되는 입자수를 감소시키는 것을 가리킨다. 목시에 의해 검출 가능한 입자의 형성이 저감된 것은, 기포의 용량의 조정의 전후에 입자수를 계수하는 것에 의해 확인할 수 있다. 입자의 사이즈나 수는, 광차폐 입자 계수법, 현미경 입자 계수법, 플로 사이트 입자 화상 해석법, 목시 검사, 입자를 단리 한 후에 현미 적외 분광(infrared spectroscopy; IR) 측정이나 현미 라만 분광 측정함으로써 측정 가능하고, 바람직하게는 목시 검사와 현미 적외 분광 또는 현미 라만 분광 측정의 조합으로 측정한다.
(3) 의약 제제
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 의약 제제는, 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 용액이다. 의약 제제는, 주사용 제제여도 된다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 주사용 제제란, 주사에 의해 투여되기 위해서 주사용의 용기에 충전된, 용액 중에 단백질을 유효 성분으로서 함유하는 의약 제제이다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 「얻어지는 주사용 제제」란, 기포 용량을 조정한 후에 최종 제품으로서 얻어지는 주사용 제제를 가리킨다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 의약 제제는, 용기 내의 용액을 동결시키지 않고 -30℃∼25℃, 바람직하게는 용액의 동결점∼25℃, 보다 바람직하게는 1℃∼10℃, 보다 바람직하게는 2℃∼8℃, 더 바람직하게는 5℃에서 보존된다. 보존은 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 24시간, 25시간, 26시간, 27시간, 28시간, 29시간, 30시간, 31시간, 32시간, 33시간, 34시간, 35시간, 36시간, 48시간, 60시간, 72시간, 84시간, 96시간 행해진다. 보존은, 적어도 24시간, 적어도 2일간, 적어도 3일간, 적어도 4일간, 적어도 10일, 적어도 20일, 적어도 30일, 적어도 40일, 적어도 50일, 적어도 60일, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 적어도 9개월, 적어도 10개월, 적어도 11개월, 적어도 12개월 행해진다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 용액 제제에서 사용하는 단백질은, 본 발명의 항HLA-DQ2.5 항체이다. 하나의 태양에 있어서, 당해 항체는, 항HLA-DQ2.5 이중 특이성 항체이다. 예를 들어, 당해 항체는, 표 2-3∼표 2-6에 기재되는 서열 번호(SEQ ID NO)로 나타나는, VH 및 VL, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3, 또는, 전장 중(H)쇄 및 경(L)쇄를 포함한다. 하나의 태양에 있어서, 당해 항체는, DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6.v2이다(서열 번호 등에 대해서는, 표 2-4(다만, 양 암의 「전장 H」는 「상이한 Fc」)를 참조).
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 의약 제제에 사용하는 단백질은, 포유동물, 특히 인간의 생리 활성 단백질과 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 갖는 것이고, 천연 유래의 것, 및 유전자 재조합법에 의해 얻어진 것을 포함한다. 유전자 재조합법에 의해 얻어지는 단백질에는 천연 단백질과 아미노산 서열이 동일한 것, 혹은 해당 아미노산 서열의 1 또는 복수를 결실, 치환, 부가한 것으로 상기 생물학적 활성을 갖는 것을 포함한다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 용액 중의 단백질의 농도는, 0.1mg/mL 이상, 0.1∼300mg/mL의 범위, 1∼200mg/mL의 범위여도 된다. 본 발명의 하나의 측면에 있어서, 용액 중의 단백질의 농도는, 50mg/mL 이상, 50∼200mg/mL의 범위, 50∼300mg/mL의 범위여도 된다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 의약 제제는, 필요에 따라서, 적당한 약학적으로 허용되는 담체, 매체 등과 혼화하고 조제하여, 용액 제제로 할 수 있다. 용액 제제의 용매는, 물 또는 약학적으로 허용되는 유기 용매이다. 그와 같은 유기 용매로서는, 예를 들어, 프로필렌 글라이콜(1,2-프로페인다이올), 폴리에틸렌 글라이콜 300, 폴리에틸렌 글라이콜 400, 에탄올, 글리세롤, 아세트산 등을 들 수 있다. 적당한 약학적으로 허용되는 담체, 매체로서는, 예를 들어, 멸균수나 생리 식염수, 안정화제, 산화 방지제(아스코르브산 등), 완충제(인산, 시트르산, 히스티딘, 다른 유기산 등), 방부제, 계면활성제(PEG, Tween 등), 킬레이트제(EDTA 등), 결합제 등을 들 수 있다. 또한, 그 외의 저분자량의 폴리펩티드, 혈청 알부민, 젤라틴이나 면역글로불린 등의 단백질, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 글루타민산, 아스파라긴산, 메티오닌, 아르기닌 및 리신 등의 아미노산, 다당 및 단당 등의 당류나 탄수화물, 만니톨이나 소르비톨 등의 당 알코올을 포함하고 있어도 된다. 주사용의 용액으로 하는 경우에는, 예를 들어 생리 식염수, 포도당이나 그 외의 보조약을 포함하는 등장액, 예를 들어, D-소르비톨, D-만노스, D-만니톨, 염화 나트륨을 들 수 있고, 적당한 용해 보조제, 예를 들어 알코올(에탄올 등), 폴리알코올(프로필렌 글라이콜, PEG 등), 비이온성 계면활성제(폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴록사머 188, HCO-50) 등과 병용해도 된다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 용액 제제에 있어서 사용하는 완충제는, 용액의 pH를 유지하기 위한 물질을 사용하여 조제한다. 본 발명의 하나의 측면에 있어서, 고농도 항체 함유 용액 제제에 있어서는, 용액의 pH가 4.5∼7.5인 것이 바람직하고, 5.0∼7.0인 것이 보다 바람직하고, 5.5∼6.5인 것이 더 바람직하다. 본 발명의 하나의 측면에 있어서, 사용 가능한 완충제는, 이 범위의 pH를 조정할 수 있고, 또한 의약적으로 허용 가능한 것이다. 이와 같은 완충제는 용액 제제의 분야에서 당업자에게 공지이며, 예를 들어, 인산염(나트륨 또는 칼륨), 탄산수소 나트륨 등의 무기염; 시트르산염(나트륨 또는 칼륨), 아세트산 나트륨, 석신산 나트륨 등의 유기산염; 또는, 인산, 탄산, 시트르산, 석신산, 말산, 글루콘산 등의 산류를 사용할 수 있다. 더욱이, Tris류 및 MES, MOPS, HEPES와 같은 굿(good) 완충제, 히스티딘(예를 들어 히스티딘 염산염), 글리신 등을 사용해도 된다.
완충제의 농도는, 일반적으로는 1∼500mmol/L이고, 바람직하게는 5∼100mmol/L이며, 더 바람직하게는 10∼20mmol/L이다. 히스티딘 완충제를 사용하는 경우, 완충제는 바람직하게는 5∼25mmol/L의 히스티딘, 더 바람직하게는 10∼20mmol/L의 히스티딘을 함유한다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 고농도 항체 함유 용액 제제는, 유효 성분인 항체에 있어 적절한 안정화제를 첨가하는 것에 의해, 안정화되는 것이 바람직하다. 본 발명의 하나의 측면에 있어서, 「안정된」 고농도 항체 함유 용액 제제는, 냉장 온도(2∼8℃)에서 적어도 12개월, 바람직하게는 2년간, 더 바람직하게는 3년간; 또는 실온(22∼28℃)에서 적어도 3개월, 바람직하게는 6개월, 더 바람직하게는 1년간, 유의한 변화가 관찰되지 않는다. 예를 들어, 5℃에서 2년간 보존 후의 2량체량 및 분해물량의 합계가 5.0% 이하, 바람직하게는 2% 이하, 더 바람직하게는 1.5% 이하, 혹은 25℃에서 6개월 보존 후의 2량체량 및 분해물량의 합계가 5.0% 이하, 바람직하게는 2% 이하, 더 바람직하게는 1.5% 이하이다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 계면활성제로서는, 비이온 계면활성제, 예를 들어 소르비탄 모노카프릴레이트, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트 등의 소르비탄 지방산 에스터; 글리세린 모노카프릴레이트, 글리세린 모노밀리테이트, 글리세린 모노스테아레이트 등의 글리세린 지방산 에스터; 데카글리세릴 모노스테아레이트, 데카글리세릴 다이스테아레이트, 데카글리세릴 모노리놀레이트 등의 폴리글리세린 지방산 에스터; 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트라이올레에이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트라이스테아레이트 등의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스터; 폴리옥시에틸렌 소르비트 테트라스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비트 테트라올레에이트 등의 폴리옥시에틸렌 소르비트 지방산 에스터; 폴리옥시에틸렌 글리세릴 모노스테아레이트 등의 폴리옥시에틸렌 글리세린 지방산 에스터; 폴리에틸렌 글라이콜 다이스테아레이트 등의 폴리에틸렌 글라이콜 지방산 에스터; 폴리옥시에틸렌 라우릴 에터 등의 폴리옥시에틸렌 알킬 에터; 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 글라이콜 에터, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 프로필 에터, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 세틸 에터 등의 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 알킬 에터; 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에터 등의 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에터; 폴리옥시에틸렌 피마자유, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유(폴리옥시에틸렌 수소 피마자유) 등의 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유; 폴리옥시에틸렌 소르비트 밀랍 등의 폴리옥시에틸렌 밀랍 유도체; 폴리옥시에틸렌 라놀린 등의 폴리옥시에틸렌 라놀린 유도체; 폴리옥시에틸렌 스테아르산 아마이드 등의 폴리옥시에틸렌 지방산 아마이드 등의 HLB6∼18을 갖는 것; 음이온 계면활성제, 예를 들어 세틸 황산 나트륨, 라우릴 황산 나트륨, 올레일 황산 나트륨 등의 탄소 원자수 10∼18의 알킬기를 갖는 알킬 황산염; 폴리옥시에틸렌 라우릴 황산 나트륨 등의, 에틸렌 옥사이드의 평균 부가 몰수가 2∼4이고 알킬기의 탄소 원자수가 10∼18인 폴리옥시에틸렌 알킬 에터 황산염; 라우릴 설포석신산 에스터 나트륨 등의, 알킬기의 탄소 원자수가 8∼18인 알킬 설포석신산 에스터염; 천연계의 계면활성제, 예를 들어 레시틴, 글리세로인지질; 스핑고미엘린 등의 스핑고인지질; 탄소 원자수 12∼18의 지방산의 자당 지방산 에스터 등을 전형적 예로서 들 수 있다. 본 발명의 하나의 측면에 있어서, 제제에는, 이들 계면활성제의 1종 또는 2종 이상을 조합하여 첨가할 수 있다.
바람직한 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스터 및 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 알킬 에터이고, 특히 바람직한 것은 폴리소르베이트 20, 21, 40, 60, 65, 80, 81, 85 및 플루로닉(등록상표)형 계면활성제이며, 가장 바람직한 것은 폴리소르베이트 20, 80 및 플루로닉 F-68(폴록사머 188)이다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 항체 제제에 첨가하는 계면활성제의 첨가량은, 일반적으로는 0.0001∼10%(mg/mL)이고, 바람직하게는 0.001∼5%이며, 더 바람직하게는 0.005∼3%이다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 항체 제제(용액) 중의 계면활성제의 농도는, 바람직하게는, 0.01mg/mL 이상, 0.01∼5mg/mL의 범위, 또는, 0.25∼0.75mg/mL의 범위이다.
또한 본 발명의 제제에는, 필요에 따라서, 동결 보호제, 현탁제, 용해 보조제, 등장화제, 보존제, 흡착 방지제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 함황 환원제, 산화 방지제 등을 적절히 첨가할 수 있다.
동결 보호제로서 예를 들어, 트레할로스, 자당, 소르비톨 등의 당류를 들 수 있다.
용액 보조제로서 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 폴리소르베이트 80, 니코틴산 아마이드, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 마그로골, 피마자유 지방산 에틸 에스터 등을 들 수 있다.
등장화제로서 예를 들어, 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘 등을 들 수 있다.
보존제로서 예를 들어, 파라옥시벤조산 메틸, 파라옥시벤조산 에틸, 소르브산, 페놀, 크레졸, 클로로크레졸 등을 들 수 있다.
흡착 방지제로서 예를 들어, 인간 혈청 알부민, 레시틴, 덱스트란, 에틸렌 옥사이드·프로필렌 옥사이드 공중합체, 하이드록시프로필셀룰로스, 메틸셀룰로스, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 폴리에틸렌 글라이콜 등을 들 수 있다.
함황 환원제로서 예를 들어, N-아세틸시스테인, N-아세틸호모시스테인, 싸이옥트산, 싸이오다이글라이콜, 싸이오에탄올아민, 싸이오글리세롤, 싸이오소르비톨, 싸이오글라이콜산 및 그의 염, 싸이오황산 나트륨, 글루타티온, 탄소 원자수 1∼7의 싸이오알칸산 등의 설프하이드릴기를 갖는 것 등을 들 수 있다.
산화 방지제로서 예를 들어, 에리소르브산, 다이뷰틸하이드록시톨루엔, 뷰틸하이드록시아니솔, α-토코페롤, 아세트산 토코페롤, L-아스코르브산 및 그의 염, L-아스코르브산 팔미테이트, L-아스코르브산 스테아레이트, 아황산수소 나트륨, 아황산 나트륨, 갈산 트라이아밀, 갈산 프로필 혹은 에틸렌다이아민 4아세트산 2나트륨(EDTA), 피로인산 나트륨, 메타인산 나트륨 등의 킬레이트제를 들 수 있다.
(4) 용기
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 의약 제제가 충전되는 용기로서 시린지 및 카트리지를 들 수 있다.
하나의 태양에 있어서, 의약 제제가 충전되는 용기는, 시린지이며, 바람직하게는, 프리필드 시린지이다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 「프리필드 시린지」란, 용기로서의 시린지에, 액체 조성물이 충전되어 있는 시린지를 의미한다. 어느 태양에 있어서, 프리필드 시린지는, 환자에게 투여하기 위한 의약 조성물이 시린지 내에 충전되어 있다. 여기에서, 시린지는 시린지 클로저, 예를 들어, 한정은 되지 않지만 스토퍼에 의해 덮개가 되고 있어도 된다. 어느 태양에 있어서, 조성물은 제조용 충전 시설에 있어서 시린지 내에 충전된다. 어느 태양에 있어서, 시린지는, 시린지 내에 조성물이 충전되기 전에 멸균된다. 어느 태양에 있어서, 프리필드 시린지는, 환자에 대한 조성물의 투여 전에, 1일, 또는 적어도 7일, 또는 적어도 14일, 또는 적어도 1개월, 또는 적어도 6개월, 또는 적어도 1년, 또는 적어도 2년의 보존 기간을 갖는다. 어느 태양에 있어서, 프리필드 시린지는 저장 및/또는 수송의 조건에 노출된다.
프리필드 시린지는, 도 7에 나타내는 바와 같이, 약제를 투여하기 위한 시린지를 구비한다. 또한, 프리필드 시린지는, 시린지에 삽입되는 스토퍼를 구비한다. 더욱이, 프리필드 시린지는, 시린지에 접속되는 주사바늘을 구비한다. 프리필드 시린지는, 주사바늘을 캐핑하는 캡을 구비한다. 약제는, 액상의 약제이며, 예를 들어, 단백질 제제이다.
시린지는, 선단부 및 기단부를 갖는 통상으로 형성된 배럴을 구비한다. 또한, 시린지는, 대략 통상이다.
배럴은, 내부에 약제를 수용하는 부재이다. 본 실시 형태의 배럴은, 선단부 및 기단부에 더하여, 선단부와 기단부를 접속하는 통상부를 구비한다(도 7 참조). 또한, 배럴은, 통상부의 통축 방향에 있어서의 다른 단의 외주 전체 둘레로부터 바깥쪽(통상부의 직경 바깥 방향)을 향해 연장되는 플랜지부를 갖는다.
배럴은, 예를 들어, 투명하고, 또한, 약제를 투여할 때에 걸리는 내압에 견딜 수 있는 재질로 형성된다. 구체적으로, 배럴의 재질은, 노보넨 등의 환상 올레핀을 반복하여 단순히 포함하는 수지이다. 보다 구체적으로 설명하면, 배럴의 재질은, 환상 올레핀에 의한 단독 중합체인 COP(사이클로올레핀 폴리머)나 환상 올레핀과 에틸렌 등의 공중합체인 COC(사이클로올레핀 코폴리머) 등의 투명한 수지이다. 한편, 배럴은, PP(폴리프로필렌)나 유리여도 된다.
한편, 배럴의 내표면(예를 들어, 통상부의 내표면)에는, 배럴의 내표면에 대한 피스톤의 접동 저항을 억제하기 위해서, 윤활제로서의 실리콘 오일이 도포되어 있어도 된다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 실리콘 오일은 폴리다이메틸실록세인이다. 몇몇 예시적인 폴리다이메틸실록세인에는, 예를 들어, 점도가 350센티스토크스인 Dow Corning(등록상표) 360 Medical Fluid, 점도가 1000센티스토크스인 Dow Corning(등록상표) 360 Medical Fluid, 점도가 12,500센티스토크스인 Dow Corning(등록상표) 360 Medical Fluid, 및 Dow Corning(등록상표) MDX4-4159 fluid를 비한정적으로 포함하는, Dow Corning(등록상표) 360 Medical Fluid가 비한정적으로 포함된다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 시린지의 용량의 사이즈(규격)는 특별히 한정되지 않는다. 구체적으로는, 용량이 0.5mL∼5.0mL, 바람직하게는 1mL와 같은 용량의 작은 사이즈의 시린지의 경우에 본 발명의 하나의 측면에 있어서, 유리한 효과가 현저하다. 또한, 1mL 규격의 시린지 내에 포함되는 용액의 용량은, 0.1∼1.2mL의 범위, 바람직하게는 0.2∼1.1mL의 범위이다. 2.5mL 규격의 시린지 내에 포함되는 용액의 용량은, 0.1∼2.5mL의 범위, 바람직하게는 0.3∼2.3mL의 범위이다. 또한 의약 제제가 수용액을 포함하는 경우, 1mL 규격의 시린지 내에 포함되는 수용액의 용량은, 0.1∼1.2mL의 범위, 바람직하게는 0.2∼1.1mL의 범위이다. 2.5mL 규격의 시린지 내에 포함되는 수용액의 용량은, 0.1∼2.5mL의 범위, 바람직하게는 0.3∼2.3mL의 범위이다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 카트리지 용량의 사이즈(규격)는 특별히 한정되지 않는다. 구체적으로는, 용량이 0.5mL∼20.0mL여도 되고, 예를 들어 1.0mL, 1.5mL, 1.8mL, 2.0mL, 2.2mL, 3.0mL, 5.0mL, 10.0mL, 15.0mL, 20.0mL여도 되지만, 이들 양으로 한정되지 않는다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 사용되는 카트리지는, 플라스틱제 또는 유리제의 표준적인 주사 카트리지이다. 유리제의 주사 카트리지의 치수 및 공차는, 국제 규격의 ISO13926-1에 정해져 있다. 스토퍼 및 봉지(封止)(캡이나 디스크)에 대해서는, 표준적인 국제 규격의 ISO13926-2 및 3에 기재되어 있다. 충전 준비 완료된 시린지 또는 프리필드 시린지의 치수 및 공차는, 국제 규격의 ISO11040-4에 정해져 있다. 하나의 태양에 있어서, 사용되는 카트리지는, 상기 국제 규격의 1 이상을 만족시키는 플라스틱제 또는 유리제의 주사 카트리지이다. 본 발명의 다른 측면에 있어서, 사용되는 카트리지는, ISO 등의 국제 규격에는 합치하지 않는 플라스틱제 또는 유리제의 주사 카트리지이다.
본 발명의 하나의 측면에 있어서, 본 발명의 주사용 제제를 조제하는 방법이 제공된다.
하나의 태양에 있어서, 주사용 제제를 조제하는 방법은, 얻어지는 주사용 제제에 있어서 용기 내의 1기압, 25℃에 있어서의 기포의 용량이 40μL 이하가 되도록, 용기 내에, 용액(예를 들어, 항체를 유효 성분으로서 함유하는 용액)을 충전하는 것을 포함한다.
하나의 태양에 있어서, 주사용 제제를 조제하는 방법은, 얻어지는 주사용 제제에 있어서 용기 내의 1기압, 25℃에 있어서의 기포의 용량이 10μL 이하가 되도록, 용기 내에, 용액(예를 들어, 항체를 유효 성분으로서 함유하는 용액)을 충전하는 것을 포함한다.
하나의 태양에 있어서, 용기 내에의 용액의 충전에 있어서, 진공 스토퍼 배치법 또는 기계적 스토퍼 배치법에 의해 용기의 마개를 한다.
본 발명은, 명확한 이해를 돕는 목적 아래, 실례 및 예시를 이용하여 상세하게 기재되지만, 본 명세서에 있어서의 기재 및 예시는, 본 발명의 범위를 한정하는 것이라고 해석되어서는 안 된다. 본 명세서에서 인용한 모든 특허문헌 및 과학문헌의 개시는, 그 전체에 걸쳐서, 참조에 의해 명시적으로 본 명세서에 원용할 수 있다.
실시예
이하는, 본 발명의 조성물의 예이다. 위에 제공한 일반적인 설명을 고려하면, 다른 다양한 태양을 실시할 수 있음이 이해된다.
실시예 1
재조합 단백질의 발현 및 정제
1.1. 재조합 HLA-DQ2.5/33mer 글리아딘 펩티드 복합체, HLA-DQ2.5/γ2 글리아딘 펩티드 복합체, 및 HLA-DQ2.5/BC 호르데인 펩티드 복합체의 발현 및 정제
재조합 HLA-DQ2.5/33mer 글리아딘 펩티드 복합체의 발현 및 정제
발현 및 정제에 사용한 서열은, HLA-DQA1*0501(Protein Data Bank 억세션 코드 4OZG) 및 HLA-DQB1*0201(Protein Data Bank 억세션 코드 4OZG)이며, 이들은 양쪽 모두 CAMPATH-1H 시그널 서열: MGWSCIILFLVATATGVHS(서열 번호: 170)를 갖는다. HLA-DQA1*0501은, C47S 변이, GGGG 링커(서열 번호: 171) 및 c-fos 류신 지퍼 서열(PNAS, 1998 Sep 29;95(20): 11828-33), 및 Flag 태그를 HLA-DQA1*0501의 C말단에 갖는다. HLA-DQB1*0201은, 33mer 글리아딘 펩티드 서열: LQLQPFPQPELPYPQPELPYPQPELPYPQPQPF(서열 번호: 172), 및 제 X 인자 절단 링커(Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 2007 Dec 1; 63(Pt 12): 1021-1025)를 HLA-DQB1*0201의 N말단에, GGGGG 링커(서열 번호: 173) 및 c-jun 류신 지퍼 서열(PNAS, 1998 Sep 29;95(20): 11828-33), GGGGG 링커(서열 번호: 173), 및 BAP 서열(BMC Biotechnol. 2008; 8: 41), 8×His 태그를 HLA-DQB1*0201의 C말단에 갖는다. FreeStyle293-F 세포주(Thermo Fisher)를 이용하여, 재조합 HLA-DQ2.5/33mer 글리아딘 펩티드 복합체를 일과성으로 발현시켰다. HLA-DQ2.5/33mer 글리아딘 펩티드 복합체를 발현하고 있는 순화 배지를, 고정화 금속 어피니티 크로마토그래피(IMAC) 수지와 함께 인큐베이트하고, 계속해서 이미다졸로 용출했다. HLA-DQ2.5/33mer 글리아딘 펩티드 복합체를 포함하는 획분을 회수한 후, 1×PBS로 평형화한 Superdex 200 겔 여과 컬럼(GE healthcare)에 제공했다. 그 후, HLA-DQ2.5/33mer 글리아딘 펩티드 복합체를 포함하는 획분을 풀링하고, -80℃에서 보존했다.
재조합 HLA-DQ2.5/γ2 글리아딘 펩티드 복합체의 발현 및 정제
발현과 정제를 위해서 사용한 서열은, HLA-DQA1*0501(Protein Data Bank 억세션 코드 4OZG) 및 HLA-DQB1*0201(Protein Data Bank 억세션 코드 4OZG)이며, 이들은 양쪽 모두 CAMPATH-1H 시그널 서열: MGWSCIILFLVATATGVHS(서열 번호: 170)를 갖는다. HLA-DQA1*0501은, C47S 변이, 3C 프로테아제 절단 링커: LEVLFQGP(서열 번호: 174) 및 GGGG 링커(서열 번호: 171), 및 c-fos 류신 지퍼 서열(PNAS, 1998 Sep 29;95(20): 11828-33) 및 Flag 태그를 HLA-DQA1*0501의 C말단에 갖는다. HLA-DQB1*0201은, γ2 글리아딘 펩티드 서열: IIQPEQPAQLP(서열 번호: 175), 및 제 X 인자 절단 링커(Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 2007 Dec 1; 63(Pt 12): 1021-1025)를 HLA-DQB1*0201의 N말단에, 3C 프로테아제 절단 링커: LEVLFQGP(서열 번호: 174) 및 c-jun 류신 지퍼 서열(PNAS, 1998 Sep 29;95(20): 11828-33), GGGGG 링커(서열 번호: 173), 및 BAP 서열(BMC Biotechnol. 2008; 8: 41), 8×His 태그를 HLA-DQB1*0201의 C말단에 갖는다. 재조합 HLA-DQ2.5/γ2 글리아딘 펩티드 복합체는, FreeStyle293-F 세포주를 이용하여 일과성으로 발현시켰다. HLA-DQ2.5/γ2 글리아딘 펩티드 복합체를 발현하고 있는 순화 배지를 IMAC 수지와 함께 인큐베이트하고, 계속해서 이미다졸로 용출했다. HLA-DQ2.5/γ2 글리아딘 펩티드 복합체를 포함하는 획분을 회수한 후, 1×PBS로 평형화한 Superdex 200 겔 여과 컬럼에 제공했다. 그 후, HLA-DQ2.5/γ2 글리아딘 펩티드 복합체를 포함하는 획분을 풀링하고, -80℃에서 보존했다.
재조합 HLA-DQ2.5/BC 호르데인 펩티드 복합체의 발현 및 정제
발현과 정제를 위해서 사용한 서열은, HLA-DQA1*0501(Protein Data Bank 억세션 코드 4OZG) 및 HLA-DQB1*0201(Protein Data Bank 억세션 코드 4OZG)이며, 이들은 양쪽 모두 CAMPATH-1H 시그널 서열: MGWSCIILFLVATATGVHS(서열 번호: 170)를 갖는다. HLA-DQA1*0501은, C47S 변이, 3C 프로테아제 절단 링커: LEVLFQGP(서열 번호: 174) 및 GGGG 링커(서열 번호: 171), 및 c-fos 류신 지퍼 서열(PNAS, 1998 Sep 29;95(20): 11828-33) 및 Flag 태그를 HLA-DQA1*0501의 C말단에 갖는다. HLA-DQB1*0201은, BC 호르데인 펩티드 서열: EPEQPIPEQPQPYPQQP(서열 번호: 176), 및 제 X 인자 절단 링커(Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 2007 Dec 1; 63(Pt 12): 1021-1025)를 HLA-DQB1*0201의 N말단에, 3C 프로테아제 절단 링커: LEVLFQGP(서열 번호: 174) 및 c-jun 류신 지퍼 서열(PNAS, 1998 Sep 29;95(20): 11828-33), GGGGG 링커(서열 번호: 173), 및 BAP 서열(BMC Biotechnol. 2008; 8: 41), 8×His 태그를 HLA-DQB1*0201의 C말단에 갖는다. 재조합 HLA-DQ2.5/BC 호르데인 펩티드 복합체는, FreeStyle293-F 세포주를 이용하여 일과성으로 발현시켰다. HLA-DQ2.5/BC 호르데인 펩티드 복합체를 발현하고 있는 순화 배지를 IMAC 수지와 함께 인큐베이트하고, 계속해서 이미다졸로 용출했다. HLA-DQ2.5/BC 호르데인 펩티드 복합체를 포함하는 획분을 회수한 후, 1×PBS로 평형화한 Superdex 200 겔 여과 컬럼에 제공했다. 그 후, HLA-DQ2.5/BC 호르데인 펩티드 복합체를 포함하는 획분을 풀링하고, -80℃에서 보존했다.
실시예 2
2.1 HLA-DQ2.5, HLA-DQ2.2, HLA-DQ7.5, HLA-DQ8, HLA-DQ5.1, HLA-DQ6.3, HLA-DQ7.3, HLA-DR, 및 HLA-DP를 발현하는 Ba/F3 세포주의 수립
HLA-DQA1*0501 cDNA(IMGT/HLA 억세션 번호 HLA00613), HLA-DQA1*0201 cDNA(IMGT/HLA 억세션 번호 HLA00607), HLA-DQA1*0505 cDNA(IMGT/HLA 억세션 번호 HLA00619), HLA-DQA1*0301 cDNA(IMGT/HLA 억세션 번호 HLA00608), HLA-DQA1*0101 cDNA(IMGT/HLA 억세션 번호 HLA00601), HLA-DQA1*0103 cDNA(IMGT/HLA 억세션 번호 HLA00604), HLA-DQA1*0303 cDNA(IMGT/HLA 억세션 번호 HLA00611), HLA-DRA1*0101 cDNA(GenBank 억세션 번호 NM_019111.4), 또는 HLADPA1*0103 cDNA(IMGT/HLA 억세션 번호 HLA00499)를 발현 벡터 pCXND3(WO2008/156083)에 삽입했다.
HLA-DQB1*0201 cDNA(IMGT/HLA 억세션 번호 HLA00622), HLA-DQB1*0202 cDNA(IMGT/HLA 억세션 번호 HLA00623), HLA-DQB1*0301 cDNA(IMGT/HLA 억세션 번호 HLA00625), HLA-DQB1*0302 cDNA(IMGT/HLA 억세션 번호 HLA00627), HLA-DQB1*0501 cDNA(IMGT/HLA 억세션 번호 HLA00638), HLA-DQB1*0603 cDNA(IMGT/HLA 억세션 번호 HLA00647), HLA-DRB1*0301 cDNA(IMGT/HLA 억세션 번호 HLA00671), 또는 HLA-DPB1*0401 cDNA(IMGT/HLA 억세션 번호 HLA00521)를 발현 벡터 pCXZD1(US/20090324589)에 삽입했다.
선상화한 HLA-DQA1*0501-pCXND3와 HLA-DQB1*0201-pCXZD1의 각각, 및 선상화한 HLA-DQA1*0201-pCXND3와 HLA-DQB1*0202-pCXZD1,
HLA-DQA1*0505-pCXND3와 HLA-DQB1*0301-pCXZD1,
HLA-DQA1*0301-pCXND3와 HLA-DQB1*0302-pCXZD1,
HLA-DQA1*0101-pCXND3와 HLA-DQB1*0501-pCXZD1,
HLA-DQA1*0103-pCXND3와 HLA-DQB1*0603-pCXZD1,
HLA-DQA1*0303-pCXND3와 HLA-DQB1*0301-pCXZD1,
HLA-DRA1*0101-pCXND3와 HLA-DRB1*0301-pCXZD1,
HLA-DPA1*0103-pCXND3와 HLA-DPB1*0401-pCXZD1의 각각을, 일렉트로포레이션(LONZA, 4D-Nucleofector X)에 의해 마우스 IL-3 의존성 프로 B 세포 유래 세포주 Ba/F3에 동시에 도입했다. 다음에, 트랜스펙트된 세포를 제네티신과 제오신을 포함하는 배지 중에서 배양했다. 그 후, 배양하여 증식시킨 세포를 HLA 분자의 발현에 대해 체크하여, HLA의 고발현을 확인했다.
수립된 각 세포주를 이하와 같이 명명했다: Ba/F3-HLA-DQ2.5(HLA-DQA1*0501, HLA-DQB1*0201), Ba/F3-HLA-DQ2.2(HLA-DQA1*0201, HLA-DQB1*0202), Ba/F3-HLA-DQ7.5(HLA-DQA1*0505, HLA-DQB1*0301), Ba/F3-HLA-DQ8(HLA-DQA1*0301, HLA-DQB1*0302), Ba/F3-HLA-DQ5.1(HLA-DQA1*0101, HLA-DQB1*0501), Ba/F3-HLA-DQ6.3(HLA-DQA1*0103, HLA-DQB1*0603), Ba/F3-HLA-DQ7.3(HLA-DQA1*0303, HLA-DQB1*0301), Ba/F3-HLA-DR(HLA-DRA1*0101, HLA-DRB1*0301), Ba/F3-HLA-DP(HLA-DPA1*0103, HLA-DPB1*0401).
2.2 HLA-DQ2.5/CLIP 펩티드, HLA-DQ2.5/B형 간염 바이러스 펩티드, HLA-DQ2.5/살모넬라균 펩티드, HLA-DQ2.5/티로퍼옥시다제 펩티드, HLA-DQ2.5/마이코박테리움 보비스 펩티드, HLA-DQ2.5/α1 글리아딘 펩티드, HLA-DQ2.5/α2 글리아딘 펩티드, HLA-DQ2.5/γ1 글리아딘 펩티드, HLA-DQ2.5/γ2 글리아딘 펩티드, HLA-DQ2.5/ω1 글리아딘 펩티드, HLA-DQ2.5/ω2 글리아딘 펩티드, HLA-DQ2.5/BC 호르데인 펩티드, HLA-DQ2.5/α3 글리아딘 펩티드, HLA-DQ2.5/α1b 글리아딘 펩티드, HLA-DQ2.5/γ4a 글리아딘 펩티드, HLA-DQ2.5/γ4b 글리아딘 펩티드, HLA-DQ2.5/아베닌 1 펩티드, HLA-DQ2.5/아베닌 2 펩티드, HLA-DQ2.5/아베닌 3 펩티드, HLA-DQ2.5/호르데인 1 펩티드, HLA-DQ2.5/호르데인 2 펩티드, HLA-DQ2.5/세칼린 1 펩티드, HLA-DQ2.5/세칼린 2 펩티드, HLA-DQ2.5/33mer 글리아딘 펩티드, HLA-DQ2.5/26mer 글리아딘 펩티드를 발현하는 Ba/F3 세포주의 수립
HLA-DQA1*0501 cDNA(IMGT/HLA 억세션 번호 HLA00613)를 발현 벡터 pCXND3(WO2008/156083)에 삽입했다.
HLA-DQB1*0201 cDNA(IMGT/HLA 억세션 번호 HLA00622)를 발현 벡터 pCXZD1(US/20090324589)에 삽입했다. HLA-DQ2.5/각 펩티드 복합체를 위한 HLA-DQB1*0201은, 각 펩티드 서열 및 제 X 인자 절단 링커(Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 2007 Dec 1; 63(Pt 12): 1021-1025.)를 HLA-DQB1*0201의 N말단에 갖는다. 구체적으로는, 각 펩티드 서열 중, CLIP(hCLIP) 펩티드 서열을 위해서 KLPKPPKPVSKMRMATPLLMQALPMGALP(서열 번호: 177)를 사용하고; B형 간염 바이러스 펩티드 서열을 위해서 PDRVHFASPLHVAWR(서열 번호: 178)를 사용하고; 살모넬라균 펩티드 서열을 위해서 MMAWRMMRY(서열 번호: 179)를 사용하고; 티로퍼옥시다제 펩티드 서열을 위해서 YIDVWLGGLAENFLPY(서열 번호: 180)를 사용하고; 마이코박테리움 보비스 펩티드 서열을 위해서 KPLLIIAEDVEGEY(서열 번호: 181)를 사용하고; α1 글리아딘 펩티드 서열을 위해서 QPFPQPELPYP(서열 번호: 182)를 사용하고; α2 글리아딘 펩티드 서열을 위해서 FPQPELPYPQP(서열 번호: 183)를 사용하고; γ1 글리아딘 펩티드 서열을 위해서 QPQQSFPEQQQ(서열 번호: 184)를 사용하고; γ2 글리아딘 펩티드 서열을 위해서 GIIQPEQPAQLP(서열 번호: 185)를 사용하고; ω1 글리아딘 펩티드 서열을 위해서 QPFPQPEQPFP(서열 번호: 186)를 사용하고; ω2 글리아딘 펩티드 서열을 위해서 FPQPEQPFPWQ(서열 번호: 187)를 사용하고; BC 호르데인 펩티드 서열을 위해서 PQQPIPEQPQPYPQQP(서열 번호: 188)를 사용하고; α3 글리아딘 펩티드 서열을 위해서 PFRPEQPYPQP(서열 번호: 189)를 사용하고; α1b 글리아딘 펩티드 서열을 위해서 LPYPQPELPYP(서열 번호: 190)를 사용하고; γ4a 글리아딘 펩티드 서열을 위해서 FSQPEQEFPQP(서열 번호: 191)를 사용하고; γ4b 글리아딘 펩티드 서열을 위해서 FPQPEQEFPQP(서열 번호: 192)를 사용하고; 아베닌 1 펩티드 서열을 위해서 QPYPEQEEPFV(서열 번호: 193)를 사용하고; 아베닌 2 펩티드 서열을 위해서 QPYPEQEQPFV(서열 번호: 194)를 사용하고; 아베닌 3 펩티드 서열을 위해서 QPYPEQEQPIL(서열 번호: 195)를 사용하고; 호르데인 1 펩티드 서열을 위해서 PQQPFPQPEQPFRQ(서열 번호: 196)를 사용하고; 호르데인 2 펩티드 서열을 위해서 QEFPQPEQPFPQQP(서열 번호: 197)를 사용하고; 세칼린 1 펩티드 서열을 위해서 PEQPFPQPEQPFPQ(서열 번호: 198)를 사용하고; 세칼린 2 펩티드 서열을 위해서 QPFPQPEQPFPQSQ(서열 번호: 199)를 사용하고; 14mer 1 펩티드 서열을 위해서 PQQQTLQPEQPAQLP(서열 번호: 200)를 사용하고; 33mer 글리아딘 펩티드 서열을 위해서 LQLQPFPQPELPYPQPELPYPQPELPYPQPQPF(서열 번호: 201)를 사용하고; 26mer 글리아딘 펩티드 서열을 위해서 FLQPEQPFPEQPEQPYPEQPEQPFPQ(서열 번호: 202)를 사용했다.
선상화한 HLA-DQA1*0501-pCXND3와 HLA-DQB1*0201/각 펩티드-pCXZD1의 각각을, 일렉트로포레이션(LONZA, 4D-Nucleofector X)에 의해 마우스 IL-3 의존성 프로 B 세포 유래 세포주 Ba/F3에 동시에 도입했다. 다음에, 트랜스펙트된 세포를 제네티신과 제오신을 포함하는 배지 중에서 배양했다.
그 후, 배양하여 증식시킨 세포를 HLA-DQ2.5 분자의 발현에 대해 체크하여, HLA-DQ2.5의 고발현을 확인했다. 수립된 각 세포주를 이하와 같이 명명했다: Ba/F3-HLA-DQ2.5/CLIP(HLA-DQA1*0501, HLA-DQ2.5/CLIP 펩티드의 HLA-DQB1*0201), Ba/F3-HLA-DQ2.5/HBV1(HLA-DQA1*0501, HLA-DQ2.5/B형 간염 바이러스 펩티드의 HLA-DQB1*0201), Ba/F3-HLA-DQ2.5/살모넬라균(HLA-DQA1*0501, HLA-DQ2.5/살모넬라균 펩티드의 HLA-DQB1*0201), Ba/F3-HLA-DQ2.5/TPO(HLA-DQA1*0501, HLA-DQ2.5/티로퍼옥시다제 펩티드의 HLA-DQB1*0201), Ba/F3-HLA-DQ2.5/M. 보비스(HLA-DQA1*0501, HLA-DQ2.5/마이코박테리움 보비스 펩티드의 HLA-DQB1*0201), Ba/F3-HLA-DQ2.5/α1 글리아딘(HLA-DQA1*0501, HLA-DQ2.5/α1 글리아딘 펩티드의 HLA-DQB1*0201), Ba/F3-HLA-DQ2.5/α2 글리아딘(HLA-DQA1*0501, HLA-DQ2.5/α2 글리아딘 펩티드의 HLA-DQB1*0201), Ba/F3-HLA-DQ2.5/γ1 글리아딘(HLA-DQA1*0501, HLA-DQ2.5/γ1 글리아딘 펩티드의 HLA-DQB1*0201), Ba/F3-HLA-DQ2.5/γ2 글리아딘(HLA-DQA1*0501, HLA-DQ2.5/γ2 글리아딘 펩티드의 HLA-DQB1*0201), Ba/F3-HLA-DQ2.5/ω1 글리아딘(HLA-DQA1*0501, HLA-DQ2.5/ω1 글리아딘 펩티드의 HLA-DQB1*0201), Ba/F3-HLA-DQ2.5/ω2 글리아딘(HLA-DQA1*0501, HLA-DQ2.5/ω2 글리아딘 펩티드의 HLA-DQB1*0201), Ba/F3-HLA-DQ2.5/BC 호르데인(HLA-DQA1*0501, HLA-DQ2.5/BC 호르데인 펩티드의 HLA-DQB1*0201), Ba/F3-HLA-DQ2.5/α3 글리아딘(HLA-DQA1*0501, HLA-DQ2.5/α3 글리아딘 펩티드의 HLA-DQB1*0201), Ba/F3-HLA-DQ2.5/α1b 글리아딘(HLA-DQA1*0501, HLA-DQ2.5/α1b 글리아딘 펩티드의 HLA-DQB1*0201), Ba/F3-HLA-DQ2.5/γ4a 글리아딘(HLA-DQA1*0501, HLA-DQ2.5/γ4a 글리아딘 펩티드의 HLA-DQB1*0201), Ba/F3-HLA-DQ2.5/γ4b 글리아딘(HLA-DQA1*0501, HLA-DQ2.5/γ4b 글리아딘 펩티드의 HLA-DQB1*0201), Ba/F3-HLA-DQ2.5/아베닌 1(HLA-DQA1*0501, HLA-DQ2.5/아베닌 1 펩티드의 HLA-DQB1*0201), Ba/F3-HLA-DQ2.5/아베닌 2(HLA-DQA1*0501, HLA-DQ2.5/아베닌 2 펩티드의 HLA-DQB1*0201), Ba/F3-HLA-DQ2.5/아베닌 3(HLA-DQA1*0501, HLA-DQ2.5/아베닌 3 펩티드의 HLA-DQB1*0201), Ba/F3-HLA-DQ2.5/호르데인 1(HLA-DQA1*0501, HLA-DQ2.5/호르데인 1 펩티드의 HLA-DQB1*0201), Ba/F3-HLA-DQ2.5/호르데인 2(HLA-DQA1*0501, HLA-DQ2.5/호르데인 2 펩티드의 HLA-DQB1*0201), Ba/F3-HLA-DQ2.5/세칼린 1(HLA-DQA1*0501, HLA-DQ2.5/세칼린 1 펩티드의 HLA-DQB1*0201), Ba/F3-HLA-DQ2.5/세칼린 2(HLA-DQA1*0501, HLA-DQ2.5/세칼린 2 펩티드의 HLA-DQB1*0201), Ba/F3-HLA-DQ2.5/14mer 1(HLA-DQA1*0501, HLA-DQ2.5/14mer 1 펩티드의 HLA-DQB1*0201), Ba/F3-HLA-DQ2.5/33mer 글리아딘(HLA-DQA1*0501, HLA-DQ2.5/33mer 글리아딘 펩티드의 HLA-DQB1*0201), Ba/F3-HLA-DQ2.5/26mer 글리아딘(HLA-DQA1*0501, HLA-DQ2.5/26mer 글리아딘 펩티드의 HLA-DQB1*0201).
실시예 3
리드 항체의 특정
항DQ2.5 리드 항체인 DQN0344xx(중쇄: DQN0344Hx, 서열 번호: 71 및 경쇄: DQN0344Lx, 서열 번호: 75) 및 DQN0385ee(중쇄: DQN0385He, 서열 번호: 79 및 경쇄: DQN0385Le, 서열 번호: 83)를, WO2019069993에 기재되어 있는 수순에 따라 선택했다.
인간화
DQN0344xx 및 DQN0385ee는, HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드에 대해서 바람직한 선택성 및 교차 반응성을 나타냈지만, 이들 항체의 가변 영역은, 토끼의 서열이며, 따라, 면역원성의 문제 때문에 환자 중으로의 투여에는 적용 불가능하다. 그 때문에, 이들 항체에 대해 가변 영역의 인간화를 행했다.
DQN0344Hx 및 DQN0385He의 프레임워크를 인간 생식 계열 프레임워크로 치환하는 것에 의해, 49타입의 VH를 설계했다(FR1로서 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7, FR2로서 DNQ0344Hx에 대해서는 서열 번호: 9 및 DQN0385He에 대해서는 서열 번호: 10, FR3으로서 서열 번호: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17, FR4로서 DNQ0344Hx에 대해서는 서열 번호: 18 및 DQN0385He에 대해서는 서열 번호: 19). DQN0344Lx 및 DQN0385Le의 프레임워크를 인간 생식 계열 프레임워크로 치환하는 것에 의해, 16타입의 VL을 설계했다(FR1로서 서열 번호: 20, 21, 22, 또는 23, FR2로서 DNQ0344Lx에 대해서는 서열 번호: 24 및 DQN0385Le에 대해서는 서열 번호: 34, FR3으로서 서열 번호: 26, 27, 28, 또는 29, FR4로서 서열 번호: 30). DQN0344Hx, DQN0385He, 및 설계된 VH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 각각, 중쇄 정상 영역 SG1(서열 번호: 31)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터 중에 클로닝했다. DQN0344Lx, DQN0385Le, 및 설계된 VL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 각각, 경쇄 정상 영역 SK1(서열 번호: 32)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터 중에 클로닝했다. 그 후, DQN0344Hx 또는 DQN0385He를, 각각의 설계된 VH와 함께 포함하는 중쇄를, 그들의 대응하는 경쇄인 DQN0344Lx, DQN0385Le, 또는 각각의 설계된 VL과 Expi293(Invitrogen) 중에서 일과성으로 발현시키고, 계속해서 프로틴 A 정제를 행했다.
HLA-DQ2.5/복수의 글루텐 펩티드에 대한 이들 항체의 결합 프로파일을, FCM 해석에 의해 평가했다. 각 항체의 결합 활성을, 평균 형광 강도치(MFI)에 의해 나타낸다. 항체를, HLA-DQ2.5-글루텐 펩티드 Ba/F3 세포와 함께 실온에서 30분간 인큐베이트하고, FACS 버퍼(PBS 중의 2% FBS, 2mM EDTA)로 세정했다. 그 다음에, 염소 F(ab')2 항인간 IgG, 마우스 ads-PE(Southern Biotech, 카탈로그 번호 2043-09)를 가하고, 암소(暗所), 4℃에서 20분간 인큐베이트하고, 그 후 세정했다. 데이터 수집을, LSRFortessa X-20(Becton Dickinson)으로 행하고, 계속해서 FlowJo 소프트웨어(Tree Star) 및 Microsoft Office Excel2013을 이용하여 해석했다.
49타입의 설계된 VH 및 16타입의 설계된 VL 중에서, HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드에 대한 결합 및 항체 발현 레벨에 기초하여, (표 2-1에 나타내는 바와 같이) 25H 및 09L을, DQN0344xx에 있어서의 프레임워크 영역 서열로서 선택하여, DQN034425(DQN034425H/09L(중쇄는 서열 번호: 84, 경쇄는 서열 번호: 85))이라고 명명했다. 그러나, FR의 조합의 어느 것도, DQN0385ee와 비교하여 HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드에 대한 결합 활성을 유지할 수 없었다. HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드에 대한 결합 활성을 해치지 않고 DQN0385ee를 인간화하는 것은, 난제인 것 같이 보인다. 제작된 수많은 배리언트로부터, 0054H 및 009L을, DQN0385He 및 DQN0385Le를 위한 FR의 조합으로서 최종적으로 선택하여(표 2-1에 나타낸다), DQN0385ee0054(DQN0385ee0054H/009L(중쇄는 서열 번호: 87, 경쇄는 서열 번호: 86))라고 명명했다.
(표 2-1)
Figure 112022135454077-pct00007
Fab의 최적화
HLA-DQ2.5/무관계한 펩티드에 대한 결합을 증가시키지 않고 HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드에 대한 결합 어피니티를 개선하기 위해서, CDR에 있어서의 및 FR 중의 몇몇 위치에 있어서의 포괄적 변이 도입을 행했다. 그 다음에, 복수의 변이 및 변이의 조합을 행하여, 무관계한 펩티드를 상회하는 HLA-DQ2.5/복수의 글루텐 펩티드에 대한 결합의 선택성 등의 다차원의 특성, 및 항체 발현 레벨, 및 항체 약물동태에 영향을 미칠 수 있는 ECM 결합 등의 물리화학적 특성을 개선했다(US2014/0080153).
DQN0344xx 및 DQN0385ee의 양쪽을 인간화했지만, 토끼 항체 서열에 일반적으로 발견되는 CDRH1(Kabat 넘버링에 따른 35a위, Kabat et al., Sequence of proteins of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) 및 CDRH2(Kabat 넘버링에 따른 50위)에 위치하는 2개의 시스테인 잔기는, 다이설파이드 결합 형성의 불균일성을 가져올 가능성이 있었다. 따라서, 이들 시스테인 잔기의 다른 아미노산으로의 치환을 행했다. 그러나, 그와 같은 치환(DQN034425H에 있어서의 C35aV/C50A 및 DQN0385ee0054H에 있어서의 C35aS/C50S)은, 유의하게, HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드에 대한 결합 어피니티를 감소시키고, 또한/또는 항체 발현 레벨을 감소시켰다. 결합 어피니티를 개선하기 위해서, S32A, N73T, 및 D95E를 DQN034425H 중에 도입하고; N28E, A55Y, S56E, H92E, I94V, 및 N95aA를 DQN034409L 중에 도입하고; S30A, S32W, W34F, 및 S61G를 DQN0385ee0054H 중에 도입하고, 또한 A25T, L54K, 및 S67L을 DQN0385ee009L 중에 도입했다. 항체 발현 레벨을 개선하기 위해서, R16G, S61K, K64E, 및 L102V를 DQN034425H 중에 도입하고, 또한 S31E 및 I35M을 DQN0385ee0054H 중에 도입했다. 더하여, ECM 결합 및 HLA-DQ2.5/CLIP 등의 HLA-DQ2.5/무관계한 펩티드에 대한 결합을 저하시키기 위해서, R16G 및 K64E를 DQN034425H 중에 도입하고; S56Y를 DQN034409L 중에 도입하고; T28E, S30A, S61E, 및 G65E를 DQN0385ee0054H 중에 도입하고, 또한 S56E 및 Y94K를 DQN0385ee009L 중에 도입했다. pI를 저하시키기 위해서, S30E, N64E를 DQN0385ee0054H 중에 도입하고, 음전하를 저하시키기 위해서, E79Q를 DQN0385ee009L 중에 도입했다.
모든 항체를, 구축된 유전자를 이용하여 당업자에게 공지된 방법에 의해 포유동물 세포에 있어서 일과성으로 발현시키고, 당업자에게 공지된 방법에 의해 정제했다. 아미노산 치환의 조합을, 표 2-2에 요약했다.
(표 2-2)
Figure 112022135454077-pct00008
이중 특이성 항체의 제작
펩티드 적용 범위를 더 확장하기 위해서, 복수의 HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드 복합체에 대해서 넓은 교차 반응 결합을 나타내는 이중 특이성 항체를 제작했다. 이중 특이성 항체를 제작하기 위해서, 13종류의 다중 글루텐 펩티드 선택적 HLA-DQ2.5 2가 항체를 이용했다(DQN0344xx, DQN0385ee, DQN034425H/09L, DQN0385ee0054H/009L, DQN0344H0976/L0591, DQN0344H1013/L0620, DQN0385H1270/L0722, DQN0385H1521/L0605, DQN0385H1270/L0681, DQN0385H1352/L0681, DQN0385H1527/L0605, DQN0385H1353/L0681, 및 DQN0385H1255/L0605). 정제된 이들 2가 항체를, (Igawa et al. WO2016/159213에 기재되어 있는 바와 같이) Fab 암 교환 기술에 제공하여, 16종류의 이중 특이성 항체를 제작했다;
DQN0344xx//DQN0385ee(DQN0344xx와 DQN0385ee의 이중 특이성 항체), DQN034425//DQN0385ee0054(DQN034425H/09L과 DQN0385ee0054H/009L의 이중 특이성 항체), DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0722-F6(DQN0344H0976/L0591과 DQN0385H1270/L0722의 이중 특이성 항체), DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0681-F6(DQN0344H0976/L0591과 DQN0385H1270/L0681의 이중 특이성 항체), DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1352/L0681-F6(DQN0344H0976/L0591과 DQN0385H1352/L0681의 이중 특이성 항체), DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1527/L0605-F6(DQN0344H0976/L0591과 DQN0385H1527/L0605의 이중 특이성 항체), DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6(DQN0344H0976/L0591과 DQN0385H1255/L0605의 이중 특이성 항체), DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0722-F6(DQN0344H1013/L0620과 DQN0385H1270/L0722의 이중 특이성 항체), DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6(DQN0344H1013/L0620과 DQN0385H1521/L0605의 이중 특이성 항체), DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6(DQN0344H1013/L0620과 DQN0385H1270/L0681의 이중 특이성 항체), DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1352/L0681-F6(DQN0344H1013/L0620과 DQN0385H1352/L0681의 이중 특이성 항체), DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1353/L0681-F6(DQN0344H1013/L0620과 DQN0385H1353/L0681의 이중 특이성 항체), DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1521/L0605-F6(DQN0344H0976/L0591과 DQN0385H1521/L0605의 이중 특이성 항체), DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1353/L0681-F6(DQN0344H0976/L0591과 DQN0385H1353/L0681의 이중 특이성 항체), DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1255/L0605-F6(DQN0344H1013/L0620과 DQN0385H1255/L0605의 이중 특이성 항체), 및 DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1527/L0605-F6(DQN0344H1013/L0620과 DQN0385H1527/L0605의 이중 특이성 항체). 산생된 이중 특이성 항체의 조합 및 서열을, 표 2-3∼2-6에 요약했다.
상기와 같이, 이중 특이성 항체를, Fab 암 교환 기술에 의해 제작했다. 혹은, 이중 특이성 항체는 또한, 2개의 상이한 중쇄 및 2개의 상이한 경쇄의 플라스미드를 포유동물 세포 중에 트랜스펙트하는 것에 의해서도 제작할 수 있다. 목적하는 이중 특이성 항체를 효율적으로 얻기 위해서는, 소망의 H쇄-L쇄 회합을 촉진하는 CHI-CL 도메인 경계면에 있어서의 공지된 아미노산 치환 및 조합이 있다(WO2019065795). 그와 같은 정상 영역(DQN0344 암에 대한 중쇄 정상 영역: 서열 번호: 162, DQN0344 암에 대한 경쇄 정상 영역: 서열 번호: 106, DQN0385 암에 대한 중쇄 정상 영역: 서열 번호: 163, DQN0385 암에 대한 경쇄 정상 영역: 서열 번호: 107. 전장의 서열 번호를, 표 2-3∼2-6에 요약했다)을 수반하는 상기의 가변 영역 서열은, HLA-DQ2.5/복수의 글루텐 펩티드에 대해서 유사한 결합 특성을 나타냄이 알려져 있다.
(표 2-3)
Figure 112022135454077-pct00009
(표 2-4)
Figure 112022135454077-pct00010
(표 2-5)
Figure 112022135454077-pct00011
(표 2-6)
Figure 112022135454077-pct00012
실시예 4
클래스 II HLA에 대한 항체의 결합 해석
도 1a∼1p는, FACS에 의해 측정된, 몇몇 펩티드와의 복합체의 형태에 있는 HLA-DQ를 발현하는 Ba/F3 세포주의 패널에 대한 각 항HLA-DQ 항체의 결합을 나타낸다. Ba/F3-HLA-DQ2.5, Ba/F3-HLA-DQ2.2, Ba/F3-HLA-DQ7.5, Ba/F3-HLA-DQ8, Ba/F3-HLA-DQ7.3, Ba/F3-HLA-DQ5.1, Ba/F3-HLA-DQ6.3, Ba/F3-HLA-DR, Ba/F3-HLA-DP, Ba/F3-HLA-DQ2.5/CLIP, Ba/F3-HLA-DQ2.5/HBV1, Ba/F3-HLA-DQ2.5/살모넬라균, Ba/F3-HLA-DQ2.5/TPO, Ba/F3-HLA-DQ2.5/M. 보비스, Ba/F3-HLA-DQ2.5/α1 글리아딘, Ba/F3-HLA-DQ2.5/α2 글리아딘, Ba/F3-HLA-DQ2.5/γ1 글리아딘, Ba/F3-HLA-DQ2.5/γ2 글리아딘, Ba/F3-HLA-DQ2.5/ω1 글리아딘, Ba/F3-HLA-DQ2.5/ω2 글리아딘, Ba/F3-HLA-DQ2.5/BC 호르데인, Ba/F3-HLA-DQ2.5/α3 글리아딘, Ba/F3-HLA-DQ2.5/α1b 글리아딘, Ba/F3-HLA-DQ2.5/γ4a 글리아딘, Ba/F3-HLA-DQ2.5/γ4b 글리아딘, Ba/F3-HLA-DQ2.5/아베닌 1, Ba/F3-HLA-DQ2.5/아베닌 2, Ba/F3-HLA-DQ2.5/아베닌 3, Ba/F3-HLA-DQ2.5/호르데인 1, Ba/F3-HLA-DQ2.5/호르데인 2, Ba/F3-HLA-DQ2.5/세칼린 1, Ba/F3-HLA-DQ2.5/세칼린 2, Ba/F3-HLA-DQ2.5/33mer 글리아딘, Ba/F3-HLA-DQ2.5/26mer 글리아딘에 대한 항HLA-DQ 항체의 결합을, 시험했다. 50ng/mL의 항HLA-DQ 항체, 및 1μg/mL의 대조의 DQN0139bb 항체 및 IC17dK 항체를, 각 세포주와 함께 실온에서 30분간 인큐베이트했다. 예외는, DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1521/L0605-F6, DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1353/L0681-F6, 및 DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1255/L0605-F6에 대한 것이고, Ba/F3-HLA-DQ2.5 및 Ba/F3-HLA-DQ2.5/CLIP에 대해서만, 이들 항HLA-DQ 항체를 313ng/mL로 이용하고, 각각의 대조의 DQN0139bb 항체 및 IC17dK 항체를 20μg/mL로 이용했다. 인큐베이션 후에, 세포주를, FACS 버퍼(PBS 중의 2% FBS, 2mM EDTA)로 세정했다. 그 다음에, 염소 F(ab')2 항인간 IgG, 마우스 ads-PE(Southern Biotech, 카탈로그 번호 2043-09)를 가하고, 4℃에서 20분간 인큐베이트하고, 계속해서 이것을 FACS 버퍼로 세정했다. 데이터 수집을, LSRFortessa X-20(Becton Dickinson)으로 행하고, 계속해서 FlowJo 소프트웨어(Tree Star) 및 Microsoft Office Excel2013을 이용하여 해석했다. IC17dK의 MFI치를 0%로 하고, DQN0139bb의 MFI치를 100%로 하는 것에 의해, 항체의 %MFI를 결정했다.
도 1a∼1m은, 상기와 같은 Ba/F3 세포주의 패널에 대한 13종류의 이중 특이성 항HLA-DQ 항체(배리언트
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0722-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0681-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1352/L0681-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1527/L0605-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0722-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1352/L0681-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1353/L0681-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1521/L0605-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1353/L0681-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1255/L0605-F6)의 결합을 나타낸다. 이들 13종류의 이중 특이성 항HLA-DQ 항체는, 시험한 글루텐 유래 펩티드(즉, 33mer 글리아딘 펩티드, α1 글리아딘 펩티드, α2 글리아딘 펩티드, γ1 글리아딘 펩티드, γ2 글리아딘 펩티드, ω1 글리아딘 펩티드, ω2 글리아딘 펩티드, BC 호르데인 펩티드, α3 글리아딘 펩티드, α1b 글리아딘 펩티드, γ4a 글리아딘 펩티드, γ4b 글리아딘 펩티드, 아베닌 1 펩티드, 아베닌 2 펩티드, 아베닌 3 펩티드, 호르데인 1 펩티드, 호르데인 2 펩티드, 세칼린 1 펩티드, 세칼린 2 펩티드, 및 26mer 글리아딘 펩티드)와의 복합체의 형태에 있는 경우에만, HLA-DQ2.5에 대해서 다양한 정도의 유의한 결합 활성을 갖는다. γ2 글리아딘 펩티드에 대한 13종류의 이중 특이성 항HLA-DQ 항체의 결합은, 약간 적다. 다른 한편, 13종류의 이중 특이성 항HLA-DQ 항체는, 글루텐 펩티드와는 무관계한 펩티드와의 복합체의 형태에 있는 경우, 또는 비HLA-DQ2.5 하플로타입에 제공되었을 경우(도 1n를 포함)에는, HLA-DQ2.5에 대해서 결합 활성을 실질적으로 갖지 않는다.
도 1o 및 1p는, 각각, 양성 결합 대조(DQN0139bb) 및 음성 결합 대조(IC17dK)이다.
실시예 5
HLA-DQ2.5+ PBMC B 세포에 대한 항체의 결합 해석
도 2는, FACS에 의해 측정된, HLA-DQ2.5 양성 PBMC-B 세포에 대한 각 항HLA-DQ 항체의 결합을 나타낸다.
인간 FcR 블로킹 시약(Miltenyi, 카탈로그 번호130-059-901)을 가하고, 4℃에서 10분간 인큐베이트했다. 50ng/mL의 항HLA-DQ 항체, 및 1μg/mL의 대조의 DQN0139bb 항체 및 IC17dK 항체를, 각 세포주와 함께 실온에서 30분간 인큐베이트했다. 예외는, DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1521/L0605-F6, DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1353/L0681-F6, 및 DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1255/L0605-F6에 대한 것이고, 이들 항HLA-DQ 항체는 313ng/mL로 이용하고, 각각의 대조의 DQN0139bb 항체 및 IC17dK 항체는 20μg/mL로 이용했다. 인큐베이션 후에, 세포를, FACS 버퍼(PBS 중의 2% FBS, 2mM EDTA)로 세정했다. 비오틴 컨주게이트 항인간 항체(Chugai, BIO12-deltaGK Ab) 및 Pacific BlueTM 항인간 CD19 항체 마우스 IgG1k(Biolegend, 카탈로그 번호 302232)를, 동시에 가하고 4℃에서 30분간 인큐베이트하고, 계속해서 이것을 FACS 버퍼로 세정했다. 그 다음에, PE 스트렙트아비딘(Biolegend, 카탈로그 번호 405203)을 가하고 4℃에서 15분간 인큐베이트하고, 계속해서 이것을 FACS 버퍼로 세정했다. 데이터 수집을, LSRFortessa X-20(Becton Dickinson)으로 행하고, 계속해서 FlowJo 소프트웨어(Tree Star) 및 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad)를 이용하여 해석했다. IC17dk의 MFI치를 0%로 하고, DQN0139bb의 MFI치를 100%로 하는 것에 의해, 항체의 %MFI를 결정했다.
도 2는, 13종류의 이중 특이성 항HLA-DQ 항체(배리언트
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0722-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0681-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1352/L0681-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1527/L0605-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0722-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1352/L0681-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1353/L0681-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1521/L0605-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1353/L0681-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1255/L0605-F6)가, HLA-DQ2.5 양성 PBMC-B 세포에 대한 결합을 실질적으로 갖지 않음을 나타낸다.
실시예 6
6.1 αβTCR KO Jurkat NFAT-Luc 세포주의 수립
Cas9와 TCR 정상 영역을 표적으로 하는 싱글 가이드 RNA(Blood. 2018;131:311-22.)로 구성되는 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체(Takara Bio)를, 일렉트로포레이션(LONZA, Nucleofector 2b)에 의해 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포주(Promega Corporation, CS176401)에 도입했다. TCRα쇄 및 TCRβ쇄에 대한 모든 싱글 가이드 RNA를 혼합하고, 동시에 도입했다. RNP를 도입한 세포를, 하이그로마이신 B를 함유하는 배지 중에서 배양하고, 계속해서 FACS Aria III(Becton, Dickinson and Company)에서의 싱글 셀 클로닝을 행했다. 그 다음에, TCRα쇄 및 TCRβ쇄의 서열을 체크하여, TCRα쇄 및 TCRβ쇄가 녹아웃된 Jurkat NFAT-Luc 유래의 클론을 특정했다. 수립된 클론을, TCR KO Jurkat NFAT-Luc라고 명명했다.
6.2 HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드 구속성 TCR을 일과성으로 발현하는 αβTCR KO Jurkat NFAT-Luc 세포주의 수립
TCR 아미노 서열 정보를, 공적 정보로부터, 또는 물질 이동 합의서에 기초하여 Oslo university로부터 입수했다. HLA-DQ2.5/α1 글리아딘 구속성 TCR(TCC ID: 387.9), HLA-DQ2.5/α1b 글리아딘 구속성 TCR(TCC ID: 370.2.25), HLA-DQ2.5/ω1 글리아딘 구속성 TCR(TCC ID: 442D.A.2), HLA-DQ2.5/ω2 글리아딘 구속성 TCR(TCC ID: 578.42), HLA-DQ2.5/γ1 글리아딘 구속성 TCR(TCC ID: 820.27), HLA-DQ2.5/γ2 글리아딘 구속성 TCR(TCC ID: 430.1.41), HLA-DQ2.5/γ3 글리아딘 구속성 TCR(TCC ID: /.2.23), HLA-DQ2.5/γ4a 글리아딘 구속성 TCR(TCC ID: 430.1.36), HLA-DQ2.5/γ4d 글리아딘 구속성 TCR(TCC ID: 430.1.94)의 아미노산 서열 정보는, 물질 이동 합의서에 기초하여 Oslo University로부터 입수했다. HLA-DQ2.5/α2 글리아딘 구속성 TCR(DQ2.5/α2 글리아딘 구속성 TCR)의 아미노산 서열 정보는, Nat Struct Mol Biol. 2014;21:480-8로부터 입수하고, HLA-DQ2.5/BC 호르데인 구속성 TCR(TCC ID: 1468.2)의 아미노산 서열 정보는, Eur J Immunol. 2020; 50: 256-269로부터 입수했다. 각 TCRβ쇄 서열을, 2A 자기 절단 펩티드 서열(P2A, 아미노산 서열: GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP, 서열 번호: 203)에 의해 대응하는 TCRα쇄 서열과 연결시켰다. HLA-DQ2.5/γ2 글리아딘 구속성 TCR 및 HLA-DQ2.5/α2 글리아딘 구속성 TCR을 제외하고, 모든 TCRα쇄 및 TCRβ쇄는, 이들 자체의 천연 시그널 펩티드 서열을 갖는다. HLA-DQ2.5/γ2 글리아딘 구속성 TCR의 천연 시그널 서열은, Campath 시그널 서열(MGWSCIILFLVATATGVHS, 서열 번호: 170)에 의해 치환했다. Campath 시그널 서열을 또한, HLA-DQ2.5/α2 글리아딘 구속성 TCR의 N말단에도 붙였다. 그 다음에, 각각의 코돈 최적화된 TCRβ쇄-P2A-TCRα쇄 cDNA를, Genscript로 발현 벡터 pCXZD1(US/20090324589) 중에 삽입했다. 벡터의 αβTCR-KO Jurkat-NFAT-luc2 중으로의 일렉트로포레이션을, SE Cell Line 4D-NucleofectorTM Kit의 프로토콜에 따르는 것에 의해 행했다.
6.3 HLA-DQ2.5/α1 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA DQ 항체의 저해 효과를 확인했다.
50μL의 IHW09023 세포(International Histocompatibility Working Group, Fred Hutch)(8.0×104세포/웰)와 33mer 글리아딘 펩티드(LQLQPFPQPELPYPQPELPYPQPELPYPQPQPF, 서열 번호: 201, 250nM)의 혼합물을, 96웰 플레이트(Corning, 3799)에 분배했다. 그 다음에, 25μL의 단계 희석한 항HLA DQ 항체를 가하고, 25μL의 α1 글리아딘 구속성 TCR이 트랜스펙트된 αβTCR-KO Jurkat-NFAT-luc2(2.0×104세포/웰)를 마지막으로 가하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이트했다. 하룻밤 배양 후에, 50μL의 배양 세포를 회수하고, OptiPlate-96(PerkinElmer, 6005299)에 재분배했다. 그 다음에, 50μL의 Bio-Glo(Promega, G7491)를 가하고 실온에서 10분간 인큐베이트하고, Envision(PerkinElmer)으로 발광을 측정하고, 계속해서, Outlook Excel 2013(Microsoft) 및 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad)를 이용하여 해석했다. 항체를 수반하지 않는 항원 펩티드의 비존재하에서의 웰의 초당 평균 카운트수(cps)를 100%로 하고, 항체를 수반하지 않는 항원의 존재하에서의 웰의 cps를 0%로 했을 때의, 항HLA DQ 항체의 저해 효과(%)를 결정했다. IC50치는, XLfit Excel 애드인 소프트웨어(IDBS)를 이용하여 결정했다.
도 3a 및 표 2-7에 나타내는 바와 같이, 모든 시험한 항HLA DQ 항체는, HLA-DQ2.5/α1 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 저해 효과를, 용량 의존적인 양식에 의해 나타냈다. 특히,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0722-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0681-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1352/L0681-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1527/L0605-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0722-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1352/L0681-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1353/L0681-F6은, DQN0344xx, DQN0344xx//DQN0385ee, DQN034425, 및 DQN034425//DQN0385ee0054와 비교하여 보다 강한, HLA-DQ2.5/α1 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 중화 활성을 나타냈다.
6.4 HLA-DQ2.5/α2 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA DQ 항체의 저해 효과를 확인했다.
50μL의 IHW09023 세포(8.0×104세포/웰)와 33mer 글리아딘 펩티드(LQLQPFPQPELPYPQPELPYPQPELPYPQPQPF, 서열 번호: 201, 250nM)의 혼합물을, 96웰 플레이트(Corning, 3799)에 분배했다. 그 다음에, 25μL의 단계 희석한 항HLA DQ 항체를 가하고, 25μL의 α2 글리아딘 구속성 TCR이 트랜스펙트된 αβTCR-KO Jurkat-NFAT-luc2(2.0×104세포/웰)를 마지막으로 가하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이트했다. 하룻밤 배양 후에, 50μL의 배양 세포를 회수하고, OptiPlate-96(PerkinElmer, 6005299)에 재분배했다. 그 다음에, 50μL의 Bio-Glo(Promega, G7491)를 가하고 실온에서 10분간 인큐베이트하고, Envision(PerkinElmer)으로 발광을 측정하고, 계속해서, Outlook Excel 2013(Microsoft) 및 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad)를 이용하여 해석했다. 항체를 수반하지 않는 항원 펩티드의 비존재하에서의 웰의 초당 평균 카운트수(cps)를 100%로 하고, 항체를 수반하지 않는 항원의 존재하에서의 웰의 cps를 0%로 했을 때의, 항HLA DQ 항체의 저해 효과(%)를 결정했다. IC50치는, XLfit Excel 애드인 소프트웨어(IDBS)를 이용하여 결정했다.
도 3b 및 표 2-7에 나타내는 바와 같이, 모든 시험한 항HLA DQ 항체는, HLA-DQ2.5/α2 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 저해 효과를, 용량 의존적인 양식에 의해 나타냈다. 특히,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0722-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0681-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1352/L0681-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1527/L0605-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0722-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1352/L0681-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1353/L0681-F6은, DQN0344xx, DQN0344xx//DQN0385ee, DQN034425, 및 DQN034425//DQN0385ee0054와 비교하여 보다 강한, HLA-DQ2.5/α2 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 중화 활성을 나타냈다.
6.5 HLA-DQ2.5/α1b 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA DQ 항체의 저해 효과를 확인했다.
50μL의 IHW09023 세포(8.0×104세포/웰)와 33mer 글리아딘 펩티드(LQLQPFPQPELPYPQPELPYPQPELPYPQPQPF, 서열 번호: 201, 250nM)의 혼합물을, 96웰 플레이트(Corning, 3799)에 분배했다. 그 다음에, 25μL의 단계 희석한 항HLA DQ 항체를 가하고, 25μL의 α1b 글리아딘 구속성 TCR이 트랜스펙트된 αβTCR-KO Jurkat-NFAT-luc2(2.0×104세포/웰)를 마지막으로 가하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이트했다. 하룻밤 배양 후에, 50μL의 배양 세포를 회수하고, OptiPlate-96(PerkinElmer, 6005299)에 재분배했다. 그 다음에, 50μL의 Bio-Glo(Promega, G7491)를 가하고 실온에서 10분간 인큐베이트하고, Envision(PerkinElmer)으로 발광을 측정하고, 계속해서, Outlook Excel 2013(Microsoft) 및 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad)를 이용하여 해석했다. 항체를 수반하지 않는 항원 펩티드의 비존재하에서의 웰의 초당 평균 카운트수(cps)를 100%로 하고, 항체를 수반하지 않는 항원의 존재하에서의 웰의 cps를 0%로 했을 때의, 항HLA DQ 항체의 저해 효과(%)를 결정했다. IC50치는, XLfit Excel 애드인 소프트웨어(IDBS)를 이용하여 결정했다.
도 3c 및 표 2-7에 나타내는 바와 같이, 모든 시험한 항HLA DQ 항체는, HLA-DQ2.5/α1b 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 저해 효과를, 용량 의존적인 양식에 의해 나타냈다. 특히,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0722-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0681-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1352/L0681-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1527/L0605-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0722-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1352/L0681-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1353/L0681-F6은, DQN0344xx, DQN0344xx//DQN0385ee, DQN034425, 및 DQN034425//DQN0385ee0054와 비교하여 보다 강한, HLA-DQ2.5/α1b 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 중화 활성을 나타냈다.
6.6 HLA-DQ2.5/ω1 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA DQ 항체의 저해 효과를 확인했다.
50μL의 IHW09023 세포(8.0×104세포/웰)와 ω1/2 글리아딘 펩티드(EQPFPQPEQPFPWQP, 서열 번호: 204, 25uM)의 혼합물을, 96웰 플레이트(Corning, 3799)에 분배했다. 그 다음에, 25μL의 단계 희석한 항HLA DQ 항체를 가하고, 25μL의 ω1 글리아딘 구속성 TCR이 트랜스펙트된 αβTCR-KO Jurkat-NFAT-luc2(2.0×104세포/웰)를 마지막으로 가하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이트했다. 하룻밤 배양 후에, 50μL의 배양 세포를 회수하고, OptiPlate-96(PerkinElmer, 6005299)에 재분배했다. 그 다음에, 50μL의 Bio-Glo(Promega, G7491)를 가하고 실온에서 10분간 인큐베이트하고, Envision(PerkinElmer)으로 발광을 측정하고, 계속해서, Outlook Excel 2013(Microsoft) 및 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad)를 이용하여 해석했다. 항체를 수반하지 않는 항원 펩티드의 비존재하에서의 웰의 초당 평균 카운트수(cps)를 100%로 하고, 항체를 수반하지 않는 항원의 존재하에서의 웰의 cps를 0%로 했을 때의, 항HLA DQ 항체의 저해 효과(%)를 결정했다. IC50치는, XLfit Excel 애드인 소프트웨어(IDBS)를 이용하여 결정했다.
도 3d 및 표 2-7에 나타내는 바와 같이, 모든 시험한 항HLA DQ 항체는, HLA-DQ2.5/ω1 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 저해 효과를, 용량 의존적인 양식에 의해 나타냈다. 특히,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0722-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0681-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1352/L0681-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1527/L0605-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0722-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1352/L0681-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1353/L0681-F6은, DQN0344xx, DQN0344xx//DQN0385ee, DQN034425, 및 DQN034425//DQN0385ee0054와 비교하여 보다 강한, HLA-DQ2.5/ω1 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 중화 활성을 나타냈다.
6.7 HLA-DQ2.5/ω2 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA DQ 항체의 저해 효과를 확인했다.
50μL의 IHW09023 세포(8.0×104세포/웰)와 ω1/2 글리아딘 펩티드(EQPFPQPEQPFPWQP, 서열 번호: 204, 250nM)의 혼합물을, 96웰 플레이트(Corning, 3799)에 분배했다. 그 다음에, 25μL의 단계 희석한 항HLA DQ 항체를 가하고, 25μL의 ω2 글리아딘 구속성 TCR이 트랜스펙트된 αβTCR-KO Jurkat-NFAT-luc2(2.0×104세포/웰)를 마지막으로 가하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이트했다. 하룻밤 배양 후에, 50μL의 배양 세포를 회수하고, OptiPlate-96(PerkinElmer, 6005299)에 재분배했다. 그 다음에, 50μL의 Bio-Glo(Promega, G7491)를 가하고 실온에서 10분간 인큐베이트하고, Envision(PerkinElmer)으로 발광을 측정하고, 계속해서, Outlook Excel 2013(Microsoft) 및 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad)를 이용하여 해석했다. 항체를 수반하지 않는 항원 펩티드의 비존재하에서의 웰의 초당 평균 카운트수(cps)를 100%로 하고, 항체를 수반하지 않는 항원의 존재하에서의 웰의 cps를 0%로 했을 때의, 항HLA DQ 항체의 저해 효과(%)를 결정했다. IC50치는, XLfit Excel 애드인 소프트웨어(IDBS)를 이용하여 결정했다.
도 3e 및 표 2-7에 나타내는 바와 같이, DQN0344xx 및 DQN034425를 제외한 모든 시험한 항HLA DQ 항체는, HLA-DQ2.5/ω2 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 저해 효과를, 용량 의존적인 양식에 의해 나타냈다. 특히,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0722-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0681-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1352/L0681-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1527/L0605-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0722-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1352/L0681-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1353/L0681-F6은, DQN0344xx, DQN0344xx//DQN0385ee, DQN034425, 및 DQN034425//DQN0385ee0054와 비교하여 보다 강한, HLA-DQ2.5/ω2 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 중화 활성을 나타냈다.
6.8 HLA-DQ2.5/BC 호르데인 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA DQ 항체의 저해 효과를 확인했다.
50μL의 IHW09023 세포(8.0×104세포/웰)와 BC 호르데인 펩티드(EPEQPIPEQPQPYPQQ, 서열 번호: 205, 250nM)의 혼합물을, 96웰 플레이트(Corning, 3799)에 분배했다. 그 다음에, 25μL의 단계 희석한 항HLA DQ 항체를 가하고, 25μL의 BC 호르데인 구속성 TCR이 트랜스펙트된 αβTCR-KO Jurkat-NFAT-luc2(2.0×104세포/웰)를 마지막으로 가하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이트했다. 하룻밤 배양 후에, 50μL의 배양 세포를 회수하고, OptiPlate-96(PerkinElmer, 6005299)에 재분배했다. 그 다음에, 50μL의 Bio-Glo(Promega, G7491)를 가하고 실온에서 10분간 인큐베이트하고, Envision(PerkinElmer)으로 발광을 측정하고, 계속해서, Outlook Excel 2013(Microsoft) 및 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad)를 이용하여 해석했다. 항체를 수반하지 않는 항원 펩티드의 비존재하에서의 웰의 초당 평균 카운트수(cps)를 100%로 하고, 항체를 수반하지 않는 항원의 존재하에서의 웰의 cps를 0%로 했을 때의, 항HLA DQ 항체의 저해 효과(%)를 결정했다. IC50치는, XLfit Excel 애드인 소프트웨어(IDBS)를 이용하여 결정했다.
도 3f 및 표 2-7에 나타내는 바와 같이, DQN0344xx 및 DQN034425를 제외한 모든 시험한 항HLA DQ 항체는, HLA-DQ2.5/BC 호르데인 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 저해 효과를, 용량 의존적인 양식에 의해 나타냈다. 특히,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0722-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0681-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1352/L0681-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1527/L0605-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0722-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1352/L0681-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1353/L0681-F6은, DQN0344xx, DQN0344xx//DQN0385ee, DQN034425, 및 DQN034425//DQN0385ee0054와 비교하여 보다 강한, HLA-DQ2.5/BC 호르데인 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 중화 활성을 나타냈다.
6.9 HLA-DQ2.5/γ1 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA DQ 항체의 저해 효과를 확인했다.
50μL의 IHW09023 세포(8.0×104세포/웰)와 γ1 글리아딘 펩티드(PQQPQQSFPEQEQPA, 서열 번호: 206, 250nM)의 혼합물을, 96웰 플레이트(Corning, 3799)에 분배했다. 그 다음에, 25μL의 단계 희석한 항HLA DQ 항체를 가하고, 25μL의 γ1 글리아딘 구속성 TCR이 트랜스펙트된 αβTCR-KO Jurkat-NFAT-luc2(2.0×104세포/웰)를 마지막으로 가하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이트했다. 하룻밤 배양 후에, 50μL의 배양 세포를 회수하고, OptiPlate-96(PerkinElmer, 6005299)에 재분배했다. 그 다음에, 50μL의 Bio-Glo(Promega, G7491)를 가하고 실온에서 10분간 인큐베이트하고, Envision(PerkinElmer)으로 발광을 측정하고, 계속해서, Outlook Excel 2013(Microsoft) 및 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad)를 이용하여 해석했다. 항체를 수반하지 않는 항원 펩티드의 비존재하에서의 웰의 초당 평균 카운트수(cps)를 100%로 하고, 항체를 수반하지 않는 항원의 존재하에서의 웰의 cps를 0%로 했을 때의, 항HLA DQ 항체의 저해 효과(%)를 결정했다. IC50치는, XLfit Excel 애드인 소프트웨어(IDBS)를 이용하여 결정했다.
도 3g 및 표 2-7에 나타내는 바와 같이, DQN0344xx 및 DQN034425를 제외한 모든 시험한 항HLA DQ 항체는, HLA-DQ2.5/γ1 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 저해 효과를, 용량 의존적인 양식에 의해 나타냈다. 특히,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0722-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0681-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1352/L0681-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1527/L0605-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0722-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1352/L0681-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1353/L0681-F6은, DQN0344xx, DQN0344xx//DQN0385ee, DQN034425, 및 DQN034425//DQN0385ee0054와 비교하여 보다 강한, HLA-DQ2.5/γ1 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 중화 활성을 나타냈다.
6.10 HLA-DQ2.5/γ2 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA DQ 항체의 저해 효과를 확인했다.
50μL의 IHW09023 세포(8.0×104세포/웰)와 γ2 글리아딘 펩티드(GQGIIQPEQPAQLIR, 서열 번호: 207, 250nM)의 혼합물을, 96웰 플레이트(Corning, 3799)에 분배했다. 그 다음에, 25μL의 단계 희석한 항HLA DQ 항체를 가하고, 25μL의 γ2 글리아딘 구속성 TCR이 트랜스펙트된 αβTCR-KO Jurkat-NFAT-luc2(2.0×104세포/웰)를 마지막으로 가하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이트했다. 하룻밤 배양 후에, 50μL의 배양 세포를 회수하고, OptiPlate-96(PerkinElmer, 6005299)에 재분배했다. 그 다음에, 50μL의 Bio-Glo(Promega, G7491)를 가하고 실온에서 10분간 인큐베이트하고, Envision(PerkinElmer)으로 발광을 측정하고, 계속해서, Outlook Excel 2013(Microsoft) 및 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad)를 이용하여 해석했다. 항체를 수반하지 않는 항원 펩티드의 비존재하에서의 웰의 초당 평균 카운트수(cps)를 100%로 하고, 항체를 수반하지 않는 항원의 존재하에서의 웰의 cps를 0%로 했을 때의, 항HLA DQ 항체의 저해 효과(%)를 결정했다. IC50치는, XLfit Excel 애드인 소프트웨어(IDBS)를 이용하여 결정했다.
도 3h 및 표 2-7에 나타내는 바와 같이, DQN0344xx 및 DQN034425를 제외한 모든 시험한 항HLA DQ 항체는, HLA-DQ2.5/γ2 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 저해 효과를, 용량 의존적인 양식에 의해 나타냈다. 특히,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0722-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0681-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1352/L0681-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1527/L0605-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0722-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1352/L0681-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1353/L0681-F6은, DQN0344xx, DQN0344xx//DQN0385ee, DQN034425, 및 DQN034425//DQN0385ee0054와 비교하여 보다 강한, HLA-DQ2.5/γ2 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 중화 활성을 나타냈다.
6.11 HLA-DQ2.5/γ3 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA DQ 항체의 저해 효과를 확인했다.
50μL의 IHW09023 세포(8.0×104세포/웰)와 γ3 글리아딘 펩티드(EQPFPEQPEQPYPEQPEQPFPQP, 서열 번호: 208, 100uM)의 혼합물을, 96웰 플레이트(Corning, 3799)에 분배했다. 그 다음에, 25μL의 단계 희석한 항HLA DQ 항체를 가하고, 25μL의 γ3 글리아딘 구속성 TCR이 트랜스펙트된 αβTCR-KO Jurkat-NFAT-luc2(2.0×104세포/웰)를 마지막으로 가하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이트했다. 하룻밤 배양 후에, 50μL의 배양 세포를 회수하고, OptiPlate-96(PerkinElmer, 6005299)에 재분배했다. 그 다음에, 50μL의 Bio-Glo(Promega, G7491)를 가하고 실온에서 10분간 인큐베이트하고, Envision(PerkinElmer)으로 발광을 측정하고, 계속해서, Outlook Excel 2013(Microsoft) 및 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad)를 이용하여 해석했다. 항체를 수반하지 않는 항원 펩티드의 비존재하에서의 웰의 초당 평균 카운트수(cps)를 100%로 하고, 항체를 수반하지 않는 항원의 존재하에서의 웰의 cps를 0%로 했을 때의, 항HLA DQ 항체의 저해 효과(%)를 결정했다. IC50치는, XLfit Excel 애드인 소프트웨어(IDBS)를 이용하여 결정했다.
도 3i 및 표 2-7에 나타내는 바와 같이, 모든 시험한 항HLA DQ 항체는, HLA-DQ2.5/γ3 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 저해 효과를, 용량 의존적인 양식에 의해 나타냈다. 특히,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0722-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0681-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1352/L0681-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1527/L0605-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0722-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1352/L0681-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1353/L0681-F6은, DQN0344xx, DQN0344xx//DQN0385ee, DQN034425, 및 DQN034425//DQN0385ee0054와 비교하여 보다 강한, HLA-DQ2.5/γ3 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 중화 활성을 나타냈다.
6.12 HLA-DQ2.5/γ4a 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA DQ 항체의 저해 효과를 확인했다.
50μL의 IHW09023 세포(8.0×104세포/웰)와 γ4a 글리아딘 펩티드(FSQPEQEFPQPQ, 서열 번호: 209, 25uM)의 혼합물을, 96웰 플레이트(Corning, 3799)에 분배했다. 그 다음에, 25μL의 단계 희석한 항HLA DQ 항체를 가하고, 25μL의 γ4a 글리아딘 구속성 TCR이 트랜스펙트된 αβTCR-KO Jurkat-NFAT-luc2(2.0×104세포/웰)를 마지막으로 가하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이트했다. 하룻밤 배양 후에, 50μL의 배양 세포를 회수하고, OptiPlate-96(PerkinElmer, 6005299)에 재분배했다. 그 다음에, 50μL의 Bio-Glo(Promega, G7491)를 가하고 실온에서 10분간 인큐베이트하고, Envision(PerkinElmer)으로 발광을 측정하고, 계속해서, Outlook Excel 2013(Microsoft) 및 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad)를 이용하여 해석했다. 항체를 수반하지 않는 항원 펩티드의 비존재하에서의 웰의 초당 평균 카운트수(cps)를 100%로 하고, 항체를 수반하지 않는 항원의 존재하에서의 웰의 cps를 0%로 했을 때의, 항HLA DQ 항체의 저해 효과(%)를 결정했다. IC50치는, XLfit Excel 애드인 소프트웨어(IDBS)를 이용하여 결정했다.
도 3j 및 표 2-7에 나타내는 바와 같이, DQN0344xx, DQN034425, 및 DQN034425//DQN0385ee0054를 제외한 모든 시험한 항HLA DQ 항체는, HLA-DQ2.5/γ4a 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 저해 효과를, 용량 의존적인 양식에 의해 나타냈다. 특히,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0722-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0681-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1352/L0681-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1527/L0605-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0722-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1352/L0681-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1353/L0681-F6은, DQN0344xx, DQN0344xx//DQN0385ee, DQN034425, 및 DQN034425//DQN0385ee0054와 비교하여 보다 강한, HLA-DQ2.5/γ4a 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 중화 활성을 나타냈다.
6.13 HLA-DQ2.5/γ4d 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA DQ 항체의 저해 효과를 확인했다.
50μL의 IHW09023 세포(8.0×104세포/웰)와 γ4d 글리아딘 펩티드(WPQQQPFPQPEQPFCEQPQR, 서열 번호: 210, 100uM)의 혼합물을, 96웰 플레이트(Corning, 3799)에 분배했다. 그 다음에, 25μL의 단계 희석한 항HLA DQ 항체를 가하고, 25μL의 γ4d 글리아딘 구속성 TCR이 트랜스펙트된 αβTCR-KO Jurkat-NFAT-luc2(2.0×104세포/웰)를 마지막으로 가하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이트했다. 하룻밤 배양 후에, 50μL의 배양 세포를 회수하고, OptiPlate-96(PerkinElmer, 6005299)에 재분배했다. 그 다음에, 50μL의 Bio-Glo(Promega, G7491)를 가하고 실온에서 10분간 인큐베이트하고, Envision(PerkinElmer)으로 발광을 측정하고, 계속해서, Outlook Excel 2013(Microsoft) 및 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad)를 이용하여 해석했다. 항체를 수반하지 않는 항원 펩티드의 비존재하에서의 웰의 초당 평균 카운트수(cps)를 100%로 하고, 항체를 수반하지 않는 항원의 존재하에서의 웰의 cps를 0%로 했을 때의, 항HLA DQ 항체의 저해 효과(%)를 결정했다. IC50치는, XLfit Excel 애드인 소프트웨어(IDBS)를 이용하여 결정했다.
표 2-7에 나타내는 바와 같이, DQN0344xx, DQN0344xx//DQN0385ee, DQN034425, 및 DQN034425//DQN0385ee0054를 제외한 모든 시험한 항HLA DQ 항체는, HLA-DQ2.5/γ4d 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 저해 효과를, 용량 의존적인 양식에 의해 나타냈다.
도 3a∼3j 및 표 2-7에 나타내는 바와 같이, 모든 시험한 글루텐 펩티드에 대한 DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0722-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0681-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1352/L0681-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1527/L0605-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0722-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1352/L0681-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1353/L0681-F6의 중화 활성은, DQN0344xx, DQN0344xx//DQN0385ee, DQN034425, 및 DQN034425//DQN0385ee0054보다도 강했다.
추가적으로, DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0722-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1270/L0681-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1352/L0681-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1527/L0605-F6,
DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0722-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1352/L0681-F6,
DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1353/L0681-F6은, DQN0344xx, DQN0344xx//DQN0385ee, DQN034425, 및 DQN034425//DQN0385ee0054와 비교하여 훨씬 광범위에 걸친, 글루텐 펩티드에 대한 중화 활성을 나타냈다.
표 2-7을 고려하여, 10종류의 시험한 항HLA-DQ 항체는, 특히, ω2 글리아딘 펩티드, BC 호르데인 펩티드, γ1 글리아딘 펩티드, γ2 글리아딘 펩티드, γ4a 글리아딘 펩티드, 및 γ4d 글리아딘 펩티드에 의존한 Jurkat T 세포 활성화에 대해서, 저해 효과(중화 활성)를 나타냈다. 본 발명의 개변 전의 사전 항체는, 이들 글루텐 펩티드에 대해서 중화 활성을 나타내지 않았다. 즉, 본 발명의 항원 결합 분자에 있어서, 글루텐 펩티드에 대한 교차 반응성은, 개변 전과 비교하여 증강되고 있다.
(표 2-7)
Figure 112022135454077-pct00013
실시예 7
실시예 7-1
pH 7.4에서 인간 HLA-DQ2.5/33mer 글리아딘 펩티드 복합체, HLA-DQ2.5/γ2 글리아딘 펩티드 복합체, 및 HLA-DQ2.5/BC 호르데인 글리아딘 펩티드 복합체에 결합하는 항HLA-DQ2.5 항체의 어피니티를, Biacore 8k 기기(GE Healthcare)를 이용하여 37℃에서 측정했다. 아민 커플링 키트(GE Healthcare)를 이용하여, CM4 센서 칩의 모든 플로 셀 상에 항인간 Fc 항체(GE Healthcare)를 고정화했다. 모든 항체 및 분석물을, 20mM ACES, 150mM NaCl, 0.05% Tween 20, 0.005% NaN3을 함유하는 ACES pH 7.4 중에서 조제했다. 각 항체를, 항인간 Fc 항체에 의해 센서 표면 상에 포착했다. 항체 포착 레벨은, 200레조넌스 유닛(RU)를 목표로 했다. 인간 HLA-DQ2.5/33mer 글리아딘 펩티드 복합체를, 2배 단계 희석에 의해 조제한 12.5∼200nM로 주입하고, 계속해서 해리시켰다. 인간 HLA-DQ2.5/γ2 글리아딘 펩티드 복합체를, 2배 단계 희석에 의해 조제한 25∼400nM로 주입하고, 계속해서 해리시켰다. 인간 HLA-DQ2.5/BC 호르데인 글리아딘 펩티드 복합체를, 2배 단계 희석에 의해 조제한 25∼400nM로 주입하고, 계속해서 해리시켰다. 센서 표면을, 각 사이클에 3M MgCl2로 재생시켰다. 결합 어피니티는, Biacore Insight Evaluation software(GE Healthcare)를 이용하여 데이터를 처리하고, 1:1 결합 모델에 피팅하는 것에 의해 결정했다.
인간 HLA-DQ2.5/33mer 글리아딘 펩티드 복합체, HLA-DQ2.5/γ2 글리아딘 펩티드 복합체, 및 HLA-DQ2.5/BC 호르데인 글리아딘 펩티드 복합체에 결합하는 항HLA-DQ2.5 항체의 어피니티를, 표 3-1에 나타낸다.
(표 3-1)
Figure 112022135454077-pct00014
실시예 7-2
pH 7.4에서 33mer 글리아딘 펩티드에 결합하는 항HLA-DQ2.5 항체의 어피니티를, Biacore 8k 기기(GE Healthcare)를 이용하여 25℃에서 측정했다. 아민 커플링 키트(GE Healthcare)를 이용하여, CM4 센서 칩의 모든 플로 셀 상에 항인간 Fc 항체(GE Healthcare)를 고정화했다. 모든 항체 및 분석물을, 20mM ACES, 150mM NaCl, 0.05% Tween 20, 0.005% NaN3을 함유하는 ACES pH 7.4 중에서 조제했다. 각 항체를, 항인간 Fc 항체에 의해 센서 표면 상에 포착했다. 항체 포착 레벨은, 600레조넌스 유닛(RU)를 목표로 했다. 33mer 글리아딘 펩티드를, 2배 단계 희석에 의해 조제한 2.5∼40nM로 주입하고, 계속해서 해리시켰다. 센서 표면을, 각 사이클에 3M MgCl2로 재생시켰다. 결합 어피니티는, Biacore Insight Evaluation software(GE Healthcare)를 이용하여 데이터를 처리하고, 1:1 결합 모델에 피팅하는 것에 의해 결정했다.
33mer 글리아딘 펩티드에 결합하는 항HLA-DQ2.5 항체의 어피니티를, 표 3-2에 나타낸다. DQN0315hh를 제외한 시험된 모든 항체는, 33mer 글리아딘 펩티드 자체에 대한 항체 결합을 나타내지 않았다.
(표 3-2)
Figure 112022135454077-pct00015
실시예 8
8.1 α/βTCR KO Jurkat NFAT-Luc 세포주의 수립
Cas9와 TCR 정상 영역을 표적으로 하는 싱글 가이드 RNA(Blood. 2018;131:311-22.)로 구성되는 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체를, 일렉트로포레이션(LONZA, Nucleofector 2b)에 의해 NFAT-RE-luc2 Jurkat 세포주(Promega corporation, CS176401)에 도입했다. TCRα쇄 및 TCRβ쇄에 대한 모든 싱글 가이드 RNA를 혼합하고, 동시에 도입했다. RNP를 도입한 세포를, 하이그로마이신 B를 함유하는 배지 중에서 배양하고, 계속해서 FACS Aria III(Becton, Dickinson and Company)에서의 싱글 셀 클로닝을 행했다. 그 다음에, TCRα쇄 및 TCRβ쇄의 서열을 체크하여, TCRα쇄 및 TCRβ쇄가 녹아웃된 Jurkat NFAT-Luc 유래의 클론을 특정했다. 수립된 클론을, TCR KO Jurkat NFAT-Luc라고 명명했다.
8.2 HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드 구속성 TCR을 일과성으로 발현하는 α/βTCR KO Jurkat NFAT-Luc 세포주의 수립
TCR 아미노 서열 정보를, 공적 정보로부터, 또는 물질 이동 합의서에 기초하여 Oslo university로부터 입수했다. HLA-DQ2.5/α1a 글리아딘 구속성 TCR(TCC ID: 387.9), HLA-DQ2.5/α1b 글리아딘 구속성 TCR(TCC ID: 370.2.25), HLA-DQ2.5/ω1 글리아딘 구속성 TCR(TCC ID: 442D.A.2), HLA-DQ2.5/ω2 글리아딘 구속성 TCR(TCC ID: 578.42), HLA-DQ2.5/γ1 글리아딘 구속성 TCR(TCC ID: 820.27), HLA-DQ2.5/γ2 글리아딘 구속성 TCR(TCC ID: 430.1.41), HLA-DQ2.5/γ3 글리아딘 구속성 TCR(TCC ID: /.2.23), HLA-DQ2.5/γ4a 글리아딘 구속성 TCR(TCC ID: 430.1.36), HLA-DQ2.5/γ4d 글리아딘 구속성 TCR(TCC ID: 430.1.94)의 아미노산 서열 정보는, 물질 이동 합의서에 기초하여 Oslo University로부터 입수했다. HLA-DQ2.5/α2 글리아딘 구속성 TCR(HLA-DQ2.5/α2 글리아딘 구속성 TCR)의 아미노산 서열 정보는, Nat Struct Mol Biol. 2014;21:480-8로부터 입수하고, HLA-DQ2.5/BC 호르데인 구속성 TCR(TCC ID: 1468.2)의 아미노산 서열 정보는, Eur J Immunol. 2020; 50: 256-269로부터 입수했다. 각 TCRβ쇄 서열을, 2A 자기 절단 펩티드 서열(P2A, 아미노산 서열: GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP, 서열 번호: 203)에 의해 대응하는 TCRα쇄 서열과 연결시켰다. HLA-DQ2.5/γ2 글리아딘 구속성 TCR 및 HLA-DQ2.5/α2 글리아딘 구속성 TCR을 제외하고, 모든 TCRα쇄 및 TCRβ쇄는, 이들 자체의 천연 시그널 펩티드 서열을 갖는다. HLA-DQ2.5/γ2 글리아딘 구속성 TCR의 천연 시그널 서열은, Campath 시그널 서열(MGWSCIILFLVATATGVHS, 서열 번호: 170)에 의해 치환했다. Campath 시그널 서열을 또한, HLA-DQ2.5/α2 글리아딘 구속성 TCR의 N말단에도 붙였다. 그 다음에, 각각의 코돈 최적화된 TCRβ쇄-P2A-TCRα쇄 cDNA를, Genscript로 발현 벡터 pCXZD1(US/20090324589) 중에 삽입했다. 벡터의 αβTCR-KO Jurkat-NFAT-luc2 중으로의 일렉트로포레이션을, SE Cell Line 4D-NucleofectorTM Kit의 프로토콜에 따르는 것에 의해 행했다.
8.3 HLA-DQ2.5/α1a 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA DQ 항체의 저해 효과를 확인했다.
50μL의 IHW09023 세포(8.0×104세포/웰)와 33mer 글리아딘 펩티드(LQLQPFPQPELPYPQPELPYPQPELPYPQPQPF, 서열 번호: 201, 250nM)의 혼합물을, 96웰 플레이트에 분배했다. 그 다음에, 25μL의 단계 희석한 항HLA DQ 항체를 가하고, 25μL의 α1a 글리아딘 구속성 TCR이 트랜스펙트된 αβTCR-KO Jurkat-NFAT-luc2(2.0×104세포/웰)를 마지막으로 가하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이트했다. 하룻밤 배양 후에, 50μL의 배양 세포를 회수하고, OptiPlate-96(PerkinElmer, 6005299)에 재분배했다. 그 다음에, 50μL의 Bio-Glo(Promega, G7491)를 가하고 실온에서 10분간 인큐베이트하고, Envision(PerkinElmer)으로 발광을 측정하고, 계속해서, Outlook Excel 2013(Microsoft) 및 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad)를 이용하여 해석했다. 항체를 수반하지 않는 항원 펩티드의 비존재하에서의 웰의 초당 평균 카운트수(cps)를 100%로 하고, 항체를 수반하지 않는 항원의 존재하에서의 웰의 cps를 0%로 했을 때의, 항HLA DQ 항체의 저해 효과(%)를 결정했다. IC50치는, XLfit Excel 애드인 소프트웨어(IDBS)를 이용하여 결정했다.
도 4a 및 표 4에 나타내는 바와 같이, 모든 시험한 항HLA DQ 항체(DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6.v2)는, HLA-DQ2.5/α1a 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대해서 농도 의존적인 중화를 매개하고, IC50치는 피코그램/mL의 범위였다. (한편, 항체명의 말미에 「.v2」라는 기호가 붙어 있는 경우, 2개의 상이한 중쇄 및 2개의 상이한 경쇄의 플라스미드를 포유동물 세포 중에 트랜스펙트했을 때에, 효율 좋게 소망의 이중 특이성 항체의 제작을 가능하게 하는, 중쇄 정상 영역에 있어서의 개변(WO2019065795)(Fab 암 교환 기술은 아니다.)이 도입되어 있는 것을 의미하고, 이 점에서, 당해 기호 「.v2」가 붙어 있지 않은 경우와는 상이하다.)
8.4 HLA-DQ2.5/α2 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA DQ 항체의 저해 효과를 확인했다.
50μL의 IHW09023 세포(8.0×104세포/웰)와 33mer 글리아딘 펩티드(LQLQPFPQPELPYPQPELPYPQPELPYPQPQPF, 서열 번호: 201, 250nM)의 혼합물을, 96웰 플레이트에 분배했다. 그 다음에, 25μL의 단계 희석한 항HLA DQ 항체를 가하고, 25μL의 α2 글리아딘 구속성 TCR이 트랜스펙트된 αβTCR-KO Jurkat-NFAT-luc2(2.0×104세포/웰)를 마지막으로 가하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이트했다. 하룻밤 배양 후에, 50μL의 배양 세포를 회수하고, OptiPlate-96(PerkinElmer, 6005299)에 재분배했다. 그 다음에, 50uL의 Bio-Glo(Promega, G7491)를 가하고 실온에서 10분간 인큐베이트하고, Envision(PerkinElmer)으로 발광을 측정하고, 계속해서, Outlook Excel 2013(Microsoft) 및 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad)를 이용하여 해석했다. 항체를 수반하지 않는 항원 펩티드의 비존재하에서의 웰의 초당 평균 카운트수(cps)를 100%로 하고, 항체를 수반하지 않는 항원의 존재하에서의 웰의 cps를 0%로 했을 때의, 항HLA DQ 항체의 저해 효과(%)를 결정했다. IC50치는, XLfit Excel 애드인 소프트웨어(IDBS)를 이용하여 결정했다.
도 4b 및 표 4에 나타내는 바와 같이, 모든 시험한 항HLA DQ 항체(DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6.v2)는, HLA-DQ2.5/α2 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대해서 농도 의존적인 중화를 매개하고, IC50치는 피코그램/mL의 범위였다.
8.5 HLA-DQ2.5/α1b 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA DQ 항체의 저해 효과를 확인했다.
50μL의 IHW09023 세포(8.0×104세포/웰)와 33mer 글리아딘 펩티드(LQLQPFPQPELPYPQPELPYPQPELPYPQPQPF, 서열 번호: 201, 250nM)의 혼합물을, 96웰 플레이트에 분배했다. 그 다음에, 25μL의 단계 희석한 항HLA DQ 항체를 가하고, 25μL의 α1b 글리아딘 구속성 TCR이 트랜스펙트된 αβTCR-KO Jurkat-NFAT-luc2(2.0×104세포/웰)를 마지막으로 가하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이트했다. 하룻밤 배양 후에, 50μL의 배양 세포를 회수하고, OptiPlate-96(PerkinElmer, 6005299)에 재분배했다. 그 다음에, 50μL의 Bio-Glo(Promega, G7491)를 가하고 실온에서 10분간 인큐베이트하고, Envision(PerkinElmer)으로 발광을 측정하고, 계속해서, Outlook Excel 2013(Microsoft) 및 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad)를 이용하여 해석했다. 항체를 수반하지 않는 항원 펩티드의 비존재하에서의 웰의 초당 평균 카운트수(cps)를 100%로 하고, 항체를 수반하지 않는 항원의 존재하에서의 웰의 cps를 0%로 했을 때의, 항HLA DQ 항체의 저해 효과(%)를 결정했다. IC50치는, XLfit Excel 애드인 소프트웨어(IDBS)를 이용하여 결정했다.
도 4c 및 표 4에 나타내는 바와 같이, 모든 시험한 항HLA DQ 항체(DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6.v2)는, HLA-DQ2.5/α1b 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대해서 농도 의존적인 중화를 매개하고, IC50치는 낮은 나노그램/mL의 범위였다.
8.6 HLA-DQ2.5/ω1 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA DQ 항체의 저해 효과를 확인했다.
50μL의 IHW09023 세포(8.0×104세포/웰)와 ω1/2 글리아딘 펩티드(EQPFPQPEQPFPWQP, 서열 번호: 204, 25μM)의 혼합물을, 96웰 플레이트에 분배했다. 그 다음에, 25μL의 단계 희석한 항HLA DQ 항체를 가하고, 25μL의 ω1 글리아딘 구속성 TCR이 트랜스펙트된 αβTCR-KO Jurkat-NFAT-luc2(2.0×104세포/웰)를 마지막으로 가하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이트했다. 하룻밤 배양 후에, 50μL의 배양 세포를 회수하고, OptiPlate-96(PerkinElmer, 6005299)에 재분배했다. 그 다음에, 50μL의 Bio-Glo(Promega, G7491)를 가하고 실온에서 10분간 인큐베이트하고, Envision(PerkinElmer)으로 발광을 측정하고, 계속해서, Outlook Excel 2013(Microsoft) 및 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad)를 이용하여 해석했다. 항체를 수반하지 않는 항원 펩티드의 비존재하에서의 웰의 초당 평균 카운트수(cps)를 100%로 하고, 항체를 수반하지 않는 항원의 존재하에서의 웰의 cps를 0%로 했을 때의, 항HLA DQ 항체의 저해 효과(%)를 결정했다. IC50치는, XLfit Excel 애드인 소프트웨어(IDBS)를 이용하여 결정했다.
도 4d 및 표 4에 나타내는 바와 같이, 모든 시험한 항HLA DQ 항체(DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6.v2)는, HLA-DQ2.5/ω1 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대해서 농도 의존적인 중화를 매개하고, IC50치는 낮은 나노그램/mL의 범위였다.
8.7 HLA-DQ2.5/ω2 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA DQ 항체의 저해 효과를 확인했다.
50μL의 IHW09023 세포(8.0×104세포/웰)와 ω1/2 글리아딘 펩티드(EQPFPQPEQPFPWQP, 서열 번호: 204, 250nM)의 혼합물을, 96웰 플레이트에 분배했다. 그 다음에, 25μL의 단계 희석한 항HLA DQ 항체를 가하고, 25μL의 ω2 글리아딘 구속성 TCR이 트랜스펙트된 αβTCR-KO Jurkat-NFAT-luc2(2.0×104세포/웰)를 마지막으로 가하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이트했다. 하룻밤 배양 후에, 50μL의 배양 세포를 회수하고, OptiPlate-96(PerkinElmer, 6005299)에 재분배했다. 그 다음에, 50μL의 Bio-Glo(Promega, G7491)를 가하고 실온에서 10분간 인큐베이트하고, Envision(PerkinElmer)으로 발광을 측정하고, 계속해서, Outlook Excel 2013(Microsoft) 및 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad)를 이용하여 해석했다. 항체를 수반하지 않는 항원 펩티드의 비존재하에서의 웰의 초당 평균 카운트수(cps)를 100%로 하고, 항체를 수반하지 않는 항원의 존재하에서의 웰의 cps를 0%로 했을 때의, 항HLA DQ 항체의 저해 효과(%)를 결정했다. IC50치는, XLfit Excel 애드인 소프트웨어(IDBS)를 이용하여 결정했다.
도 4e 및 표 4에 나타내는 바와 같이, 모든 시험한 항HLA DQ 항체(DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6.v2)는, HLA-DQ2.5/ω2 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대해서 농도 의존적인 중화를 매개하고, IC50치는 피코그램/mL의 범위였다.
8.8 HLA-DQ2.5/BC 호르데인 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA DQ 항체의 저해 효과를 확인했다.
50μL의 IHW09023 세포(8.0×104세포/웰)와 BC 호르데인 펩티드(EPEQPIPEQPQPYPQQ, 서열 번호: 205, 250nM)의 혼합물을, 96웰 플레이트에 분배했다. 그 다음에, 25μL의 단계 희석한 항HLA DQ 항체를 가하고, 25μL의 BC 호르데인 구속성 TCR이 트랜스펙트된 αβTCR-KO Jurkat-NFAT-luc2(2.0×104세포/웰)를 마지막으로 가하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이트했다. 하룻밤 배양 후에, 50μL의 배양 세포를 회수하고, OptiPlate-96(PerkinElmer, 6005299)에 재분배했다. 그 다음에, 50μL의 Bio-Glo(Promega, G7491)를 가하고 실온에서 10분간 인큐베이트하고, Envision(PerkinElmer)으로 발광을 측정하고, 계속해서, Outlook Excel 2013(Microsoft) 및 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad)를 이용하여 해석했다. 항체를 수반하지 않는 항원 펩티드의 비존재하에서의 웰의 초당 평균 카운트수(cps)를 100%로 하고, 항체를 수반하지 않는 항원의 존재하에서의 웰의 cps를 0%로 했을 때의, 항HLA DQ 항체의 저해 효과(%)를 결정했다. IC50치는, XLfit Excel 애드인 소프트웨어(IDBS)를 이용하여 결정했다.
도 4f 및 표 4에 나타내는 바와 같이, 모든 시험한 항HLA DQ 항체(DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6.v2)는, HLA-DQ2.5/BC 호르데인 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대해서 농도 의존적인 중화를 매개하고, IC50치는 나노그램/mL의 범위였다.
8.9 HLA-DQ2.5/γ1 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA DQ 항체의 저해 효과를 확인했다.
50μL의 IHW09023 세포(8.0×104세포/웰)와 γ1 글리아딘 펩티드(PQQPQQSFPEQEQPA, 서열 번호: 206, 250nM)의 혼합물을, 96웰 플레이트에 분배했다. 그 다음에, 25μL의 단계 희석한 항HLA DQ 항체를 가하고, 25μL의 γ1 글리아딘 구속성 TCR이 트랜스펙트된 αβTCR-KO Jurkat-NFAT-luc2(2.0×104세포/웰)를 마지막으로 가하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이트했다. 하룻밤 배양 후에, 50μL의 배양 세포를 회수하고, OptiPlate-96(PerkinElmer, 6005299)에 재분배했다. 그 다음에, 50μL의 Bio-Glo(Promega, G7491)를 가하고 실온에서 10분간 인큐베이트하고, Envision(PerkinElmer)으로 발광을 측정하고, 계속해서, Outlook Excel 2013(Microsoft) 및 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad)를 이용하여 해석했다. 항체를 수반하지 않는 항원 펩티드의 비존재하에서의 웰의 초당 평균 카운트수(cps)를 100%로 하고, 항체를 수반하지 않는 항원의 존재하에서의 웰의 cps를 0%로 했을 때의, 항HLA DQ 항체의 저해 효과(%)를 결정했다. IC50치는, XLfit Excel 애드인 소프트웨어(IDBS)를 이용하여 결정했다.
도 4g 및 표 4에 나타내는 바와 같이, 모든 시험한 항HLA DQ 항체(DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6.v2)는, HLA-DQ2.5/γ1 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대해서 농도 의존적인 중화를 매개하고, IC50치는 낮은 나노그램/mL의 범위였다.
8.10 HLA-DQ2.5/γ2 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA DQ 항체의 저해 효과를 확인했다.
50μL의 IHW09023 세포(8.0×104세포/웰)와 γ2 글리아딘 펩티드(GQGIIQPEQPAQLIR, 서열 번호: 207, 250nM)의 혼합물을, 96웰 플레이트에 분배했다. 그 다음에, 25μL의 단계 희석한 항HLA DQ 항체를 가하고, 25μL의 γ2 글리아딘 구속성 TCR이 트랜스펙트된 αβTCR-KO Jurkat-NFAT-luc2(2.0×104세포/웰)를 마지막으로 가하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이트했다. 하룻밤 배양 후에, 50μL의 배양 세포를 회수하고, OptiPlate-96(PerkinElmer, 6005299)에 재분배했다. 그 다음에, 50μL의 Bio-Glo(Promega, G7491)를 가하고 실온에서 10분간 인큐베이트하고, Envision(PerkinElmer)으로 발광을 측정하고, 계속해서, Outlook Excel 2013(Microsoft) 및 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad)를 이용하여 해석했다. 항체를 수반하지 않는 항원 펩티드의 비존재하에서의 웰의 초당 평균 카운트수(cps)를 100%로 하고, 항체를 수반하지 않는 항원의 존재하에서의 웰의 cps를 0%로 했을 때의, 항HLA DQ 항체의 저해 효과(%)를 결정했다. IC50치는, XLfit Excel 애드인 소프트웨어(IDBS)를 이용하여 결정했다.
도 4h 및 표 4에 나타내는 바와 같이, 모든 시험한 항HLA DQ 항체(DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6.v2)는, HLA-DQ2.5/γ2 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대해서 농도 의존적인 중화를 매개하고, IC50치는 나노그램/mL의 범위였다.
8.11 HLA-DQ2.5/γ3 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA DQ 항체의 저해 효과를 확인했다.
50μL의 IHW09023 세포(8.0×104세포/웰)와 γ3 글리아딘 펩티드(EQPFPEQPEQPYPEQPEQPFPQP, 서열 번호: 208, 100μM)의 혼합물을, 96웰 플레이트에 분배했다. 그 다음에, 25μL의 단계 희석한 항HLA DQ 항체를 가하고, 25μL의 γ3 글리아딘 구속성 TCR이 트랜스펙트된 αβTCR-KO Jurkat-NFAT-luc2(2.0×104세포/웰)를 마지막으로 가하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이트했다. 하룻밤 배양 후에, 50μL의 배양 세포를 회수하고, OptiPlate-96(PerkinElmer, 6005299)에 재분배했다. 그 다음에, 50μL의 Bio-Glo(Promega, G7491)를 가하고 실온에서 10분간 인큐베이트하고, Envision(PerkinElmer)으로 발광을 측정하고, 계속해서, Outlook Excel 2013(Microsoft) 및 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad)를 이용하여 해석했다. 항체를 수반하지 않는 항원 펩티드의 비존재하에서의 웰의 초당 평균 카운트수(cps)를 100%로 하고, 항체를 수반하지 않는 항원의 존재하에서의 웰의 cps를 0%로 했을 때의, 항HLA DQ 항체의 저해 효과(%)를 결정했다. IC50치는, XLfit Excel 애드인 소프트웨어(IDBS)를 이용하여 결정했다.
도 4i 및 표 4에 나타내는 바와 같이, 모든 시험한 항HLA DQ 항체(DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6.v2)는, HLA-DQ2.5/γ3 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대해서 농도 의존적인 중화를 매개하고, IC50치는 낮은 나노그램/mL의 범위였다.
8.12 HLA-DQ2.5/γ4a 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA DQ 항체의 저해 효과를 확인했다.
50μL의 IHW09023 세포(8.0×104세포/웰)와 γ4a 글리아딘 펩티드(FSQPEQEFPQPQ, 서열 번호: 209, 25μM)의 혼합물을, 96웰 플레이트에 분배했다. 그 다음에, 25μL의 단계 희석한 항HLA DQ 항체를 가하고, 25μL의 γ4a 글리아딘 구속성 TCR이 트랜스펙트된 αβTCR-KO Jurkat-NFAT-luc2(2.0×104세포/웰)를 마지막으로 가하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이트했다. 하룻밤 배양 후에, 50μL의 배양 세포를 회수하고, OptiPlate-96(PerkinElmer, 6005299)에 재분배했다. 그 다음에, 50μL의 Bio-Glo(Promega, G7491)를 가하고 실온에서 10분간 인큐베이트하고, Envision(PerkinElmer)으로 발광을 측정하고, 계속해서, Outlook Excel 2013(Microsoft) 및 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad)를 이용하여 해석했다. 항체를 수반하지 않는 항원 펩티드의 비존재하에서의 웰의 초당 평균 카운트수(cps)를 100%로 하고, 항체를 수반하지 않는 항원의 존재하에서의 웰의 cps를 0%로 했을 때의, 항HLA DQ 항체의 저해 효과(%)를 결정했다. IC50치는, XLfit Excel 애드인 소프트웨어(IDBS)를 이용하여 결정했다.
도 4j 및 표 4에 나타내는 바와 같이, 모든 시험한 항HLA DQ 항체(DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6.v2)는, HLA-DQ2.5/γ4a 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대해서 농도 의존적인 중화를 매개하고, IC50치는 낮은 마이크로그램/mL 내지 나노그램/mL의 범위였다.
8.13 HLA-DQ2.5/γ4d 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA DQ 항체의 저해 효과를 확인했다.
50μL의 IHW09023 세포(8.0×104세포/웰)와 γ4d 글리아딘 펩티드(WPQQQPFPQPEQPFCEQPQR, 서열 번호: 210, 100μM)의 혼합물을, 96웰 플레이트에 분배했다. 그 다음에, 25μL의 단계 희석한 항HLA DQ 항체를 가하고, 25μL의 γ4d 글리아딘 구속성 TCR이 트랜스펙트된 αβTCR-KO Jurkat-NFAT-luc2(2.0×104세포/웰)를 마지막으로 가하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이트했다. 하룻밤 배양 후에, 50μL의 배양 세포를 회수하고, OptiPlate-96(PerkinElmer, 6005299)에 재분배했다. 그 다음에, 50μL의 Bio-Glo(Promega, G7491)를 가하고 실온에서 10분간 인큐베이트하고, Envision(PerkinElmer)으로 발광을 측정하고, 계속해서, Outlook Excel 2013(Microsoft) 및 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad)를 이용하여 해석했다. 항체를 수반하지 않는 항원 펩티드의 비존재하에서의 웰의 초당 평균 카운트수(cps)를 100%로 하고, 항체를 수반하지 않는 항원의 존재하에서의 웰의 cps를 0%로 했을 때의, 항HLA DQ 항체의 저해 효과(%)를 결정했다. IC50치는, XLfit Excel 애드인 소프트웨어(IDBS)를 이용하여 결정했다.
표 4에 나타내는 바와 같이, 모든 시험한 항HLA DQ 항체(DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6.v2)는, HLA-DQ2.5/γ4d 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대해서 농도 의존적인 중화를 매개하고, IC50치는 나노그램/mL의 범위였다.
(표 4)
Figure 112022135454077-pct00016
실시예 9
9.1 HLA-DQ2.5/글루텐 펩티드 구속성 TCR을 일과성으로 발현하는 αβTCR KO Jurkat NFAT-Luc 세포주의 수립
TCR 아미노 서열 정보를, 공적 정보로부터, 또는 물질 이동 합의서에 기초하여 Oslo university로부터 입수했다. HLA-DQ2.5/α1a 글리아딘 구속성 TCR(TCC ID: 387.9)의 아미노산 서열 정보는, 물질 이동 합의서에 기초하여 Oslo University로부터 입수했다. HLA-DQ2.5/α2 글리아딘 구속성 TCR(HLA-DQ2.5/α2 글리아딘 구속성 TCR)의 아미노산 서열 정보는, Nat Struct Mol Biol. 2014;21:480-8로부터 입수했다. 그들 TCR은, HLA-DQ2.5 구속성이지만, HLA-DQ2.2가 α1a 글리아딘, α2 글리아딘과의 복합체의 형태에 있는 경우에는 HLA-DQ2.2에 대해서 교차 반응성이다(도 5a 및 5b). 각 TCRβ쇄 서열을, 2A 자기 절단 펩티드 서열(P2A, 아미노산 서열: GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP, 서열 번호: 203)에 의해 대응하는 TCRα쇄 서열과 연결시켰다. HLA-DQ2.5/α1a 글리아딘 구속성 TCR의 TCRα쇄 및 TCRβ쇄는, 이들 자체의 천연 시그널 펩티드 서열을 갖는다. Campath 시그널 서열(MGWSCIILFLVATATGVHS, 서열 번호: 170)을, HLA-DQ2.5/α2 글리아딘 구속성 TCR의 N말단에 붙였다. 그 다음에, 각각의 코돈 최적화된 TCRβ쇄-P2A-TCRα쇄 cDNA를, Genscript로 발현 벡터 pCXZD1(US/20090324589) 중에 삽입했다. 벡터의 αβTCR-KO Jurkat-NFAT-luc2 중으로의 일렉트로포레이션을, SE Cell Line 4D-NucleofectorTM Kit의 프로토콜에 따르는 것에 의해 행했다.
9.2 HLA-DQ2.2+Human Blood B Booster B 세포(HBBB2.2)의 수립
HLA-DQ2.2+PBMC(Precision for Medicines)로부터, B 세포를 단리했다. 그 다음에, 단리된 B 세포를, Human Blood B Booster(등록상표)(DENDRITICS)를 이용하는 것에 의해 불사화했다.
9.3 HLA-DQ2.2/α1a 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA DQ 항체의 저해 효과를 확인했다.
50μL의 HBBB2.2 세포(8.0×104세포/웰)와 33mer 글리아딘 펩티드(LQLQPFPQPELPYPQPELPYPQPELPYPQPQPF, 서열 번호: 201, 25μM)의 혼합물을, 96웰 플레이트에 분배했다. 그 다음에, 25μL의 단계 희석한 항HLA DQ 항체를 가하고, 25μL의 α1a 글리아딘 구속성 TCR이 트랜스펙트된 αβTCR-KO Jurkat-NFAT-luc2(2.0×104세포/웰)를 마지막으로 가하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이트했다. 하룻밤 배양 후에, 50μL의 배양 세포를 회수하고, OptiPlate-96(PerkinElmer, 6005299)에 재분배했다. 그 다음에, 50μL의 Bio-Glo(Promega, G7491)를 가하고 실온에서 10분간 인큐베이트하고, Envision(PerkinElmer)으로 발광을 측정하고, 계속해서, Office 365 MSO의 Microsoft(등록상표) Excel(등록상표) 및 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad)를 이용하여 해석했다. 항체를 수반하지 않는 항원 펩티드의 비존재하에서의 웰의 초당 평균 카운트수(cps)를 100%로 하고, 항체를 수반하지 않는 항원의 존재하에서의 웰의 cps를 0%로 했을 때의, 항HLA DQ 항체의 저해 효과(%)를 결정했다. IC50치는, XLfit Excel 애드인 소프트웨어(IDBS)를 이용하여 결정했다.
도 5c 및 표 5에 나타내는 바와 같이, 모든 시험한 항HLA DQ 항체(DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6.v2)는, HLA-DQ2.2/α1a 글리아딘 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대해서 농도 의존적인 중화를 매개하고, IC50치는 낮은 나노그램/mL의 범위였다.
9.4 HLA-DQ2.2/α2 글리아딘 펩티드 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대한 항HLA DQ 항체의 저해 효과를 확인했다.
50μL의 HBBB2.2 세포(8.0×104세포/웰)와 33mer 글리아딘 펩티드(LQLQPFPQPELPYPQPELPYPQPELPYPQPQPF, 서열 번호: 201, 1μM)의 혼합물을, 96웰 플레이트에 분배했다. 그 다음에, 25μL의 단계 희석한 항HLA DQ 항체를 가하고, 25μL의 α2 글리아딘 구속성 TCR이 트랜스펙트된 αβTCR-KO Jurkat-NFAT-luc2(2.0×104세포/웰)를 마지막으로 가하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 인큐베이트했다. 하룻밤 배양 후에, 50μL의 배양 세포를 회수하고, OptiPlate-96(PerkinElmer, 6005299)에 재분배했다. 그 다음에, 50μL의 Bio-Glo(Promega, G7491)를 가하고 실온에서 10분간 인큐베이트하고, Envision(PerkinElmer)으로 발광을 측정하고, 계속해서, Office 365 MSO의 Microsoft(등록상표) Excel(등록상표) 및 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad)를 이용하여 해석했다. 항체를 수반하지 않는 항원 펩티드의 비존재하에서의 웰의 초당 평균 카운트수(cps)를 100%로 하고, 항체를 수반하지 않는 항원의 존재하에서의 웰의 cps를 0%로 했을 때의, 항HLA DQ 항체의 저해 효과(%)를 결정했다. IC50치는, XLfit Excel 애드인 소프트웨어(IDBS)를 이용하여 결정했다.
도 5d 및 표 5에 나타내는 바와 같이, 모든 시험한 항HLA DQ 항체(DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6.v2)는, HLA-DQ2.2/α2 글리아딘 의존성 Jurkat T 세포 활성화에 대해서 농도 의존적인 중화를 매개하고, IC50치는 낮은 나노그램/mL의 범위였다.
도 5c∼5d 및 표 5에 나타내는 바와 같이, DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6.v2는, HLA-DQ2.2/α1 글리아딘 및 α2 글리아딘에 대해서 농도 의존적인 중화를 매개했다.
도 4a∼5d 및 표 4, 표 5에 나타내는 바와 같이, DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6.v2는, 모든 시험한 글루텐 에피토프에 대해서 농도 의존적인 중화를 매개했다. 더하여, 표 2-7 및 표 4에 나타내는 바와 같이, DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6.v2, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6.v2의 중화 활성은, 각각, DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1521/L0605-F6, DQN0344H1013/L0620//DQN0385H1270/L0681-F6의 것에 필적하고 있었다.
(표 5)
Figure 112022135454077-pct00017
실시예 10 목시에 의해 검출 가능한 입자의 계수
본 발명의 항HLA-DQ2.5 이중 특이성 항체인 mAb6(DQN0344H0976/L0591//DQN0385H1255/L0605-F6.v2의 별명이다. 서열 번호 등에 대해서는, 표 2-4(다만, 양 암의 「전장 H」는 「상이한 Fc」) 및 [101](전술) 등을 참조.)에 관해서, 항체 함유 용액(50mg/mL, 완충제: 20mmol/L 히스티딘, 안정화제: 150mmol/L 아르기닌 및 162mmol/L 아스파라긴산, 계면활성제: 0.01mg/mL 폴록사머 188, pH 6.0)을 조제하고 0.22μm 필터로 여과한 후, 방사선(25 kGy) 멸균한 27G 바늘 부가 COP제 시린지(1mL 규격) 내에, 1.0mL의 용액을 충전하고 스토퍼로 타전(打栓)했다. 충전·타전한 샘플에 대해, 타전 직후에 목시에 의해 검출 가능한 입자 평가 1을 실시하여, 시린지 내에 목시에 의해 검출 가능한 입자를 포함하고 있다고 판단한 샘플을 제외했다. mAb6은 불안정도가 높아, 충전 직후의 목시에 의해 검출 가능한 입자 발생 빈도가 극히 높았기 때문에, 각 3개를 시험에 제공했다. 하기의 기포 용량 측정·설정 방법으로 작성한 검량선에 기초하여, 시린지의 스토퍼 위치를 조정하여, 1기압, 25℃에 있어서의 기포 용량이 120μL 및 10μL인 샘플을 준비했다. 각 기포 용량의 샘플에 대해, 5℃에서 1일 보관한 후에 목시에 의해 검출 가능한 입자 평가 2를 실시했다.
［목시에 의해 검출 가능한 입자 평가 1］
샘플의 시린지 용기의 외표면을 청정하게 하고, 백색 광원의 직하의 약 10000lx의 명도의 위치에서, 흑색의 배경의 앞에서 시린지를 완만하게 선회 또는 전도시키고, 육안으로 약 30초 목시 검사를 실시하는 것에 의해 시린지에 충전된 용액 중의 목시에 의해 검출 가능한 입자의 유무를 조사했다.
［기포 용량 측정·설정 방법］
1.0mL의 항체 함유 용액을 충전하고 스토퍼로 타전한 항체 용액 함유 시린지 샘플의 27G 바늘 부가 COP제 시린지(1mL 규격)를 바늘이 위가 되는 방향을 향해 기포를 바늘의 기부까지 상승시켜 바늘 끝으로부터 공기를 밀어냄으로써, 플랜지로부터 스토퍼까지의 거리가 11mm가 되도록 스토퍼의 위치를 조정했다. 내경 0.5mm의 튜브에, 시린지에 포함되는 용액 및 모든 공기를 주입했다. 튜브 내의 공기층의 길이를 측정함으로써, 시린지의 기포 용량을 산출했다. 이 측정을 4회 반복한 결과, 플랜지로부터 스토퍼까지의 거리가 11mm인 경우, 평균 기포 용량은 120μL였다. 다음에 시린지의 바늘 끝으로부터 가능한 한 공기를 뽑은 샘플을 3개 작성하여, 플랜지로부터 스토퍼까지의 거리를 측정했다. 플랜지로부터 스토퍼까지의 평균 거리는 15.1mm였다. 또한, 그 실제의 기포 용량은 3μL였다. 이들 측정 결과로부터, 플랜지로부터 스토퍼까지의 거리와 기포 용량의 검량선을 작성하고, 플랜지로부터 스토퍼까지의 거리에 기초하여 기포 용량을 설정했다. 설정한 기포 용량의 조건은 이하의 표 6과 같다.
(표 6)
기포 용량 설정 조건
Figure 112022135454077-pct00018
［목시에 의해 검출 가능한 입자 평가 2］
샘플의 시린지 용기의 외표면을 청정하게 하고, 백색 광원의 직하의 약 8000lx의 명도의 위치에서, 흑색의 배경의 앞에서 시린지를 완만하게 선회 또는 전도시키고, 약 30초 목시 검사를 실시함으로써 시린지에 충전된 용액 중의 목시에 의해 검출 가능한 입자의 유무를 조사했다. 목시에 의해 검출 가능한 입자의 존재가 인정된 샘플에 대해서는, 백색 광원의 직하의 약 8000lx의 명도의 위치에서, 흑색의 배경의 앞에서 완만하게 선회 또는 전도시키고, 육안으로 시린지 내의 목시에 의해 검출 가능한 입자수를 계수했다.
［평가 결과］
샘플을 5℃에서 1일 보관 후의 시린지 내의 목시에 의해 검출 가능한 입자 평가 2의 결과를 이하의 표 7에 나타낸다.
(표 7)
5℃ 보관 1일 후의 목시에 의해 검출 가능한 입자 평가 결과
Figure 112022135454077-pct00019

Claims (20)

  1. 항HLA-DQ2.5 항체를 유효 성분으로서 함유하는 용액이 용기에 충전된 주사용 제제로서,
    상기 항체가, 이하의 (1)∼(2) 중 어느 하나를 포함하고,
    용액 중의 상기 항체의 농도가 0.1mg/mL 이상이고,
    용액의 pH가 5.5∼6.5의 범위인, 주사용 제제:
    (1) 서열 번호: 88의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 항체 가변 영역; 서열 번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 항체 가변 영역; 서열 번호: 95의 아미노산 서열을 포함하는 제 3 항체 가변 영역; 및 서열 번호: 100의 아미노산 서열을 포함하는 제 4 항체 가변 영역; 또는,
    (2) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 중쇄 및 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 경쇄, 및 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 중쇄 및 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 경쇄.
  2. 제 1 항에 있어서,
    용기가 시린지 또는 카트리지인, 주사용 제제.
  3. 제 1 항에 있어서,
    1기압(101325Pa), 25℃에 있어서의 용기 내의 기포의 용량이 40μL 이하인, 주사용 제제.
  4. 제 3 항에 있어서,
    1기압(101325Pa), 25℃에 있어서의 용기 내의 기포의 용량이 10μL 이하인, 주사용 제제.
  5. 제 1 항에 있어서,
    용기가 프리필드 시린지인, 주사용 제제.
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서,
    1mL 용기 내에 포함되는 용액이 0.1∼1.2mL의 범위이거나, 또는 2.25mL 용기 내에 포함되는 용액이 0.1∼2.5mL의 범위인, 주사용 제제.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 용액이 용기에 충전된 주사용 제제가, 내부에 의약 제제를 함유하는 시린지 또는 카트리지와 스토퍼를 포함하는, 주사용 제제.
  9. 제 8 항에 있어서,
    시린지 또는 카트리지가, 유리 또는 사이클로올레핀계의 수지제인, 주사용 제제.
  10. 제 9 항에 있어서,
    사이클로올레핀계의 수지가, 사이클로올레핀 폴리머(COP) 또는 사이클로올레핀 코폴리머(COC)인, 주사용 제제.
  11. 제 1 항에 있어서,
    용액이, 당, 당 알코올, 완충제, 보존제, 담체, 산화 방지제, 킬레이트제, 천연 폴리머, 합성 폴리머, 동결 보호제, 계면활성제, 증량제, 안정화제 또는 이들의 조합을 포함하는, 1종 또는 복수의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 주사용 제제.
  12. 제 11 항에 있어서,
    계면활성제가, 폴리소르베이트, 폴록사머 188, 라우릴 황산 나트륨, 폴리올, 폴리(에틸렌 글라이콜), 글리세롤, 프로필렌 글라이콜 또는 폴리(바이닐 알코올)인, 주사용 제제.
  13. 제 11 항에 있어서,
    계면활성제가 폴리소르베이트 혹은 폴록사머 188인, 주사용 제제.
  14. 제 11 항에 있어서,
    용액 중의 계면활성제의 농도가 0.01mg/mL 이상인, 주사용 제제.
  15. 삭제
  16. 제 1 항에 있어서,
    0.01mg/mL의 계면활성제를 포함하는 주사용 제제의 5℃에서 1일 보관 후에 있어서의, 용액 중의 평균의 입자수가, 주사용 제제 내의 1기압(101325Pa), 25℃에 있어서의 기포의 용량이 120μL인 조건의 경우에 비해 감소하는, 주사용 제제.
  17. 제 1 항에 있어서,
    셀리악병 치료용 주사용 제제인, 주사용 제제.
  18. 제 1 항 내지 제 5 항, 제 7 항 내지 제 14 항, 제 16 항 및 제 17 항 중 어느 한 항에 기재된 주사용 제제를 조제하는 방법으로서,
    얻어지는 주사용 제제에 있어서 용기 내의 1기압(101325Pa), 25℃에 있어서의 기포의 용량이 40μL 이하가 되도록, 용기 내에, 상기 항체를 유효 성분으로서 함유하는 용액을 충전하는 것을 포함하는, 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    얻어지는 주사용 제제에 있어서 용기 내의 1기압(101325Pa), 25℃에 있어서의 기포의 용량이 10μL 이하가 되도록, 용기 내에 상기 용액을 충전하는 것을 포함하는, 방법.
  20. 제 18 항에 있어서,
    용기 내에의 용액의 충전에 있어서, 진공 스토퍼 배치법 또는 기계적 스토퍼 배치법에 의해 용기의 마개를 하는, 방법.
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