CN111787947A - 用于肥大细胞介导的炎性疾病的治疗和诊断方法 - Google Patents

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Abstract

本发明特征在于治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的方法,确定具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者是否很可能响应疗法(例如包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,Fc厄普西隆受体(FcεR)拮抗剂,IgE+B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,蛋白酶活化的受体2(PAR2)拮抗剂,IgE拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法)的方法,为具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者选择疗法的方法,用于评估具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的响应的方法,和用于监测具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的响应的方法,等等。

Description

用于肥大细胞介导的炎性疾病的治疗和诊断方法
对相关申请的交叉援引
本申请要求2018年2月9日提交的美国临时申请No.62/628,564的权益,通过本文中的援引将其完整收录。
序列表
本申请含有序列表,已经以ASCII格式电子提交且据此通过援引完整收录。于2019年2月4日创建的所述ASCII拷贝,名称为50474-161WO2_Sequence_Listing_2.4.19_ST25且大小为47,396个字节。
发明领域
本发明涉及用于肥大细胞介导的炎性疾病的治疗和诊断方法,包括哮喘。
发明背景
哮喘规范地描述为气道的变应性炎性病症,临床上特征在于发作性可逆气道阻塞。通过抗2型细胞因子疗法,例如抗IL-5实现的临床功效证实了靶向哮喘中的变应性炎症的介质的治疗原理。这些研究支持靶向2型途径以提供有意义的临床益处的治疗策略,尤其是在基于2型生物标志物选择的受试者中。尽管有这些进展,对发现和开发在2型高哮喘中以及对具有低水平2型生物标志物的哮喘患者(当前开发的疗法对于他们预期提供更少的临床益处)具有更大功效的新哮喘疗法仍有浓厚兴趣。
肥大细胞浸润气道平滑肌是哮喘的定义病理生理特征。IgE/FcεRI依赖性和IgE/FcεRI不依赖性机制挑起可溶性肥大细胞哮喘介质的释放。证明靶向肥大细胞生物学的治疗重要性,抗IgE单克隆抗体疗法
Figure BDA0002598124610000011
(奥马珠单抗)在降低哮喘恶化方面是有效的。
本领域仍然需要用于哮喘和其它肥大细胞介导的炎性疾病的改良治疗和诊断办法。
发明概述
本发明特征在于治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的方法,确定具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者是否很可能响应疗法(例如包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,Fc厄普西隆受体(FcεR)拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,蛋白酶活化的受体2(PAR2)拮抗剂,IgE拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法)的方法,为具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者选择疗法的方法,用于评估具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的响应的方法,和用于监测具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的响应的方法,等等。
在一个方面,本发明特征在于一种治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的方法,该患者已经鉴定为具有(i)包含处于或高于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数的基因型；或(ii)来自该患者的样品中处于或高于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平,该方法包含对具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者施用包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,蛋白酶活化的受体2(PAR2)拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法。
在另一个方面,本发明特征在于一种确定具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者是否很可能响应包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,蛋白酶活化的受体2(PAR2)拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法的方法,该方法包含:(a)测定来自具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的样品中患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数；和(b)基于该患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数将该患者鉴定为很可能响应包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法,其中处于或高于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数指示该患者具有升高的可能性是响应该疗法的。
在另一个方面,本发明特征在于一种确定具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者是否很可能响应包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,蛋白酶活化的受体2(PAR2)拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法的方法,该方法包含:(a)测定来自具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平；和(b)基于来自该患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平将该患者鉴定为很可能响应包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法,其中该样品中处于或高于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平指示该患者具有升高的可能性是响应该疗法的。
在任何前述方面的一些实施方案中,该方法进一步包含将该疗法施用于该患者。
在任何前述方面的一些实施方案中,该患者已经鉴定为具有来自该患者的样品中低于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平。在一些实施方案中,作为单一疗法将该药剂施用于该患者。
在任何前述方面的一些实施方案中,该患者已经鉴定为具有来自该患者的样品中处于或高于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平。在一些实施方案中,该方法进一步包含将TH2途径抑制剂施用于该患者。
在另一个方面,本发明特征在于一种治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的方法,该患者已经鉴定为具有(i)包含低于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数的基因型；或(ii)来自该患者的样品中低于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平,该方法包含对具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者施用包含IgE拮抗剂或Fc厄普西隆受体(FcεR)拮抗剂的疗法。
在另一个方面,本发明特征在于一种确定具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者是否很可能响应包含IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的疗法的方法,该方法包含:(a)测定来自具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的样品中患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数；和(b)基于该患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数将该患者鉴定为很可能响应包含IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的疗法,其中低于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数指示该患者具有升高的可能性是响应该疗法的。
在另一个方面,本发明特征在于一种确定具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者是否很可能响应包含IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的疗法的方法,该方法包含:(a)测定来自具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平；和(b)基于来自该患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平将该患者鉴定为很可能响应包含IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的疗法,其中来自该患者的样品中低于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平指示该患者具有升高的可能性是响应该疗法的。
在任何前述方面的一些实施方案中,该方法进一步包含将该疗法施用于该患者。
在任何前述方面的一些实施方案中,该患者已经鉴定为具有来自该患者的样品中处于或高于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平。在一些实施方案中,该方法进一步包含将另外的TH2途径抑制剂施用于该患者。
在另一个方面,本发明特征在于一种为具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者选择疗法的方法,该方法包含:(a)测定来自具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的样品中患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数；和(b)为该患者选择:(i)包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,蛋白酶活化的受体2(PAR2)拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法,如果该患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数处于或高于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的话,或(ii)包含IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的疗法,如果该患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数低于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的话。
在另一个方面,本发明特征在于一种为具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者选择疗法的方法,该方法包含:(a)测定来自具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平；和(b)为该患者选择:(i)包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,蛋白酶活化的受体2(PAR2)拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法,如果来自该患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平处于或高于类胰蛋白酶的参照水平的话,或(ii)包含IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的疗法,如果来自该患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平低于类胰蛋白酶的参照水平的话。
在任何前述方面的一些实施方案中,该方法进一步包含将依照(b)选择的疗法施用于该患者。
在任何前述方面的一些实施方案中,该患者已经鉴定为具有来自该患者的样品中低于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平。在一些实施方案中,作为单一疗法将该药剂施用于该患者。
在任何前述方面的一些实施方案中,该患者已经鉴定为具有来自该患者的样品中处于或高于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平,且该方法进一步包含选择包含TH2途径抑制剂的组合疗法。在一些实施方案中,该方法进一步包含将TH2途径抑制剂(或另外的TH2途径抑制剂)施用于该患者。
在另一个方面,本发明特征在于一种用于评估具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者对用包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,蛋白酶活化的受体2(PAR2)拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法的治疗的响应的方法,该方法包含:(a)测定在将包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法施用于该患者期间或之后的时间点来自具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平；和(b)基于该样品中类胰蛋白酶的表达水平与类胰蛋白酶的参照水平的比较维持,调节,或停止该治疗,其中来自该患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平与参照水平相比的变化指示对用该疗法的治疗的响应。在一些实施方案中,该变化是类胰蛋白酶的表达水平的升高且维持该治疗。在一些实施方案中,该变化是类胰蛋白酶的表达水平的降低且调节或停止该治疗。
在另一个方面,本发明特征在于一种用于监测用包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,蛋白酶活化的受体2(PAR2)拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法治疗的具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的响应的方法,该方法包含:(a)测定在将包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法施用于该患者期间或之后的时间点来自该患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平；和(b)比较来自该患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平与类胰蛋白酶的参照水平,由此监测经历用该疗法的治疗的患者的响应。在一些实施方案中,该变化是类胰蛋白酶的水平的升高且维持该治疗。在一些实施方案中,该变化是类胰蛋白酶的表达水平的降低且调节或停止该治疗。
在另一个方面,本发明特征在于供治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的方法中使用的选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合组成的组的药剂,其中(i)该患者的基因型已经测定为包含处于或高于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数；或(ii)来自该患者的样品已经测定为具有处于或高于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平。在一些实施方案中,该患者已经测定为具有来自该患者的样品中低于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平,且该药剂供作为单一疗法使用。在一些实施方案中,该患者已经鉴定为具有来自该患者的样品中处于或高于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平,且该药剂供与TH2途径抑制剂组合使用。在一些实施方案中,该类胰蛋白酶拮抗剂是抗类胰蛋白酶抗体,例如本文中公开的任何抗类胰蛋白酶抗体。在一些实施方案中,该IgE拮抗剂是抗IgE抗体。例如本文中公开的任何抗IgE抗体。
在另一个方面,本发明特征在于供治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的方法中使用的选自IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的药剂,其中(i)该患者的基因型已经测定为包含低于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数；或(ii)来自该患者的样品已经测定为具有低于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平。在一些实施方案中,该患者已经测定为具有来自该患者的样品中处于或高于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平,且该IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂供与另外的TH2途径抑制剂组合使用。
在另一个方面,本发明提供选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合组成的组的药剂在制造用于治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的药物中的用途,其中(i)该患者的基因型已经测定为包含处于或高于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数；或(ii)来自该患者的样品已经测定为具有处于或高于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平。在一些实施方案中,该患者已经测定为具有来自该患者的样品中低于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平,且该药剂供作为单一疗法使用。在一些实施方案中,该患者已经鉴定为具有来自该患者的样品中处于或高于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平,且该药剂供与TH2途径抑制剂组合使用。在一些实施方案中,该类胰蛋白酶拮抗剂是抗类胰蛋白酶抗体,例如本文中公开的任何抗类胰蛋白酶抗体。在一些实施方案中,该IgE拮抗剂是抗IgE抗体,例如本文中公开的任何抗IgE抗体。在一些实施方案中,该类胰蛋白酶拮抗剂要与IgE拮抗剂组合施用。在一些实施方案中,该药剂是类胰蛋白酶拮抗剂,且配制该药物供与IgE拮抗剂一起施用。
在另一个方面,本发明提供IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂在制造用于治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的药物中的用途,其中(i)该患者的基因型已经测定为包含低于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数；或(ii)来自该患者的样品已经测定为具有低于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平。在一些实施方案中,该患者已经测定为具有来自该患者的样品中处于或高于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平,且该IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂供与另外的TH2途径抑制剂组合使用。
在任何前述方面的一些实施方案中,该活性类胰蛋白酶等位基因计数是通过对该患者的基因组的TPSAB1和TPSB2基因座测序而测定的。在一些实施方案中,该测序是Sanger测序或大量平行测序。在一些实施方案中,通过包含下述步骤的方法对TPSAB1基因座测序:(i)在包含核苷酸序列5’-CTG GTG TGC AAG GTG AAT GG-3’(SEQ ID NO:31)的第一正向引物和包含核苷酸序列5’-AGG TCC AGC ACT CAG GAG GA-3’(SEQ ID NO:32)的第一反向引物存在下扩增来自该受试者的核酸以形成TPSAB1扩增子,和(ii)对该TPSAB1扩增子测序。在一些实施方案中,对该TPSAB1扩增子测序包含使用该第一正向引物和该第一反向引物。在一些实施方案中,通过包含下述步骤的方法对TPSB2基因座测序:(i)在包含核苷酸序列5’-GCA GGT GAG CCT GAG AGT CC-3’(SEQ ID NO:33)的第二正向引物和包含核苷酸序列5’-GGG ACC TTC ACC TGC TTC AG-3’(SEQ ID NO:34)的第二反向引物存在下扩增来自该受试者的核酸以形成TPSB2扩增子,和(ii)对该TPSB2扩增子测序。在一些实施方案中,对该TPSB2扩增子测序包含使用该第二正向引物和包含核苷酸序列5’-CAG CCA GTG ACC CAGCAC-3’(SEQ ID NO:35)的测序反向引物。
在任何前述方面的一些实施方案中,该活性类胰蛋白酶等位基因计数是通过下述公式测定的:4–该患者的基因型中类胰蛋白酶α和类胰蛋白酶βIII移码(βIIIFS)等位基因的数目之和。在一些实施方案中,类胰蛋白酶α是通过检测包含核苷酸序列CTGCAGGCGGGCGTGGTCAGCTGGG[G/A]CGAGGGC TGTGCCCAGCCCAACCGG(SEQ ID NO:36)的TPSAB1处的c733 G>A SNP而检测的,其中c733 G>A SNP处A的存在指示类胰蛋白酶α。在一些实施方案中,类胰蛋白酶βIIIFS是通过检测包含核苷酸序列CACACGGTCACCCTGCCCCCTGCCTCAGAGACCTTCCCCCCC(SEQ ID NO:37)的TPSB2处的c980_981insC突变而检测的。
在任何前述方面的一些实施方案中,该参照活性类胰蛋白酶等位基因计数是在一组具有该肥大细胞介导的炎性疾病的患者中测定的。在一些实施方案中,该参照活性类胰蛋白酶等位基因计数是3。
在任何前述方面的一些实施方案中,该患者具有3或4的活性类胰蛋白酶等位基因计数。
在任何前述方面的一些实施方案中,该患者具有0,1,或2的活性类胰蛋白酶等位基因计数。
在任何前述方面的一些实施方案中,该类胰蛋白酶是类胰蛋白酶βI,类胰蛋白酶βII,类胰蛋白酶βIII,类胰蛋白酶αI,或其组合。
在任何前述方面的一些实施方案中,该类胰蛋白酶的表达水平是蛋白质表达水平。在一些实施方案中,该类胰蛋白酶的蛋白质表达水平是活性类胰蛋白酶的表达水平。在一些实施方案中,该类胰蛋白酶的蛋白质表达水平是总类胰蛋白酶的表达水平。在一些实施方案中,该蛋白质表达水平是使用免疫测定法,酶联免疫吸附测定法(ELISA),Western印迹,或质谱术测定的。在一些实施方案中,该类胰蛋白酶的表达水平是mRNA表达水平。在一些实施方案中,该mRNA表达水平是使用聚合酶链式反应(PCR)方法或微阵列芯片测定的。在一些实施方案中,该PCR方法是qPCR。
在任何前述方面的一些实施方案中,该类胰蛋白酶的参照水平是在一组具有该肥大细胞介导的炎性疾病的个体中测定的水平。在一些实施方案中,该类胰蛋白酶的参照水平是中值水平。
在任何前述方面的一些实施方案中,该来自患者的样品选自由血液样品,组织样品,痰样品,细支气管灌洗样品,粘膜衬里液(MLF)样品,支气管吸收样品,和鼻吸收样品组成的组。在一些实施方案中,该血液样品是全血样品,血清样品,血浆样品,或其组合。在一些实施方案中,该血液样品是血清样品或血浆样品。
在任何前述方面的一些实施方案中,该药剂是类胰蛋白酶拮抗剂。在一些实施方案中,该类胰蛋白酶拮抗剂是类胰蛋白酶α拮抗剂或类胰蛋白酶β拮抗剂。在一些实施方案中,该类胰蛋白酶拮抗剂是类胰蛋白酶β拮抗剂。在一些实施方案中,该类胰蛋白酶β拮抗剂是抗类胰蛋白酶β抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中,该抗体包含下述六种高变区(HVR):(a)包含氨基酸序列DYGMV(SEQ ID NO:1)的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列FISSGSSTVYYADTMKG(SEQ ID NO:2)的HVR-H2；(c)包含氨基酸序列RNYDDWYFDV(SEQ ID NO:3)的HVR-H3；(d)包含氨基酸序列SASSSVTYMY(SEQ ID NO:4)的HVR-L1；(e)包含氨基酸序列RTSDLAS(SEQ ID NO:5)的HVR-L2；和(f)包含氨基酸序列QHYHSYPLT(SEQ ID NO:6)的HVR-L3。在一些实施方案中,该抗体包含(a)包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少90％,至少95％,或至少99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变(VH)域；(b)包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少90％,至少95％,或至少99％同一性的氨基酸序列的轻链可变(VL)域；或(c)如(a)中的VH域和如(b)中的VL域。在一些实施方案中,该VH域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施方案中,该VL域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中,该VH域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列且该VL域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中,该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链和(b)包含SEQ IDNO:10的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中,该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链和(b)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中,该抗体包含下述六种HVR:(a)包含氨基酸序列GYAIT(SEQ ID NO:12)的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列GISSAATTFYSSWAKS(SEQ ID NO:13)的HVR-H2；(c)包含氨基酸序列DPRGYGAALDRLDL(SEQ IDNO:14)的HVR-H3；(d)包含氨基酸序列QSIKSVYNNRLG(SEQ ID NO:15)的HVR-L1；(e)包含氨基酸序列ETSILTS(SEQ ID NO:16)的HVR-L2；和(f)包含氨基酸序列AGGFDRSGDTT(SEQ IDNO:17)的HVR-L3。在一些实施方案中,该抗体包含(a)包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少90％,至少95％,或至少99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变(VH)域；(b)包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少90％,至少95％,或至少99％同一性的氨基酸序列的轻链可变(VL)域；或(c)如(a)中的VH域和如(b)中的VL域。在一些实施方案中,该VH域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中,该VL域包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方案中,该VH域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列且该VL域包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方案中,该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链和(b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中,该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链和(b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中,该疗法进一步包含IgE拮抗剂。
在任何前述方面的一些实施方案中,该药剂是FcεR拮抗剂。在一些实施方案中,该FcεR拮抗剂是Bruton氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂。在一些实施方案中,该BTK抑制剂是GDC-0853,阿卡替尼,GS-4059,spebrutinib,BGB-3111,或HM71224。在一些实施方案中,该药剂是IgE+ B细胞消减性抗体。在一些实施方案中,该IgE+ B细胞消减性抗体是抗M1’域抗体。
在任何前述方面的一些实施方案中,该药剂是肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体。
在任何前述方面的一些实施方案中,该药剂是PAR2拮抗剂。
在本文中公开的任何方面的一些实施方案中,该疗法或该组合包含类胰蛋白酶拮抗剂(例如抗类胰蛋白酶抗体,包括本文中描述的任何抗类胰蛋白酶抗体)和IgE拮抗剂(例如抗IgE抗体,包括本文中描述的任何抗IgE抗体,例如奥马珠单抗(例如
Figure BDA0002598124610000101
))。
在本文中公开的任何方面的一些实施方案中,该药剂是IgE拮抗剂。在一些实施方案中,该IgE拮抗剂是抗IgE抗体。在一些实施方案中,该抗IgE抗体是IgE阻断性抗体和/或IgE消减性抗体。在一些实施方案中,该抗IgE抗体包含下述六种HVR:(a)包含氨基酸序列GYSWN(SEQ ID NO:40)的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SITYDGSTNYNPSVKG(SEQ ID NO:41)的HVR-H2；(c)包含氨基酸序列GSHYFGHWHFAV(SEQ ID NO:42)的HVR-H3；(d)包含氨基酸序列RASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:43)的HVR-L1；(e)包含氨基酸序列AASYLES(SEQ ID NO:44)的HVR-L2；和(f)包含氨基酸序列QQSHEDPYT(SEQ ID NO:45)的HVR-L3。在一些实施方案中,该抗IgE抗体包含(a)包含与SEQ ID NO:38的氨基酸序列具有至少90％,至少95％,或至少99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变(VH)域；(b)包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列具有至少90％,至少95％,或至少99％同一性的氨基酸序列的轻链可变(VL)域；或(c)如(a)中的VH域和如(b)中的VL域。在一些实施方案中,该VH域包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。在一些实施方案中,该VL域包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中,该VH域包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列且该VL域包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中,该抗IgE抗体是奥马珠单抗
Figure BDA0002598124610000111
或XmAb7195。在一些实施方案中,该抗IgE抗体是奥马珠单抗
Figure BDA0002598124610000112
在任何前述方面的一些实施方案中,该2型生物标志物是TH2细胞相关细胞因子,骨膜素,嗜曙红细胞计数,嗜曙红细胞签名,FeNO,或IgE。在一些实施方案中,该TH2细胞相关细胞因子是IL-13,IL-4,IL-9,或IL-5。在一些实施方案中,该TH2途径抑制剂抑制选自下述的任何靶物:白介素-2可诱导T细胞激酶(ITK),Bruton氏酪氨酸激酶(BTK),Janus激酶1(JAK1)(例如ruxolitinib,tofacitinib,oclacitinib,baricitinib,filgotinib,gandotinib,lestaurtinib,momelotinib,pacrinitib,upadacitinib,peficitinib,和fedratinib),GATA结合蛋白3(GATA3),IL-9(例如MEDI-528),IL-5(例如mepolizumab,CASNo.196078-29-2；resilizumab),IL-13(例如IMA-026,IMA-638(也称作anrukinzumab,INNNo.910649-32-0；QAX-576；IL-4/IL-13陷阱),tralokinumab(也称作CAT-354,CASNo.1044515-88-9)；AER-001,ABT-308(也称作人源化13C5.5抗体)),IL-4(例如AER-001,IL-4/IL-13陷阱),OX40L,TSLP,IL-25,IL-33,和IgE(例如
Figure BDA0002598124610000113
QGE-031；和MEDI-4212)；和受体,诸如:IL-9受体,IL-5受体(例如MEDI-563(benralizumab,CAS No.1044511-01-4)),IL-4受体α(例如AMG-317,AIR-645),IL-13受体α1(例如R-1671)和IL-13受体α2,OX40,TSLP-R,IL-7Rα(TSLP的共同受体),IL-17RB(IL-25的受体),ST2(IL-33的受体),CCR3,CCR4,CRTH2(例如AMG-853,AP768,AP-761,MLN6095,ACT129968),FcεRI,FcεRII/CD23(IgE的受体),Flap(例如GSK2190915),Syk激酶(R-343,PF3526299)；CCR4(AMG-761),TLR9(QAX-935)和CCR3,IL-5,IL-3,和GM-CSF的多细胞因子抑制剂(例如TPI ASM8)。
在任何前述方面的一些实施方案中,该方法进一步包含将另外的治疗剂施用于该患者。在一些实施方案中,该另外的治疗剂选自由皮质类固醇,IL-33轴结合拮抗剂,TRPA1拮抗剂,支气管扩张剂或哮喘症状控制药疗,免疫调控剂,酪氨酸激酶抑制剂,和磷酸二酯酶抑制剂组成的组。在一些实施方案中,该另外的治疗剂是皮质类固醇。在一些实施方案中,该皮质类固醇是吸入式皮质类固醇。
在任何前述方面的一些实施方案中,该肥大细胞介导的炎性疾病选自由哮喘,特应性皮炎,慢性自发性荨麻疹(CSU),系统性过敏反应,肥大细胞增多症,慢性阻塞性肺病(COPD),特发性肺纤维化(IPF),和嗜曙红细胞性食管炎组成的组。在一些实施方案中,该肥大细胞介导的炎性疾病是哮喘。在一些实施方案中,该哮喘是中度至重度哮喘。在一些实施方案中,该哮喘不受皮质类固醇控制。在一些实施方案中,该哮喘是TH2高哮喘或TH2低哮喘。
在另一个方面,本发明特征在于一种用于鉴定很可能响应包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,蛋白酶活化的受体2(PAR2)拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法的具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的试剂盒,该试剂盒包含:(a)用于测定该患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数或用于测定来自该患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平的试剂；和,任选地,(b)关于使用该试剂来鉴定很可能响应包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法的具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的说明书。在一些实施方案中,该药剂是类胰蛋白酶拮抗剂,且该疗法进一步包含IgE拮抗剂。在一些实施方案中,该疗法包含类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂。
在另一个方面,本发明特征在于一种用于鉴定很可能响应包含IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的疗法的具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的试剂盒,该试剂盒包含:(a)用于测定该患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数或用于测定来自该患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平的试剂；和,任选地,(b)关于使用该试剂来鉴定很可能响应包含IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的疗法的具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的说明书。
在任何前述方面的一些实施方案中,该试剂盒进一步包含用于测定来自该患者的样品中2型生物标志物的水平的试剂。
在另一个方面,本发明特征在于供治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的方法中使用的选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合组成的组的药剂,其中(i)该患者的基因型已经测定为包含处于或高于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数；或(ii)来自该患者的样品已经测定为具有处于或高于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平。在一些实施方案中,该患者已经测定为具有来自该患者的样品中低于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平,且该药剂供作为单一疗法使用。在一些实施方案中,该患者已经鉴定为具有来自该患者的样品中处于或高于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平,且该药剂供与TH2途径抑制剂组合使用。
在另一个方面,本发明特征在于供治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的方法中使用的选自IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的药剂,其中(i)该患者的基因型已经测定为包含低于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数；或(ii)来自该患者的样品已经测定为具有低于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平。在一些实施方案中,该患者已经测定为具有来自该患者的样品中处于或高于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平,且该IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂供与另外的TH2途径抑制剂组合使用。
在另一个方面,本发明提供选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合组成的组的药剂在制造用于治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的药物中的用途,其中(i)该患者的基因型已经测定为包含处于或高于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数；或(ii)来自该患者的样品已经测定为具有处于或高于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平。在一些实施方案中,该患者已经测定为具有来自该患者的样品中低于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平,且该药剂供作为单一疗法使用。在一些实施方案中,该患者已经鉴定为具有来自该患者的样品中处于或高于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平,且该药剂供与TH2途径抑制剂组合使用。
在另一个方面,本发明提供IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂在制造用于治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的药物中的用途,其中(i)该患者的基因型已经测定为包含低于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数；或(ii)来自该患者的样品已经测定为具有低于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平。在一些实施方案中,该患者已经测定为具有来自该患者的样品中处于或高于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平,且该IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂供与另外的TH2途径抑制剂组合使用。
附图简述
图1是显示中度至重度哮喘患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数的一幅图。为BOBCAT,EXTRA,和MILLY中度至重度哮喘受试者通过柱图将活性类胰蛋白酶等位基因计数绘图。
图2A和2B是一系列图,显示总外周类胰蛋白酶蛋白质水平与中度至重度哮喘中的类胰蛋白酶拷贝数有关。为来自BOBCAT的血浆总类胰蛋白酶(图2A)和来自MILLY研究的血清总类胰蛋白酶(图2B)进行蛋白质定量性状联系(pQTL)分析。以灰色阴影标示线性回归线(95％CI)。在图上注释来自线性回归的r2的P值。r2是线性回归的确定系数,其取值自0至1；递增的值指示通过自变量描述的方差比例。
图3是一系列图,显示基于活性类胰蛋白酶拷贝数来自抗IgE疗法(奥马珠单抗(
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))的哮喘FEV1治疗益处。基于活性类胰蛋白酶等位基因计数在来自EXTRA研究的受试者中评估FEV1自基线的百分比变化(左边小图,1或2；右边小图,3或4)。
图4A-4C是一系列图,显示2型哮喘的生物标志物与中度至重度哮喘中的活性类胰蛋白酶等位基因计数无关。就BOBCAT,EXTRA,和MILLY中度至重度哮喘队列中的活性类胰蛋白酶计数而言评估2型生物标志物血清骨膜素的水平(图4A),呼出一氧化氮分数(FeNO)(图4B),和血液嗜曙红细胞计数(图4C)。
发明详述
I.定义
如本文中使用的,术语“约”指此技术领域中的技术人员容易知道的相应数值的通常误差范围。本文中提到“约”数值或参数包括(且描述)涉及该数值或参数本身的实施方案。
术语“生物标志物”和“标志物”在本文中可互换使用,指基于DNA,RNA,蛋白质,碳水化合物,或糖脂的分子标志物,它们在受试者的或患者的样品中的表达或存在可通过标准方法(或本文中公开的方法)来检测,而且对于例如鉴定例如哺乳动物受试者对治疗的响应性或敏感性的可能性或监测受试者对治疗的响应是有用的。此类生物标志物的表达可以测定为在自具有升高或降低的可能性响应疗法的患者获得的样品中比参照水平(包括例如来自一组/一群患者(例如哮喘患者)的样品中生物标志物的中值表达水平；来自一组/一群对照个体(例如健康个体)的样品中生物标志物的水平；或在以前的时间自个体先前获得的样品中的水平)要高或低。在特定实施方案中,如本文中描述的生物标志物是活性类胰蛋白酶等位基因计数或类胰蛋白酶的表达水平。
如本文中使用的,“类胰蛋白酶”指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物,诸如灵长动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠))的任何天然类胰蛋白酶,除非另外指明。类胰蛋白酶在本领域也称作肥大细胞类胰蛋白酶,肥大细胞蛋白酶II,皮肤类胰蛋白酶,肺类胰蛋白酶,垂体类胰蛋白酶,肥大细胞中性蛋白酶,和肥大细胞丝氨酸蛋白酶II。术语“类胰蛋白酶”涵盖类胰蛋白酶α(在人中由TPSAB1编码),类胰蛋白酶β(在人中由TPSAB1和TPSB2编码；见下文),类胰蛋白酶δ(在人中由TPSD1编码),类胰蛋白酶γ(在人中由TPSG1编码),和类胰蛋白酶ε(在人中由PRSS22编码)。类胰蛋白酶阿尔法(α),贝塔(β),和伽马(γ)蛋白质是可溶的,而类胰蛋白酶厄普西隆(ε)蛋白质是膜锚定的。类胰蛋白酶β和γ是活性丝氨酸蛋白酶,尽管它们具有不同特异性。类胰蛋白酶α和德尔塔(δ)蛋白质大部分是无活性蛋白酶,因为它们在关键位置具有与典型活性丝氨酸蛋白酶不同的残基。一种例示性类胰蛋白酶α全长蛋白质序列可见于NCBI GenBank登录号ACZ98910.1。例示性类胰蛋白酶γ全长蛋白质序列可见于Uniprot登录号Q9NRR2或GenBank登录号Q9NRR2.3,AAF03695.1,NP_036599.3或AAF76457.1。例示性类胰蛋白酶δ全长蛋白质序列可见于Uniprot登录号Q9BZJ3或GenBank登录号NP_036349.1。数个类胰蛋白酶基因在人染色体16p13.3上聚簇。该术语涵盖“全长”,未加工类胰蛋白酶以及源自细胞中加工的任何形式的类胰蛋白酶。类胰蛋白酶β是在肥大细胞中表达的主要类胰蛋白酶,而类胰蛋白酶α是在嗜碱性细胞中表达的主要类胰蛋白酶。类胰蛋白酶α和类胰蛋白酶β典型地包括大约30个氨基酸的前导序列和大约245个氨基酸的催化序列(见例如Schwartz,Immunol.Allergy Clin.N.Am.26:451-463,2006)。
如本文中使用的,“类胰蛋白酶β”指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物诸如灵长动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠))的任何天然类胰蛋白酶β,除非另外指明。类胰蛋白酶β是丝氨酸蛋白酶,是肥大细胞分泌颗粒的主要成分。如本文中使用的,该术语涵盖类胰蛋白酶β1(由TPSAB1基因编码,其还编码类胰蛋白酶α1),类胰蛋白酶β2(由TPSB2基因编码),和类胰蛋白酶β3(还由TPSB2基因编码)。一种例示性人类胰蛋白酶β1序列显示于SEQ ID NO:23(还见GenBank登录号NP_003285.2)。一种例示性人类胰蛋白酶β2序列显示于SEQ ID NO:24(还见GenBank登录号AAD13876.1)。一种例示性人类胰蛋白酶β3序列显示于SEQ ID NO:25(还见GenBank登录号NP_077078.5)。术语类胰蛋白酶β涵盖“全长”,未加工类胰蛋白酶β以及源自翻译后修饰,包括蛋白水解加工的类胰蛋白酶β。认为全长原类胰蛋白酶β以两个蛋白水解步骤得到加工。首先,发生R-3处的自催化分子间切割,特别是在酸性pH和在聚阴离子(例如肝素或硫酸葡聚糖)存在下。接着,去除剩余的原’二肽(很可能通过二肽基肽酶I)。对于全长人类胰蛋白酶β1,参考下文SEQ ID NO:23,下划线氨基酸残基对应于天然前导序列,而粗体和灰色阴影氨基酸残基对应于原域,其受到切割以形成成熟蛋白质(见例如Sakai et al.,J.Clin.Invest.97:988-995,1996)
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成熟,酶活性类胰蛋白酶β典型地是同四聚体或异四聚体,尽管活性单体已有报告(见例如Fukuoka et al.,J.Immunol.176:3165,2006)。类胰蛋白酶β四聚体的各亚基通过各亚基之间的疏水和极性相互作用保持在一起并通过聚阴离子(特别是肝素和硫酸葡聚糖)稳定化。术语类胰蛋白酶可以指类胰蛋白酶四聚体或类胰蛋白酶单体。成熟人类胰蛋白酶β1,β2,和β3的例示性序列分别显示于SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,和SEQ ID NO:28。每个亚基的活性位点面对四聚体的中心孔,其测量为大约50x 30埃(见例如Pereira et al.,Nature 392:306-311,1998)。中心孔的尺寸典型地限制抑制剂到达活性位点。类胰蛋白酶β的例示性底物包括但不限于PAR2,C3,纤维蛋白原,纤连蛋白,和激肽原。
术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”可交换使用,且指包含2个或更多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸(优选超过3个)的分子。它的确切大小将取决于许多因素,其相应地取决于该寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可合成或通过克隆得到。脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合体也可在本发明的范围内。
术语“基因型”指对个体或样品中含有的基因的等位基因的描述。在本发明的背景中,在个体的基因型和源自该个体的样品的基因型之间没有产生差异。尽管通常从二倍体细胞的样品测定基因型,但也可从单倍体细胞如精子细胞的样品测定基因型。
基因组中在群体中可能有多于一种序列的核苷酸位置在本文中称作“多态性”或“多态性位点”。例如,多态性位点可以是两个或更多个核苷酸的核苷酸序列,插入的核苷酸或核苷酸序列,删除的核苷酸或核苷酸序列,或微卫星。长度为两个或更多个核苷酸的多态性位点可以是长度为3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15或更多,20或更多,30或更多,50或更多,75或更多,100或更多,500或更多,或约1000个核苷酸,其中所有或一些核苷酸序列在该区域内不同。
术语“单核苷酸多态性”或“SNP”指DNA序列内导致遗传变异性的单碱基替代。单核苷酸多态性可发生在基因的任何区域。在一些情况中,所述多态性可能导致蛋白质序列中的变化。所述蛋白质序列中的变化可能影响或不影响蛋白质功能。
当多态性位点处有两种,三种,或四种备选核苷酸序列时,每种核苷酸序列称作“多态性变体”或“核酸变体”。DNA序列中的每种可能变体称作“等位基因”。典型地,第一鉴定的等位形式被随意称为参照形式,而其他等位形式被称为备选的或变异等位基因。
术语“活性类胰蛋白酶等位基因计数”指受试者的基因型中活性类胰蛋白酶等位基因的数目。在一些实施方案中,活性类胰蛋白酶等位基因计数可以通过考虑TPSAB1和TPSB2的灭活突变来推断。因为每个二倍体受试者会具有TPSAB1和TPSB2每种的两个拷贝,所以可以依照下面的公式来确定活性类胰蛋白酶等位基因计数:4–受试者的基因型中类胰蛋白酶α和类胰蛋白酶βIII移码(βIIIFS)等位基因的数目之和。在一些实施方案中,受试者的活性类胰蛋白酶等位基因计数是0至4的范围中的整数(例如0,1,2,3,或4)。
术语“参照活性类胰蛋白酶等位基因计数”指针对它比较另一活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数,例如为了做出诊断,预测,预后,和/或治疗决定。参照活性类胰蛋白酶等位基因计数可以是在参照样品,参照群体中确定的,和/或是预先指派的值(例如先前确定用于显著(例如统计学上显著)分开第一个体子集与第二个体子集的截留值(例如就对疗法(例如包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,FcεR拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法)的响应而言)。在一些实施方案中,参照活性类胰蛋白酶等位基因计数是预先确定的值。在一个实施方案中,参照活性类胰蛋白酶等位基因计数是在患者所属疾病实体中预先确定的(例如肥大细胞介导的炎性疾病,诸如哮喘)。在某些实施方案中,活性类胰蛋白酶等位基因计数是自所调查的疾病实体中的或给定群体中的值的总体分布确定的。在一些实施方案中,参照活性类胰蛋白酶等位基因计数是0至4的范围中的整数(例如0,1,2,3,或4)。在特定实施方案中,参照活性类胰蛋白酶等位基因计数是3。
术语“水平”,“表达的水平”或“表达水平”可互换使用,一般指生物学样品中多核苷酸或氨基酸产物或蛋白质的量。“表达”一般指基因所编码的信息转换成细胞中存在的和运行的结构的过程。因此,依照本发明,基因的“表达”可以指转录成多核苷酸,翻译成蛋白质,或甚至蛋白质的翻译后修饰。转录得到的多核苷酸的,翻译得到的蛋白质的,或翻译后修饰得到的蛋白质的片段也应视为表达的,无论它们是源自通过可变剪接生成的转录物或经过降解的转录物,或者是源自蛋白质的翻译后加工(例如通过蛋白水解)。“表达的基因”包括转录成多核苷酸(像mRNA),然后翻译成蛋白质的基因,还有转录成RNA但不翻译成蛋白质的基因(例如转运RNA或核糖体RNA)。
在某些实施方案中,术语“参照水平”在本文中指预定值。如技术人员会领会的,参照水平预先确定和设置为在例如特异性和/或灵敏度方面达到要求。这些要求可以变化,例如在不同管理机构之间。它可以是例如测定法灵敏度或特异性分别要设置成某些限制,例如80％,90％,或95％。这些要求也可以在阳性或阴性预测值方面限定。无论如何,基于本发明中给出的教导,总是会有可能到达达到那些要求的参照水平。在一个实施方案中,参照水平是在健康个体中确定的。在一个实施方案中,参照值是在患者所属疾病实体中预先确定的(例如肥大细胞介导的炎性疾病,诸如哮喘)。在某些实施方案中,参照水平可以例如设置为调查的疾病实体中的值的总体分布的25％和75％之间的任何百分比。在其它实施方案中,参照水平可以例如设置为自给定群体中的或调查的疾病实体中的值的总体分布确定的中值,三分位,四分位或五分位。在一个实施方案中,参照水平设置为自调查的疾病实体中的值的总体分布确定的中值。在一个实施方案中,参照水平可能依赖于患者的性别,例如男性/雄性和女性/雌性可具有不同参照水平。
在某些实施方案中,术语“处于参照水平”指与通过本文所述方法自参照样品检测的水平相同的标志物(例如类胰蛋白酶)的水平。
在某些实施方案中,术语“升高”或“高于”指处于参照水平的水平或通过本文所述方法检测的,标志物(例如类胰蛋白酶)的水平与来自参照样品的水平相比5％,10％,20％,25％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,85％,90％,95％,100％,或更大的总体升高。
在某些实施方案中,术语“降低”或“低于”在本文中指低于参照水平的水平或通过本文所述方法检测的,标志物(例如类胰蛋白酶)的水平与来自参照样品的水平相比5％,10％,20％,25％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％或更大的总体降低。
“病症”或“疾病”是会受益于用本发明的方法的治疗或诊断的任何状况。这包括慢性和急性病症或疾病,包括那些使哺乳动物易患上所讨论病症的病理状况。本文中要治疗的病症的例子包括肥大细胞介导的炎性疾病,诸如哮喘。
“肥大细胞介导的炎性疾病”指至少部分由肥大细胞介导的疾病或病症,诸如哮喘(例如变应性哮喘),荨麻疹(例如慢性自发性荨麻疹(CSU)或慢性特发性荨麻疹(CIU)),湿疹,瘙痒,变态反应,特应性变态反应,过敏反应,过敏性休克,变应性支气管肺曲霉病,变应性鼻炎,变应性结膜炎,以及自身免疫性病症,包括类风湿性关节炎,青少年类风湿性关节炎,银屑病关节炎,胰腺炎,银屑病,斑块状银屑病,滴状银屑病,皮褶银屑病,脓疱性银屑病,红皮性银屑病,副肿瘤性自身免疫性疾病,自身免疫性肝炎,大疱性类天疱疮,重症肌无力,炎性肠病,克罗恩氏病,溃疡性结肠炎,乳糜泻,甲状腺炎(例如格雷夫斯氏病),斯耶格伦氏综合症,格巴二氏病,雷诺氏现象,艾迪生氏病,肝病(例如原发性胆汁性肝硬变,原发性硬化性胆管炎,非酒精性脂肪肝病,和非酒精性脂肪性肝炎),和糖尿病(例如I型糖尿病)。
在一些实施方案中,哮喘是持续慢性重度哮喘带有可能危及生命的恶化症状的急性事件(加重或发作)。在一些实施方案中,哮喘是特应性(也称作变应性)哮喘,非变应性哮喘(例如常常由感染呼吸道病毒(例如流感,副流感,鼻病毒,人偏肺病毒,和呼吸道合胞病毒)或吸入刺激物(例如空气污染物,烟雾,柴油颗粒,室内或室外挥发性化学品和气体,或甚至由干冷空气)触发的)。
在一些实施方案中,哮喘是间歇性或运动诱发的,急性或慢性原发或二手暴露于“烟”(典型地是卷烟,雪茄,或烟斗),吸入或“雾化”(烟草,大麻,或其它此类物质)所致哮喘,或由最近摄取阿司匹林或相关非甾体抗炎药(NSAID)触发的哮喘。在一些实施方案中,哮喘是轻度的,或未用皮质类固醇治疗的哮喘,新诊断的和未治疗的哮喘,或先前不需要长期使用吸入式表面或系统类固醇来控制症状(咳嗽,哮鸣,呼吸短促/气急,或胸痛)。在一些实施方案中,哮喘是慢性的,皮质类固醇抗性的哮喘,皮质类固醇不应性的哮喘,或皮质类固醇或其它慢性哮喘控制剂药疗未控制的哮喘。
在一些实施方案中,哮喘是中度至重度哮喘。在某些实施方案中,哮喘是TH2高哮喘。在一些实施方案中,哮喘是重度哮喘。在一些实施方案中,哮喘是特应性哮喘,变应性哮喘,非变应性哮喘(例如由于感染和/或呼吸道合胞病毒(RSV)),运动诱发的哮喘,阿司匹林敏感性/加重哮喘,轻度哮喘,中度至重度哮喘,未用皮质类固醇治疗的哮喘,慢性哮喘,皮质类固醇抗性哮喘,皮质类固醇不应性哮喘,新诊断的和未治疗的哮喘,吸烟所致哮喘,或皮质类固醇未控制的哮喘。在一些实施方案中,哮喘是嗜曙红细胞性哮喘。在一些实施方案中,哮喘是变应性哮喘。在一些实施方案中,个体已经测定为嗜曙红细胞性炎症阳性(EIP)。见WO 2015/061441。在一些实施方案中,哮喘是骨膜素高哮喘(例如具有至少约20ng/ml,25ng/ml,或50ng/ml血清任一的骨膜素水平)。在一些实施方案中,哮喘是嗜曙红细胞高哮喘(例如至少约150,200,250,300,350,400个嗜曙红细胞计数/ml血液任一)。在一些实施方案中,个体已经测定为嗜曙红细胞性炎症阴性(EIN)。见WO 2015/061441。在一些实施方案中,哮喘是骨膜素低哮喘(例如具有小于约20ng/ml血清的骨膜素水平)。在一些实施方案中,哮喘是嗜曙红细胞低哮喘(例如小于约150个嗜曙红细胞计数/μl血液或小于约100个嗜曙红细胞计数/μl血液)。
如本文中使用的,术语“TH2高哮喘”指展现高水平的一种或多种TH2细胞相关细胞因子,例如,IL-13,IL-4,IL-9,或IL-5,或展现TH2细胞因子相关炎症的哮喘。在某些实施方案中,术语TH2高哮喘可以与嗜曙红细胞高哮喘,T辅助淋巴细胞类型2高,类型2高,或TH2驱动的哮喘互换使用。在一些实施方案中,哮喘患者已经测定为嗜曙红细胞性炎症阳性(EIP)。见例如国际专利申请公开号WO 2015/061441,通过援引将其完整收入本文中。在某些实施方案中,个体已经测定为具有与对照或参照水平相比升高水平的至少一种嗜曙红细胞性签名基因。见WO 2015/061441。在某些实施方案中,TH2高哮喘是骨膜素高哮喘。在一些实施方案中,个体具有高血清骨膜素。在某些实施方案中,个体是18岁或更大。在某些实施方案中,个体已经测定为具有与对照或参照水平相比升高水平的血清骨膜素。在某些实施方案中,对照或参照水平是群体中骨膜素的中值水平。在某些实施方案中,个体已经测定为具有20ng/ml或更高血清骨膜素。在某些实施方案中,个体已经测定为具有25ng/ml或更高血清骨膜素。在某些实施方案中,个体已经测定为具有50ng/ml或更高血清骨膜素。在某些实施方案中,血清骨膜素的对照或参照水平是20ng/ml,25ng/ml,或50ng/ml。在某些实施方案中,哮喘是嗜曙红细胞高哮喘。在某些实施方案中,个体已经测定为具有与对照或参照水平相比升高的嗜曙红细胞计数。在某些实施方案中,对照或参照水平是群体的中值水平。在某些实施方案中,个体已经测定为具有150或更高的嗜曙红细胞计数/μl血液。在某些实施方案中,个体已经测定为具有200或更高的嗜曙红细胞计数/μl血液。在某些实施方案中,个体已经测定为具有250或更高的嗜曙红细胞计数/μl血液。在某些实施方案中,个体已经测定为具有300或更高的嗜曙红细胞计数/μl血液。在某些实施方案中,个体已经测定为具有350或更高的嗜曙红细胞计数/μl血液。在某些实施方案中,个体已经测定为具有400或更高的嗜曙红细胞计数/μl血液。在某些实施方案中,个体已经测定为具有450或更高的嗜曙红细胞计数/μl血液。在某些实施方案中,个体已经测定为具有500或更高的嗜曙红细胞计数/μl血液。在某些优选实施方案中,个体已经测定为具有300或更高的嗜曙红细胞计数/μl血液。在某些实施方案中,嗜曙红细胞是外周血液嗜曙红细胞。在某些实施方案中,嗜曙红细胞是痰嗜曙红细胞。在某些实施方案中,个体展现升高水平的FeNO(呼出硝酸分数)和/或升高水平的IgE。例如,在一些情况中,个体展现高于约250ppb(每十亿的份数),高于约275ppb,高于约300ppb,高于约325ppb,高于约325ppb,或高于约350ppb的FeNO水平。在一些情况中,个体具有高于50IU/ml的IgE水平。关于TH2高哮喘的综述,见例如Fajt et al.,J.Allergy Clin.Immunol.135(2):299-310,2015。
如本文中使用的,术语“TH2低哮喘”或“非TH2高哮喘”指展现低水平的一种或多种TH2细胞相关细胞因子,例如,IL-13,IL-4,IL-9,或IL-5,或展现非TH2细胞因子相关炎症的哮喘。在某些实施方案中,术语TH2低哮喘可以与嗜曙红细胞低哮喘互换使用。在一些实施方案中,哮喘患者已经测定为嗜曙红细胞性炎症阴性(EIN)。见例如WO 2015/061441。在某些实施方案中,TH2低哮喘是骨膜素低哮喘。在某些实施方案中,个体是18岁或更大。在某些实施方案中,个体已经测定为具有与对照或参照水平相比降低水平的血清骨膜素。在某些实施方案中,对照或参照水平是群体中骨膜素的中值水平。在某些实施方案中,个体已经测定为具有小于20ng/ml血清骨膜素。在某些实施方案中,哮喘是嗜曙红细胞低哮喘。在某些实施方案中,个体已经测定为具有与对照或参照水平相比降低的嗜曙红细胞计数。在某些实施方案中,对照或参照水平是群体的中值水平。在某些实施方案中,个体已经测定为具有小于150个嗜曙红细胞计数/μl血液。在某些实施方案中,个体已经测定为具有小于100个嗜曙红细胞计数/μl血液。在某些实施方案中,个体已经测定为具有小于300个嗜曙红细胞计数/μl血液。
如本文中使用的,“2型生物标志物”指与TH2炎症有关的生物标志物。2型生物标志物的非限制性例子包括TH2细胞相关细胞因子(例如IL-13,IL-4,IL-9,或IL-5),骨膜素,嗜曙红细胞计数,嗜曙红细胞签名,FeNO,或IgE。
术语“施用”意味着将组合物施用于患者(例如具有肥大细胞介导的炎性疾病,诸如哮喘的患者)。本文中描述的方法中利用的组合物可以例如胃肠外,腹膜内,肌肉内,静脉内,皮内,经皮,动脉内,损害内,颅内,关节内,前列腺内,胸膜内,气管内,鞘内,鼻内,阴道内,直肠内,表面,肿瘤内,腹膜,皮下,结膜下,囊内,粘膜,心包内,脐内,眼内,眶内,口服,表面,透皮,玻璃体内,眼周,结膜,眼球筋膜囊下(subtenonly),前房内(intracamerally),视网膜下,眼球后,小管内,通过吸入,通过注射,通过植入,通过输注,通过连续输注,通过直接沐浴靶细胞的局部灌注,通过导管,通过灌洗,在乳剂中,或在脂质组合物中施用。胃肠外施用包括肌肉内,静脉内,动脉内,腹膜内,或皮下施用。本文中描述的方法中利用的组合物还可以系统或局部施用。施用的方法可以随多个因素(例如所施用的化合物或组合物和所治疗的状况,疾病,或病症的严重程度)而变化。
术语“治疗剂”或“药剂”指用于治疗疾病,例如肥大细胞介导的炎性疾病,例如哮喘的任何药剂。治疗剂可以是例如能结合蛋白质的多肽(例如抗体,免疫粘附素,或肽体),适体,小分子,或能结合编码靶物的核酸分子的核酸分子(例如siRNA),等等。
如本文中可互换使用的,术语“抑制剂”和“拮抗剂”指抑制或降低它们所结合的分子的生物学活性的化合物或药剂。抑制剂包括结合例如类胰蛋白酶或IgE的抗体,合成或天然序列肽,免疫粘附素,和小分子抑制剂。在某些实施方案中,抑制剂(例如抗体)将在抑制剂存在下抗原的活性与在抑制剂缺失下的活性相比抑制至少10％。在一些实施方案中,抑制剂将活性抑制至少20％,至少30％,至少40％,至少50％,至少60％,至少70％,至少80％,至少90％,或100％。
如本文中使用的,术语“类胰蛋白酶拮抗剂”指抑制或降低类胰蛋白酶(例如类胰蛋白酶α(例如类胰蛋白酶αI)或类胰蛋白酶β(例如类胰蛋白酶βI,类胰蛋白酶βII,或类胰蛋白酶βIII))的生物学活性的化合物或药剂。在一些实施方案中,类胰蛋白酶拮抗剂是抗类胰蛋白酶抗体或小分子抑制剂。
术语“抗类胰蛋白酶抗体”,“结合类胰蛋白酶的抗体”,和“特异性结合类胰蛋白酶的抗体”指能够以足够亲和力结合类胰蛋白酶,使得该抗体作为靶向类胰蛋白酶的诊断剂和/或治疗剂是有用的抗体。在一个实施方案中,如例如通过放射免疫测定法(RIA)测量的,抗类胰蛋白酶抗体结合无关的,非类胰蛋白酶的蛋白质的程度小于该抗体对类胰蛋白酶的结合的约10％。在某些实施方案中,结合类胰蛋白酶的抗体具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10-8M或更少,例如10-8M至10-13M,例如10-9M至10-13M)的解离常数(KD)。在某些实施方案中,抗类胰蛋白酶抗体结合在来自不同物种的类胰蛋白酶中保守的类胰蛋白酶表位。例示性抗类胰蛋白酶抗体描述于本文和美国临时专利申请No.62/457,722和国际专利申请公开号WO 2018/148585,通过援引将其完整收入本文。
除非另有说明,术语“FcεRI”指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物,诸如灵长动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠))的任何天然FcεRI(在本领域也称作高亲和力IgE受体或FCΕR1)。FcεRI是结合IgE的ε重链的Fc蛋白质的四聚体受体复合物。FcεRI由一条α链,一条β链,和两条γ链构成。一种例示性人FcεRIα多肽的氨基酸序列在UniProt登录号P12319下列出。一种例示性人FcεRIβ多肽的氨基酸序列在UniProt登录号Q01362下列出。一种例示性人FcεRIγ多肽的氨基酸序列在UniProt登录号P30273下列出。
除非另外指明,术语“FcεRII”指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物,诸如灵长动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠))的任何天然FcεRII(在本领域也称作CD23,FCER2,或低亲和力IgE受体)。术语涵盖“全长”,未加工FcεRII以及源自细胞中加工的任何形式的FcεRII。该术语还涵盖FcεRII的天然发生变体,例如剪接变体或等位变体。一种例示性人FcεRII多肽的氨基酸序列在UniProt登录号P06734下列出。
如本文中使用的,术语“Fc厄普西隆受体(FcεR)拮抗剂”指抑制或降低FcεR(例如FcεRI或FcεRII)的生物学活性的化合物或药剂。FcεR拮抗剂可以抑制FcεR或牵涉FcεR信号转导的核酸(例如基因或自该基因转录的mRNA)或多肽的活性。例如,在一些实施方案中,FcεR拮抗剂抑制酪氨酸蛋白质激酶Lyn(Lyn),Bruton氏酪氨酸激酶(BTK),酪氨酸蛋白质激酶Fyn(Fyn),脾相关酪氨酸激酶(Syk),T细胞激活接头(LAT),生长因子受体结合的蛋白质2(Grb2),son of sevenless(Sos),Ras,Raf-1,丝裂原活化的蛋白质激酶激酶1(MEK),丝裂原活化的蛋白质激酶1(ERK),胞质磷脂酶A2(cPLA2),花生四烯酸5-脂肪氧合酶(5-LO),花生四烯酸5-脂肪氧合酶活化蛋白质(FLAP),鸟嘌呤核苷酸交换因子VAV(Vav),Rac,丝裂原活化的蛋白质激酶激酶3,丝裂原活化的蛋白质激酶激酶7,p38 MAP激酶(p38),c-Jun N端激酶(JNK),生长因子受体结合的蛋白质2相关蛋白质2(Gab2),磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶(PI3K),磷脂酶C伽马(PLCγ),蛋白质激酶C(PKC),3-磷酸肌醇依赖性蛋白质激酶1(PDK1),RAC丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶(AKT),组胺,肝素,白介素(IL)-3,IL-4,IL-13,IL-5,粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),肿瘤坏死因子阿尔法(TNFα),白三烯(例如LTC4,LTD4和LTE4),和前列腺素(例如PDG2)。在一些实施方案中,FcεR拮抗剂是BTK抑制剂,例如GDC-0853,阿卡替尼,GS-4059,spebrutinib,BGB-3111,或HM71224。
“B细胞”是在骨髓内成熟的淋巴细胞,而且包括幼稚B细胞,记忆B细胞,或效应B细胞(浆细胞)。本文中的B细胞可以是正常的或非恶性的。
术语“IgE+ B细胞消减性抗体”指能降低受试者中IgE+ B细胞的数目和/或干扰一种或多种IgE+ B细胞功能的抗体。“IgE+ B细胞”指表达膜B细胞受体形式的IgE的B细胞。在一些实施方案中,IgE+ B细胞是IgE转换B细胞或记忆B细胞。人膜IgE含有52个氨基酸的细胞外区段,称作M1初段(prime)(也称作M1’,me.1,或CemX),它在分泌型IgE抗体中不表达。在一些实施方案中,IgE+ B细胞消减性抗体是抗M1’抗体(例如quilizumab)。在一些实施方案中,抗M1’抗体是国际专利申请公开号WO 2008/116149中描述的任何抗M1’抗体。
“肥大细胞”是一种类型的粒细胞免疫细胞。肥大细胞典型地存在于遍及全身的粘膜和上皮组织。肥大细胞含有细胞质颗粒,其储存炎性介质,包括类胰蛋白酶(特别是类胰蛋白酶β),组胺,肝素,和细胞因子。肥大细胞可以通过抗原/IgE/FcεRI交联而激活,这可导致脱粒和释放炎性介质。肥大细胞可以是粘膜肥大细胞或结缔组织肥大细胞。见例如Krystel-Whittemore et al.,Front.Immunol.6:620,2015。
“嗜碱性细胞”是一种类型的粒细胞免疫细胞。嗜碱性细胞典型地存在于外周血中。嗜碱性细胞可以经由抗原/IgE/FcεRI交联而激活以释放诸如组胺,类胰蛋白酶(特别是类胰蛋白酶α),白三烯,和细胞因子等分子。见例如Siracusa et al.,J.AllergyClin.Immunol.132(4):789-801,2013。
术语“肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体”指能降低受试者中肥大细胞或嗜碱性细胞的数目或生物学活性和/或干扰肥大细胞或嗜碱性细胞的一种或多种功能的抗体。在一些实施方案中,抗体是肥大细胞消减性抗体。在其它实施方案中,抗体是嗜碱性细胞消减性抗体。在还有其它实施方案中,抗体消减肥大细胞和嗜碱性细胞。在一些实施方案中,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体是抗Siglec8抗体。
除非另外指明,术语“蛋白酶活化的受体2(PAR2)”指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物,诸如灵长动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠))的任何天然PAR2(在本领域也称作F2R样胰蛋白酶受体1(F2RL1)或G蛋白偶联受体11(GPR11))。该术语涵盖“全长”,未加工PAR2以及源自细胞中加工的任何形式的PAR2。该术语还涵盖PAR2的天然发生变体,例如剪接变体或等位变体。一种例示性人PAR2的核酸序列在RefSeq登录号NM_005252中列出。由人PAR2编码的一种例示性蛋白质的氨基酸序列在UniProt登录号P55085中列出。
术语“PAR2拮抗剂”指降低,阻断,抑制,消除,或干扰PAR2生物学活性或信号转导的分子。PAR2典型地通过蛋白水解切割它的N端而活化,这揭开结合并活化跨膜受体域的拴系肽配体。例示性PAR2拮抗剂包括小分子抑制剂(例如K-12940,K-14585,GB83,GB88,AZ3451,和AZ8838),可溶性受体,siRNA,和抗PAR2抗体(例如MAB3949和Fab3949)。见例如Cheng et al.,Nature 545:112-115,2017；Kanke et al.,Br.J.Pharmacol.158(1):361-371,2009；和Lohman et al.,FASEB J.26(7):2877-2887,2012。
术语“IgE拮抗剂”指降低,阻断,抑制,消除,或干扰IgE生物学活性的分子。此类拮抗剂包括但不限于抗IgE抗体,IgE受体,抗IgE受体抗体,IgE抗体的变体,IgE受体的配体,和其片段。在一些实施方案中,IgE拮抗剂能够破坏或阻断IgE(例如人IgE)和高亲和力受体FcεRI(例如肥大细胞或嗜碱性细胞上的)之间的相互作用。
“抗IgE抗体”包括以当IgE结合肥大细胞和嗜碱性细胞上的高亲和力受体时并不诱导交联的方式特异性结合IgE的任何抗体。例示性抗IgE抗体包括rhuMabE25(E25,奥马珠单抗(
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)),E26,E27,以及CGP-5101(Hu-901),HA抗体,ligelizumab,和talizumab。人源化抗IgE抗体E25,E26和E27的重和轻链可变域的氨基酸序列公开于例如美国专利No.6,172,213和WO 99/01556。CGP-5101(Hu-901)抗体描述于Corne et al.,J.Clin.Invest.99(5):879-887,1997；WO 92/17207；和ATCC保藏号BRL-10706,BRL-11130,BRL-11131,BRL-11132和BRL-11133。HA抗体描述于美国流水号60/444,229,WO 2004/070011,和WO 2004/070010。
除非另外指明,如本文中使用的,术语“白介素-33(IL-33)”指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物,诸如灵长动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠))的任何天然IL-33。IL-33在本领域还称作高内皮小静脉的核因子(NF-HEV；见例如Baekkevold et al.,Am.J.Pathol.163(1):69-79,2003),DVS27,C9orf26,和白介素-1家族成员11(IL-1F11)。该术语涵盖“全长”,未加工IL-33,以及源自细胞中加工的任何形式的IL-33。人全长,未加工IL-33含有270个氨基酸(a.a.)且还可以称作IL-331-270。加工形式的人IL-33包括例如IL-3395-270,IL-3399-270,IL-33109-270,IL-33112-270,IL-331-178,和IL-33179-270(
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et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.109(5):1673-1678,2012和Martin,Semin.Immunol.25:449-457,2013)。在一些实施方案中,加工形式的人IL-33,例如IL-3395-270,IL-3399-270,IL-33109-270,或由诸如钙蛋白酶,蛋白酶3,嗜中性细胞弹性蛋白酶,和组织蛋白酶G等蛋白酶加工的其它形式可以具有与全长IL-33相比升高的生物学活性。该术语还涵盖IL-33的天然发生变体,例如剪接变体(例如缺乏外显子3的组成性有活性的剪接变体spIL-33,Hong et al.,J.Biol.Chem.286(22):20078-20086,2011)或等位变体。IL-33可以在细胞内(例如在核内)或作为分泌型细胞因子形式存在。全长IL-33蛋白质含有包括核定位序列的螺旋-转角-螺旋DNA结合基序(人IL-33的a.a.1-75),其包括染色质结合基序(人IL-33的a.a.40-58)。加工和分泌形式的IL-33缺乏这些N端基序。一种例示性人IL-33的氨基酸序列可以例如在UniProt登录号O95760下找到。
“IL-33轴”意味着牵涉IL-33信号转导的核酸(例如基因或自该基因转录的mRNA)或多肽。例如,lL-33轴可以包括配体IL-33,受体(例如ST2和/或IL-1RAcP),衔接头分子(例如MyD88),或与受体分子和/或衔接头分子有关的蛋白质(例如激酶,诸如白介素-1受体相关激酶1(IRAK1)和白介素-1受体相关激酶4(IRAK4),或E3泛素连接酶,诸如TNF受体相关因子6(TRAF6))。
“IL-33轴结合拮抗剂”指抑制IL-33轴结合配偶与一种或多种它的结合配偶的相互作用的分子。如本文中使用的,IL-33轴结合拮抗剂包括IL-33结合拮抗剂,ST2结合拮抗剂,和IL1RAcP结合拮抗剂。例示性IL-33轴结合拮抗剂包括抗IL-33抗体和其抗原结合片段(例如抗IL-33抗体,诸如ANB-020(AnaptysBio Inc.)或EP1725261,US8187596,WO 2011/031600,WO 2014/164959,WO 2015/099175,WO 2015/106080,或WO 2016/077381中描述的任何抗体,通过援引将其完整收入本文)；结合IL-33和/或它的受体(ST2和/或IL-1RAcP)并阻断配体-受体相互作用的多肽(例如ST2-Fc蛋白质；免疫粘附素,肽体,和可溶性ST2,或其衍生物)；抗IL-33受体抗体(例如抗ST2抗体,例如AMG-282(Amgen)或STLM15(Janssen)或WO2013/173761或WO 2013/165894中描述的任何抗ST2抗体,通过援引将其每一篇完整收入本文；或ST2-Fc蛋白质,诸如WO 2013/173761；WO 2013/165894；或WO 2014/152195中描述的那些,通过援引将其每一篇完整收入本文)；和IL-33受体拮抗剂,诸如小分子抑制剂,结合IL-33的适体,和在严格条件下与IL-33轴核酸序列杂交的核酸(例如短干扰RNA(siRNA)或聚簇规则间隔短回文重复RNA(CRISPR-RNA或crRNA))。
术语“ST2结合拮抗剂”指抑制ST2与IL-33,IL1RAcP,和/或第二ST2分子的相互作用的分子。ST2结合拮抗剂可以是包括IL-33结合域(例如ST2或IL1RAcP蛋白质的全部或部分)和多聚化域(例如免疫球蛋白的Fc部分,例如选自同种型IgG1,IgG2,IgG3,和IgG4,以及每个同种型组内的任何同种异型的IgG的Fc域)的蛋白质,诸如“ST2-Fc蛋白质”,其中IL-33结合域和多聚化域或是直接地或是经由接头(例如丝氨酸-甘氨酸(SG)接头,甘氨酸-甘氨酸(GG)接头,或其变体(例如SGG,GGS,SGS,或GSG接头))间接地彼此附着,和包括但不限于WO 2013/173761,WO 2013/165894,和WO 2014/152195中描述的ST2-Fc蛋白质和其变体,通过援引将其每一篇完整收入本文。
“TH2途径抑制剂”或“TH2抑制剂”是抑制TH2途径的药剂。TH2途径抑制剂的例子包括选自白介素-2可诱导T细胞激酶(ITK),Bruton氏酪氨酸激酶(BTK),Janus激酶1(JAK1)(例如ruxolitinib,tofacitinib,oclacitinib,baricitinib,filgotinib,gandotinib,lestaurtinib,momelotinib,pacrinitib,upadacitinib,peficitinib,和fedratinib),GATA结合蛋白质3(GATA3),IL-9(例如MEDI-528),IL-5(例如mepolizumab,CAS No.196078-29-2；resilizumab),IL-13(例如IMA-026,IMA-638(也称作anrukinzumab,INN No.910649-32-0；QAX-576；IL-4/IL-13陷阱),tralokinumab(也称作CAT-354,CAS No.1044515-88-9)；AER-001,ABT-308(也称作人源化13C5.5抗体)),IL-4(例如AER-001,IL-4/IL-13陷阱),OX40L,TSLP,IL-25,IL-33,和IgE(例如
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QGE-031；和MEDI-4212)；和受体,诸如IL-9受体,IL-5受体(例如MEDI-563(benralizumab,CAS No.1044511-01-4)),IL-4受体α(例如AMG-317,AIR-645),IL-13受体α1(例如R-1671)和IL-13受体α2,OX40,TSLP-R,IL-7Rα(TSLP的共同受体),IL-17RB(IL-25的受体),ST2(IL-33的受体),CCR3,CCR4,CRTH2(例如AMG-853,AP768,AP-761,MLN6095,ACT129968),FcεRI,FcεRII/CD23(IgE的受体),Flap(例如GSK2190915),Syk激酶(R-343,PF3526299)；CCR4(AMG-761),TLR9(QAX-935)和CCR3,IL-5,IL-3,和GM-CSF的多细胞因子抑制剂(例如TPI ASM8)的靶物任一的活性的抑制剂。上述靶物的抑制剂的例子公开于例如WO 2008/086395；WO 2006/085938；US 7,615,213；US 7,501,121；WO 2006/085938；WO 2007/080174；US 7,807,788；WO 2005/007699；WO 2007/036745；WO 2009/009775；WO 2007/082068；WO 2010/073119；WO 2007/045477；WO 2008/134724；US 2009/0047277；和WO 2008/127271。
术语“患者”或“受试者”指期望诊断或治疗的任何单个动物,更具体地是哺乳动物(包括非人动物,诸如例如猫,犬,马,家兔,牛,猪,绵羊,动物园动物,和非人灵长类)。甚至更具体地,本文中的患者是人。
术语“小分子”指具有50道尔顿至2500道尔顿的分子量的有机分子。
术语“有效量”指药物或治疗剂(例如类胰蛋白酶拮抗剂,FcεR拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,IgE拮抗剂,或其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂))有效治疗受试者或患者,诸如哺乳动物,例如人中的疾病或病症(例如肥大细胞介导的炎性疾病,例如哮喘)的量。
如本文中使用的,“疗法”或“治疗/处理”指试图改变所治疗个体或细胞的自然进程的临床干预,可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括预防疾病的发生或复发,缓解症状,削弱疾病的任何直接或间接病理学后果,减缓疾病进展的速率,改善或减轻疾病状态,及免除或改善预后。那些需要治疗的包括可以包括那些早就具有病症的以及那些有风险患上病症的或那些要预防病症的。如果例如在接受哮喘疗法后,患者显示可观察的和/或可测量的下述一项或多项的减轻/减少或缺失的话,患者可以是成功“治疗”哮喘的:反复喘息,咳嗽,呼吸困难,胸闷,夜间发生或恶化的症状,由冷空气,运动或暴露于变应原触发的症状。
患者对治疗或疗法,例如包括类胰蛋白酶拮抗剂,FcεR拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,IgE拮抗剂,或其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂)的疗法的“响应”或“响应性”指来自或由于治疗的给予有风险或具有哮喘的患者的临床或治疗益处。技术人员会容易确定患者是否是响应性的。例如,对包括类胰蛋白酶拮抗剂,FcεR拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,IgE拮抗剂,或其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂)的疗法响应性的具有哮喘的患者可显示可观察的和/或可测量的一种或多种哮喘症状的减轻/减少或缺失,例如反复喘息,咳嗽,呼吸困难,胸闷,夜间发生或恶化的症状,由冷空气,运动或暴露于变应原触发的症状。在一些实施方案中,响应可以是肺功能的改善,例如FEV1％的改善。
术语“样品”和“生物学样品”可互换使用,指任何自个体获得的生物学样品,包括体液,身体组织(例如肺样品),鼻样品(包括鼻拭子或鼻息肉),痰,鼻吸收样品,支气管吸收样品,细胞,或其它来源。体液包括例如细支气管灌洗液(BAL),粘膜衬里液(MLF；包括例如鼻MLF或支气管MLF),淋巴,血清,新鲜全血,冷冻的全血,血浆(包括新鲜的或冷冻的),血清(包括新鲜的或冷冻的),外周血单个核细胞,尿液,唾液,精液,滑液和脊髓液。用于自哺乳动物获得组织活检和体液的方法是本领域公知的。
本文中的术语“抗体”以最广义使用,并且涵盖各种抗体结构,包括但不限于单克隆抗体,多克隆抗体,多特异性抗体(例如双特异性抗体),和抗体片段,只要它们展现出期望的抗原结合活性。
“亲和力成熟的”抗体指如下的抗体,其具有一个或多个高变区HVR和/或框架区中的一处或多处改变,与不拥有那些改变的亲本抗体相比,所述改变导致抗体对抗原的亲和力改善。优选的亲和力成熟的抗体会具有纳摩尔或甚至皮摩尔的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体通过本领域已知的规程生成。例如,Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783,1992描述通过VH和VL域改组的亲和力突变。HVR和/或框架残基的随机诱变描述于Barbas et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3809-3813,1994；Schier et al.,Gene169:147-155,1995；Yelton et al.,J.Immunol.155:1994-2004,1995；Jackson et al.,J.Immunol.154(7):3310-3319,1995；和Hawkins et al.,J.Mol.Biol.226:889-896,1992。
为了本文中的目的,“受体人框架”是包含自如下文定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含其相同的氨基酸序列,或者它可含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中,氨基酸变化的数目是10或更少,9或更少,8或更少,7或更少,6或更少,5或更少,4或更少,3或更少,或2或更少。在一些实施方案中,VL受体人框架在序列方面与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点和它的结合配偶(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示,如本文中使用的,“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对它的配偶Y的亲和力一般可以用解离常数(KD)来代表。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量,包括本文中描述的那些。下面描述了用于测量结合亲和力的具体的示例性和例示性实施方案。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”指与参照抗体相比接触抗原的氨基酸残基的一个交叠集合或在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50％或更多,60％或更多,70％或更多,80％或更多,或90％或更多的抗体。在一些实施方案中,抗体接触的氨基酸残基的集合可以与参照抗体接触的氨基酸残基的集合完全交叠或部分交叠。在一些实施方案中,与参照抗体结合相同表位的抗体在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50％或更多,60％或更多,70％或更多,80％或更多,或90％或更多,且相反,参照抗体在竞争测定法中将抗体对其抗原的结合阻断50％或更多,60％或更多,70％或更多,80％或更多,或90％或更多。本文中提供了一种例示性竞争测定法。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分,优选完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab,Fab',F(ab')2,和Fv片段；双抗体；线性抗体(见美国专利No.5,641,870,实施例2；Zapata et al.,Protein Eng.8(10):1057-1062,1995)；单链抗体分子；和自抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的木瓜蛋白酶消化生成两个相同的抗原结合片段,称作“Fab”片段,和一个剩余的“Fc”片段,其名称反映易于结晶的能力。Fab片段由整个L链连同一条H链的可变区结构域(VH),和重链的第一恒定域(CH1)组成。抗体的胃蛋白酶处理产生一个大F(ab')2片段,其大致对应于具有二价抗原结合活性的两个二硫化物连接的Fab片段且仍然能够交联抗原。Fab'片段与Fab片段的区别在于具有CH1域的羧基末端处的另外的少数残基,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中对于其中恒定域的半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab'的名称。F(ab')2抗体片段最初是作为具有Fab'片段之间的铰链半胱氨酸的成对Fab'片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。
本文中的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中含有恒定区的至少一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中,人IgG重链Fc区自Cys226,或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而,Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定,Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号依照EU编号系统,也称作EU索引,如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中描述的。
“Fv”由紧密,非共价联合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中生发出六个高变环(H和L链各3个环),贡献出抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而,即使是单个可变域(或只包含对抗原特异性的三个HVR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力,尽管亲和力常常低于完整结合位点。
“单链Fv”,也缩写成“sFv”或“scFv”,是包含连接成一条多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地,sFv多肽在VH和VL域之间进一步包含多肽接头,其使得sFv能够形成结合抗原的期望结构。关于sFv的综述见Pluckthun in The Pharmacology of MonoclonalAntibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315,1994。
术语“双抗体”指通过在VH和VL域之间使用短接头(约5-10个残基)构建sFv片段(见上一段)而制备的小型抗体片段,由于接头短,使得V域实行链间而非链内配对,由此导致二价片段,即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个“交叉”sFv片段的异二聚体,其中两种抗体的VH和VL域存在于不同多肽链上。双抗体更详细的描述于例如EP404,097；WO 93/11161；和Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448,1993。
“阻断性抗体”或“拮抗性抗体”是抑制或降低其结合的抗原的生物学活性的抗体。某些阻断性抗体或拮抗性抗体实质性或完全抑制抗原的生物学活性。例如,就抗类胰蛋白酶抗体而言,在一些实施方案中,活性可以是类胰蛋白酶酶活性,例如蛋白酶活性。在其它情况中,活性可以是类胰蛋白酶介导的刺激支气管平滑肌细胞增殖和/或基于胶原的收缩。在其它情况中,活性可以是肥大细胞组胺释放(例如IgE触发的组胺释放和/或类胰蛋白酶触发的组胺释放)。在一些实施方案中,抗体能将其结合的抗原的生物学活性抑制至少约1％,约5％,约10％,约20％,约25％,约30％,约35％,约40％,约45％,约50％,约55％,约60％,约65％,约70％,约75％,约80％,约85％,约90％,约95％,约96％,约97％,约98％,约99％,或约100％。
抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。有五大类抗体:IgA,IgD,IgE,IgG,和IgM,而且这些中的数种可进一步分为亚类(同种型),例如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,和IgA2。与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α,δ,ε,γ,和μ。
抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括:C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞,嗜中性细胞,和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞,随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。抗体“武装”细胞毒性细胞且是此类杀伤绝对需要的。介导ADCC的主要细胞,NK细胞,只表达FcγRIII,而单核细胞表达FcγRI,FcγRII和FcγRIII。Ravetch et al.,Annu.Rev.Immunol.9:457-492,1991第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估感兴趣分子的ADCC活性,可进行体外ADCC测定法,诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外,可在体内评估感兴趣分子的ADCC活性,例如在动物模型中,诸如Clynes etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:652-656,1998中所披露的。
“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外,优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体),包括FcγRI,FcγRII和FcγRIII亚类的受体,包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”),它们具有相似的氨基酸序列,区别主要在其胞质结构域中。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(见综述M.in
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Annu.Rev.Immunol.15:203-234,1997)。FcR的综述见例如Ravetch et al.,Annu.Rev.Immunol.9:457-492,1991；Capel et al.,Immunomethods 4:25-34,1994；和deHaas et al.,J.Lab.Clin.Med.126:330-41,1995。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR,包括那些未来将会鉴定的。该术语还包括新生儿受体,FcRn,其负责将母体IgG转移至胎儿(见例如Guyer et al.,J.Immunol.117:587,1976；和Kim et al.,J.Immunol.24:249,1994)。
“人效应细胞”是表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。优选地,该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC),天然杀伤(NK)细胞,单核细胞,细胞毒性T细胞和嗜中性细胞；优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源分离,例如血液。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的裂解。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分(C1q)结合抗体(适宜亚类的)起始的,该抗体已结合至其关联抗原。为了评估补体激活,可进行CDC测定法,例如如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163,1996中所记载的。
“表位”是抗原中抗体选择结合的部分。对于多肽抗原,线性表位可以是约4-15,例如4,5,6,7,8,9,10,11,12个氨基酸残基的肽部分。非线性,构象表位可以包含多肽序列中在蛋白质的三维(3D)结构中变成密切接近的残基。在一些实施方案中,表位包含在抗体的任何原子4埃
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内的氨基酸。在某些实施方案中,表位包含在抗体的任何原子
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或
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内的氨基酸。抗体中接触抗原的氨基酸残基(即互补位)可例如通过测定与抗原复合的抗体的晶体结构或通过实施氢/氘交换来测定。
术语“全长抗体”,“完整抗体”,和“全抗体”在本文中可互换使用,指与天然抗体结构具有实质性相似的结构或具有含有如本文中定义的Fc区的重链的抗体。
“人抗体”指拥有与由人生成的和/或使用用于生成人抗体的任何技术生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”是代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选集中最常发生的氨基酸残基的框架。一般地,人免疫球蛋白VL或VH序列的选集来自可变域序列的亚组。一般地,序列的亚组是如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD,vols.1-3,1991中的亚组。在一个实施方案中,对于VL,亚组是如Kabat等人,见上文中的亚组卡帕III或卡帕IV。在一个实施方案中,对于VH,亚组是如Kabat等人,见上文中的亚组III。
非人(例如啮齿动物)抗体的“人源化”形式是最低限度含有自非人抗体衍生的序列的嵌合抗体。对于大部分,人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)中来自高变区的残基用来自具有期望的抗体特异性,亲和力,和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠,大鼠,家兔或非人灵长动物的高变区的残基替换的人免疫球蛋白。在一些情况中,人免疫球蛋白的框架区域(FR)残基用相应的非人残基替换。而且,人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体性能。一般地,人源化抗体会包含至少一个,典型地两个实质性整个如下的可变域,其中所有或实质性所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环且所有或实质性所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还会包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分,典型地人免疫球蛋白的。别的详情见Jones et al.,Nature 321:522-525,1986；Riechmann et al.,Nature 332:323-329,1988；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596,1992。
“免疫缀合物”是与一种或多种异源分子,包括但不限于细胞毒剂缀合的抗体。
术语“分离的”在用于描述本文中公开的各种抗体时意味着已经鉴定且与和/或自表达它的细胞或细胞培养物分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分是会典型地干扰多肽的诊断或治疗用途的物质,而且可包括酶,激素,和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在一些实施方案中,抗体纯化至大于95％或99％的纯度,如通过例如电泳(例如十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),等电聚焦(IEF),毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相HPLC)方法测定的。用于评估抗体纯度的方法的综述,见例如Flatman etal.,J.Chromatogr.B 848:79-87,2007。在优选的实施方案中,抗体会纯化至(1)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N端或内部氨基酸序列的程度,或(2)通过在非还原性或还原性条件下的SDS-PAGE,使用考马斯蓝或优选地银染色,达到同质。既然多肽天然环境的至少一种成分不会存在,那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而,分离的抗体通常会通过至少一个纯化步骤来制备。
如本文中使用的,术语“单克隆抗体”指从一群实质性同质的抗体获得的抗体,即构成群体的抗体个体相同和/或结合抗原上的相同表位,除了例如含有天然发生突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外,此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同,单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此,修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特性,而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如,可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体,包括但不限于杂交瘤方法,重组DNA方法,噬菌体展示方法,和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法,本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。在某些实施方案中,术语“单克隆抗体”涵盖双特异性抗体。
术语“二价抗体”指具有两个针对抗原的结合位点的抗体。二价抗体可以是但不限于IgG格式或F(ab’)2格式。
术语“多特异性抗体”以最广义使用且涵盖结合一种抗原上的两个或更多个决定簇或表位或多于一种抗原上的两个或更多个决定簇或表位的抗体。此类多特异性抗体包括但不限于全长抗体,具有两种或更多种VL和VH域的抗体,抗体片段,诸如Fab,Fv,dsFv,scFv,双抗体,双特异性双抗体和三抗体,共价或非共价连接的抗体片段。“多表位特异性”指特异性结合相同或不同靶物上的两个或更多个不同表位的能力。在某些实施方案中,多特异性抗体是双特异性抗体。“双重特异性”或“双特异性”指特异性结合相同或不同靶物上的两个不同表位的能力。然而,与双特异性抗体不同,双重特异性抗体具有氨基酸序列相同的两个抗原结合臂且每个Fab臂能够识别两种抗原。双重特异性容许抗体像单一Fab或IgG分子一样以高亲和力与两种不同抗原相互作用。依照一个实施方案,多特异性抗体以5μM至0.001pM,3μM至0.001pM,1μM至0.001pM,0.5μM至0.001pM或0.1μM至0.001pM的亲和力结合每种表位。“单特异性”指结合仅仅一种表位的能力。
“裸抗体”指未与异源模块(例如细胞毒性模块)或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药学组合物中。
就抗体结合靶分子而言,术语“结合”或“特异性结合”特定多肽或特定多肽靶上的表位或对之“特异性的”意味着与非特异性相互作用可测量不同的结合。特异性结合可例如通过与对照分子的结合相比测定分子的结合来测量。例如,特异性结合可通过与与靶相似的对照分子,例如过量的未标记的靶的竞争来测定。在这种情况中,如果标记的靶与探针的结合受到过量的未标记的靶的竞争性抑制的话,指示特异性结合。如本文中使用的,术语“特异性结合”特定多肽或特定多肽靶上的表位或对之“特异性的”可例如通过具有10-4M或更低,或者10-5M或更低,或者10-6M或更低,或者10-7M或更低,或者10-8M或更低,或者10-9M或更低,或者10-10M或更低,或者10-11M或更低,或者10-12M或更低的对靶的KD或10-4M至10-6M或10-6M至10-10M或10-7M至10-9M范围中的KD的分子来展现。正如熟练技术人员会领会的,亲和力和KD值成反比。对抗原的高亲和力通过低KD值来测量。在一个实施方案中,术语“特异性结合”指其中分子结合至特定多肽或特定多肽上的表位且没有实质性结合任何其它多肽或多肽表位的结合。
术语“可变的”指可变域的某些区段在抗体间在序列方面差异广泛的实情。可变或“V”域介导抗原结合且限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而,可变性并非在可变域的110个氨基酸跨度上均匀分布。反而是,V区由15-30个氨基酸的称作框架区(FR)的相对不易变的节段和将它们分开的每个长9-12个氨基酸的称作“高变区”的具有极端可变性的更短区域组成。当在本文中使用时,术语“高变区”或“HVR”指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区一般包含来自例如VL中的大约残基24-34(L1),50-56(L2)和89-97(L3)左右,和VH中的大约残基26-35(H1),49-65(H2)和95-102(H3)左右的氨基酸残基(在一个实施方案中,H1是大约残基31-35左右；Kabat等人,见上文)和/或那些来自“高变环”的残基(例如VL中的残基26-32(L1),50-52(L2),和91-96(L3),和VH中的26-32(H1),53-55(H2),和96-101(H3)；Chothia et al.,J.Mol.Biol.196:901-917,1987)。天然重和轻链的可变域每一个包含四个FR,大多采取β-片层构象,通过三个高变区连接,高变区形成连接β-片层结构的环,且在一些情况中形成β-片层结构的一部分。每条链中的高变区通过FR与来自另一条链的高变区保持在一起,紧密靠近,促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人,见上文)。因而,HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以下述顺序出现:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。恒定域并不直接牵涉抗体对抗原的结合,但展现多种效应器功能,诸如抗体在抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)中的参与。
术语“如Kabat中的可变域残基编号方式”或“如Kabat中的氨基酸位置编号方式”,和其变异指Kabat等人,见上文中用于抗体的编辑的重链可变域或轻链可变域的编号系统。使用此编号系统,实际的线性氨基酸序列可含有较少或另外的氨基酸,对应于可变域的FR或HVR的缩短或插入。例如,重链可变域可包括在H2的残基52之后的单一氨基酸插入(依照Kabat的残基52a)和在重链FR残基82之后的插入残基(例如依照Kabat的残基82a,82b,和82c,等)。可通过在抗体序列的同源性区域处与“标准”Kabat编号序列的比对为给定抗体确定残基的Kabat编号。
Kabat编号系统一般在提及可变域中的残基(大约是轻链残基1-107和重链残基1-113)时使用(例如Kabat等人,见上文)。“EU编号系统”或“EU索引”一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如Kabat等人,见上文中报告的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1 EU抗体的残基编号方式。除非本文中另有说明,提及抗体的可变域中的残基编号意指通过Kabat编号系统的残基编号。除非本文中另有说明,提及抗体的恒定域中的残基编号意指通过EU编号系统的残基编号(例如参见美国临时申请No.60/640,323,关于EU编号方式的图)。
就本文中鉴定的多肽序列而言的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性之后,而且在任何保守替代不作为序列同一性的一部分考虑的情况下,候选序列中与所比较的多肽中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为了确定百分比氨基酸序列同一性目的的比对可以以本领域技能内的多种方式实现,例如使用公众可得的计算机软件,诸如BLAST,BLAST-2,ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能确定用于测量比对的适宜参数,包括对所比较的序列的全长实现最大比对需要的任何算法。然而,为了本文中的目的,％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写,而且源代码已经与用户文档一起提交美国版权局(Washington D.C.,20559),以美国版权注册号TXU510087注册。公众经由Genentech公司(South San Francisco,California)可得到ALIGN-2程序。ALIGN-2程序应当编译成在UNIX操作系统,优选数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设置且不变。
在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况中,给定氨基酸序列A相对于(to),与(with),或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为给定氨基酸序列A具有或包含相对于,与,或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)如下计算:
100 乘 分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B的比对中打分为相同匹配的氨基酸残基的数目,且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。会领会的是,在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况中,A相对于B的％氨基酸序列同一性会不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有具体说明,本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值是如上一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。
“大量平行测序”或“大量平行测序,”在本领域也称作“下一代测序”或“第二代测序”,意味着任何高通量核酸测序办法。这些办法典型地牵涉大量(例如数千,数百万,或数十亿)空间分开的,克隆扩增的DNA模板或单一DNA分子的平行测序。见例如Metzker,NatureReviews Genetics 11:31-36,2010。
术语“包装插页”用于指通常包括在治疗用产品的商业包装中的说明书,其含有关于关注此类治疗用产品的使用的适应征,用法,剂量,施用,组合疗法,禁忌症和/或警告的信息。
术语“药学配制剂”和“药学组合物”在本文中可互换使用,指其形式允许其中含有的活性组分的生物学活性是有效的,且并不含有对会施用该配制剂的受试者有不可接受的毒性的另外的成分的制剂。此类配制剂是无菌的。
“无菌”药学配制剂是无菌的或没有或本质上没有所有活的微生物和它们的孢子。
“药学可接受载剂”指药物配制剂中除活性组分以外的组分,它对受试者是无毒的。药学可接受载剂包括但不限于缓冲剂,赋形剂,稳定剂,或防腐剂。
“试剂盒”指包含至少一种试剂(例如用于测定患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数或测定如本文中描述的生物标志物(例如类胰蛋白酶)的表达水平的探针和/或用于治疗肥大细胞介导的炎性疾病(例如哮喘)的药物)的任何制品(例如包装或容器)。所述制品优选以用于实施本发明方法的单元来宣传,分发,或销售。
II.本发明的治疗方法和用途
本发明特征在于治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病(例如哮喘)的患者的方法。在一些实施方案中,本发明的方法包括基于本发明的生物标志物,例如类胰蛋白酶的存在和/或表达水平(例如患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数和/或类胰蛋白酶的表达水平)将疗法施用于患者。在一些实施方案中,该方法牵涉施用疗法,例如包括类胰蛋白酶拮抗剂,Fc厄普西隆受体(FcεR)拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,蛋白酶活化的受体2(PAR2)拮抗剂,IgE拮抗剂,或其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂)的疗法。在一些实施方案中,该疗法包括肥大细胞定向疗法(例如类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,和/或PAR2拮抗剂)。在一些实施方案中,该疗法包括类胰蛋白酶拮抗剂(例如抗类胰蛋白酶抗体,例如本文或WO 2018/148585中描述的任何抗类胰蛋白酶抗体)和IgE拮抗剂(例如抗IgE抗体,例如奥马珠单抗(
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))。
例如,本发明特征在于一种治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的方法,其包括对具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者施用肥大细胞定向疗法(例如包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂)组成的组的药剂的疗法),其中(i)该患者的基因型已经测定为包含处于或高于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数；或(ii)来自该患者的样品已经测定为具有处于或高于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平。例如,在一些实施方案中,该患者的基因型已经测定为包含处于或高于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数。在其它实施方案中,来自该患者的样品已经测定为具有处于或高于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平。
在另一个方面,本发明特征在于一种治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的方法,该患者已经鉴定为具有(i)包含处于或高于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数的基因型；或(ii)来自该患者的样品中处于或高于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平,该方法包括对具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者施用肥大细胞定向疗法(例如包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂)组成的组的药剂的疗法)。例如,在一些实施方案中,该患者的基因型已经鉴定为包含处于或高于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数。在其它实施方案中,该患者已经鉴定为具有来自该患者的样品中处于或高于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平。
在另一个方面,本发明特征在于一种治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的方法,该方法包括:(a)获得来自该患者的含有核酸的样品；(b)对该样品实施基因型测定并检测处于或高于类胰蛋白酶的参照水平的活性类胰蛋白酶等位基因计数的存在；(c)将具有处于或高于类胰蛋白酶的参照水平的活性类胰蛋白酶等位基因计数的患者鉴定为具有升高的可能性受益于用肥大细胞定向疗法(例如包含类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂)的疗法)的治疗；和(d)将肥大细胞定向疗法(例如包含类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂)的疗法)施用于该患者。
在仍有又一个方面,本发明特征在于一种治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的方法,该方法包括:(a)获得来自该患者的含有核酸或蛋白质的样品；(b)实施表达测定法并检测处于或高于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平；(c)将具有处于或高于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平的患者鉴定为具有升高的可能性受益于用肥大细胞定向疗法(例如包含类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂)的疗法)的治疗；和(d)将肥大细胞定向疗法(例如包含类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂)的疗法)施用于该患者。在一些实施方案中,该样品含有蛋白质且该表达测定法是ELISA或免疫测定法。
在任何前述方法的一些实施方案中,该患者已经鉴定为具有来自该患者的样品中低于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平。在一些实施方案中,作为单一疗法将该药剂施用于该患者。
在任何前述方法的一些实施方案中,该患者已经鉴定为具有来自该患者的样品中处于或高于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平。在一些实施方案中,该方法进一步包含将TH2途径抑制剂施用于该患者。
在另一个方面,本发明特征在于一种治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的方法,其包括对具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者施用包含IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的疗法,其中(i)该患者的基因型已经测定为包含低于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数；或(ii)来自该患者的样品已经测定为具有低于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平。例如,在一些实施方案中,该患者的基因型已经测定为包含低于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数。在其它实施方案中,来自该患者的样品已经测定为具有低于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平。
在另一个方面,本发明特征在于一种治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的方法,该患者已经鉴定为具有(i)包含低于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数的基因型；或(ii)来自该患者的样品中低于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平,该方法包括对具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者施用包含IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的疗法。例如,在一些实施方案中,该患者的基因型已经鉴定为包含低于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数。在其它实施方案中,该患者已经鉴定为具有来自该患者的样品中低于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平。
在另一个方面,本发明特征在于一种治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的方法,该方法包括:(a)获得来自该患者的含有核酸的样品；(b)对该样品实施基因型测定并检测低于类胰蛋白酶的参照水平的活性类胰蛋白酶等位基因计数的存在；(c)将具有低于类胰蛋白酶的参照水平的活性类胰蛋白酶等位基因计数的患者鉴定为具有升高的可能性受益于用IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的治疗；和(d)将IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂施用于该患者。
在仍有又一个方面,本发明特征在于一种治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的方法,该方法包括:(a)获得来自该患者的含有核酸或蛋白质的样品；(b)实施表达测定法并检测低于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平；(c)将具有低于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平的患者鉴定为具有升高的可能性受益于用IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的治疗；和(d)将IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂施用于该患者。在一些实施方案中,该样品含有蛋白质且该表达测定法是ELISA或免疫测定法。
在任何前述方法的一些实施方案中,该患者已经鉴定为具有来自该患者的样品中处于或高于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平。在一些实施方案中,该方法进一步包含将另外的TH2途径抑制剂施用于该患者。
在任何前述方法的一些实施方案中,该活性类胰蛋白酶等位基因计数是通过对该患者的基因组的TPSAB1和TPSB2基因座测序而测定的。可使用任何合适测序办法,例如Sanger测序或大量平行(例如
Figure BDA0002598124610000431
)测序。在一些实施方案中,通过包含下述步骤的方法对TPSAB1基因座测序:(i)在包含核苷酸序列5’-CTG GTG TGC AAG GTG AAT GG-3’(SEQ ID NO:31)的第一正向引物和包含核苷酸序列5’-AGG TCC AGC ACT CAG GAG GA-3’(SEQ ID NO:32)的第一反向引物存在下扩增来自该受试者的核酸以形成TPSAB1扩增子,和(ii)对该TPSAB1扩增子测序。在一些实施方案中,对该TPSAB1扩增子测序包含使用该第一正向引物和该第一反向引物。在一些实施方案中,通过包含下述步骤的方法对TPSB2基因座测序:(i)在包含核苷酸序列5’-GCA GGT GAG CCT GAG AGT CC-3’(SEQ ID NO:33)的第二正向引物和包含核苷酸序列5’-GGG ACC TTC ACC TGC TTC AG-3’(SEQ ID NO:34)的第二反向引物存在下扩增来自该受试者的核酸以形成TPSB2扩增子,和(ii)对该TPSB2扩增子测序。在一些实施方案中,对该TPSB2扩增子测序包含使用该第二正向引物和包含核苷酸序列5’-CAG CCA GTG ACC CAG CAC-3’(SEQ ID NO:35)的测序反向引物。在一些实施方案中,该活性类胰蛋白酶等位基因计数可以通过测定该患者的基因组的TPSAB1和TPSB2基因座中任何变异的存在来测定。在一些实施方案中,该活性类胰蛋白酶等位基因计数是通过下述公式测定的:4–该患者的基因型中类胰蛋白酶α和类胰蛋白酶βIII移码(βIIIFS)等位基因的数目之和。在一些实施方案中,类胰蛋白酶α是通过而检测TPSAB1处的c733 G>A SNP检测的。在一些实施方案中,检测TPSAB1处的c733 G>A SNP包含检测该患者在多态性CTGCAGGCGGGCGTGGTCAGCTGGG[G/A]CGAGGGCTGTGCCCAGCCCAACCGG(SEQ ID NO:36)处的基因型,其中c733 G>A SNP处A的存在指示类胰蛋白酶α。在一些实施方案中,类胰蛋白酶βIIIFS是通过检测TPSB2处的c980_981insC突变而检测的。在一些实施方案中,检测TPSB2处的c980_981insC突变包含检测核苷酸序列CACACGGTCACCCTGCCCCCTGCCTCAGAGACCTTCCCCCCC(SEQ ID NO:37)。
在任何前述方法的一些实施方案中,该患者具有3或4的活性类胰蛋白酶等位基因计数。在一些实施方案中,该活性类胰蛋白酶等位基因计数是3。在其它实施方案中,该活性类胰蛋白酶等位基因计数是4。
在任何前述方法的其它实施方案中,该患者具有0,1,或2的活性类胰蛋白酶等位基因计数。在一些实施方案中,该活性类胰蛋白酶等位基因计数是0。在一些实施方案中,该活性类胰蛋白酶等位基因计数是1。在其它实施方案中,该活性类胰蛋白酶等位基因计数是2。
在任何前述方法的一些实施方案中,参照活性类胰蛋白酶等位基因计数可以是在参照样品,参照群体中确定的,和/或是预先指派的值(例如先前确定显著(例如统计学上显著)分开第一个体子集与第二个体子集(例如就对疗法(例如包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,FcεR拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂)组成的组的药剂的疗法)的响应而言)的截留值)。在一些实施方案中,参照活性类胰蛋白酶等位基因计数是预先确定的值。在一些实施方案中,参照活性类胰蛋白酶等位基因计数是在患者所属肥大细胞介导的炎性疾病(例如哮喘)中预先确定的。在某些实施方案中,活性类胰蛋白酶等位基因计数是自给定群体中的或所调查的肥大细胞介导的炎性疾病(例如哮喘)中的值的总体分布确定的。在一些实施方案中,参照活性类胰蛋白酶等位基因计数是0至4的范围中的整数(例如0,1,2,3,或4)。在特定实施方案中,参照活性类胰蛋白酶等位基因计数是3。
在任何前述方法中,可以使用本文中描述的(例如发明详述IV节中或实施例1中)或本领域已知的任何方法或测定法测定患者的基因型。
在任何前述方面的一些实施方案中,2型生物标志物是TH2细胞相关细胞因子,骨膜素,嗜曙红细胞计数,嗜曙红细胞签名,FeNO,或IgE。在一些实施方案中,TH2细胞相关细胞因子是IL-13,IL-4,IL-9,或IL-5。
在任何前述方法的一些实施方案中,生物标志物(例如类胰蛋白酶)的表达水平是蛋白质表达水平。例如,在一些实施方案中,使用免疫测定法(例如多路免疫测定法),ELISA,Western印迹,或质谱术测量蛋白质表达水平。见例如发明详述V节。在一些实施方案中,类胰蛋白酶的蛋白质表达水平是活性类胰蛋白酶的表达水平。在其它实施方案中,类胰蛋白酶的蛋白质表达水平是总类胰蛋白酶的表达水平。
在任何前述方法的其它实施方案中,生物标志物(例如类胰蛋白酶)的表达水平是mRNA表达水平。例如,在一些实施方案中,使用PCR方法(例如qPCR)或微阵列芯片测量mRNA表达水平。见例如发明详述V节。
在任何前述方法或用途中,自患者衍生的样品中本发明的生物标志物(例如类胰蛋白酶)的表达水平可以相对于生物标志物的参照水平变化至少约10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％,100％,2倍,3倍,4倍,5倍,6倍,7倍,8倍,9倍,10倍,11倍,12倍,13倍,14倍,15倍,16倍,或更多。例如,在一些实施方案中,自患者衍生的样品中本发明的生物标志物的表达水平可以相对于生物标志物的参照水平升高至少约10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％,100％,2倍,3倍,4倍,5倍,6倍,7倍,8倍,9倍,10倍,11倍,12倍,13倍,14倍,15倍,16倍,或更多。在其它实施方案中,自患者衍生的样品中本发明的生物标志物的表达水平可以相对于生物标志物的参照水平降低至少约10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％,100％,2倍,3倍,4倍,5倍,6倍,7倍,8倍,9倍,10倍,11倍,12倍,13倍,14倍,15倍,16倍,或更多。
在一些实施方案中,参照水平可以设置为例如健康受试者中或一组具有病症(例如肥大细胞介导的炎性疾病(例如哮喘))的患者中例如生物标志物(例如类胰蛋白酶)的表达水平的总体分布的第20百分位和第99百分位之间的任何百分位(例如第20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,或99百分位)。在特定实施方案中,参照水平可以设置为一群哮喘患者中的值的总体分布的第25百分位。在其它特定实施方案中,参照水平可以设置为一群具有哮喘的患者中的值的总体分布的第50百分位。在其它实施方案中,参照水平可以是一群具有哮喘的患者中的值的总体分布的中值。
可以在任何前述方法中使用任何合适的自患者衍生的样品。例如,在一些实施方案中,自患者衍生的样品是血液样品(例如全血样品,血清样品,血浆样品,或其组合),组织样品,痰样品,细支气管灌洗样品,粘膜衬里液(MLF)样品,支气管吸收样品,或鼻吸收样品。
本发明还特征在于供治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的方法中使用的肥大细胞定向疗法(例如选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂)组成的组的药剂),其中(i)该患者的基因型已经测定为包含处于或高于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数；或(ii)来自该患者的样品已经测定为具有处于或高于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平。在一些实施方案中,该患者已经测定为具有来自该患者的样品中低于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平,且该药剂供作为单一疗法使用。在一些实施方案中,该患者已经鉴定为具有来自该患者的样品中处于或高于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平,且该药剂供与TH2途径抑制剂组合使用。
在另一个方面,本发明提供肥大细胞定向疗法(例如选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂)组成的组的药剂)在制造用于治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的药物中的用途,其中(i)该患者的基因型已经测定为包含处于或高于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数；或(ii)来自该患者的样品已经测定为具有处于或高于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平。在一些实施方案中,该患者已经测定为具有来自该患者的样品中低于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平,且该药剂供作为单一疗法使用。在一些实施方案中,该患者已经鉴定为具有来自该患者的样品中处于或高于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平,且该药剂供与TH2途径抑制剂组合使用。
在还有另一个方面,本发明特征在于供治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的方法中使用的IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂,其中(i)该患者的基因型已经测定为包含低于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数；或(ii)来自该患者的样品已经测定为具有低于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平。在一些实施方案中,该患者已经测定为具有来自该患者的样品中处于或高于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平,且该IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂供与TH2途径抑制剂组合使用。
在又一个方面,本发明提供IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂在制造用于治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的药物中的用途,其中(i)该患者的基因型已经测定为包含低于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数；或(ii)来自该患者的样品已经测定为具有低于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平。在一些实施方案中,该患者已经测定为具有来自该患者的样品中处于或高于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平,且该IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂供与TH2途径抑制剂组合使用。
任何前述方法或用途可以包括将类胰蛋白酶拮抗剂施用于该患者。该类胰蛋白酶拮抗剂可以是类胰蛋白酶α拮抗剂(例如类胰蛋白酶α1拮抗剂)或类胰蛋白酶β拮抗剂(例如类胰蛋白酶β1,类胰蛋白酶β2,和/或类胰蛋白酶β3拮抗剂)。在一些实施方案中,该类胰蛋白酶拮抗剂是类胰蛋白酶α拮抗剂和类胰蛋白酶β拮抗剂。在一些实施方案中,该类胰蛋白酶拮抗剂(例如该类胰蛋白酶α拮抗剂和/或该类胰蛋白酶β拮抗剂)是抗类胰蛋白酶抗体(例如抗类胰蛋白酶α抗体和/或抗类胰蛋白酶β抗体)。可以使用下文VII节中描述的任何抗类胰蛋白酶抗体。
任何前述方法或用途可以包括将FcεR拮抗剂施用于该患者。在一些实施方案中,该FcεR拮抗剂抑制FcεRIα,FcεRIβ,和/或FcεRIγ。在其它实施方案中,该FcεR拮抗剂抑制FcεRII。在还有其它实施方案中,该FcεR拮抗剂抑制FcεR信号传导途径的成员。例如,在一些实施方案中,该FcεR拮抗剂抑制酪氨酸蛋白质激酶Lyn(Lyn),Bruton氏酪氨酸激酶(BTK),酪氨酸蛋白质激酶Fyn(Fyn),脾相关酪氨酸激酶(Syk),T细胞激活接头(LAT),生长因子受体结合的蛋白质2(Grb2),son of sevenless(Sos),Ras,Raf-1,丝裂原活化的蛋白质激酶激酶1(MEK),丝裂原活化的蛋白质激酶1(ERK),胞质磷脂酶A2(cPLA2),花生四烯酸5-脂肪氧合酶(5-LO),花生四烯酸5-脂肪氧合酶活化蛋白质(FLAP),鸟嘌呤核苷酸交换因子VAV(Vav),Rac,丝裂原活化的蛋白质激酶激酶3,丝裂原活化的蛋白质激酶激酶7,p38MAP激酶(p38),c-Jun N端激酶(JNK),生长因子受体结合的蛋白质2相关蛋白质2(Gab2),磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶(PI3K),磷脂酶C伽马(PLCγ),蛋白质激酶C(PKC),3-磷酸肌醇依赖性蛋白质激酶1(PDK1),RAC丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶(AKT),组胺,肝素,白介素(IL)-3,IL-4,IL-13,IL-5,粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),肿瘤坏死因子阿尔法(TNFα),白三烯(例如LTC4,LTD4和LTE4)和前列腺素(例如PDG2)。在一些实施方案中,该FcεR拮抗剂是BTK抑制剂(例如GDC-0853,阿卡替尼,GS-4059,spebrutinib,BGB-3111,或HM71224)。
任何前述方法或用途可以包括将IgE+ B细胞消减性药剂(例如IgE+ B细胞消减性抗体)施用于该患者。在一些实施方案中,该IgE+ B细胞消减性抗体是抗M1’域抗体。可以使用任何合适的抗M1’域抗体,例如国际专利申请公开号WO 2008/116149中描述的任何抗M1’域抗体,通过援引将其完整收入本文。在一些实施方案中,该抗M1’域抗体是无岩藻糖基化的。在一些实施方案中,该抗M1’域抗体是quilizumab或47H4(见例如Brightbill et al.,J.Clin.Invest.120(6):2218-2229,2010)。
任何前述方法或用途可以包括将肥大细胞或嗜碱性细胞消减性药剂(例如肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体)施用于该患者。在一些实施方案中,该抗体消减肥大细胞。在其它实施方案中,该抗体消减嗜碱性细胞。在还有其它实施方案中,该抗体消减肥大细胞和嗜碱性细胞。
任何前述方法或用途可以包括将PAR2拮抗剂施用于该患者。例示性PAR2拮抗剂包括小分子抑制剂(例如K-12940,K-14585,肽FSLLRY-NH2(SEQ ID NO:30),GB88,AZ3451,和AZ8838),可溶性受体,siRNA,和抗PAR2抗体(例如MAB3949和Fab3949)。
任何前述方法或用途可以包括将IgE拮抗剂施用于该患者。在一些实施方案中,该IgE拮抗剂是抗IgE抗体。可以使用任何合适的抗IgE抗体。例如,该抗IgE抗体可以是美国专利No.8,961,964中描述的任何抗IgE抗体,通过援引将其完整收入本文。例示性抗IgE抗体包括奥马珠单抗
Figure BDA0002598124610000481
E26,E27,CGP-5101(Hu-901),HA,ligelizumab,和talizumab。在特定实施方案中,该抗IgE抗体是奥马珠单抗
Figure BDA0002598124610000484
奥马珠单抗
Figure BDA0002598124610000482
的重链可变(VH)域的氨基酸序列如下(HVR-H1,-H2,和-H3氨基酸序列标有下划线):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGYSITSGYSWNWIRQAPGKGLEWVASITYDGSTNYNPSVKGRITISRDDSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSHYFGHWHFAVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:38)。奥马珠单抗
Figure BDA0002598124610000483
的轻链可变(VL)域的氨基酸序列如下(HVR-L1,-L2,和-L3氨基酸序列标有下划线):
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASYLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSHEDPYTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:40)。
因而,在一些实施方案中,抗IgE抗体包括下述六种HVR中的一种,两种,三种,四种,五种,或所有六种:(a)包含氨基酸序列GYSWN(SEQ ID NO:40)的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SITYDGSTNYNPSVKG(SEQ ID NO:41)的HVR-H2；(c)包含氨基酸序列GSHYFGHWHFAV(SEQID NO:42)的HVR-H3；(d)包含氨基酸序列RASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:43)的HVR-L1；(e)包含氨基酸序列AASYLES(SEQ ID NO:44)的HVR-L2；和(f)包含氨基酸序列QQSHEDPYT(SEQID NO:45)的HVR-L3。在一些实施方案中,该抗IgE抗体包括(a)包含与SEQ ID NO:38的氨基酸序列具有至少90％,至少95％,或至少99％序列同一性的氨基酸序列的VH域；(b)包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列具有至少90％,至少95％,或至少99％同一性的氨基酸序列的VL域；或(c)如(a)中的VH域和如(b)中的VL域。在一些实施方案中,该VH域包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。在一些实施方案中,该VL域包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中,该VH域包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列且该VL域包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。本文中描述的任何抗IgE抗体可以与本文中,例如下文VII节中描述的任何抗类胰蛋白酶抗体组合使用。
任何前述方法或用途可以包括将TH2途径抑制剂施用于该患者。在一些实施方案中,该TH2途径抑制剂抑制选自下述的任何靶物:白介素-2可诱导T细胞激酶(ITK),Bruton氏酪氨酸激酶(BTK),Janus激酶1(JAK1)(例如ruxolitinib,tofacitinib,oclacitinib,baricitinib,filgotinib,gandotinib,lestaurtinib,momelotinib,pacrinitib,upadacitinib,peficitinib,和fedratinib),GATA结合蛋白3(GATA3),IL-9(例如MEDI-528),IL-5(例如mepolizumab,CAS No.196078-29-2；resilizumab),IL-13(例如IMA-026,IMA-638(也称作anrukinzumab,INN No.910649-32-0；QAX-576；IL-4/IL-13陷阱),tralokinumab(也称作CAT-354,CAS No.1044515-88-9)；AER-001,ABT-308(也称作人源化13C5.5抗体)),IL-4(例如AER-001,IL-4/IL-13陷阱),OX40L,TSLP,IL-25,IL-33,和IgE(例如
Figure BDA0002598124610000491
QGE-031；和MEDI-4212)；和受体,诸如IL-9受体,IL-5受体(例如MEDI-563(benralizumab,CAS No.1044511-01-4)),IL-4受体α(例如AMG-317,AIR-645),IL-13受体α1(例如R-1671)和IL-13受体α2,OX40,TSLP-R,IL-7Rα(TSLP的共同受体),IL-17RB(IL-25的受体),ST2(IL-33的受体),CCR3,CCR4,CRTH2(例如AMG-853,AP768,AP-761,MLN6095,ACT129968),FcεRI,FcεRII/CD23(IgE的受体),Flap(例如GSK2190915),Syk激酶(R-343,PF3526299)；CCR4(AMG-761),TLR9(QAX-935)和CCR3,IL-5,IL-3,和GM-CSF的多细胞因子抑制剂(例如TPI ASM8)。
任何前述方法或用途可以包括将另外的治疗剂施用于该患者。在一些实施方案中,该另外的治疗剂选自由TH2途径抑制剂,皮质类固醇,IL-33轴结合拮抗剂,TRPA1拮抗剂,支气管扩张剂或哮喘症状控制药疗,免疫调控剂,酪氨酸激酶抑制剂,和磷酸二酯酶抑制剂组成的组。下文进一步描述了此类组合疗法。
在一些实施方案中,另外的治疗剂是哮喘疗法,如下文描述的。中度哮喘当前用每天吸入式抗炎性皮质类固醇或肥大细胞抑制剂诸如色甘酸钠或奈多罗米加吸入式β2-激动剂(根据需要)(每天3-4次)以缓解突破性症状或变应原或运动诱发的哮喘来治疗。例示性吸入式皮质类固醇包括
Figure BDA0002598124610000501
Figure BDA0002598124610000502
Figure BDA0002598124610000503
和
Figure BDA0002598124610000504
另外的哮喘疗法包括长效支气管扩张剂(LABD)。在某些实施方案中,LABD是长效β-2激动剂(LABA),白三烯受体拮抗剂(LTRA),长效毒蕈碱拮抗剂(LAMA),茶碱,或口服皮质类固醇(OCS)。例示性LABD包括
Figure BDA0002598124610000505
PERFOROMISTTM,和
Figure BDA0002598124610000506
在一些实施方案中,任何前述方法或用途进一步包含施用支气管扩张剂或哮喘症状控制剂药疗。在一些实施方案中,支气管扩张剂或哮喘控制剂药疗是β2-肾上腺素能激动剂,诸如短效β2-激动剂(SABA)(诸如沙丁胺醇),或长效β2-肾上腺素能激动剂(LABA)。在一些实施方案中,LABA是沙美特罗,阿贝特罗,茚达特罗,维兰特罗,和/或福莫特罗(富马酸福莫特罗脱水物)。在一些实施方案中,哮喘控制剂药疗是白三烯受体拮抗剂(LTRA)。在一些实施方案中,LTRA是孟鲁司特,扎鲁司特,和/或齐留通。在一些实施方案中,支气管扩张剂或哮喘控制剂药疗是毒蕈碱拮抗剂,诸如长效毒蕈碱乙酰胆碱受体(胆碱能)拮抗剂(LAMA)。在一些实施方案中,LAMA是葡萄糖吡喀。在一些实施方案中,支气管扩张剂或哮喘控制剂药疗是离子通道,诸如苦味受体(诸如TAS2R)的激动剂。
在一些实施方案中,任何前述方法或用途进一步包含施用支气管扩张剂。在一些实施方案中,支气管扩张剂是吸入式支气管扩张剂。在一些实施方案中,吸入式支气管扩张剂是β2-肾上腺素能激动剂。在一些实施方案中,β2-肾上腺素能激动剂是短效β2-肾上腺素能激动剂(SABA)。在一些实施方案中,SABA是比托特罗,非诺特罗,异丙肾上腺素,左旋沙丁胺醇,间羟异丙肾上腺素,吡布特罗,丙卡特罗,利托君,沙丁胺醇,和/或特布他林。在一些实施方案中,β2-肾上腺素能激动剂是长效β2-肾上腺素能激动剂(LABA)。在一些实施方案中,LABA是阿福特罗,班布特罗,克仑特罗,福莫特罗,沙美特罗,阿贝特罗,卡莫昔罗,茚达特罗,奥洛特罗,和/或维兰特罗。在一些实施方案中,吸入式支气管扩张剂是毒蕈碱受体拮抗剂。在一些实施方案中,毒蕈碱受体拮抗剂是短效毒蕈碱受体拮抗剂(SAMA)。在一些实施方案中,SAMA是异丙托溴铵。在一些实施方案中,毒蕈碱受体拮抗剂是长效毒蕈碱受体拮抗剂(LAMA)。在一些实施方案中,LAMA是噻托溴铵,格隆溴铵,乌美溴铵,阿地溴铵,和/或雷芬那辛。在一些实施方案中,吸入式支气管扩张剂是SABA/SAMA组合。在一些实施方案中,SABA/SAMA组合是沙丁胺醇/异丙托铵。在一些实施方案中,吸入式支气管扩张剂是LABA/LAMA组合。在一些实施方案中,LABA/LAMA组合是福莫特罗/阿地溴铵,福莫特罗/格隆溴铵,福莫特罗/噻托溴铵,茚达特罗/格隆溴铵,茚达特罗/噻托溴铵,奥洛特罗/噻托溴铵,沙美特罗/噻托溴铵,和/或维兰特罗/乌美溴铵。在一些实施方案中,吸入式支气管扩张剂是双功能支气管扩张剂。在一些实施方案中,双功能支气管扩张剂是毒蕈碱拮抗剂/β2-激动剂(MABA)。在一些实施方案中,MABA是batefenterol,THRX 200495,AZD 2115,LAS 190792,TEI3252,PF-3429281和/或PF-4348235。在一些实施方案中,吸入式支气管扩张剂是TAS2R的激动剂。在一些实施方案中,支气管扩张剂是喷雾SABA。在一些实施方案中,喷雾SABA是沙丁胺醇和/或左旋沙丁胺醇。在一些实施方案中,支气管扩张剂是喷雾LABA。在一些实施方案中,喷雾LABA是阿福特罗和/或福莫特罗。在一些实施方案中,支气管扩张剂是喷雾SAMA。在一些实施方案中,喷雾SAMA是异丙托铵。在一些实施方案中,支气管扩张剂是喷雾LAMA。在一些实施方案中,喷雾LAMA是格隆溴铵和/或雷芬那辛。在一些实施方案中,支气管扩张剂是喷雾SABA/SAMA组合。在一些实施方案中,喷雾SABA/SAMA组合是沙丁胺醇/异丙托铵。在一些实施方案中,支气管扩张剂是白三烯受体拮抗剂(LTRA)。在一些实施方案中,LTRA是孟鲁司特,扎鲁司特,和/或齐留通。在一些实施方案中,支气管扩张剂是甲基黄嘌呤。在一些实施方案中,甲基黄嘌呤是茶碱。
在一些实施方案中,任何前述方法或用途进一步包含施用免疫调控剂。在一些实施方案中,该方法进一步包含施用色甘酸。在一些实施方案中,该方法进一步包含施用甲基黄嘌呤。在一些实施方案中,甲基黄嘌呤是茶碱或咖啡因。
在一些实施方案中,任何前述方法或用途进一步包含施用一种或多种皮质类固醇,诸如吸入式皮质类固醇(ICS)或口服皮质类固醇。非限制性例示性皮质类固醇包括吸入式皮质类固醇,诸如二丙酸倍氯米松,布地奈德,环索奈德,氟尼缩松,丙酸氟替卡松,糠酸氟替卡松,莫米松,和/或曲安奈德和口服皮质类固醇,诸如甲泼尼龙,泼尼松龙,和泼尼松。在一些实施方案中,皮质类固醇是ICS。在一些实施方案中,ICS是倍氯米松,布地奈德,氟尼缩松,糠酸氟替卡松,丙酸氟替卡松,莫米松,环索奈德,和/或曲安西龙。在一些实施方案中,该方法进一步包含施用ICS/LABA和/或LAMA组合。在一些实施方案中,ICS/LABA和/或LAMA组合是丙酸氟替卡松/沙美特罗,布地奈德/福莫特罗,莫米松/福莫特罗,糠酸氟替卡松/维兰特罗,丙酸氟替卡松/福莫特罗,倍氯米松/福莫特罗,糠酸氟替卡松/乌美溴铵,糠酸氟替卡松/维兰特罗/乌美溴铵,氟替卡松/沙美特罗/噻托溴铵,倍氯米松/福莫特罗/格隆溴铵,布地奈德/福莫特罗/格隆溴铵,和/或布地奈德/福莫特罗/噻托溴铵。在一些实施方案中,该方法进一步包含施用喷雾皮质类固醇。在一些实施方案中,喷雾皮质类固醇是布地奈德。在一些实施方案中,该方法进一步包含施用口服或静脉内皮质类固醇。在一些实施方案中,口服或静脉内皮质类固醇是泼尼松,泼尼松龙,甲泼尼龙,和/或氢化可的松。
在一些实施方案中,任何前述方法或用途进一步包含施用一种或多种选自氨基水杨酸盐；类固醇；生物剂；硫嘌呤；甲氨蝶呤；钙调磷酸酶抑制剂,例如环孢霉素或他克莫司；和抗生素的活性组分。在一些实施方案中,该方法包含施用口服或表面配制剂中的别的活性组分。氨基水杨酸盐的例子包括4-氨基水杨酸,柳氮磺吡啶,巴柳氮,奥沙拉秦和美沙拉秦,以像Eudragit-S涂层,pH依赖性美沙拉敏,乙基纤维素包被的美沙拉敏,和多基质释放美沙拉敏的形式。类固醇的例子包括皮质类固醇或糖皮质类固醇。皮质类固醇的例子包括泼尼松和氢化可的松或甲泼尼龙,或第二代皮质类固醇,例如布地奈德或硫唑嘌呤；例如以像氢化可的松灌肠或氢化可的松泡沫的形式。生物剂的例子包括依那西普；肿瘤坏死因子α的抗体,例如英夫利昔单抗,阿达木单抗或塞妥珠单抗；IL-12和IL-23的抗体,例如尤特克单抗；维多珠单抗；etrolizumab,和那他珠单抗。硫嘌呤的例子包括硫唑嘌呤,6-巯嘌呤和硫鸟嘌呤。抗生素的例子包括万古霉素,利福昔明,甲硝唑,甲氧苄啶,磺胺甲噁唑,氨苯砜,和环丙沙星；和抗病毒药剂,像更昔洛韦。
在一些实施方案中,任何前述方法或用途进一步包含施用抗纤维变性剂。在一些实施方案中,抗纤维变性剂抑制转化生长因子β(TGF-β)刺激的胶原合成,减少细胞外基质,和/或阻断成纤维细胞增殖。在一些实施方案中,抗纤维变性剂是吡非尼酮。在一些实施方案中,抗纤维变性剂是PBI-4050。在一些实施方案中,抗纤维变性剂是tipelukast。
在一些实施方案中,任何前述方法或用途进一步包含施用酪氨酸激酶抑制剂。在一些实施方案中,酪氨酸激酶抑制剂抑制介导一种或多种纤维生成生长因子的加工的酪氨酸激酶。在一些实施方案中,纤维生成生长因子是血小板衍生生长因子,血管内皮生长因子,和/或成纤维细胞生长因子。在一些实施方案中,酪氨酸激酶抑制剂是伊马替尼和/或尼达尼布。在一些实施方案中,酪氨酸激酶抑制剂是尼达尼布。在一些实施方案中,该方法进一步包含施用抗腹泻剂。在一些实施方案中,抗腹泻剂是洛哌丁胺。
在一些实施方案中,任何前述方法或用途进一步包含施用抗体。在一些实施方案中,抗体是抗白介素(IL)-13抗体。在一些实施方案中,抗IL-13抗体是tralokinumab。在一些实施方案中,抗体是抗IL-4/抗IL-13抗体。在一些实施方案中,抗IL-4/抗IL-13抗体是SAR 156597。在一些实施方案中,抗体是抗结缔组织生长因子(CTGF)抗体。在一些实施方案中,抗CTGF抗体是FG-3019。在一些实施方案中,抗体是抗赖氨酰氧化酶样2(LOXL2)抗体。在一些实施方案中,抗LOXL2抗体是simtuzumab。在一些实施方案中,抗体是抗αvβ6整联蛋白受体抗体。在一些实施方案中,抗αvβ6整联蛋白受体抗体是STX-100。在一些实施方案中,抗体是单克隆抗体。
在一些实施方案中,任何前述方法或用途进一步包含施用溶血磷脂酸-1(LPA1)受体拮抗剂。在一些实施方案中,LPA1受体拮抗剂是BMS-986020。在一些实施方案中,该方法进一步包含施用半乳凝素3抑制剂。在一些实施方案中,半乳凝素3抑制剂是TD-139。
在一些实施方案中,任何前述方法或用途进一步包含施用姑息疗法。在一些实施方案中,姑息疗法包含一种或多种抗生素,抗焦虑药,皮质类固醇,和阿片样物质。在一些实施方案中,抗生素是广谱抗生素。在一些实施方案中,抗生素是青霉素,β-内酰胺酶抑制剂,和/或头孢菌素。在一些实施方案中,抗生素是哌拉西林/三唑巴坦,头孢克肟,头孢曲松和/或头孢地尼。在一些实施方案中,抗焦虑药是阿普唑仑,丁螺环酮,氯丙嗪,地西泮,咪达唑仑,劳拉西泮,和/或异丙嗪。在一些实施方案中,该皮质类固醇是糖皮质类固醇。在一些实施方案中,糖皮质类固醇是泼尼松,泼尼松龙,甲泼尼龙,和/或氢化可的松。在一些实施方案中,阿片样物质是吗啡,可待因,双氢可待因,和/或二醋吗啡。
在一些实施方案中,任何前述方法或用途进一步包含施用抗生素。在一些实施方案中,抗生素是大环内酯。在一些实施方案中,大环内酯是阿奇霉素,和/或克拉霉素。在一些实施方案中,抗生素是多西环素。在一些实施方案中,抗生素是甲氧苄啶/磺胺甲噁唑。在一些实施方案中,抗生素是头孢菌素。在一些实施方案中,头孢菌素是头孢吡肟,头孢克肟,头孢泊肟,头孢罗齐,头孢他啶,和/或头孢呋辛。在一些实施方案中,抗生素是青霉素。在一些实施方案中,抗生素是阿莫西林,氨苄西林,和/或匹氨西林。在一些实施方案中,抗生素是青霉素/β-内酰胺酶抑制剂组合。在一些实施方案中,青霉素/β-内酰胺酶抑制剂组合是阿莫西林/克拉维酸钾和/或哌拉西林/三唑巴坦。在一些实施方案中,抗生素是氟喹诺酮。在一些实施方案中,氟喹诺酮是环丙沙星,吉米沙星,左氧氟沙星,莫西沙星,和/或氧氟沙星。
在一些实施方案中,任何前述方法或用途进一步包含施用磷酸二酯酶抑制剂。在一些实施方案中,磷酸二酯酶抑制剂是磷酸二酯酶5型抑制剂。在一些实施方案中,磷酸二酯酶抑制剂是阿伐那非,苯扎那非,达生那非,淫羊藿苷,罗地那非,米罗那非,西地那非,他达那非,乌地那非,和/或伐地那非。在一些实施方案中,PDE抑制剂是PDE-4抑制剂。在一些实施方案中,PDE-4抑制剂是罗氟司特,西洛司特,替托司特,和/或CHF6001。在一些实施方案中,PDE抑制剂是PDE-3/PDE-4抑制剂。在一些实施方案中,PDE-3/PDE-4抑制剂是RPL-554。
在一些实施方案中,任何前述方法或用途进一步包含施用细胞毒性和/或免疫遏制性药剂。在一些实施方案中,细胞毒性和/或免疫遏制性药剂是硫唑嘌呤,秋水仙素,环磷酰胺,环孢霉素,甲氨蝶呤,青霉胺,和/或沙利度胺。在一些实施方案中,该方法进一步包含施用药剂恢复肺中消减的谷胱甘肽水平。在一些实施方案中,恢复肺中消减的谷胱甘肽水平的药剂是N-乙酰半胱氨酸。在一些实施方案中,该方法进一步包含施用抗凝血药。在一些实施方案中,抗凝血药是华法林,肝素,活化的蛋白C,和/或组织因子途径抑制剂。
在一些实施方案中,任何前述方法或用途进一步包含施用内皮缩血管肽受体拮抗剂。在一些实施方案中,内皮缩血管肽受体拮抗剂是波生坦,马昔腾坦和/或安利生坦。在一些实施方案中,该方法进一步包含施用TNF-α拮抗剂。在一些实施方案中,TNF-α拮抗剂包含一种或多种依那西普,阿达木单抗,英夫利昔单抗,塞妥珠单抗,和戈利木单抗。在一些实施方案中,该方法进一步包含施用干扰素γ-1b。
在一些实施方案中,任何前述方法或用途进一步包含施用白介素(IL)抑制剂。在一些实施方案中,IL抑制剂是IL-5抑制剂。在一些实施方案中,IL-5抑制剂是美泊利单抗和/或贝那利珠单抗。在一些实施方案中,IL抑制剂是IL-17A抑制剂。在一些实施方案中,IL-17A抑制剂是CNTO-6785。
在一些实施方案中,任何前述方法或用途进一步包含施用p38丝裂原活化的蛋白质激酶(MAPK)抑制剂。在一些实施方案中,p38 MAPK抑制剂是洛批莫德和/或AZD-7624。在一些实施方案中,该方法进一步包含施用CXCR2拮抗剂。在一些实施方案中,CXCR2拮抗剂是danirixin。
在一些实施方案中,任何前述方法或用途进一步包含疫苗接种。在一些实施方案中,疫苗接种是针对肺炎球菌和/或流感的疫苗接种。在一些实施方案中,疫苗接种是针对肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和/或流感的疫苗接种。在一些实施方案中,该方法进一步包含施用抗病毒疗法。在一些实施方案中,抗病毒疗法是奥塞米韦,帕拉米韦,和/或扎那米韦。
在一些实施方案中,任何前述方法或用途进一步包含预防胃食管反流和/或复发性微吸入(recurrent microaspiration)。
在一些实施方案中,任何前述方法或用途进一步包含通气支持。在一些实施方案中,通气支持是机械通气。在一些实施方案中,该通气支持是非侵入性通气。在一些实施方案中,通气支持是补充供氧。在一些实施方案中,该方法进一步包含肺康复。
在一些实施方案中,任何前述方法或用途进一步包含肺移植。在一些实施方案中,肺移植是单肺移植。在一些实施方案中,该肺移植是双肺移植。
在一些实施方案中,任何前述方法或用途进一步包含非药理学干预。在一些实施方案中,非药理学干预是戒烟,健康饮食,和/或定期运动。在一些实施方案中,该方法进一步包含施用戒烟的药理帮助。在一些实施方案中,戒烟的药理帮助是尼古丁替代疗法,丁氨苯丙酮,和/或伐尼克兰。在一些实施方案中,非药理学干预是肺疗法。在一些实施方案中,肺疗法是肺康复和/或补充供氧。在一些实施方案中,非药理学干预是肺手术。在一些实施方案中,肺手术是肺容积减除手术,单肺移植,双肺移植,或大气泡切除术。在一些实施方案中,非药理学干预是使用装置。在一些实施方案中,装置是肺容积减除线圈,呼气气道支架,和/或鼻通气支持系统。
组合疗法可以提供“协同作用”及证实是“协同性”的,即当一起使用活性组分时所实现的效果大于分开使用化合物时所产生的效果之和。当活性组分为如下情况时可以获得协同效应:(1)共配制和施用或在组合的单位剂量配制剂中同时投递；(2)作为分开的配制剂交替或平行投递；或(3)通过一些其它方案。组合施用包括使用分开的配制剂或单一药物配制剂的共施用,和任一次序的序贯施用,其中优选有一段时间所有活性剂同时发挥它们的生物学活性。当在交替疗法中投递时,在顺序施用或投递化合物时,例如通过不同注射器中的不同注射,可以获得协同效应。一般地,在交替疗法期间,顺序即连续施用有效剂量的每种活性组分,而在组合疗法中,一起施用有效剂量的两种或更多种活性组分。在顺序施用时,组合可以在两次或更多次施用中施用。
上文记录的此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在同一配制剂或分开的配制剂中),和分开施用,在该情况中,药剂(例如类胰蛋白酶拮抗剂,FcεR拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,IgE拮抗剂,或其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂))或其药学组合物的施用可以在一种或多种另外的治疗剂的施用之前,同时和/或之后发生。在一个实施方案中,药剂(例如类胰蛋白酶拮抗剂,FcεR拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,IgE拮抗剂,或其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂))或其药学组合物的施用和另外的治疗剂的施用彼此在约一个月内；或在约一,两或三周内；或在约一,两,三,四,五,或六天内；或在约1,2,3,4,5,6,7,8,或9个小时内；或在约1,5,10,20,30,40,或50分钟内发生。对于牵涉顺序施用的实施方案,药剂(例如类胰蛋白酶拮抗剂,Fc厄普西隆受体(FcεR)拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,蛋白酶活化的受体2(PAR2)拮抗剂,IgE拮抗剂,或其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂))可以在一种或多种另外的治疗剂的施用之前或之后施用。
在任何前述方法或用途中,疗法(例如包括类胰蛋白酶拮抗剂,FcεR拮抗剂,IgE+B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,IgE拮抗剂,或其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂)的疗法)和任何另外的治疗剂可通过任何合适手段来施用,包括胃肠外,腹膜内,肌肉内,静脉内,皮内,经皮,动脉内,损害内,颅内,关节内,前列腺内,胸膜内,气管内,鞘内,鼻内,阴道内,直肠内,表面,肿瘤内,腹膜,皮下,结膜下,囊内,粘膜,心包内,脐内,眼内,眶内,口服,表面,透皮,玻璃体内,眼周,结膜,眼球筋膜囊下(subtenonly),前房内(intracamerally),视网膜下,眼球后,小管内,通过吸入,通过注射,通过植入,通过输注,通过连续输注,通过直接沐浴靶细胞的局部灌注,通过导管,通过灌洗,在乳剂中,或在脂质组合物中。施用可以是系统的或局部的。另外,可以通过脉冲输注适当地施用拮抗剂,例如用递减剂量的拮抗剂。
任何治疗剂,例如类胰蛋白酶拮抗剂,FcεR拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,IgE拮抗剂,其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂),任何另外的治疗剂,或其药学组合物,会以与优良医学实践一致的方式配制,定剂量,和施用。此类剂量是本领域已知的。这种背景中考虑的因素包括所治疗的特定病症,所治疗的特定哺乳动物,患者个体的临床状况,病症的起因,药剂的投递部位,施用的方法,施用的进度,和医学从业人员知道的其它因素。类胰蛋白酶拮抗剂,FcεR拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,IgE拮抗剂,或其药学组合物无需但任选与当前用于预防或治疗所讨论病症的一种或多种药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的抗体的量,病症或治疗的类型,和上文讨论的其它因素。这些一般以与本文中所述相同的剂量和相同的施用路径,或本文中描述的剂量的约1至99％,或以凭经验/临床上确定为适宜的任何剂量和任何路径使用。
例如,为了预防或治疗疾病,抗体(例如抗类胰蛋白酶抗体,抗IgE抗体(例如
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),IgE+ B细胞消减性抗体(例如抗M1’域抗体(例如quilizumab)),肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,或抗PAR2抗体)的适宜剂量(当单独或与一种或多种其它另外的治疗剂组合使用时)会取决于要治疗的疾病的类型,抗体的类型,疾病的严重程度和过程,施用抗体是为了预防还是治疗目的,在先疗法,患者的临床史和对抗体的响应,和主治医师的斟酌。以一次或以一系列治疗将抗体适当地施用于患者。取决于疾病的类型和严重程度,约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg至10mg/kg)的抗体可能是施用于患者的初始候选剂量,无论例如通过一次或多次分开的施用,或者通过连续输注。一种典型的日剂量可以范围为约1μg/kg至200mg/kg或更多,取决于上文提到的因素。对于数天或更久的重复施用,取决于状况,治疗一般会持续直至发生期望的疾病症状的遏制。抗体的一种例示性剂量会在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围中。如此,可以将约0.5mg/kg,2.0mg/kg,4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一剂或多剂施用于患者。此类剂量可以间歇施用,例如每周,每两周,每三周,或每四周(例如使得患者接受约2至约20剂,或例如约6剂抗体)。例如,可以每月一次施用剂量。可以施用一个较高的初始加载剂量,继以一个或多个较低的剂量。然而,其它剂量方案可能是有用的。这种疗法的进展容易通过常规技术和测定法来监测。在一些情况中,可以施用约50mg/mL至约200mg/mL(例如约50mg/mL,约60mg/mL,约70mg/mL,约80mg/mL,约90mg/mL,约100mg/mL,约110mg/mL,约120mg/mL,约130mg/mL,约140mg/mL,约150mg/mL,约160mg/mL,约170mg/mL,约180mg/mL,约190mg/mL,或约200mg/mL剂量的抗体。在一些实施方案中,可以使用本领域已知的办法基于体重和治疗前IgE水平确定用于哮喘患者的
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(奥马珠单抗)剂量给药。可以每四周通过皮下注射以300mg或150mg每剂施用
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(奥马珠单抗)来治疗CIU。
在任何前述方法或用途中,在一些实施方案中,肥大细胞介导的炎性疾病选自由哮喘,特应性皮炎,荨麻疹(例如CSU或CIU),系统性过敏反应,肥大细胞增多症,慢性阻塞性肺病(COPD),特发性肺纤维化(IPF),和嗜曙红细胞性食管炎组成的组。
在任何前述方法或用途的一些实施方案中,肥大细胞介导的炎性疾病是哮喘。在一些实施方案中,哮喘是持续慢性重度哮喘带有可能危及生命的恶化症状的急性事件(加重或发作)。在一些实施方案中,哮喘是特应性(也称作变应性)哮喘,非变应性哮喘(例如常常由感染呼吸道病毒(例如流感,副流感,鼻病毒,人偏肺病毒,和呼吸道合胞病毒)或吸入刺激物(例如空气污染物,烟雾,柴油颗粒,室内或室外挥发性化学品和气体,或甚至由干冷空气)触发的)。
在任何前述方法或用途的一些实施方案中,哮喘是间歇性或运动诱发的,急性或慢性原发性或二手暴露于“烟”(典型地是卷烟,雪茄,或烟斗),吸入或“雾化”(烟草,大麻,或其它此类物质)所致哮喘,或由最近摄取阿司匹林或相关NSAID触发的哮喘。在一些实施方案中,哮喘是轻度的,或未用皮质类固醇治疗的哮喘,新诊断的和未治疗的哮喘,或先前不需要长期使用吸入式表面或系统类固醇来控制症状(咳嗽,哮鸣,呼吸短促/气急,或胸痛)。在一些实施方案中,哮喘是慢性的,皮质类固醇抗性的哮喘,皮质类固醇不应性的哮喘,皮质类固醇或其它慢性哮喘控制剂药疗未控制的哮喘。
在任何前述方法或用途的一些实施方案中,哮喘是中度至重度哮喘。在某些实施方案中,哮喘是TH2高哮喘。在一些实施方案中,哮喘是重度哮喘。在一些实施方案中,哮喘是特应性哮喘,变应性哮喘,非变应性哮喘(例如由于感染和/或呼吸道合胞病毒(RSV)),运动诱发的哮喘,阿司匹林敏感性/加重哮喘,轻度哮喘,中度至重度哮喘,未用皮质类固醇治疗的哮喘,慢性哮喘,皮质类固醇抗性哮喘,皮质类固醇不应性哮喘,新诊断的和未治疗的哮喘,吸烟所致哮喘,或皮质类固醇未控制的哮喘。在一些实施方案中,哮喘是嗜曙红细胞性哮喘。在一些实施方案中,哮喘是变应性哮喘。在一些实施方案中,个体已经测定为嗜曙红细胞性炎症阳性(EIP)。见WO2015/061441。在一些实施方案中,哮喘是骨膜素高哮喘(例如具有至少约20ng/ml,25ng/ml,或50ng/ml血清任一的骨膜素水平)。在一些实施方案中,哮喘是嗜曙红细胞高哮喘(例如至少约150,200,250,300,350,400个嗜曙红细胞计数/ml血液任一)。在某些实施方案中,哮喘是TH2低哮喘。在一些实施方案中,个体已经测定为嗜曙红细胞性炎症阴性(EIN)。见WO2015/061441。在一些实施方案中,哮喘是骨膜素低哮喘(例如具有小于约20ng/ml血清的骨膜素水平)。在一些实施方案中,哮喘是嗜曙红细胞低哮喘(例如小于约150个嗜曙红细胞计数/μl血液或小于约100个嗜曙红细胞计数/μl血液)。
例如,在任何前述方法或用途的特定实施方案中,哮喘是中度至重度哮喘。在一些实施方案中,哮喘不受皮质类固醇控制。在一些实施方案中,哮喘是TH2高哮喘或TH2低哮喘。在特定实施方案中,哮喘是TH2高哮喘。
III.本发明的诊断方法
本发明特征在于确定具有肥大细胞介导的炎性疾病(例如哮喘)的患者是否很可能响应疗法(例如包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,Fc厄普西隆受体(FcεR)拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,蛋白酶活化的受体2(PAR2)拮抗剂,IgE拮抗剂,和其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂)组成的组的药剂的疗法)的方法,为具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者选择疗法的方法,用于评估具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的响应的方法,和用于监测具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的响应的方法。在一些实施方案中,该疗法是肥大细胞定向疗法(例如包括类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,和/或PAR2拮抗剂的疗法)。在一些实施方案中,该疗法包括类胰蛋白酶拮抗剂(例如抗类胰蛋白酶抗体,例如本文或WO 2018/148585中描述的任何抗类胰蛋白酶抗体)和IgE拮抗剂(例如抗IgE抗体,例如奥马珠单抗(
Figure BDA0002598124610000601
))。
本发明的生物标志物(例如活性类胰蛋白酶等位基因计数和/或类胰蛋白酶)的存在和/或表达水平可以使用本文中描述的任何测定法或通过本领域已知的任何方法或测定法来测定。在一些实施方案中,该方法进一步牵涉将疗法施用于该患者,例如如上文发明详述II节中描述的。该方法可以以多种测定法格式进行,包括检测遗传信息的测定法(例如DNA或RNA测序),基因或蛋白质表达(诸如聚合酶链式反应(PCR)和酶免疫测定法),和检测适宜活性的生化测定法,例如如下文描述的。
例如,在一个方面,本发明特征在于一种确定具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者是否很可能响应肥大细胞定向疗法(例如包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂)组成的组的药剂的疗法)的方法,该方法包括:(a)测定来自具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的样品中患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数；和(b)基于该患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数将该患者鉴定为很可能响应肥大细胞定向疗法(例如包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂)组成的组的药剂的疗法),其中处于或高于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数指示该患者具有升高的可能性是响应该疗法的。在一些实施方案中,该方法进一步包括将该疗法施用于该患者。
在另一个例子中,本发明特征在于一种确定具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者是否很可能响应肥大细胞定向疗法(例如包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,蛋白酶活化的受体2(PAR2)拮抗剂,和其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂)组成的组的药剂的疗法)的方法,该方法包括:(a)测定来自具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平；和(b)基于来自该患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平将该患者鉴定为很可能响应肥大细胞定向疗法(例如包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂)组成的组的药剂的疗法),其中该样品中处于或高于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平指示该患者具有升高的可能性是响应该疗法的。在一些实施方案中,该方法进一步包括将该疗法施用于该患者。
在任何前述方法的一些实施方案中,该患者已经鉴定为具有来自该患者的样品中低于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平。在一些实施方案中,作为单一疗法将该药剂施用于该患者。
在任何前述方法的一些实施方案中,该患者已经鉴定为具有来自该患者的样品中处于或高于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平。在一些实施方案中,该方法进一步包含将TH2途径抑制剂施用于该患者。
在另一个方面,本发明特征在于一种确定具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者是否很可能响应包含IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的疗法的方法,其包括(a)测定来自具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的样品中患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数；和(b)基于该患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数将该患者鉴定为很可能响应包含IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的疗法,其中低于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数指示该患者具有升高的可能性是响应该疗法的。在一些实施方案中,该方法进一步包括将该疗法施用于该患者。
在另一个例子中,本发明特征在于一种确定具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者是否很可能响应包含IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的疗法的方法,其包括(a)测定来自具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平；和(b)基于来自该患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平将该患者鉴定为很可能响应包含IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的疗法,其中来自该患者的样品中低于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平指示该患者具有升高的可能性是响应该疗法的。在一些实施方案中,该方法进一步包括将该疗法施用于该患者。
在任何前述方法的一些实施方案中,该患者已经鉴定为具有来自该患者的样品中处于或高于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平。在一些实施方案中,该方法进一步包含将另外的TH2途径抑制剂施用于该患者。
在又一个例子中,本发明特征在于一种为具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者选择疗法的方法,其包括(a)测定来自具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的样品中患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数；和(b)为该患者选择:(i)肥大细胞定向疗法(例如包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂)组成的组的药剂的疗法),如果该患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数处于或高于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的话,或(ii)包含IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的疗法,如果该患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数低于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的话。在一些实施方案中,该方法进一步包括将依照(b)选择的疗法施用于该患者。
在还有另一个例子中,本发明特征在于一种为具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者选择疗法的方法,其包括(a)测定来自具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平；和(b)为该患者选择:(i)肥大细胞定向疗法(例如包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂)组成的组的药剂的疗法),如果来自该患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平处于或高于类胰蛋白酶的参照水平的话,或(ii)包含IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的疗法,如果来自该患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平低于类胰蛋白酶的参照水平的话。在一些实施方案中,该方法进一步包括将依照(b)选择的疗法施用于该患者。
在任何前述方面的一些实施方案中,该患者已经鉴定为具有来自该患者的样品中低于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平。在一些实施方案中,作为单一疗法将该药剂施用于该患者。
在任何前述方面的一些实施方案中,该患者已经鉴定为具有来自该患者的样品中处于或高于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平,且该方法进一步包含选择包含TH2途径抑制剂的组合疗法。在一些实施方案中,该方法进一步包含将TH2途径抑制剂(或另外的TH2途径抑制剂)施用于该患者。
本发明还特征在于一种用于评估具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者对用肥大细胞定向疗法(例如包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂)组成的组的药剂的疗法)的治疗的响应的方法,该方法包括:(a)测定在将肥大细胞定向疗法(例如包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂)组成的组的药剂的疗法)施用于具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者期间或之后的时间点来自该患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平；和(b)基于该样品中类胰蛋白酶的表达水平与类胰蛋白酶的参照水平的比较维持,调节,或停止该治疗,其中来自该患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平与参照水平相比的变化指示对用该疗法的治疗的响应。在一些实施方案中,该变化是类胰蛋白酶的表达水平的升高且维持该治疗。在其它实施方案中,该变化是类胰蛋白酶的表达水平的降低且调节或停止该治疗。
在另一个例子中,本发明特征在于一种用于监测用肥大细胞定向疗法(例如包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂)组成的组的药剂的疗法)治疗的具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的响应的方法,该方法包括:(a)测定在将肥大细胞定向疗法(例如包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂)组成的组的药剂的疗法)施用于该患者期间或之后的时间点来自该患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平；和(b)比较来自该患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平与类胰蛋白酶的参照水平,由此监测经历用该疗法的治疗的患者的响应。在一些实施方案中,该变化是类胰蛋白酶的表达水平的升高且维持该治疗。在其它实施方案中,该变化是类胰蛋白酶的表达水平的降低且调节或停止该治疗。
在任何前述方法的一些实施方案中,该活性类胰蛋白酶等位基因计数是通过对该患者的基因组的TPSAB1和TPSB2基因座测序而测定的。可以使用任何合适的测序办法,例如Sanger测序或大量平行(例如
Figure BDA0002598124610000641
)测序。在一些实施方案中,通过包含下述步骤的方法对TPSAB1基因座测序:(i)在包含核苷酸序列5’-CTG GTG TGC AAG GTG AAT GG-3’(SEQ ID NO:31)的第一正向引物和包含核苷酸序列5’-AGG TCC AGC ACT CAG GAG GA-3’(SEQ ID NO:32)的第一反向引物存在下扩增来自该受试者的核酸以形成TPSAB1扩增子,和(ii)对该TPSAB1扩增子测序。在一些实施方案中,对该TPSAB1扩增子测序包含使用该第一正向引物和该第一反向引物。在一些实施方案中,通过包含下述步骤的方法对TPSB2基因座测序:(i)在包含核苷酸序列5’-GCA GGT GAG CCT GAG AGT CC-3’(SEQ ID NO:33)的第二正向引物和包含核苷酸序列5’-GGG ACC TTC ACC TGC TTC AG-3’(SEQ ID NO:34)的第二反向引物存在下扩增来自该受试者的核酸以形成TPSB2扩增子,和(ii)对该TPSB2扩增子测序。在一些实施方案中,对该TPSB2扩增子测序包含使用该第二正向引物和包含核苷酸序列5’-CAG CCA GTG ACC CAG CAC-3’(SEQ ID NO:35)的测序反向引物。在一些实施方案中,该活性类胰蛋白酶等位基因计数可以通过测定该患者的基因组的TPSAB1和TPSB2基因座中任何变异的存在来测定。在一些实施方案中,该活性类胰蛋白酶等位基因计数是通过下述公式测定的:4–该患者的基因型中类胰蛋白酶α和类胰蛋白酶βIII移码(βIIIFS)等位基因的数目之和。在一些实施方案中,类胰蛋白酶α是通过检测TPSAB1处的c733 G>C SNP而检测的。在一些实施方案中,检测TPSAB1处的c733 G>A SNP包含检测该患者在多态性CTGCAGGCGGGCGTGGTCAGCTGGG[G/A]CGAGGGCTGTGCCCAGCCCAACCGG(SEQ ID NO:36)处的基因型,其中c733 G>A SNP处A的存在指示类胰蛋白酶α。在一些实施方案中,类胰蛋白酶βIIIFS是通过检测TPSB2处的c980_981insC突变而检测的。在一些实施方案中,检测TPSB2处的c980_981insC突变包含检测核苷酸序列CACACGGTCACCCTGCCCCCTGCCTCAGAGACCTTCCCCCCC(SEQ ID NO:37)。在任何前述方法的一些实施方案中,该患者具有3或4的活性类胰蛋白酶等位基因计数。在一些实施方案中,该活性类胰蛋白酶等位基因计数是3。在其它实施方案中,该活性类胰蛋白酶等位基因计数是4。
在任何前述方法的其它实施方案中,该患者具有0,1,或2的活性类胰蛋白酶等位基因计数。在一些实施方案中,该活性类胰蛋白酶等位基因计数是0。在一些实施方案中,该活性类胰蛋白酶等位基因计数是1。在其它实施方案中,该活性类胰蛋白酶等位基因计数是2。
在任何前述方法的一些实施方案中,参照活性类胰蛋白酶等位基因计数可以是在参照样品,参照群体中确定的,和/或是预先指派的值(例如先前确定显著(例如统计学上显著)分开第一个体子集与第二个体子集(例如就对疗法(例如包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,FcεR拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂)组成的组的药剂的疗法)的响应而言)的截留值)。在一些实施方案中,参照活性类胰蛋白酶等位基因计数是预先确定的值。在一些实施方案中,参照活性类胰蛋白酶等位基因计数是在患者所属肥大细胞介导的炎性疾病(例如哮喘)中预先确定的。在某些实施方案中,活性类胰蛋白酶等位基因计数是自给定群体中的或所调查的肥大细胞介导的炎性疾病(例如哮喘)中的值的总体分布确定的。在一些实施方案中,参照活性类胰蛋白酶等位基因计数是0至4的范围中的整数(例如0,1,2,3,或4)。在特定实施方案中,参照活性类胰蛋白酶等位基因计数是3。
任何前述方法可包括测定一种或多种2型生物标志物的表达水平。在一些实施方案中,2型生物标志物是TH2细胞相关细胞因子,骨膜素,嗜曙红细胞计数,嗜曙红细胞签名,FeNO,或IgE。在一些实施方案中,TH2细胞相关细胞因子是IL-13,IL-4,IL-9,或IL-5。
在任何前述方法中,可使用本文中描述的(例如发明详述IV节中或实施例1中)或本领域已知的任何方法或测定法测定患者的基因型。
在任何前述方法的一些实施方案中,生物标志物的表达水平是蛋白质表达水平。例如,在一些实施方案中,使用免疫测定法(例如多路免疫测定法),ELISA,Western印迹,或质谱术测定蛋白质表达水平。在一些实施方案中,类胰蛋白酶的蛋白质表达水平是活性类胰蛋白酶的表达水平。在其它实施方案中,类胰蛋白酶的蛋白质表达水平是总类胰蛋白酶的表达水平。
在任何前述方法的其它实施方案中,生物标志物的表达水平是mRNA表达水平。例如,在一些实施方案中,使用PCR方法(例如qPCR)或微阵列芯片测定mRNA表达水平。
在任何前述方法的一些实施方案中,生物标志物的参照水平是在具有哮喘的一组个体中测定的生物标志物的水平。例如,在一些实施方案中,参照水平是中值水平。
可以在任何前述方法中使用任何合适的自患者衍生的样品。例如,在一些实施方案中,自患者衍生的样品是血液样品(例如全血样品,血清样品,血浆样品,或其组合),组织样品,痰样品,细支气管灌洗样品,粘膜衬里液(MLF)样品,支气管吸收样品,或鼻吸收样品。
在任何前述方法中,自患者衍生的样品中本发明的生物标志物(例如类胰蛋白酶)的表达水平可以相对于生物标志物的参照水平变化至少约10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％,100％,2倍,3倍,4倍,5倍,6倍,7倍,8倍,9倍,10倍,11倍,12倍,13倍,14倍,15倍,16倍,或更多。例如,在一些实施方案中,自患者衍生的样品中本发明的生物标志物的表达水平可以相对于生物标志物的参照水平升高至少约10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％,100％,2倍,3倍,4倍,5倍,6倍,7倍,8倍,9倍,10倍,11倍,12倍,13倍,14倍,15倍,16倍,或更多。在其它实施方案中,自患者衍生的样品中本发明的生物标志物的表达水平可以相对于生物标志物的参照水平降低至少约10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％,100％,2倍,3倍,4倍,5倍,6倍,7倍,8倍,9倍,10倍,11倍,12倍,13倍,14倍,15倍,16倍,或更多。
在任何前述方法的一些实施方案中,参照水平可以设置为例如健康受试者中或具有病症(例如肥大细胞介导的炎性疾病(例如哮喘))的患者中例如生物标志物(例如类胰蛋白酶)的表达水平的总体分布的第20百分位和第99百分位之间的任何百分位(例如第20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,或99百分位)。在一些实施方案中,参照水平可以设置为一群具有哮喘的患者中的值的总体分布的第25百分位。在其它实施方案中,参照水平可以设置为一群具有肥大细胞介导的炎性疾病(例如哮喘)的患者中的值的总体分布的第50百分位。在还有其它实施方案中,参照水平可以是一群具有肥大细胞介导的炎性疾病(例如哮喘)的患者中的值的总体分布的中值。
在任何前述方法中,该患者可以具有相对于参照水平升高水平的TH2生物标志物。在一些实施方案中,该TH2生物标志物选自由血清骨膜素,呼出一氧化氮分数(FeNO),痰嗜曙红细胞计数,和外周血液嗜曙红细胞计数组成的组。在一些实施方案中,该TH2生物标志物是血清骨膜素。例如,该患者可以具有约20ng/ml或更高(例如约20ng/ml,约25ng/ml,约30ng/ml,约35ng/ml,约40ng/ml,约45ng/ml,约50ng/ml,或更高)的血清骨膜素水平。在其它实施方案中,该患者可以具有约50ng/ml或更高(例如约50ng/ml,约55ng/ml,约60ng/ml,约65ng/ml,约70ng/ml,约75ng/ml,约80ng/ml,或更高)的血清骨膜素水平。可以使用任何合适方法测定血清骨膜素水平,例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)。本文中描述了合适的办法。
在任何前述方法的一些实施方案中,该疗法包括类胰蛋白酶拮抗剂。该类胰蛋白酶拮抗剂可以是类胰蛋白酶α拮抗剂(例如类胰蛋白酶α1拮抗剂)或类胰蛋白酶β拮抗剂(例如类胰蛋白酶β1,类胰蛋白酶β2,和/或类胰蛋白酶β3拮抗剂)。在一些实施方案中,该类胰蛋白酶拮抗剂是类胰蛋白酶α拮抗剂和类胰蛋白酶β拮抗剂。在一些实施方案中,该类胰蛋白酶拮抗剂(例如该类胰蛋白酶α拮抗剂和/或该类胰蛋白酶β拮抗剂)是抗类胰蛋白酶抗体(例如抗类胰蛋白酶α抗体和/或抗类胰蛋白酶β抗体)。可以使用下文VII节中描述的任何抗类胰蛋白酶抗体。
在任何前述方法的一些实施方案中,该疗法包括FcεR拮抗剂。在一些实施方案中,该FcεR拮抗剂抑制FcεRIα,FcεRIβ,和/或FcεRIγ。在其它实施方案中,该FcεR拮抗剂抑制FcεRII。在还有其它实施方案中,该FcεR拮抗剂抑制FcεR信号传导途径的成员。例如,在一些实施方案中,该FcεR拮抗剂抑制酪氨酸蛋白质激酶Lyn(Lyn),Bruton氏酪氨酸激酶(BTK),酪氨酸蛋白质激酶Fyn(Fyn),脾相关酪氨酸激酶(Syk),T细胞激活接头(LAT),生长因子受体结合的蛋白质2(Grb2),son of sevenless(Sos),Ras,Raf-1,丝裂原活化的蛋白质激酶激酶1(MEK),丝裂原活化的蛋白质激酶1(ERK),胞质磷脂酶A2(cPLA2),花生四烯酸5-脂肪氧合酶(5-LO),花生四烯酸5-脂肪氧合酶活化蛋白质(FLAP),鸟嘌呤核苷酸交换因子VAV(Vav),Rac,丝裂原活化的蛋白质激酶激酶3,丝裂原活化的蛋白质激酶激酶7,p38MAP激酶(p38),c-Jun N端激酶(JNK),生长因子受体结合的蛋白质2相关蛋白质2(Gab2),磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶(PI3K),磷脂酶C伽马(PLCγ),蛋白质激酶C(PKC),3-磷酸肌醇依赖性蛋白质激酶1(PDK1),RAC丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶(AKT),组胺,肝素,白介素(IL)-3,IL-4,IL-13,IL-5,粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),肿瘤坏死因子阿尔法(TNFα),白三烯(例如LTC4,LTD4和LTE4)和前列腺素(例如PDG2)。在一些实施方案中,该FcεR拮抗剂是BTK抑制剂(例如GDC-0853,阿卡替尼,GS-4059,spebrutinib,BGB-3111,或HM71224)。
在任何前述方法的一些实施方案中,该疗法包括IgE+ B细胞消减性药剂(例如IgE+B细胞消减性抗体)。在一些实施方案中,该IgE+ B细胞消减性抗体是抗M1’域抗体。可以使用任何合适的抗M1’域抗体,例如国际专利申请公开号WO 2008/116149中描述的任何抗M1’域抗体,通过援引将其完整收入本文。在一些实施方案中,该抗M1’域抗体是无岩藻糖基化的。在一些实施方案中,该抗M1’域抗体是quilizumab或47H4(见例如Brightbill et al.,J.Clin.Invest.120(6):2218-2229,2010)。
在任何前述方法的一些实施方案中,该疗法包括肥大细胞或嗜碱性细胞消减性药剂(例如肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体)。在一些实施方案中,该抗体消减肥大细胞。在其它实施方案中,该抗体消减嗜碱性细胞。在还有其它实施方案中,该抗体消减肥大细胞和嗜碱性细胞。
在任何前述方法的一些实施方案中,该疗法包括PAR2拮抗剂。例示性PAR2拮抗剂包括小分子抑制剂(例如K-12940,K-14585,肽FSLLRY-NH2(SEQ ID NO:30),GB88,AZ3451,和AZ8838),可溶性受体,siRNA,和抗PAR2抗体(例如MAB3949和Fab3949)。
在任何前述方法的一些实施方案中,该疗法包括IgE拮抗剂。在一些实施方案中,该IgE拮抗剂是抗IgE抗体。可以使用任何合适的抗IgE抗体。例示性抗IgE抗体包括奥马珠单抗
Figure BDA0002598124610000681
E26,E27,CGP-5101(Hu-901),HA,ligelizumab,和talizumab。在一些实施方案中,该抗IgE抗体包括下述六种HVR中一种,两种,三种,四种,五种,或所有六种:(a)包含氨基酸序列GYSWN(SEQ ID NO:40)的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SITYDGSTNYNPSVKG(SEQ ID NO:41)的HVR-H2；(c)包含氨基酸序列GSHYFGHWHFAV(SEQ ID NO:42)的HVR-H3；(d)包含氨基酸序列RASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:43)的HVR-L1；(e)包含氨基酸序列AASYLES(SEQ ID NO:44)的HVR-L2；和(f)包含氨基酸序列QQSHEDPYT(SEQ ID NO:45)的HVR-L3。在一些实施方案中,该抗IgE抗体包括(a)包含与SEQ ID NO:38的氨基酸序列具有至少90％,至少95％,或至少99％序列同一性的氨基酸序列的VH域；(b)包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列具有至少90％,至少95％,或至少99％同一性的氨基酸序列的VL域；或(c)如(a)中的VH域和如(b)中的VL域。在一些实施方案中,该VH域包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。在一些实施方案中,该VL域包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中,该VH域包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列且该VL域包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。本文中描述的任何抗IgE抗体可以与本文中,例如下文VII节中描述的任何抗类胰蛋白酶抗体组合使用。在特定实施方案中,该抗IgE抗体是奥马珠单抗
Figure BDA0002598124610000691
在任何前述方法的一些实施方案中,该疗法包括TH2途径抑制剂。在一些实施方案中,该TH2途径抑制剂抑制选自下述的任何靶物:白介素-2可诱导T细胞激酶(ITK),Bruton氏酪氨酸激酶(BTK),Janus激酶1(JAK1)(例如ruxolitinib,tofacitinib,oclacitinib,baricitinib,filgotinib,gandotinib,lestaurtinib,momelotinib,pacrinitib,upadacitinib,peficitinib,和fedratinib),GATA结合蛋白3(GATA3),IL-9(例如MEDI-528),IL-5(例如美泊利单抗,CAS No.196078-29-2；resilizumab),IL-13(例如IMA-026,IMA-638(也称作anrukinzumab,INN No.910649-32-0；QAX-576；IL-4/IL-13陷阱),tralokinumab(也称作CAT-354,CAS No.1044515-88-9)；AER-001,ABT-308(也称作人源化13C5.5抗体)),IL-4(例如AER-001,IL-4/IL-13陷阱),OX40L,TSLP,IL-25,IL-33,和IgE(例如
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QGE-031；和MEDI-4212)；和受体,诸如IL-9受体,IL-5受体(例如MEDI-563(贝那利珠单抗,CAS No.1044511-01-4)),IL-4受体α(例如AMG-317,AIR-645),IL-13受体α1(例如R-1671)和IL-13受体α2,OX40,TSLP-R,IL-7Rα(TSLP的共同受体),IL-17RB(IL-25的受体),ST2(IL-33的受体),CCR3,CCR4,CRTH2(例如AMG-853,AP768,AP-761,MLN6095,ACT129968),FcεRI,FcεRII/CD23(IgE的受体),Flap(例如GSK2190915),Syk激酶(R-343,PF3526299)；CCR4(AMG-761),TLR9(QAX-935)和CCR3,IL-5,IL-3,和GM-CSF的多细胞因子抑制剂(例如TPI ASM8)。
在任何前述方法的一些实施方案中,哮喘是持续慢性重度哮喘带有可能危及生命的恶化症状的急性事件(加重或发作)。在一些实施方案中,哮喘是特应性(也称作变应性)哮喘,非变应性哮喘(例如常常由感染呼吸道病毒(例如流感,副流感,鼻病毒,人偏肺病毒,和呼吸道合胞病毒)或吸入刺激物(例如空气污染物,烟雾,柴油颗粒,室内或室外挥发性化学品和气体,或甚至由干冷空气)触发的)。
在任何前述方法的一些实施方案中,哮喘是间歇性或运动诱发的,急性或慢性原发性或二手暴露于“烟”(典型地是卷烟,雪茄,或烟斗),吸入或“雾化”(烟草,大麻,或其它此类物质)所致哮喘,或由最近摄取阿司匹林或相关NSAID触发的哮喘。在一些实施方案中,哮喘是轻度的,或未用皮质类固醇治疗的哮喘,新诊断的和未治疗的哮喘,或先前不需要长期使用吸入式表面或系统类固醇来控制症状(咳嗽,哮鸣,呼吸短促/气急,或胸痛)。在一些实施方案中,哮喘是慢性的,皮质类固醇抗性的哮喘,皮质类固醇不应性的哮喘,或皮质类固醇或其它慢性哮喘控制剂药疗未控制的哮喘。
在任何前述方法的一些实施方案中,哮喘是中度至重度哮喘。在某些实施方案中,哮喘是TH2高哮喘。在一些实施方案中,哮喘是重度哮喘。在一些实施方案中,哮喘是特应性哮喘,变应性哮喘,非变应性哮喘(例如由于感染和/或呼吸道合胞病毒(RSV)),运动诱发的哮喘,阿司匹林敏感性/加重哮喘,轻度哮喘,中度至重度哮喘,未用皮质类固醇治疗的哮喘,慢性哮喘,皮质类固醇抗性哮喘,皮质类固醇不应性哮喘,新诊断的和未治疗的哮喘,吸烟所致哮喘,或皮质类固醇未控制的哮喘。在一些实施方案中,哮喘是T辅助淋巴细胞2型(TH2)或2型(TH2)高,或2型(T2)驱动的哮喘。在一些实施方案中,哮喘是嗜曙红细胞性哮喘。在一些实施方案中,哮喘是变应性哮喘。在一些实施方案中,个体已经测定为嗜曙红细胞性炎症阳性(EIP)。见WO2015/061441。在一些实施方案中,哮喘是骨膜素高哮喘(例如具有至少约20ng/ml,25ng/ml,或50ng/ml血清任一的骨膜素水平)。在一些实施方案中,哮喘是嗜曙红细胞高哮喘(例如至少约150,200,250,300,350,400个嗜曙红细胞计数/ml血液任一)。在某些实施方案中,哮喘是TH2低哮喘或非TH2驱动的哮喘。在一些实施方案中,个体已经测定为嗜曙红细胞性炎症阴性(EIN)。见WO2015/061441。在一些实施方案中,哮喘是骨膜素低哮喘(例如具有小于约20ng/ml血清的骨膜素水平)。在一些实施方案中,哮喘是嗜曙红细胞低哮喘(例如小于约150个嗜曙红细胞计数/μl血液或小于约100个嗜曙红细胞计数/μl血液)。
例如,在任何前述方法的特定实施方案中,哮喘是中度至重度哮喘。在一些实施方案中,哮喘不受皮质类固醇控制。在一些实施方案中,哮喘是TH2高哮喘或TH2低哮喘。在特定实施方案中,哮喘是TH2高哮喘。
要理解的是,在其中该方法包括将疗法(例如包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,Fc厄普西隆受体(FcεR)拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,蛋白酶活化的受体2(PAR2)拮抗剂,IgE拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法)施用于该患者的实施方案中可以采用本文中,例如上文发明详述II节中描述的任何治疗患者的方法。例如,在一些实施方案中,该方法包括施用包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,Fc厄普西隆受体(FcεR)拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,蛋白酶活化的受体2(PAR2)拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法。在其它实施方案中,该方法包括施用包含IgE拮抗剂的疗法。
IV.核酸多态性的检测
在数个实施方案中,本发明提供的治疗和诊断方法牵涉测定患者在一个或多个多态性处的基因型,例如用于测定患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数。用于评估核酸中多态性(例如SNP(例如TPSAB1处的c733 G>A SNP,CTGCAGGCGGGCGTGGTCAGCTGGG[G/A]CGAGGGCTGTGCCCAGCCCAACCGG(SEQ ID NO:36)(还见rs145402040)或插入(例如TPSB2处的c980_981insC突变,
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(SEQ ID NO:37),以粗体和下划线C核苷酸标示))的存在的检测技术牵涉分子遗传学领域公知的规程。许多但并非所有方法牵涉核酸的扩增。本领域中提供了实施扩增的大量指导。例示性参考包括手册如Erlich,ed.,PCR Technology:Principles andApplications for DNA Amplification,Freeman Press,1992；Innis et al.,eds.,PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press,1990；Ausubel,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,1994-1999,包括补充更新至2004年4月；Sambrook et al.,eds.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2001。用于检测单核苷酸多态性的一般方法披露于Kwok,ed.,Single Nucleotide Polymorphisms:Methodsand Protocols,Humana Press,2003。
尽管所述方法通常采用PCR步骤,但也可以使用其他扩增方案。合适的扩增方法包括连接酶链式反应(参见例如Wu et al.,Genomics 4:560-569,1988)；链置换测定法(参见例如Walker et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:392-396,1992；美国专利No.5,455,166)；和数种基于转录的扩增系统,包括记载于美国专利No.5,437,990；5,409,818；和5,399,491的方法；转录扩增系统(TAS)(Kwoh et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173-1177,1989)；和自身持续(self-sustained)的序列复制(3SR)(Guatelli et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874-1878,1990；WO 1992/08800)。或者,可使用将探针扩增至可检测水平的方法,如Qβ复制酶扩增(Kramer et al.,Nature 339:401-402,1989；Lomeli et al.,Clin.Chem.35:1826-1831,1989)。提供对已知扩增方法的综述,例如Abramson et al.,Curr.Opin.Biotech.4:41-47,1993。
可使用寡核苷酸引物和/或探针来实施对个体基因型,单体型,SNP,微卫星或其他多态性的检测。寡核苷酸可通过任何合适的方法制备,通常是化学合成。寡核苷酸可使用商品化的试剂和仪器合成。或者,可经由商业性来源购买它们。合成寡核苷酸的方法是本领域中公知的(参见例如Narang et al.,Meth.Enzymol.68:90-99,1979；Brown et al.,Meth.Enzymol.68:109-151,1979；Beaucage et al.,Tetra.Lett.22:1859-1862,1981；和美国专利No.4,458,066的固体支持物方法)。另外,可利用对上述合成方法的改良来期望性地影响关于合成的寡核苷酸的酶行为。例如,可利用将经修饰的磷酸二酯连接(例如硫代磷酸,甲基膦酸酯,氨基磷酸酯或硼烷磷酸酯(boranophosphate))或除亚磷酸衍生物以外的连接掺入寡核苷酸中来防止在选定位点处的切割。另外,当与也是用于合成新核酸链的模板的核酸杂交时,2’-氨基经修饰的糖的使用倾向于利于对寡核苷酸消化的置换。
可使用本领域公知的许多检测方法来测定个体(例如具有肥大细胞介导的炎性疾病(例如哮喘)的患者)的基因型。大多数测定法需要数种一般性方案之一:测序,使用等位基因特异性寡核苷酸的杂交,引物延伸,等位基因特异性连接,或电泳分离技术,例如单链构象多态性(SSCP)和异双链体分析。例示性的测定法包括5’-核酸酶测定法,模板指导的染料-终止子掺入,分子信标等位基因特异性寡核苷酸测定,单碱基延伸测定,和通过实时焦磷酸序列的SNP打分。对扩增序列的分析可使用各种技术进行,如微芯片,荧光偏振测定法和MALDI-TOF(基质辅助激光解吸离子化-飞行时间)质谱。还可使用的两种方法是基于使用Flap核酸酶的侵入性切割的测定法和采用挂锁(padlock)探针的方法学。
对特定等位基因的存在或不存在的确定一般通过分析从要分析的个体获得的核酸样品来进行。所述核酸样品经常包含基因组DNA。所述基因组DNA通常从血液样品获得,但也可从其他细胞或组织获得。
还可能对RNA样品分析多态性等位基因的存在。例如,mRNA可用于测定一个或多个多态性位点处个体的基因型。在此情况中,核酸样品从其中表达靶核酸的细胞例如T辅助-2(Th2)细胞和肥大细胞获得。这类分析可通过以下进行:首先逆转录靶RNA(使用例如病毒逆转录酶),然后扩增所得cDNA；或使用组合的高温逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),如记载于美国专利No.5,310,652；5,322,770；5,561,058；5,641,864；和5,693,517的。
样品可以取自怀疑具有或诊断具有肥大细胞介导的炎性疾病(例如哮喘),因此很可能需要治疗的患者或没有怀疑具有任何病症的正常个体。为了测定基因型,可以在本发明的方法中使用患者样品,诸如那些含有细胞的,或由这些细胞生成的核酸。可用作本发明中样品的体液或分泌物包括例如血液,尿液,唾液,粪便,胸水,淋巴液,痰,BAL,粘膜衬里液(MLF)(例如通过鼻吸收或支气管吸收获得的MLF),腹水,前列腺液,脑脊液(CSF),或任何其它身体分泌物或其衍生物。词语“血液”意图包括全血,血浆,血清,或任何血液衍生物。供本文中描述的方法中使用的样品核酸可以自受试者的任何细胞类型或组织获得。例如,可以通过已知技术获得受试者的体液(例如血液)。或者,可以对干样品(例如毛发或皮肤)实施核酸测试。
样品可以是冷冻的,新鲜的,固定的(例如福尔马林固定的),离心的,和/或包埋的(例如石蜡包埋的),等。当然,细胞样品可以在评估样品中基因型之前进行多种公知的收集后准备和保存技术(例如核酸和/或蛋白质提取,固定,保存,冷冻,超滤,浓缩,蒸发,离心,等)。同样,活检物也可进行收集后准备和保存技术,例如固定。
下文简短描述了用于分析核酸样品以检测在本发明中有用的多态性诸如SNP或插入的存在的经常使用的方法学。然而,可在本发明中使用本领域中已知的任何方法来检测单核苷酸取代的存在。
a.DNA测序和单碱基延伸
可以通过直接测序来检测多态性,例如SNP或插入。方法包括例如基于双脱氧测序的方法(例如Sanger测序)和其它方法,诸如Maxam和Gilbert序列(见例如Sambrook和Russell,见上文)。在一些实施方案中,测序办法是Sanger测序。
测序办法可以是大量平行测序办法(例如
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测序)。其它检测方法包括寡核苷酸长度产物的PYRO测序TM。此类方法常常采用扩增技术,诸如PCR。例如,在焦磷酸测序中,测序引物与单链的PCR扩增的DNA模板杂交并与酶DNA聚合酶,ATP硫化酶,萤光素酶,和腺苷三磷酸酶,和底物腺苷5’-磷酸硫酸(APS)和萤光素一起温育。将四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)中的第一种添加至反应。DNA聚合酶催化脱氧核苷酸三磷酸掺入DNA链,如果它与模板链中的碱基互补的话。每个掺入事件伴有与掺入的核苷酸的量等摩尔数量的焦磷酸(PPi)的释放。在APS存在下ATP硫化酶定量地将PPi转变成ATP。此ATP驱动萤光素酶介导的萤光素转变成氧化萤光素,其以与ATP的量成正比的量生成可见光。通过电荷耦合装置(CCD)相机检测萤光素酶催化的反应中生成的光并作为PYROGRAMTM中的峰看见。每个光信号与掺入的核苷酸的数目成正比。核苷酸降解酶腺苷三磷酸酶连续降解未掺入的dNTP和过量的ATP。当降解完全时,添加另一种dNTP。
在一些实施方案中,可以使用RNA测序(RNA-Seq),也称作全转录物组弹枪测序(WTSS)来检测多态性(例如SNP或插入)。见例如Wang et al.,Nature Reviews Genetics10:57-63,2009。
用于表征SNP的另一种类似方法并不要求使用完整PCR,但是典型地仅仅使用引物延伸与要调查的核苷酸互补的单个荧光标记的双脱氧核糖核酸分子(ddNTP)。可以经由检测延伸了一个碱基并荧光标记的引物来鉴定多态性位点处的核苷酸(例如Kobayashi etal,Mol.Cell.Probes,9:175-182,1995)。
b.等位基因特异性杂交
此技术(亦普遍称为等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASO))(例如Stoneking etal.,Am.J.Hum.Genet.48:70-382,1991；Saiki et al.,Nature 324,163-166,1986；EP235,726；和WO 1989/11548)依赖于在仅有一个碱基不同的两种DNA分子之间进行区分,其通过将特异于变体之一的寡核苷酸探针与从扩增核酸样品获得的扩增产物杂交。该方法通常采用短寡核苷酸,例如长度为15-20个碱基。探针设计为对一种变体相对于另一种变体差异性杂交。设计这类探针的原理和指导是本领域中可得的。杂交条件应当足够严格从而在等位基因之间杂交强度有显著差异,并产生基本二元性响应,由此探针仅与等位基因之一杂交。一些探针设计为与靶DNA的区段杂交,从而多态性位点与探针的中心位置(例如在15个碱基的寡核苷酸中在位置7；在16个碱基的寡核苷酸中在位置8或9)联配,但该设计不是必需的。
可以通过测量与样品杂交的等位基因特异性寡核苷酸的量来测定等位基因的量和/或存在。典型地,将寡核苷酸用标记物如荧光标记物标记。例如,将等位基因特异性寡核苷酸应用于固定化的代表SNP序列的寡核苷酸。在严格的杂交和清洗条件后,对每种SNP寡核苷酸测量荧光强度。
在一个实施方案中,鉴定在多态性位点处存在的核苷酸,其通过在序列特异性杂交条件下使用与涵盖多态性位点的区域中的多态性等位基因之一准确互补的寡核苷酸探针或引物的杂交。所述探针或引物杂交序列和序列特异性杂交条件选定为使得多态性位点处的单个错误匹配将杂交双链体充分去稳定从而不能有效形成双链体。如此,在序列特异性杂交条件下,稳定的双链体将仅在探针或引物与准确互补的等位基因序列之间形成。如此,长度为约10至约35个核苷酸(通常长度为约15至约35个核苷酸),与涵盖多态性位点的区域中的等位基因序列准确互补的寡核苷酸在本发明的范围内。
在一个备选的实施方案中,鉴定在多态性位点处存在的核苷酸,其通过在足够严格的杂交条件下使用与涵盖多态性位点的区域中的SNP等位基因之一基本互补且与多态性位点处的等位基因准确互补的寡核苷酸的杂交。由于存在于非多态性位点处的错误匹配是对两种等位基因序列的错误匹配,与靶等位基因序列形成的双链体中和与相应的非靶等位基因序列形成的双链体中错误匹配数的差异与使用对靶等位基因序列准确互补的寡核苷酸时相同。在该实施方案中,杂交条件足够松以允许与靶序列形成稳定的双链体,并维持足够的严格性以排除与非靶序列形成稳定双链体。在这类充分严格的杂交条件下,稳定的双链体将仅在探针或引物与靶等位基因之间形成。如此,长度为约10至约35个核苷酸(长度通常为约15至约35个核苷酸),与涵盖多态性位点的区域中的等位基因序列基本互补且与多态性位点处的等位基因序列准确互补的寡核苷酸在本发明的范围内。
可能期望在其中限制杂交条件优化的测定形式中使用基本而非准确互补的寡核苷酸。例如,在典型的多靶物固定化的寡核苷酸测定形式中,每种靶物的探针或引物固定化于单个固体支持物上。通过使固体支持物与含有靶DNA的溶液接触来同时实施杂交。由于所有杂交均在等同条件下进行,因此杂交条件不能针对每种探针或引物分别优化。当测定形式排除调整杂交条件时,可利用错误匹配到探针或引物中的掺入来调整双链体稳定性。引入的特定错误匹配对双链体稳定性的影响是公知的,且双链体稳定性可常规地估测和经验性测定,如上文描述的。可使用本文中提供和本领域中公知的指导来经验性选择依赖于探针或引物的确切大小和序列的适宜杂交条件。使用寡核苷酸探针或引物来检测序列中的单碱基对差异记载于例如Conner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:278-282,1983以及美国专利No.5,468,613和5,604,099。
完美匹配的和单碱基错配的杂交双链体之间稳定性的成比例变化依赖于杂交的寡核苷酸的长度。与更短的探针序列形成的双链体由错误匹配的存在成比例更多地去稳定。长度为约15至约35个核苷酸之间的寡核苷酸经常用于序列特异性检测。此外,由于杂交的寡核苷酸端经历连续的随机解离和再退火(由于热能量),在任一端的错误匹配比存在于内部的错误匹配使杂交双链体更少地去稳定。为了区分靶序列中的单碱基对变化,选择与靶序列杂交的探针序列从而多态性位点存在于探针的内部区域。
上文用于选择与特定等位基因杂交的探针序列的标准适用于探针杂交区域,即涉及与靶序列杂交的探针部分。探针可结合额外的核酸序列,如用于固定化探针的聚T尾部,而不显著改变探针的杂交特征。本领域技术人员将认可对于在所述方法中的使用,结合额外的核酸序列,与靶序列不互补如此不涉及杂交的探针基本与不结合的探针等同。
用于检测探针和样品中靶核酸序列之间形成的杂合体的合适的测定形式是本领域中已知的且包括固定化的靶物(点印迹)形式和固定化的探针(反向点印迹或线印迹)测定形式。点印迹和反向点印迹测定形式记载于美国专利No.5,310,893；5,451,512；5,468,613；和5,604,099。
在点印迹形式中,扩增的靶DNA固定化于固体支持物如尼龙膜上。将膜-靶物复合物与经标记的探针在适宜的杂交条件下温育,未杂交的探针通过在适宜严格条件下清洗除去,并对膜监测结合的探针的存在。
在反向点印迹(或线印迹)形式中,探针固定化于固体支持物如尼龙膜或微滴定板上。靶DNA是经标记的,通常在扩增期间通过掺入经标记的引物。可标记引物之一或两者。将膜-探针复合物与经标记的扩增后靶DNA在适宜的杂交条件下温育,通过在适宜的严格条件下清洗除去未杂交的靶DNA,并监测膜上结合的靶DNA的存在。反向线印迹检测测定法记载于实施例。
特异于多态性变体之一的等位基因特异性探针经常连同针对其他多态性变体的等位基因特异性探针一起使用。在一些实施方案中,探针固定化于固体支持物上且同时使用两种探针来分析个体中的靶序列。核酸阵列的例子由WO 95/11995描述。同一阵列或不同阵列可用于分析表征的多态性。WO 95/11995还描述了针对预表征的多态性变体形式的检测优化过的子阵列。这类子阵列可用于检测本文中描述的多态性的存在。
c.等位基因特异性引物
多态性诸如SNP或插入还普遍使用等位基因特异性扩增或引物延伸方法检测。这些反应通常牵涉设计为特异性靶向多态性的引物的使用,所述靶向经由引物3’端的错配。错配的存在影响在聚合酶缺少错误校正活性时聚合酶延伸引物的能力。例如,要使用基于等位基因特异性扩增或延伸的方法来检测等位基因序列,与多态性的一种等位基因互补的引物设计为使得3’末端核苷酸在多态性位置处杂交。特定等位基因的存在可由引物启动延伸的能力确定。如果3’末端错误匹配,那么延伸受到阻碍。
在一些实施方案中,在扩增反应中引物连同第二引物一起使用。第二引物在与多态性位置不相关的位点杂交。扩增从两条引物前进产生可检测产物,表示存在特定的等位形式。基于等位基因特异性扩增或延伸的方法记载于例如WO 93/22456和美国专利No.5,137,806；5,595,890；5,639,611；和4,851,331。
使用基于等位基因特异性扩增的基因型分型,对等位基因的鉴定仅需要检测扩增的靶序列的存在或不存在。用于检测扩增后靶序列的方法是本领域中公知的。例如,描述的凝胶电泳和探针杂交测定经常用于检测核酸的存在。
在一个备选的探针较少(probe-less)的方法中,通过监测反应混合物中双链DNA总量的增加来检测扩增的核酸,其记载于例如美国专利No.5,994,056；和欧洲专利公开文本No.487,218和512,334。双链靶DNA的检测依赖于增加的荧光,其由各种结合DNA的染料例如SYBR Green在结合双链DNA时显示。
如本领域技术人员领会的,可在采用多种等位基因特异性引物来靶向特定等位基因的反应中进行等位基因特异性扩增方法。针对这类多重应用的引物一般用可区分的标记物标记或选择为使得从等位基因产生的扩增产物可通过大小区分。如此,例如可使用单一扩增通过对扩增产物的凝胶分析来鉴定单一样品中的两种等位基因。
如在等位基因特异性探针的情况中的,等位基因特异性寡核苷酸引物可与杂交区中的多态性等位基因之一准确互补,或者可在寡核苷酸3’末端以外的位置具有一些错误匹配,该错误匹配存在于两种等位基因序列中的非多态性位点处。
d.可检测探针
i)5’-核酸酶测定探针
基因型分型还可使用
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或“5’-核酸酶测定法”,如记载于美国专利No.5,210,015；5,487,972；和5,804,375；和Holland et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:7276-7280,1988的实施。在
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测定中,在扩增反应期间添加在扩增区内杂交的经标记检测探针。所述探针经修饰以预防探针充当DNA合成的引物。扩增使用具有5’至3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶进行。在扩增的每个合成步骤期间,任何与延伸的引物下游靶核酸杂交的探针均通过DNA聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性降解。如此,新靶物链的合成还导致探针的降解,而降解产物的积累提供对靶序列合成的量度。
杂交探针可以是在SNP等位基因之间进行区分的等位基因特异性探针。或者,所述方法可使用等位基因特异性引物和结合扩增产物的经标记探针进行。
任何适用于检测降解产物的方法可用于5’-核酸酶测定。经常将检测探针用两种荧光染料标记,其中一种能将另一种染料的荧光淬灭。染料附接于探针,通常一种附接于5’末端而另一种附接于内部位点,从而当探针在未杂交状态时发生淬灭且从而通过DNA聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性对探针的切割发生在两种染料之间。扩增导致染料之间探针的切割,其伴随有淬灭消除以及可从初始淬灭的染料观察到的荧光中的增加。降解产物的积累通过测量反应荧光中的增加来监测。美国专利No.5,491,063和5,571,673描述了用于检测伴随扩增发生的探针降解的备选方法。
ii)二级结构探针
在二级结构变化时可检测的探针也适用于检测多态性,包括SNP。例示性的二级结构或茎环结构探针包括分子信标或
Figure BDA0002598124610000783
引物/探针。分子信标探针是单链寡核酸探针,其可形成发夹结构,其中荧光团和淬灭剂通常位于寡核苷酸的相反端。在探针的任一端,短互补序列允许形成分子内的茎,其使得荧光团和淬灭剂进入紧密临近。分子信标的环部分与感兴趣的靶核酸互补。该探针对感兴趣的其靶核酸的结合形成迫使茎分开的杂合体。这导致将荧光团和淬灭剂彼此移开的构象变化且导致更强烈的荧光信号。然而,分子信标探针对探针靶物中的小序列变化高度敏感(见例如Tyagi et al.,Nature Biotech.14:303-308,1996；Tyagi et al.,Nature Biotech.16:49-53,1998；Piatek et al.,NatureBiotech.16:359-363,1998；Marras et al.,Genetic Analysis:BiomolecularEngineering 14:151-156,1999；Tapp et al,BioTechniques 28:732-738,2000)。
Figure BDA0002598124610000791
引物/探针包含共价连接于引物的茎环结构探针。
e.电泳
可通过使用变性梯度凝胶电泳分析使用聚合酶链式反应生成的扩增产物。不同的等位基因可基于不同序列依赖性解链特性和DNA在溶液中的电泳迁移来鉴定(参见例如Erlich,ed.,PCR Technology,Principles and Applications for DNA Amplification,W.H.Freeman and Co.,1992)。
对微卫星多态性的区分可使用毛细管电泳完成。毛细管电泳便利地允许鉴定出特定微卫星等位基因中的重复数。对DNA多态性分析应用毛细管电泳是本领域中技术人员公知的(参见例如Szantai et al.,J Chromatogr A.1079(1-2):41-9,2005；Bjorheim etal.,Electrophoresis 26(13):2520-30,2005和Mitchelson,Mol.Biotechnol.24(1):41-68,2003)。
等位基因变体的身份还可以通过分析包含多态性区域的核酸在含有变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中的移动来获得,其是使用变性梯度凝胶电泳(DGGE)测定的(见例如Myers et al.,Nature 313:495-498,1985)。当使用DGGE作为分析方法时,会修饰DNA以确保其并不完全变性,例如通过以PCR添加高熔点的富含GC的DNA的大约40bp的GC钳子。在又一个实施方案中,使用温度梯度代替变性剂梯度来鉴定对照和样品DNA的迁移率的差异(见例如Rosenbaum et al.,Biophys.Chem.265:1275,1987)。
f.单链确认多态性分析
可使用单链确认多态性分析来区分靶序列的等位基因,该分析通过单链PCR产物的电泳迁移变化来识别碱基差异,如记载于例如Orita et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.86,2766-2770,1989；Cotton Mutat.Res.285:125-144,1993；和HayashiGenet.Anal.Tech.Appl.9:73-79,1992的。扩增的PCR产物可如上文所述的生成,并加热或变性以形成单链扩增产物。单链核酸可重折叠或形成二级结构,其部分取决于碱基序列。单链扩增产物的不同电泳迁移率可与靶物等位基因之间的碱基序列差异相关,而且所得电泳迁移率改变能够检测甚至单碱基变化。可以用标记的探针标记或检测DNA片段。可通过使用其中二级结构对序列变化更加敏感的RNA(而非DNA)来增强该测定法的灵敏度。在另一个优选实施方案中,主题方法利用异源双链体分析基于电泳迁移率变化分开双链异源双链体分子(见例如Keen et al.,Trends Genet.7:5-10,1991)。
SNP检测方法经常采用经标记的寡核苷酸。可通过掺入标记物来标记寡核苷酸,所述标记物可通过光谱,光化学,生化,免疫化学或化学手段检出。可用的标记物包括荧光染料,放射性标记物例如32P,电子致密性试剂,酶如过氧化物酶或碱性磷酸酶,生物素,或对其可获得抗血清或单克隆抗体的半抗原和蛋白质。标记技术是本领域中公知的(参见例如Current Protocols in Molecular Biology,见上文；Sambrook等人,见上文)。
g.测定多态性处个体的基因型的另外的方法
可以使用DNA微阵列技术,例如DNA芯片装置,用于高通量筛选应用的高密度微阵列,和较低密度微阵列。用于微阵列制作的方法是本领域中已知的,而且包括各种喷墨(inkjet)和微喷(microjet)沉积或点样(spotting)技术和工艺,原位或芯片上(on-chip)光刻寡核苷酸合成工艺,和电子DNA探针寻址工艺。已经在基因表达分析和点突变的基因型分型,单核苷酸多态性(SNP),和短串联重复(STR)领域中成功应用DNA微阵列杂交应用。另外的方法包括干扰RNA微阵列和微阵列与其它方法,诸如激光捕获显微解剖(LCM),比较基因组杂交(CGH),阵列CGH,和染色质免疫沉淀(ChiP)的组合。见例如He et al.,Adv.Exp.Med.Biol.593:117-133,2007和Heller Annu.Rev.Biomed.Eng.4:129-153,2002。
在一些实施方案中,可以使用免于切割剂(诸如核酸酶,羟胺或四氧化锇及用哌啶)的保护来检测RNA/RNA,DNA/DNA,或RNA/DNA异双链体中的错配碱基(见例如Myers etal.,Science 230:1242,1985)。一般地,通过提供异双链体开始“错配切割”技术,所述异双链体通过杂交任选地标记的包含基因等位变体的核苷酸序列的对照核酸(例如RNA或DNA)与自组织样品获得的样品核酸(例如RNA或DNA)形成。用切割双链体诸如基于对照与样品链间的碱基对错配形成的双链体的单链区的试剂处理双链双链体。例如,可以用RNA酶处理RNA/DNA双链体,及用S1核酸酶处理DNA/DNA杂合物以酶促消化错配区。或者,可以用羟胺或四氧化锇及用哌啶处理DNA/DNA或RNA/DNA双链体以消化错配区。在消化错配区后,然后将所得的材料在变性聚丙烯酰胺凝胶上根据大小分开以测定对照和样品核酸是否具有相同的核苷酸序列或者它们在哪些核苷酸中不同。见例如美国专利No.6,455,249；Cotton etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:4397-4401,1988；Saleeba et al.,Meth.Enzymol.217:286-295,1992。
在一些情况中,可以通过限制酶分析来显示来自受试者的DNA中特定等位基因的存在。例如,特定的核苷酸多态性可以导致包含基因的另一等位变体的核苷酸序列缺乏的限制性位点的核苷酸序列。
在另一个实施方案中,使用寡核苷酸连接测定法(OLA)来实施等位变体的鉴定,如记载于例如美国专利No.4,998,617和Laridegren et al.,Science 241:1077-1080,1988的。OLA方案使用两种寡核苷酸,其设计为能够与靶物的单一链的邻接序列杂交。一种寡核苷酸与分离标志物连接,例如通过生物素化,而另一种是可检测标记的。若在靶分子中找到精确的互补序列,则寡核苷酸会杂交,从而其末端邻接,并创建连接底物。然后,连接容许使用亲合素或另一种生物素配体来回收经标记的寡核苷酸。本领域还知道的是一种组合PCR和OLA属性的核酸检测测定法(见例如Nickerson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:8923-8927,1990)。在此方法中,使用PCR来实现靶DNA的指数式扩增,然后使用OLA来检测。
可以通过使用专门化的外切核酸酶抗性核苷酸来检测单碱基多态性,如披露于例如美国专利No.4,656,127的。依照该方法,容许与刚刚在多态性位点3’的等位序列互补的引物与自特定动物或人获得的靶分子杂交。若靶分子上的多态性位点含有与存在的特定外切核酸酶抗性核苷酸衍生物互补的核苷酸,则所述衍生物会被掺入杂交引物末端上。此类掺入使引物对外切核酸酶有抗性,并且由此容许其检出。因为样品的外切核酸酶抗性衍生物的身份是已知的,所以引物已经变为对外切核酸酶有抗性的发现揭示了存在于靶分子的多态性位点中的核苷酸与反应中使用的核苷酸衍生物的核苷酸互补。此方法具有如下的优点,即它不需要测定大量的外来序列数据。
也可以使用基于溶液的方法来测定多态性位点的核苷酸的身份(见例如WO 1991/02087)。如上述的,采用与刚刚在多态性位点3’的等位序列互补的引物。该方法使用经标记的双脱氧核苷酸衍生物来测定该位点的核苷酸的身份,若与多态性位点的核苷酸互补,则所述经标记的双脱氧核苷酸衍生物会被掺入引物的末端上。
可以使用的一种备选方法记载于WO 92/15712。此方法使用经标记的终止物与引物的混合物,所述引物与多态性位点3’的序列互补。如此,掺入的经标记的终止物通过所评估的靶分子的多态性位点中存在的核苷酸确定,并且与所述核苷酸互补。该方法通常是一种异质相测定法,其中将引物或靶分子固定化于固相。
已经描述了用于测定DNA中的多态性位点的多种其它引物引导的核苷酸掺入规程(Komher et al.,Nucl.Acids.Res.17:7779-7784,1989；Sokolov Nucl.Acids Res.18:3671,1990；Syvanen et al.,Genomics 8:684-692,1990；Kuppuswamy et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1143-1147,1991；Prezant et al.,Hum.Mutat.1:159-164,1992；Ugozzoli et al.,GATA 9:107-112,1992；Nyren et al.,Anal.Biochem.208:171-175,1993)。这些方法均依赖于经标记的脱氧核苷酸的掺入以区别多态性位点处的碱基。
V.生物标志物的表达水平的测定
本发明的治疗和诊断方法可牵涉测定一种或多种生物标志物(例如类胰蛋白酶)的表达水平。可以通过本领域已知的或下文描述的任何方法实施生物标志物的水平的测定。
本文中描述的生物标志物(例如类胰蛋白酶)的表达可以使用本领域已知的任何方法来检测。例如,可以使用Northern,点印迹,或PCR分析,阵列杂交,RNA酶保护测定法,或使用商品化的DNA SNP芯片微阵列(包括DNA微阵列急射(snapshot))方便地对来自哺乳动物的组织或细胞样品测定例如感兴趣生物标志物的mRNA或DNA。例如,实时PCR(RT-PCR)测定法(诸如定量PCR测定法)是本领域公知的。在本发明的一个例示性实施方案中,用于检测生物学样品中感兴趣生物标志物(例如类胰蛋白酶)的mRNA的方法包括使用至少一种引物通过逆转录自样品生成cDNA；扩增如此生成的cDNA；并检测扩增cDNA的存在。另外,此类方法可以包括一个或多个如下步骤,其容许测定生物学样品中mRNA的水平(例如通过同时检查“持家”基因(诸如肌动蛋白家族成员)的比较性对照mRNA序列的水平)。任选的是,可以测定扩增cDNA的序列。
供本发明中使用的可用于检测核酸的其它方法牵涉高通量RNA序列表达分析,包括基于RNA的基因组分析,诸如例如RNASeq。
在一个具体的实施方案中,生物标志物(例如类胰蛋白酶)的表达可通过RT-PCR技术来实施。用于PCR的探针可以用可检测标记物标记,诸如例如放射性同位素,发荧光化合物,生物发光化合物,化学发光化合物,金属螯合物,或酶。此类探针和引物可用于检测样品中表达的生物标志物的存在。正如熟练技术人员会理解的,可基于本文中提供的序列制备极其多种不同引物和探针,并有效用于扩增,克隆,和/或测定生物标志物的存在和/或水平。
其它方法包括通过微阵列技术检验或检测组织或细胞样品中生物标志物(例如类胰蛋白酶)的mRNA的方案。使用核酸微阵列,逆转录并标记来自测试和对照组织样品的测试和对照mRNA样品以生成cDNA探针。然后使探针杂交至在固体支持物上固定化的核酸阵列。该阵列配置成该阵列的每个成员的序列和位置是已知的。例如,可以将在某些疾病状态中潜在表达的基因选集在固体支持物上排列成阵列。经过标记的探针与特定阵列成员的杂交指示衍生该探针的样品表达该基因。疾病组织的差异基因表达分析能提供有价值的信息。微阵列技术利用核酸杂交技术和计算技术在一个实验内评估数以千计的基因的mRNA表达概况(参见例如WO 2001/75166)。关于阵列制作的讨论,参见例如美国专利No.5,700,637；5,445,934；和5,807,522；Lockart,Nat.Biotech.14:1675-1680,1996；和Cheung et al.,Nat.Genet.21(Suppl):15-19,1999。
另外,可采用利用欧洲专利EP 1753878中记载的微阵列进行的DNA概况分析和检测方法。此方法利用短串联重复(STR)分析和DNA微阵列快速鉴定和区分不同DNA序列。在一个实施方案中,使经过标记的STR靶序列杂交至携带互补探针的DNA微阵列。这些探针长度不同以覆盖可能STR的范围。利用杂交后酶促消化自微阵列表面选择性去除DNA杂合物的经标记的单链区。根据仍然杂交至微阵列的靶DNA的样式来推导未知靶物中重复的数目。
微阵列处理器的一个例子是Affymetrix
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系统,它是商品化的且包含通过在玻璃表面上直接合成寡核苷酸而制作的阵列。可使用本领域技术人员知道的其它系统。
许多参考文献是可获得的,它们提供了应用上述技术的指导(Kohler et al.,Hybridoma Techniques,Cold Spring Harbor Laboratory,1980；Tijssen,Practice andTheory of Enzyme Immunoassays,Elsevier,1985；Campbell,Monoclonal AntibodyTechnology,Elsevier,1984；Hurrell,Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniquesand Applications,CRC Press,1982；和Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual ofTechniques,pp.147-158,CRC Press,Inc.,1987)。Northern印迹分析是本领域公知的一种便利的技术,记载于例如Sambrook et al,见上文。用于评估基因和基因产物的状态的典型方案可见于例如Ausubel等人,见上文。
关于检测蛋白质生物标志物,多种蛋白质测定法是可获得的,包括例如基于抗体的方法以及质谱术和本领域已知的其它类似手段。在基于抗体的方法的情况中,例如,可以在足以形成抗体-生物标志物复合物的条件下使样品接触对生物标志物(例如类胰蛋白酶)特异性的抗体,然后检测复合物。蛋白质生物标志物的存在的检测可以以许多方式来实现,诸如通过用于测定多种组织和样品(包括血浆或血清)的Western印迹(含或不含免疫沉淀),2维十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),免疫沉淀,荧光激活细胞分选(FACSTM),流式细胞术,和酶联免疫吸附测定法(ELISA)规程。使用此类测定法形式的一系列免疫测定技术是可获得的,参见例如美国专利No.4,016,043,4,424,279和4,018,653。这些包括非竞争类型的单个位点和两个位点或“三明治式”测定法,以及传统的竞争性结合测定法二者。这些测定法也包括经标记抗体对靶生物标志物的直接结合。
三明治式测定法是最有用且最常用的测定法之一。三明治式测定技术存在许多变化形式,本发明意图涵盖所有的变化形式。简言之,在一种典型的正向测定法(forwardassay)中,将未标记的抗体固定化于固体基片上,并使待测试的样品与结合的分子接触。温育合适的一段时间后,即足以容许抗体-抗原复合体形成的一段时间,然后添加经能够产生可检测信号的报道分子标记的,对所述抗原特异性的第二抗体,并温育,容许足以形成抗体-抗原-经标记抗体的另一种复合体的时间。洗掉任何未反应的物质,并通过观察由所述报道分子产生的信号来测定所述抗原的存在。结果可以是定性的(通过对可视信号的简单观察来进行),或者可以是定量的(通过与含有已知量的生物标志物的对照样品比较来进行)。
正向测定法上的变化包括同时测定法(simultaneous assay),其中同时将样品和经标记的抗体两者添加至结合的抗体。这些技术对本领域技术人员是公知的,包括会容易明白的任何微小变化。在一种典型的正向三明治式测定法中,将具有对所述生物标志物特异性的第一抗体或是共价地或是被动地结合至固体表面。典型地,所述固体表面是玻璃或聚合物,最常用的聚合物是纤维素,聚丙烯酰胺,尼龙,聚苯乙烯,聚氯乙烯或聚丙烯。固体支持物可以采用试管,珠,微量板盘的形式,或者适于进行免疫测定法的任何其它表面。结合过程是本领域公知的,并且一般包括交联,共价结合,或物理吸附,清洗聚合物-抗体复合体,为测试样品做好准备。然后将测试样品的等分试样添加至固相复合体,并在合适的条件(例如从室温至40℃,诸如25℃和32℃之间,包括端点在内)下温育足够的一段时间(例如2-40分钟或者过夜,如果更方便的话),容许抗体中存在的任何亚基结合。温育期后,清洗抗体亚基固相,干燥,并与对生物标志物一部分特异性的第二抗体一起温育。所述第二抗体连接有用于指示第二抗体对分子标志物结合的报道分子。
一种备选的方法包括将样品中的靶生物标志物固定化,然后使固定化的靶物暴露于特异性抗体,该特异性抗体可以是或不是经报道分子标记的。根据靶物的量和报道分子信号的强度,可以通过用所述抗体直接标记,使结合的靶物变成可检测的。或者,使对第一抗体特异性的经标记第二抗体暴露于靶物-第一抗体复合体以形成靶物-第一抗体-第二抗体三元复合体。通过报道分子所发出的信号检测所述复合体。如本说明书中使用的,“报道分子”指通过其化学性质提供分析上可鉴定的信号的分子,所述信号容许结合至抗原的抗体的检测。这种类型的测定法中最常用的报道分子是酶,荧光团,或含放射性核素的分子(即放射性同位素)和化学发光分子。
在酶免疫测定法(EIA)的情况中,酶是缀合至第二抗体的,一般藉由戊二醛或高碘酸盐进行。然而,会容易认可的是,存在极其多种不同的缀合技术,它们对技术人员是轻易可获得的。适合于本发明的方法的常用的酶的例子包括辣根过氧化物酶,葡萄糖氧化酶,β-半乳糖苷酶,和碱性磷酸酶。一般选择与特定酶一起使用的底物以在相应酶的水解作用后产生可检测的颜色变化。还可能采用产生发荧光产物的荧光底物而不是上文所记录的显色底物。在所有情况中,将酶标记的抗体添加至第一抗体-分子标志物复合体,容许结合,然后洗掉过量的试剂。然后将含有合适底物的溶液添加至抗体-抗原-抗体复合体。底物会与连接至第二抗体的酶起反应,给出定性的视觉信号,其可以被进一步地定量(通常通过分光光度法)以给出存在于样品中的生物标志物(例如类胰蛋白酶)的量的指标。或者,发荧光化合物(诸如荧光素和罗丹明)可以以化学方法偶联至抗体,而不改变所述抗体的结合能力。通过使用特定波长的光线照射来激发时,荧光染料标记的抗体吸收光能,在分子中诱导激发态,接着发出光线,其特征性颜色是用光学显微镜在视觉上可检测的。如在EIA中那样,容许荧光标记的抗体结合至第一抗体-分子标志物复合体。洗掉未结合的试剂后,然后使剩余的三元复合体暴露于适当波长的光线,观察到的荧光表明感兴趣的分子标志物的存在。免疫荧光和EIA技术在本领域中都是非常完善建立的。然而,还可以采用其它报道分子,诸如放射性同位素,化学发光或生物发光分子。
在一些实施方案中,可以使用活性类胰蛋白酶ELISA测定法测定样品(例如血液(例如血清或血浆),BAL,或MLF)中活性类胰蛋白酶的水平,例如如美国临时专利申请No.62/457,722的实施例6中描述的。可以通过ELISA测定法测定人活性类胰蛋白酶(四聚体)的浓度。简言之,利用识别人类胰蛋白酶的单克隆抗体克隆作为捕捉抗体(例如Fukuoka等人,见上文中描述的单克隆抗体B12,或E88AS抗体克隆)。可以使用任何合适的结合人类胰蛋白酶的抗体。纯化重组人活性类胰蛋白酶β1并用作用于制备测定法标准品的原材料。将测定法标准品,对照,和稀释样品与500μg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI；Sigma目录号10109886001)一起温育10分钟,然后用基于活性的探针(ABP)(G0353816)标记1小时。添加小分子类胰蛋白酶抑制剂(G02849855)达20分钟以停止ABP标记。根据测定法中使用的捕捉抗体,可以将此混合物与能够解离类胰蛋白酶四聚体的抗人类胰蛋白酶抗体(例如hu31A.v11或B12)一起温育,之后添加至带有捕捉抗体的ELISA板达1小时,用1x磷酸缓冲盐水-
Figure BDA0002598124610000861
(PBST)清洗,并与SA-HRP试剂(链霉亲合素缀合的辣根过氧化物酶,GeneralElectric(GE)目录号RPN4401V)一起温育2小时。通过应用HRP底物四甲基联苯胺(TMB)来生成比色信号,并通过添加磷酸来停止反应。在读板仪(例如
Figure BDA0002598124610000862
M5读板仪)上读板,为检测吸光度使用450nm并为参照吸光度使用650nm。可以进行类似的测定法来测定样品(例如血液(例如血清或血浆),BAL,或MLF)中活性食蟹猴(cyno)类胰蛋白酶的水平,例如使用抗体克隆13G6作为捕捉抗体。
在一些实施方案中,可以使用总类胰蛋白酶ELISA测定法测定样品(例如血液(例如血清或血浆),BAL,或MLF)中总类胰蛋白酶的水平,例如如美国临时专利申请No.62/457,722的实施例6中描述的。简言之,可以通过ELISA测定法测定人总类胰蛋白酶的浓度。利用识别人类胰蛋白酶的抗体作为捕捉抗体(例如抗体克隆B12)。利用识别人类胰蛋白酶的单克隆抗体作为检测抗体(例如抗体克隆E82AS)。纯化重组人活性类胰蛋白酶β1并用作用于制备测定法标准品的原材料。根据测定法中使用的捕捉抗体,可以将此混合物与能够解离类胰蛋白酶四聚体的抗人类胰蛋白酶抗体(例如hu31A.v11或B12)一起温育,之后添加至带有捕捉抗体的ELISA板达2小时,然后用1x PBST清洗。添加生物素化检测抗体达1小时。接着,添加SA-HRP试剂达1小时。通过应用TMB来生成比色信号,并通过添加磷酸来停止反应。在读板仪(例如
Figure BDA0002598124610000871
M5读板仪)上读板,为检测吸光度使用450nm并为参照吸光度使用650nm。可以进行类似的测定法来测定样品(例如血液(例如血清或血浆),BAL,或MLF)中总食蟹猴(cyno)类胰蛋白酶的水平,例如使用抗体克隆13G6作为捕捉抗体和抗体克隆E88AS作为检测抗体。
在一些实施方案中,血液(例如血清或血浆)中总类胰蛋白酶的例示性参照水平可以是约1ng/ml,约2ng/ml,约3ng/ml,约4ng/ml,约5ng/ml,约6ng/ml,约7ng/ml,约8ng/ml,约9ng/ml,或约10ng/ml。例如,在一些实施方案中,血浆中总类胰蛋白酶的例示性参照水平是约3ng/ml。在另一个例子中,在一些实施方案中,血清中总类胰蛋白酶的例示性参照水平是约4ng/ml。例如,在一些实施方案中,受试者可具有处于或高于参照水平的总类胰蛋白酶水平,如果受试者的总类胰蛋白酶水平(例如血液(例如血清或血浆)中的)是约1ng/ml或更高,约2ng/ml或更高,约3ng/ml或更高,约4ng/ml或更高,约5ng/ml或更高,约6ng/ml或更高,约7ng/ml或更高,约8ng/ml或更高,约9ng/ml或更高,或约10ng/ml或更高的话。例如,在一些实施方案中,受试者可具有处于或高于参照水平的总类胰蛋白酶水平,如果受试者的总血浆类胰蛋白酶水平是3ng/ml或更高的话。在另一个例子中,在一些实施方案中,受试者可具有处于或高于参照水平的总类胰蛋白酶水平,如果受试者的总血清类胰蛋白酶水平是4ng/ml或更高的话。
在本发明的一些实施方案中,使用总骨膜素测定法测定自患者衍生的样品中骨膜素的水平,如国际专利申请公开号WO 2012/083132中描述的,通过援引将其完整收入本文。例如,可以使用在WO 2012/083132中称作E4测定法的非常灵敏(大约1.88ng/ml的灵敏度)的骨膜素捕捉ELISA测定法。抗体以纳摩尔亲和力识别骨膜素同等型1-4(WO 2012/083132的SEQ ID NO:5-8)。在其它实施方案中,可以使用WO 2012/083132中描述的
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骨膜素测定法来测定自患者衍生的样品中骨膜素的水平。
在一些实施方案中,骨膜素水平的例示性参照水平是20ng/ml,例如当使用上文描述的E4测定法时。例如,当使用E4测定法时,患者可具有处于或大于参照水平的骨膜素水平,如果患者的骨膜素水平(例如血清或血浆中的)是20ng/ml或更高,21ng/ml或更高,22ng/ml或更高,23ng/ml或更高,24ng/ml或更高,25ng/ml或更高,26ng/ml或更高,27ng/ml或更高,28ng/ml或更高,29ng/ml或更高,30ng/ml或更高,31ng/ml或更高,32ng/ml或更高,33ng/ml或更高,34ng/ml或更高,35ng/ml或更高,36ng/ml或更高,37ng/ml或更高,38ng/ml或更高,39ng/ml或更高,40ng/ml或更高,41ng/ml或更高,42ng/ml或更高,43ng/ml或更高,44ng/ml或更高,45ng/ml或更高,46ng/ml或更高,47ng/ml或更高,48ng/ml或更高,49ng/ml或更高,50ng/ml或更高,51ng/ml或更高,52ng/ml或更高,53ng/ml或更高,54ng/ml或更高,55ng/ml或更高,56ng/ml或更高,57ng/ml或更高,58ng/ml或更高,59ng/ml或更高,60ng/ml或更高,61ng/ml或更高,62ng/ml或更高,63ng/ml或更高,64ng/ml或更高,65ng/ml或更高,66ng/ml或更高,67ng/ml或更高,68ng/ml或更高,69ng/ml或更高或70ng/ml或更高的话。
当使用E4测定法时,患者可具有处于或低于参照水平的骨膜素水平,如果患者的骨膜素水平(例如血清或血浆中的)是20ng/ml或更低,19ng/ml或更低,18ng/ml或更低,17ng/ml或更低,16ng/ml或更低,15ng/ml或更低,14ng/ml或更低,13ng/ml或更低,12ng/ml或更低,11ng/ml或更低,10ng/ml或更低,9ng/ml或更低,8ng/ml或更低,7ng/ml或更低,6ng/ml或更低,5ng/ml或更低,4ng/ml或更低,3ng/ml或更低,2ng/ml或更低,或1ng/ml或更低的话。
在其它实施方案中,骨膜素水平(例如血清或血浆中的)的例示性参照水平是50ng/ml,例如当使用上文描述的
Figure BDA0002598124610000881
骨膜素测定法时。例如,当使用
Figure BDA0002598124610000882
骨膜素测定法时,患者可具有处于或大于参照水平的骨膜素水平,如果患者的骨膜素水平是50ng/ml或更高,51ng/ml或更高,52ng/ml或更高,53ng/ml或更高,54ng/ml或更高,55ng/ml或更高,56ng/ml或更高,57ng/ml或更高,58ng/ml或更高,59ng/ml或更高,60ng/ml或更高,61ng/ml或更高,62ng/ml或更高,63ng/ml或更高,64ng/ml或更高,65ng/ml或更高,66ng/ml或更高,67ng/ml或更高,68ng/ml或更高,69ng/ml或更高,70ng/ml或更高,71ng/ml或更高,72ng/ml或更高,73ng/ml或更高,74ng/ml或更高,75ng/ml或更高,76ng/ml或更高,77ng/ml或更高,78ng/ml或更高,79ng/ml或更高,80ng/ml或更高,81ng/ml或更高,82ng/ml或更高,83ng/ml或更高,84ng/ml或更高,85ng/ml或更高,86ng/ml或更高,87ng/ml或更高,88ng/ml或更高,89ng/ml或更高,90ng/ml或更高,91ng/ml或更高,92ng/ml或更高,93ng/ml或更高,94ng/ml或更高,95ng/ml或更高,96ng/ml或更高,97ng/ml或更高,98ng/ml或更高,或99ng/ml或更高的话。
当使用
Figure BDA0002598124610000891
骨膜素测定法时,患者可具有处于或低于参照水平的骨膜素水平,如果患者的骨膜素水平(例如血清或血浆中的)是50ng/ml或更低,49ng/ml或更低,48ng/ml或更低,47ng/ml或更低,46ng/ml或更低,45ng/ml或更低,44ng/ml或更低,43ng/ml或更低,42ng/ml或更低,41ng/ml或更低,40ng/ml或更低,39ng/ml或更低,38ng/ml或更低,37ng/ml或更低,36ng/ml或更低,35ng/ml或更低,34ng/ml或更低,33ng/ml或更低,32ng/ml或更低,31ng/ml或更低,30ng/ml或更低,29ng/ml或更低,28ng/ml或更低,27ng/ml或更低,26ng/ml或更低,25ng/ml或更低,24ng/ml或更低,23ng/ml或更低,22ng/ml或更低,21ng/ml或更低,20ng/ml或更低,19ng/ml或更低,18ng/ml或更低,17ng/ml或更低,16ng/ml或更低,15ng/ml或更低,14ng/ml或更低,13ng/ml或更低,12ng/ml或更低,11ng/ml或更低,10ng/ml或更低,9ng/ml或更低,8ng/ml或更低,7ng/ml或更低,6ng/ml或更低,5ng/ml或更低,4ng/ml或更低,3ng/ml或更低,2ng/ml或更低,或1ng/ml或更低的话。
VI.试剂盒
为了在检测生物标志物(例如类胰蛋白酶)的存在和/或表达水平中使用,本发明还提供了试剂盒或制品。此类试剂盒可用于确定具有肥大细胞介导的炎性病症(例如哮喘)的患者是否很可能响应疗法,例如包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,FcεR拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂)组成的组的药剂的疗法,或包含IgE拮抗剂或Fc厄普西隆受体(FcεR)拮抗剂的疗法,和/或评估或监测具有哮喘的患者对用疗法的治疗的响应。在一些实施方案中,试剂盒可用于测定患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数。在其它实施方案中,试剂盒可用于测定来自患者的样品中类胰蛋白酶(例如活性或总类胰蛋白酶)的表达水平。此类试剂盒可用于进行本发明的任何方法。
例如,本发明特征在于一种用于鉴定很可能响应肥大细胞定向疗法(例如包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,FcεR拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂)组成的组的药剂的疗法)的具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的试剂盒,该试剂盒包括:(a)用于测定患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数或测定来自患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平的试剂；和,任选地,(b)关于使用该试剂来鉴定很可能响应肥大细胞定向疗法(例如包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE拮抗剂,FcεR拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂)组成的组的药剂的疗法)的具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的说明书。在一些实施方案中,试剂盒包括用于测定患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数的试剂。在其它实施方案中,试剂盒包括用于测定来自患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平的试剂。
在另一个例子中,本发明特征在于一种用于鉴定很可能响应包含IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的疗法的具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的试剂盒,其包括(a)用于测定患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数或测定来自患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平的试剂；和,任选地,(b)关于使用该试剂来鉴定很可能响应包含IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的疗法的具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的说明书。
可以在任何前述试剂盒中使用用于测定患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数或测定类胰蛋白酶的表达水平的任何合适试剂,包括例如寡核苷酸,多肽(例如抗体),等等。
在一些实施方案中,试剂盒进一步包含用于测定来自患者的样品中2型生物标志物的水平的试剂。
例如,在一些实施方案中,试剂包含寡核苷酸。对遗传基因座“特异性”的寡核苷酸或是结合基因座的多态性区域或是结合毗邻基因座的多态性区域。对于要作为引物用于扩增的寡核苷酸,引物是毗邻的,如果它们足够接近以用于生成包含多态性区域的多核苷酸的话。在一个实施方案中,寡核苷酸是毗邻的,如果它们在离多态性约1-2kb,例如小于1kb内结合的话。特异性寡核苷酸能够与序列杂交,而且在合适条件下会不结合相差一个核苷酸的序列。
无论是否用作探针或引物,试剂盒中含有的寡核苷酸可以是可检测标记的。可以直接(例如对荧光标记物)或间接检测标记物。间接检测可包括本领域技术人员知道的任何检测方法,包括生物素-亲合素相互作用,抗体结合等等。荧光标记的寡核苷酸还可含有淬灭分子。寡核苷酸可以结合至表面。在一些实施方案中,表面是二氧化硅或玻璃。在一些实施方案中,表面是金属电极。
在其它实施方案中,用于测定类胰蛋白酶的表达水平的试剂可以是多肽,例如抗体。在一些实施方案中,抗体可以是可检测标记的。
本发明的还有其它试剂盒包含至少一种实施测定法所必需的试剂。例如,试剂盒可包含酶。或者,试剂盒可包含缓冲剂或任何其它必需试剂。试剂盒可包括本文中描述的用于测定患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数或测定来自患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平的阳性对照,阴性对照,试剂,引物,测序标志物,探针,和抗体中的全部或一些。
任何前述试剂盒可包括载具,载具被分成小格以接纳紧密排列的一个或多个容器,诸如管形瓶,管,等,每个容器装有所述方法中要使用的不同成分之一。例如,所述容器之一可以装有可检测标记的或可以可检测标记的探针。此类探针可以是分别对蛋白质或信使(message)特异性的抗体或寡核苷酸。若试剂盒利用核酸杂交来检测靶核酸,则试剂盒还可具有装有用于扩增靶核酸序列的核苷酸的容器和/或装有报告物(诸如结合至报告物分子(诸如酶,荧光,或放射性同位素标记物)的生物素结合蛋白,例如亲合素或链霉亲合素)的容器。
此类试剂盒通常会包括上文所述容器和一个或多个其它容器,其中装有从商业和使用者立场看想要的材料,包括缓冲剂,稀释剂,滤器,针头,注射器,和印有使用说明的包装插页。容器上可存在标签,指示该组合物用于具体的应用,而且还可指示体内或体外使用的说明,诸如上文所描述的那些。
本发明的试剂盒有许多实施方案。一个典型的实施方案是一种试剂盒,包括容器,所述容器上的标签,和装在所述容器内的组合物,其中所述组合物包括结合蛋白质生物标志物(例如类胰蛋白酶)的一抗,而且所述容器上的标签指示该组合物可用于评估样品中此类蛋白质的存在情况,且其中所述试剂盒包括说明书,其关于使用该抗体来评估特定样品类型中生物标志物蛋白质的存在情况。所述试剂盒可进一步包括一套用于制备样品并将抗体应用于样品的说明书和材料。所述试剂盒可以包括一抗和二抗二者,其中所述二抗缀合有标记物,例如酶标记物。
另一个实施方案是一种试剂盒,包括容器,所述容器上的标签,和装在所述容器内的组合物,其中所述组合物包括一种或多种在严格条件下与生物标志物(例如类胰蛋白酶)的互补物发生杂交的多核苷酸,而所述容器上的标签指示该组合物可用于评估样品中生物标志物(例如类胰蛋白酶)的存在情况,且其中所述试剂盒包括说明书,其关于使用该多核苷酸来评估特定样品类型中生物标志物RNA或DNA的存在情况。
试剂盒中的其它任选成分包括一种或多种缓冲液(例如封闭缓冲液,清洗缓冲液,底物缓冲液等),其它试剂(诸如可以被酶标记物化学改变的底物,例如色原),表位修复液,对照样品(阳性和/或阴性对照),对照载玻片等。试剂盒还可包括用于解读使用该试剂盒获得的结果的说明书。
在又一些具体实施方案中,对于基于抗体的试剂盒,试剂盒可包含例如:(1)结合生物标志物蛋白质(例如类胰蛋白酶)的第一抗体(例如附着至固体支持物的)；和,任选地,(2)结合该蛋白质或该第一抗体且缀合至可检测标记物的不同的第二抗体。
对于基于寡核苷酸的试剂盒,试剂盒可包含例如:(1)与类胰蛋白酶基因(例如TPSAB1或TPSB2)和/或编码生物标志物蛋白质(例如类胰蛋白酶)的核酸序列杂交的寡核苷酸,例如可检测标记的寡核苷酸,或(2)对于扩增生物标志物核酸分子有用的一对引物。试剂盒还可包含例如缓冲剂,防腐剂,或蛋白质稳定剂。试剂盒可进一步包含检测可检测标记物所必需的成分(例如酶或底物)。试剂盒还可装有能测定并与测试样品比较的对照样品或一系列对照样品。试剂盒的每种构件可以封装在单独的容器内,而且各个容器都可与说明书(用于解读使用试剂盒实施的测定法的结果)一起在单个包装内。
任何前述试剂盒可以进一步包括一种或多种治疗剂,包括任何类胰蛋白酶拮抗剂,FcεR拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,IgE拮抗剂,和其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂),和/或本文中描述的另外的治疗剂。
VII.组合物和药学配制剂
在一个方面,本发明部分基于如下发现,即可使用本发明的生物标志物(例如患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数和/或类胰蛋白酶的表达水平)来鉴定很可能响应疗法(例如包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,Fc厄普西隆受体(FcεR)拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,蛋白酶活化的受体2(PAR2)拮抗剂,IgE拮抗剂,和其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂和IgE拮抗剂)组成的组的药剂的疗法)的具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者。这些药剂和其组合是对于治疗肥大细胞介导的炎性疾病有用的,例如作为本文中描述的任何方法的一部分,例如在上文II和III节中。在一些实施方案中,该疗法是肥大细胞定向疗法。可以在本文中描述的方法和测定法中使用任何合适类胰蛋白酶拮抗剂(例如抗类胰蛋白酶抗体),Fc厄普西隆受体(FcεR)拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,蛋白酶活化的受体2(PAR2)拮抗剂,和/或IgE拮抗剂。下文进一步描述适合在本发明的方法和测定法中使用的非限制性例子。
A.抗体
可以在本文中描述的方法中使用任何合适抗体,例如抗类胰蛋白酶抗体,抗FcεR抗体,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,抗PAR2抗体,和/或抗IgE抗体。明确涵盖的是供上文列举的任何实施方案中使用的此类抗类胰蛋白酶抗体,抗FcεR抗体,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,抗PAR2抗体,和/或抗IgE抗体可以单一地或组合地具有下文a-c和1-7节中描述的任何特征。
a.抗类胰蛋白酶抗体
可以在本发明的方法中使用任何合适抗类胰蛋白酶抗体。例如,抗类胰蛋白酶抗体可以是美国临时专利申请No.62/457,722中描述的任何抗类胰蛋白酶抗体,通过援引将其完整收入本文。
在一些实施方案中,抗类胰蛋白酶抗体(例如抗类胰蛋白酶β抗体)可包括至少一种,至少两种,至少三种,至少四种,至少五种,或所有六种选自下述的高变区(HVR):(a)包含氨基酸序列DYGMV(SEQ ID NO:1)的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列FISSGSSTVYYADTMKG(SEQID NO:2)的HVR-H2；(c)包含氨基酸序列RNYDDWYFDV(SEQ ID NO:3)的HVR-H3；(d)包含氨基酸序列SASSSVTYMY(SEQ ID NO:4)的HVR-L1；(e)包含氨基酸序列RTSDLAS(SEQ ID NO:5)的HVR-L2；和(f)包含氨基酸序列QHYHSYPLT(SEQ ID NO:6)的HVR-L3,或一种或多种上述HVR和一种或多种其与SEQ ID NO:1-6任一具有至少约80％序列同一性(例如81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,或99％同一性)的变体的组合。例如,在一些实施方案中,抗类胰蛋白酶抗体包括(a)包含氨基酸序列DYGMV(SEQ ID NO:1)的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列FISSGSSTVYYADTMKG(SEQ IDNO:2)的HVR-H2；(c)包含氨基酸序列RNYDDWYFDV(SEQ ID NO:3)的HVR-H3；(d)包含氨基酸序列SASSSVTYMY(SEQ ID NO:4)的HVR-L1；(e)包含氨基酸序列RTSDLAS(SEQ ID NO:5)的HVR-L2；和(f)包含氨基酸序列QHYHSYPLT(SEQ ID NO:6)的HVR-L3。
在一些实施方案中,抗类胰蛋白酶抗体(例如抗类胰蛋白酶β抗体)可包括(a)包含SEQ ID NO:7的序列或与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如至少91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,或99％序列同一性)的氨基酸序列的重链可变(VH)域；(b)包含SEQ ID NO:8的序列或与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如至少91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,或99％序列同一性)的氨基酸序列的轻链可变(VL)域；或(c)如(a)中的VH域和如(b)中的VL域。例如,在一些实施方案中,VH域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施方案中,VL域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在特定实施方案中,VH域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列且VL域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在一些实施方案中,抗类胰蛋白酶抗体(例如抗类胰蛋白酶β抗体)可包括(a)包含SEQ ID NO:9的序列或与SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如至少91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,或99％序列同一性)的氨基酸序列的重链和(b)包含SEQ ID NO:10的序列或与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如至少91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,或99％序列同一性)的氨基酸序列的轻链。例如,在一些实施方案中,抗类胰蛋白酶抗体(例如抗类胰蛋白酶β抗体)包括(a)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链和(b)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链。
在其它实施方案中,抗类胰蛋白酶抗体(例如抗类胰蛋白酶β抗体)可包括(a)包含SEQ ID NO:11的序列或与SEQ ID NO:11的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如至少91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,或99％序列同一性)的氨基酸序列的重链和(b)包含SEQ ID NO:10的序列或与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如至少91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,或99％序列同一性)的氨基酸序列的轻链。例如,在一些实施方案中,抗类胰蛋白酶抗体(例如抗类胰蛋白酶β抗体)包括(a)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链和(b)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链。
在仍有其它实施方案中,抗类胰蛋白酶抗体(例如抗类胰蛋白酶β抗体)包括至少一种,至少两种,至少三种,至少四种,至少五种,或所有六种选自下述的高变区(HVR):(a)包含氨基酸序列GYAIT(SEQ ID NO:12)的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列GISSAATTFYSSWAKS(SEQ ID NO:13)的HVR-H2；(c)包含氨基酸序列DPRGYGAALDRLDL(SEQ ID NO:14)的HVR-H3；(d)包含氨基酸序列QSIKSVYNNRLG(SEQ ID NO:15)的HVR-L1；(e)包含氨基酸序列ETSILTS(SEQ ID NO:16)的HVR-L2；和(f)包含氨基酸序列AGGFDRSGDTT(SEQ ID NO:17)的HVR-L3,或一种或多种上述HVR和一种或多种其与SEQ ID NO:12-17任一具有至少约80％序列同一性(例如81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,或99％同一性)的变体的组合。例如,在一些实施方案中,抗类胰蛋白酶抗体包括(a)包含氨基酸序列GYAIT(SEQ ID NO:12)的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列GISSAATTFYSSWAKS(SEQ ID NO:13)的HVR-H2；(c)包含氨基酸序列DPRGYGAALDRLDL(SEQ IDNO:14)的HVR-H3；(d)包含氨基酸序列QSIKSVYNNRLG(SEQ ID NO:15)的HVR-L1；(e)包含氨基酸序列ETSILTS(SEQ ID NO:16)的HVR-L2；和(f)包含氨基酸序列AGGFDRSGDTT(SEQ IDNO:17)的HVR-L3。
在一些实施方案中,抗类胰蛋白酶抗体(例如抗类胰蛋白酶β抗体)包括(a)包含SEQ ID NO:18的序列或与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如至少91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,或99％序列同一性)的氨基酸序列的重链可变(VH)域；(b)包含SEQ ID NO:19的序列或与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如至少91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,或99％序列同一性)的氨基酸序列的轻链可变(VL)域；或(c)如(a)中的VH域和如(b)中的VL域。例如,在一些实施方案中,VH域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中,VL域包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在特定实施方案中,VH域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列且VL域包含SEQID NO:19的氨基酸序列。
在任何前述方法的一些实施方案中,抗类胰蛋白酶抗体(例如抗类胰蛋白酶β抗体)包括(a)包含SEQ ID NO:20的序列或与SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如至少91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,或99％序列同一性)的氨基酸序列的重链和(b)包含SEQ ID NO:21的序列或与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如至少91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,或99％序列同一性)的氨基酸序列的轻链。例如,在一些实施方案中,抗类胰蛋白酶抗体(例如抗类胰蛋白酶β抗体)包括(a)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链和(b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链。
在任何前述方法的其它实施方案中,抗类胰蛋白酶抗体(例如抗类胰蛋白酶β抗体)包括(a)包含SEQ ID NO:22的序列或与SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如至少91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,或99％序列同一性)的氨基酸序列的重链和(b)包含SEQ ID NO:21的序列或与SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如至少91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,或99％序列同一性)的氨基酸序列的轻链。例如,在一些实施方案中,抗类胰蛋白酶抗体(例如抗类胰蛋白酶β抗体)包括(a)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链和(b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中,抗类胰蛋白酶抗体是与任一前述抗体结合相同表位的抗体。
本文中公开的任何抗类胰蛋白酶抗体可以与下文C小节中描述的任何抗IgE抗体,包括奥马珠单抗
Figure BDA0002598124610000961
组合施用。
b.IgE+ B细胞消减性抗体
可以在本发明的方法中使用任何合适IgE+ B细胞消减性抗体。在一些实施方案中,IgE+ B细胞消减性抗体是抗M1’抗体(例如quilizumab)。在一些实施方案中,抗M1’抗体是国际专利申请公开号WO 2008/116149中描述的任何抗M1’抗体。
c.抗IgE抗体
可以在本发明的方法中使用任何合适抗IgE抗体。例示性抗IgE抗体包括rhuMabE25(E25,奥马珠单抗(
Figure BDA0002598124610000962
)),E26,E27,以及CGP-5101(Hu-901),HA抗体,ligelizumab,和talizumab。人源化抗IgE抗体E25,E26和E27的重和轻链可变域的氨基酸序列公开于例如美国专利No.6,172,213和WO 99/01556。CGP-5101(Hu-901)抗体描述于Corneet al.,J.Clin.Invest.99(5):879-887,1997；WO 92/17207；和ATCC保藏物No.BRL-10706,BRL-11130,BRL-11131,BRL-11132和BRL-11133。HA抗体描述于美国流水号60/444,229,WO2004/070011,和WO 2004/070010。
例如,在一些实施方案中,抗IgE抗体包括下述六种HVR中的一种,两种,三种,四种,五种,或所有六种:(a)包含氨基酸序列GYSWN(SEQ ID NO:40)的HVR-H1；(b)包含氨基酸序列SITYDGSTNYNPSVKG(SEQ ID NO:41)的HVR-H2；(c)包含氨基酸序列GSHYFGHWHFAV(SEQID NO:42)的HVR-H3；(d)包含氨基酸序列RASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:43)的HVR-L1；(e)包含氨基酸序列AASYLES(SEQ ID NO:44)的HVR-L2；和(f)包含氨基酸序列QQSHEDPYT(SEQID NO:45)的HVR-L3。在一些实施方案中,抗IgE抗体包括(a)包含与SEQ ID NO:38的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如至少91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,或99％序列同一性)的氨基酸序列的VH域；(b)包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如至少91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,或99％序列同一性)的氨基酸序列的VL域；或(c)如(a)中的VH域和如(b)中的VL域。在一些实施方案中,VH域包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。在一些实施方案中,VL域包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中,VH域包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列且VL域包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。本文中描述的任何抗IgE抗体可以与上文A小节中描述的任何抗类胰蛋白酶抗体组合使用。
1.抗体亲和力
在某些实施方案中,本文中提供的抗体(例如抗类胰蛋白酶抗体,抗FcεR抗体,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,抗PAR2抗体,或抗IgE抗体)具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,≤1pM,或≤0.1pM的解离常数(KD)(例如10-6M或更少,例如10-6M至10-9M或更少,例如,10-9M至10-13M或更少)。例如,在一些实施方案中,抗类胰蛋白酶抗体以约100nM或更低(例如100nM或更低,10nM或更低,1nM或更低,100pM或更低,10pM或更低,1pM或更低,或0.1pM或更低)的KD结合类胰蛋白酶(例如人类胰蛋白酶,例如人类胰蛋白酶β)。在一些实施方案中,抗体以10nM或更低(例如10nM或更低,1nM或更低,100pM或更低,10pM或更低,1pM或更低,或0.1pM或更低)的KD结合类胰蛋白酶(例如人类胰蛋白酶,例如人类胰蛋白酶β)。在一些实施方案中,抗体以1nM或更低(例如1nM或更低,100pM或更低,10pM或更低,1pM或更低,或0.1pM或更低)的KD结合类胰蛋白酶(例如人类胰蛋白酶,例如人类胰蛋白酶β)。在一些实施方案中,任何上文或本文中描述的抗类胰蛋白酶抗体以约0.5nM或更低(例如0.5nM或更低,400pM或更低,300pM或更低,200pM或更低,100pM或更低,50pM或更低,25pM或更低,10pM或更低,1pM或更低,或0.1pM或更低)的KD结合类胰蛋白酶(例如人类胰蛋白酶,例如人类胰蛋白酶β)。在一些实施方案中,抗体以约0.1nM至约0.5nM(例如约0.1nM,约0.2nM,约0.3nM,约0.4nM,或约0.5nM)的KD结合类胰蛋白酶(例如人类胰蛋白酶,例如人类胰蛋白酶β)。在一些实施方案中,抗体以约0.4nM的KD结合类胰蛋白酶(例如人类胰蛋白酶,例如人类胰蛋白酶β)。在一些实施方案中,抗体以约0.18nM的KD结合类胰蛋白酶(例如人类胰蛋白酶,例如人类胰蛋白酶β)。本文中描述的任何其它抗体可以以上文就抗类胰蛋白酶抗体而言描述的亲和力结合它的抗原。
在一个实施方案中,KD是通过放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的。在一个实施方案中,用Fab型式的感兴趣抗体及其抗原实施RIA。例如,通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况中用最小浓度的(125I)标记抗原平衡Fab,然后用抗Fab抗体包被板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(见例如Chen et al.,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了建立测定法的条件,将
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多孔板(Thermo Scientific)用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(Cappel Labs)包被过夜,随后用PBS中的2％(w/v)牛血清清蛋白于室温(约23℃)封闭2-5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中,将100pM或26pM[125I]-抗原与连续稀释的感兴趣Fab(例如与Presta et al.,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中抗VEGF抗体,Fab-12的评估一致)混合。然后将感兴趣的Fab温育过夜；然而,温育可持续更长时间(例如约65小时)以确保达到平衡。此后,将混合物转移至捕捉板,于室温温育(例如1小时)。然后除去溶液,并用PBS中的0.1％聚山梨酯20(
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-20)洗板8次。平板干燥后,加入150μl/孔闪烁液(MICROSCINT-20TM；Packard),然后在TOPCOUNTTM伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20％的浓度用于竞争性结合测定法。
依照另一个实施方案,KD是使用
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表面等离振子共振测定法测量的。例如,于25℃使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)使用
Figure BDA0002598124610000984
-2000或
Figure BDA0002598124610000985
-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)实施测定法。在一个实施方案中,依照供应商的用法说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIACORE,Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠pH 4.8稀释至5μg/ml(约0.2μM),然后以5μl/分钟的流速注射以获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后,注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量,于25℃以约25μl/分钟的流速注入在含0.05％聚山梨酯20(
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-20)表面活性剂的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(PBST)中两倍连续稀释的Fab(0.78nM至500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(
Figure BDA0002598124610000992
Evaluation Software version 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)以比率koff/kon计算。见例如Chen et al.,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法,结合速率超过106M-1s-1,那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定,即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量,在存在浓度渐增的抗原的情况中,测量PBS pH 7.2中20nM抗抗原抗体(Fab形式)于25℃的荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm,16nm带通)的升高或降低。
在一些实施方案中,KD是使用
Figure BDA0002598124610000993
SPR测定法测量的。在一些实施方案中,SPR测定法可使用
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T200或等效装置。在一些实施方案中,用单克隆小鼠抗人IgG(Fc)抗体固定化
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S系列CM5传感器芯片(或等效传感器芯片),随后在流动室上捕捉抗类胰蛋白酶抗体。以30μl/min的流速注射带His标签的人类胰蛋白酶β1单体(SEQID NO:128)的连续3倍稀释液。每份样品分析3分钟结合和10分钟解离。于25℃实施测定法。在每次注射后,使用3M MgCl2再生芯片。通过减去来自以相似密度捕捉无关IgG的流动室的响应单位(RU)来修正结合响应。使用同时拟合kon和koff的1:1Languir模型进行动力学分析。
2.抗体片段
在某些实施方案中,本文中提供的抗体(例如抗类胰蛋白酶抗体,抗FcεR抗体,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,抗PAR2抗体,或抗IgE抗体)是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab,Fab’,Fab’-SH,F(ab’)2,Fv,和scFv片段,和下文所描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述,见Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述,见例如Pluckthün,于The Pharmacology of MonoclonalAntibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编,(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994)。还可见WO 93/16185；和美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基,并且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论,见美国专利No.5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段,其可以是二价的或双特异性的。见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也记载于Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)。
单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中,单域抗体是人单域抗体(见例如美国专利No.6,248,516 B1)。
可以通过多种技术,包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成来生成抗体片段,如本文中描述的。
3.嵌合和人源化抗体
在某些实施方案中,本文中提供的抗体(例如抗类胰蛋白酶抗体,抗FcεR抗体,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,抗PAR2抗体,或抗IgE抗体)是嵌合抗体。某些嵌合抗体记载于例如美国专利No.4,816,567；和Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。在一个例子中,嵌合抗体包含非人可变区(例如,自小鼠,大鼠,仓鼠,家兔,或非人灵长类,诸如猴衍生的可变区)和人恒定区。在又一个例子中,嵌合抗体是“类转换的”抗体,其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中,嵌合抗体是人源化抗体。通常,将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性,同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地,人源化抗体包含一个或多个可变域,其中HVR(或其部分)自非人抗体衍生,而FR(或其部分)自人抗体序列衍生。任选地,人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中,将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的相应残基替代,例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro et al.,Front.Biosci.13:1619-1633(2008),并且进一步记载于例如Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988)；Queen et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；Kashmiri et al.,Methods 36:25-34(2005)(描述了特异性决定区(SDR)嫁接)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“重修表面”)；Dall’Acqua et al.,Methods 36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；Osbourn et al.,Methods 36:61-68(2005)；和Klimka et al.,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”方法)。
可以用于人源化的人框架区包括但不限于:使用“最佳拟合(best-fit)”方法选择的框架区(见例如Sims et al.,J.Immunol.151:2296(1993))；自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区(见例如Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta et al.,J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟的(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(见例如Almagro et al.,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和通过筛选FR文库衍生的框架区(见例如Baca et al.,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok et al.,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
4.人抗体
在某些实施方案中,本文中提供的抗体(例如抗类胰蛋白酶抗体,抗FcεR抗体,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,抗PAR2抗体,或抗IgE抗体)是人抗体。可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地,人抗体记载于van Dijket al.,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)。
可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体,所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座,其替换内源免疫球蛋白基因座,或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中,一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述,见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还可见例如美国专利No.6,075,181和6,150,584,其描述了XENOMOUSETM技术；美国专利No.5,770,429,其描述了
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技术；美国专利No.7,041,870,其描述了K-M
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技术,和美国专利申请公开文本No.US 2007/0061900,其描述了
Figure BDA0002598124610001021
技术)。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。
也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系(见例如Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner et al.,J.Immunol.,147:86(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)。其它方法包括那些例如记载于美国专利No.7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)和Ni,XiandaiMianyixue,26(4):265-268(2006)(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma技术)也记载于Vollmers et al.,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)和Vollmers et al.,Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91(2005)。
也可以通过分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变域序列生成人抗体。然后,可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。
5.文库衍生的抗体
可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离本发明的抗体。例如,用于生成噬菌体展示文库并对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom et al.,于Methods in MolecularBiology 178:1-37(O’Brien等编,Human Press,Totowa,NJ,2001),并且进一步记载于例如McCafferty et al.,Nature 348:552-554(1990)；Clackson et al.,Nature 352:624-628(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks et al.,于Methods inMolecular Biology 248:161-175(Lo编,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004)；和Lee et al.,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中,将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆,并在噬菌体文库中随机重组,然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体,如记载于Winter et al.,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)的。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体,而不需要构建杂交瘤。或者,可以(例如自人)克隆天然全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源,如由Griffiths etal.,EMBO J,12:725-734(1993)描述的。最后,也可以通过自干细胞克隆未重排的V基因区段,并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的HVR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库,如由Hoogenboom et al.,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如:美国专利No.5,750,373,和美国专利公开文本No.2005/0079574,2005/0119455,2005/0266000,2007/0117126,2007/0160598,2007/0237764,2007/0292936和2009/0002360。
认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。
6.多特异性抗体
在某些实施方案中,本文中提供的抗体(例如抗类胰蛋白酶抗体,抗FcεR抗体,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,抗PAR2抗体,或抗IgE抗体)是多特异性抗体,例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。例如,就抗类胰蛋白酶抗体而言,在某些实施方案中,双特异性抗体可以结合类胰蛋白酶的两个不同表位。在某些实施方案中,结合特异性之一针对类胰蛋白酶而另一针对任何其它抗原(例如第二生物学分子)。在一些实施方案中,双特异性抗体可以结合类胰蛋白酶的两个不同表位。在其它实施方案中,结合特异性之一针对类胰蛋白酶(例如人类胰蛋白酶,例如人类胰蛋白酶β)而且另一针对任何其它抗原(例如第二生物学分子,例如IL-13,IL-4,IL-5,IL-17,IL-33,IgE,M1 prime,CRTH2,或TRPA)。因而,双特异性抗体可以具有针对类胰蛋白酶和IL-13；类胰蛋白酶和IgE；类胰蛋白酶和IL-4；类胰蛋白酶和IL-5；类胰蛋白酶和IL-17；或类胰蛋白酶和IL-33的结合特异性。特别是,双特异性抗体可以具有针对类胰蛋白酶和IL-13或类胰蛋白酶和IL-33的结合特异性。在其它特定实施方案中,双特异性抗体可以具有针对类胰蛋白酶和IgE的结合特异性。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。
用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(见Milstein et al.,Nature 305:537(1983),WO 93/08829,和Traunecker et al.,EMBO J.10:3655(1991)),和“节-入-穴”工程化(见例如美国专利No.5,731,168)。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(见例如美国专利No.4,676,980,和Brennan et al.,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(见例如Kostelny et al.,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；使用单链Fv(scFv)二聚体(见例如Gruber et al.,J.Immunol.,152:5368(1994))；和如例如Tutt et al.,J.Immunol.147:60(1991)中所描述的,制备三特异性抗体来生成多特异性抗体。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体,包括“章鱼抗体”(见例如US 2006/0025576A1)。
本文中的抗体或片段还包括包含结合类胰蛋白酶以及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF”(见例如US 2008/0069820)。
节-入-穴
节-入-穴作为生成多特异性抗体的方法的用途描述于例如美国专利No.5,731,168,WO2009/089004,US2009/0182127,US2011/0287009,Marvin and Zhu,ActaPharmacol.Sin.(2005)26(6):649-658,和Kontermann(2005)Acta Pharmacol.Sin.26:1-9。下文提供了简短非限制性讨论。
“隆起”指至少一个氨基酸侧链自第一多肽的界面凸出并因此可放置在邻近界面(即第二多肽的界面)的补偿空腔中,从而稳定异多聚体,并由此例如有利于异多聚体形成,超过同多聚体形成。隆起可存在于初始界面中或可通过合成而引入(例如通过改变编码界面的核酸)。在一些实施方案中,改变编码第一多肽的界面的核酸以编码隆起。为了实现这一点,将编码第一多肽的界面中的至少一个“初始”氨基酸残基的核酸用编码至少一个侧链体积比初始氨基酸残基要大的“输入”氨基酸残基的核酸替换。会领会可以有超过一个初始和对应输入残基。各种氨基酸残基的侧链体积显示于例如US 2011/0287009的表1或美国专利No.7,642,228的表1。
在一些实施方案中,用于形成隆起的输入残基是选自精氨酸(R),苯丙氨酸(F),酪氨酸(Y)和色氨酸(W)的天然发生氨基酸残基。在一些实施方案中,输入残基是色氨酸或酪氨酸。在一些实施方案中,用于形成隆起的初始残基具有较小侧链体积,诸如丙氨酸,天冬酰胺,天冬氨酸,甘氨酸,丝氨酸,苏氨酸或缬氨酸。见例如美国专利No.7,642,228。
“空腔”指至少一个氨基酸侧链自第二多肽的界面凹进并因此容纳第一多肽的邻近界面上的对应隆起。空腔可存在于初始界面中或可通过合成而引入(例如通过改变编码界面的核酸)。在一些实施方案中,改变编码第二多肽的界面的核酸以编码空腔。为了实现这一点,将编码第二多肽的界面中的至少一个“初始”氨基酸残基的核酸用编码至少一个侧链体积比初始氨基酸残基要小的“输入”氨基酸残基的DNA替换。会领会可以有超过一个初始和对应输入残基。在一些实施方案中,用于形成空腔的输入残基是选自丙氨酸(A),丝氨酸(S),苏氨酸(T)和缬氨酸(V)的天然发生氨基酸残基。在一些实施方案中,输入残基是丝氨酸,丙氨酸或苏氨酸。在一些实施方案中,用于形成空腔的初始残基具有较大的侧链体积,诸如酪氨酸,精氨酸,苯丙氨酸或色氨酸。
隆起“可放置”在空腔中,这意味着隆起和空腔分别在第一多肽和第二多肽的界面上的空间位置及隆起和空腔的大小使得隆起能定位在空腔中,而对第一和第二多肽在界面处的正常联合没有显著扰乱。因为隆起诸如Tyr,Phe和Trp通常不与界面的轴垂直延伸且具有优选构象,所以隆起与对应空腔的排列在一些情况中可能依赖于隆起/空腔对基于三维结构(诸如通过X射线晶体学或核磁共振(NMR)获得的)的建模。这可以使用本领域广泛接受的技术来实现。
在一些实施方案中,IgG1恒定区中的节突变为T366W。在一些实施方案中,IgG1恒定区中的穴突变包含一处或多处选自T366S,L368A和Y407V的突变。在一些实施方案中,IgG1恒定区中的穴突变包含T366S,L368A和Y407V。
在一些实施方案中,IgG4恒定区中的节突变为T366W。在一些实施方案中,IgG4恒定区中的穴突变包含一处或多处选自T366S,L368A,和Y407V的突变。在一些实施方案中,IgG4恒定区中的穴突变包含T366S,L368A,和Y407V。
7.抗体变体
在某些实施方案中,涵盖本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如,可以期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性,诸如抑制活性。可以通过将合适的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中,或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除,和/或插入和/或替代。可以进行删除,插入,和替代的任何组合以得到最终的构建体,只要最终的构建体拥有期望的特征,例如,抗原结合。
a)替代,插入,和删除变体
在某些实施方案中,提供了具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。保守替代在表1中在“优选的替代”的标题下显示。更实质的变化在表1中在“例示性替代”的标题下提供,并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中,并且对产物筛选期望的活性,例如保留/改善的抗原结合,降低的免疫原性,或改善的ADCC或CDC。
表1
Figure BDA0002598124610001061
Figure BDA0002598124610001071
依照共同的侧链特性,氨基酸可以如下分组:
(1)疏水性的:正亮氨酸,Met,Ala,Val,Leu,Ile；
(2)中性,亲水性的:Cys,Ser,Thr,Asn,Gln；
(3)酸性的:Asp,Glu；
(4)碱性的:His,Lys,Arg；
(5)影响链取向的残基:Gly,Pro；
(6)芳香族的:Trp,Tyr,Phe。
非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一类别的。
一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地,为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力,降低的免疫原性)和/或会实质性保留亲本抗体的某些生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体,其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之,将一个或多个HVR残基突变,并将变体抗体在噬菌体上展示,并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。
可以对HVR做出变化(例如,替代),例如以改善抗体亲和力。可以对HVR“热点”,即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基(见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008)),和/或接触抗原的残基做出此类变化,其中对所得的变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经记载于例如Hoogenboom et al.,Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等编,Human Press,Totowa,NJ,(2001))。在亲和力成熟的一些实施方案中,通过多种方法(例如,易错PCR,链改组,或寡核苷酸指导的诱变)任一将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后,创建次级文库。然后,筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉HVR指导的方法,其中将几个HVR残基(例如,一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定牵涉抗原结合的HVR残基。特别地,经常靶向HVR-H3和HVR-L3。
在某些实施方案中,可以在一个或多个HVR内发生替代,插入,或删除,只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如,可以对HVR做出保守变化(例如,保守替代,如本文中提供的),其不实质性降低结合亲和力。例如,此类变化可以在HVR中的抗原接触残基以外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中,每个HVR或是未改变的,或是含有不超过1,2或3处氨基酸替代。
一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”,如由Cunningham et al.,Science,244:1081-1085(1989)所描述的。在此方法中,将残基或靶残基的组(例如,带电荷的残基诸如Arg,Asp,His,Lys,和Glu)鉴定,并用中性或带负电荷的氨基酸(例如,Ala或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外,利用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原间的接触点。作为替代的候选,可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合,及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。
b)糖基化变体
在某些实施方案中,改变本文中提供的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列,使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体的糖基化位点的添加或删除。
在抗体包含Fc区的情况中,可以改变其附着的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的,双触角寡糖,其一般通过N连接附着于Fc区的CH2域的Asn297。见例如Wright et al.,TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物,例如,甘露糖,N-乙酰葡糖胺(GlcNAc),半乳糖,和唾液酸,以及附着于双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中,可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施方案中,提供了抗体变体,其具有缺乏(直接或间接)附着于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如,此类抗体中的岩藻糖量可以是1％至80％,1％至65％,5％至65％或20％至40％。通过相对于附着于Asn297的所有糖结构(例如,复合的,杂合的和高甘露糖的结构)的总和,计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量,如通过MALDI-TOF质谱术测量的,例如如记载于WO 2008/077546的。Asn297指位于Fc区中的约第297位(Fc区残基的Eu编号方式)的天冬酰胺残基；然而,Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸,即在第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。见例如美国专利公开文本No.2003/0157108和2004/0093621。涉及“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的出版物的例子包括:US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO2002/031140；Okazaki et al.,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；和Yamane-Ohnuki etal.,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够生成脱岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka et al.,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；US 2003/0157108；和WO 2004/056312A1,尤其在实施例11),和敲除细胞系,诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(见例如Yamane-Ohnuki et al.,Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda et al.,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO 2003/085107)。
进一步提供了具有两分型寡糖的抗体变体,例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO 2003/011878；美国专利No.6,602,684；和US 2005/0123546。还提供了在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO 1997/30087；WO 1998/58964；和WO 1999/22764。
c)Fc区变体
在某些实施方案中,可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区中,由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如,人IgG1,IgG2,IgG3或IgG4 Fc区)。
在某些实施方案中,本发明涵盖拥有一些但不是所有效应器功能的抗体变体,所述效应器功能使其成为如下应用的期望候选物,其中抗体的体内半衰期是重要的,而某些效应器功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如,可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性),但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII,而单核细胞表达FcγRI,FcγRII和FcγRIII。在Ravetchet al.,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中汇总了造血细胞上的FcR表达。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性例子记载于美国专利No.5,500,362(见例如Hellstrom et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986)；Hellstrom et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；美国专利No.5,821,337；Bruggemann,M.et al.,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者,可以采用非放射性测定方法(见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA；和CytoTox
Figure BDA0002598124610001101
非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外,可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性,例如在动物模型中,诸如披露于Clynes et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)的。也可以实施C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q,并且因此缺乏CDC活性。见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活,可以实施CDC测定法(见例如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg et al.,Blood 101:1045-1052(2003)；和Cragg et al.,Blood 103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域中已知的方法来实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定(见例如Petkova et al.,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效应器功能的抗体包括那些具有Fc区残基238,265,269,270,297,327和329中的一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265,269,270,297和327中的两处或更多处具有替代的Fc突变体,包括残基265和297替代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。
描述了具有改善的或降低的对FcR的结合的某些抗体变体(见例如美国专利No.6,737,056；WO 2004/056312,和Shields et al.,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在某些实施方案中,抗体变体包含具有改善ADCC的一处或多处氨基酸替代,例如Fc区的位置298,333,和/或334(残基的EU编号方式)的替代的Fc区。
在一些实施方案中,对Fc区做出改变,其导致改变的(即,改善的或降低的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC),例如,如记载于美国专利No.6,194,551,WO 99/51642,和Idusogie et al.,J.Immunol.164:4178-4184(2000)的。
具有延长的半衰期和改善的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合的抗体记载于US2005/0014934,新生儿Fc受体(FcRn)负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer et al.,J.Immunol.117:587(1976)和Kim et al.,J.Immunol.24:249(1994))。那些抗体包含其中具有改善Fc区对FcRn结合的一处或多处替代的Fc区。此类Fc变体包括那些在Fc区残基238,256,265,272,286,303,305,307,311,312,317,340,356,360,362,376,378,380,382,413,424或434中的一处或多处具有替代,例如,Fc区残基434的替代的(美国专利No.7,371,826)。
还可见Duncan et al.,Nature 322:738-40(1988)；美国专利No.5,648,260和5,624,821；和WO 94/29351,其关注Fc区变体的其它例子。
d)经半胱氨酸工程化改造的抗体变体
在某些实施方案中,可以期望创建经半胱氨酸工程化改造的抗体,例如,“thioMAb”,其中抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在特定的实施方案中,替代的残基存在于抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基,反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点,并且可以用于将抗体与其它模块,诸如药物模块或接头-药物模块缀合,以创建免疫缀合物,如本文中进一步描述的。在某些实施方案中,可以用半胱氨酸替代下列残基之任一个或多个:轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。可以如例如美国专利No.7,521,541所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。
e)抗体衍生物
在某些实施方案中,可以进一步修饰本文中提供的抗体以含有本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG),乙二醇/丙二醇共聚物,羧甲基纤维素,右旋糖苷,聚乙烯醇,聚乙烯吡咯烷酮,聚-1,3-二氧戊环,聚-1,3,6-三噁烷,乙烯/马来酸酐共聚物,聚氨基酸(均聚物或随机共聚物),和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇,丙二醇均聚物,环氧丙烷/环氧乙烷共聚物,聚氧乙烯化多元醇(例如甘油),聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性,聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量,而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化,而且如果附着了超过一个聚合物,那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言,可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型,包括但不限于抗体要改进的具体特性或功能,抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗,等等。
在另一个实施方案中,提供了抗体和可以通过暴露于辐射选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中,非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的,并且包括但不限于对普通细胞没有损害,但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。
B.药物配制剂
以冻干配制剂或水溶液的形式通过混合具有期望程度的纯度的治疗剂与任选的药学可接受载剂,赋形剂,或稳定剂来制备包括依照本发明使用的治疗剂(例如任何类胰蛋白酶拮抗剂(例如抗类胰蛋白酶抗体,包括任何本文中描述的抗类胰蛋白酶抗体),FcεR拮抗剂,IgE+ B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,IgE拮抗剂(例如抗IgE抗体,例如奥马珠单抗(
Figure BDA0002598124610001121
)),和其组合(例如类胰蛋白酶拮抗剂(例如抗类胰蛋白酶抗体,包括任何本文中描述的抗类胰蛋白酶抗体)和IgE拮抗剂(例如抗IgE抗体,例如奥马珠单抗(
Figure BDA0002598124610001122
))),和/或本文中描述的另外的治疗剂)的治疗配制剂供贮存。关于配制剂的一般信息参见例如Gilman et al.,(eds.)The PharmacologicalBases of Therapeutics,8th Ed.,Pergamon Press,1990；A.Gennaro(ed.),Remington’sPharmaceutical Sciences,18th Edition,Mack Publishing Co.,Pennsylvania,1990；Avis et al.,(eds.)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications Dekker,New York,1993；Lieberman et al.,(eds.)Pharmaceutical Dosage Forms:TabletsDekker,New York,1990；Lieberman et al.,(eds.),Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems Dekker,New York,1990；和Walters(ed.)Dermatological andTransdermal Formulations(Drugs and the Pharmaceutical Sciences),Vol 119,Marcel Dekker,2002。
可接受载剂,赋形剂,或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的,而且包括缓冲剂,诸如磷酸盐,柠檬酸盐,和其它有机酸；抗氧化剂,包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚,丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯,诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质,诸如血清清蛋白,明胶,或免疫球蛋白；亲水性聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸,诸如甘氨酸,谷氨酰胺,天冬酰胺,组氨酸,精氨酸,或赖氨酸；单糖,二糖,和其它碳水化合物,包括葡萄糖,甘露糖,或糊精；螯合剂,诸如EDTA；糖,诸如蔗糖,甘露醇,海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子,诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂,诸如TWEENTM,PLURONICSTM,或聚乙二醇(PEG)。
本文中的配制剂还可含有多于一种活性化合物,优选活性互补且彼此没有不利影响的那些。此类药物的类型和有效量取决于例如配制剂中存在的治疗剂的量和类型,和受试者的临床参数。
活性组分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊),在胶状药物投递系统中(例如脂质体,清蛋白微球体,微乳剂,纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗滴乳状液中。此类技术披露于Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.,1980。
可制备持久释放制剂。持久释放制剂的合适例子包括含有拮抗剂的固体疏水性聚合物的半透性基质,基质为成形制品形式,例如膜或微胶囊。持久释放基质的例子包括聚酯,水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯),或聚(乙烯醇)),聚交酯(美国专利No.3,773,919),L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物,不可降解的乙烯-乙酸乙烯,可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体),和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这容易通过穿过无菌滤膜过滤来实现。
实施例
提供下面的实施例来例示而非限制当前要求保护的发明。
实施例1:材料和方法
A)活性类胰蛋白酶等位基因计数
如先前描述的(Trivedi et al.,J.Allergy Clin.Immunol.124:1099-1105e1-4,2009),采用基因组DNA的PCR继以Sanger测序来测定活性类胰蛋白酶等位基因计数。简言之,作为在考虑了类胰蛋白酶缺陷等位基因之后的剩余活性类胰蛋白酶基因(即那些决定α和βIIIFS的)的数目评估活性类胰蛋白酶等位基因计数。使用两种(A/B)等位基因的强度比自动调用基因型。基于这种比率将患者指派至基因型仓。通过目视检测5％的群体的测序迹线没有错误确认基因型。目视检查未正确分仓的患者数据。如先前描述的(Ramirez-Carrozzi et al.,J.Allergy Clin.Immunol.135:1080-1083e3,2015),对欧洲裔哮喘受试者进行活性类胰蛋白酶等位基因计数的基因型测定,通过基因组范围SNP数据的主成分分析确定。
为了类胰蛋白酶α的基因型测定,使用正向引物5’-CTG GTG TGC AAG GTG AATGG-3’(SEQ ID NO:31)和反向引物5’-AGG TCC AGC ACT CAG GAG GA-3’(SEQ ID NO:32)来扩增TPSAB1基因座的一部分。PCR条件如下:在95℃达5分钟,继以35个循环的94℃达60秒,58℃达60秒,和72℃达2分钟的热循环仪条件期间使用Qiagen
Figure BDA0002598124610001141
Plus聚合酶。在PCR后,使用EXOSAP-ITTM PCR产物清洁试剂进行清洁。使用相同的正向和反向引物进行测序。在由Applied Biosystems制造的ABI 3730XL DNA分析仪上使用BIG-
Figure BDA0002598124610001142
终止物化学实施测序。
为了类胰蛋白酶βIIIFS的基因型测定,使用正向引物5’-GCA GGT GAG CCT GAGAGT CC-3’(SEQ ID NO:33)和反向引物5’-GGG ACC TTC ACC TGC TTC AG-3’(SEQ ID NO:34)扩增TPSB2基因座的一部分。PCR条件如下:在95℃达5分钟,继以35个循环的94℃达60秒,60℃达60秒,和72℃达2分钟的热循环仪条件期间使用Qiagen
Figure BDA0002598124610001143
Plus聚合酶。在PCR后,使用EXOSAP-ITTM PCR产物清洁试剂进行清洁。为了测序,使用正向引物5’-GCA GGT GAG CCT GAG AGT CC-3’(SEQ ID NO:33)和反向测序引物5’-CAG CCA GTGACC CAG CAC-3’(SEQ ID NO:35)。在由Applied Biosystems制造的ABI 3730XL DNA分析仪上使用BIG-
Figure BDA0002598124610001151
终止物化学实施测序。
B)临床队列
EXTRA(ClinicalTrials.gov标识符:NCT00314574)是Xolair(抗IgE)在具有中度至重度持续哮喘的12-75岁受试者中的随机化,双盲,安慰剂对照的一项研究。先前已经发表研究设计的全部详情(Hanania et al.,Ann.Intern.Med.154:573-582,2011；Hananiaet al.,Am.J.Respir.Crit.Care Med.187:804-811,2013；Choy et al.,J.AllergyClin.Immunol.138:1230-1233e8,2016)。简言之,在2-4周导入(run-in)期后,将适格患者以1:1比率随机化来接受
Figure BDA0002598124610001152
(奥马珠单抗)或安慰剂(在高剂量吸入式皮质类固醇(ICS)和长效β-肾上腺素受体激动剂(LABA)以外,有或无另外的控制剂药疗)达48周。
BOBCAT(Arron et al.,Eur.Respir.J.43:627-629,2014；Choy等人,见上文；Huang et al.,J.Allergy Clin.Immunol.136:874-884,2015；Jia et al.,J.AllergyClin.Immunol.130:647-654,2012)是在美国,加拿大,和英国进行的67名具有中度至重度哮喘的成年患者的一项多中心,观察性研究。入选标准要求诊断为中度至重度哮喘(通过40％至80％的预测值的1秒用力呼气体积(FEV1),以及过去5年内用短效支气管扩张剂时气道阻塞>12％可逆性的证据或乙酰甲胆碱敏感性(引起FEV1下降20％的诱发浓度(PC20)<8mg/mL确认),不受控制(定义为前一年至少2次恶化或接受高剂量ICS(每天>1000mg氟替卡松或等同物)的稳定剂量方案(>6周)时5项版本哮喘控制问卷(ACQ)(ACQ-5)得分>1.50),有或无LABA。
MILLY(ClinicalTrials.gov标识符:NCT00930163)是lebrikizumab(抗IL-13抗体)在具有尽管有吸入式糖皮质激素疗法仍然控制不当的哮喘的成人中的随机化,双盲,安慰剂对照的一项研究(Corren et al.,N.Engl.J.Med.365:1088-1098,2011)。
C)总类胰蛋白酶ELISA
用2种能够检测人类胰蛋白酶β1,β2,β3,和α1的单体和四聚体的单克隆抗体使用夹心式酶联免疫吸附测定法(ELISA)测量血清或血浆类胰蛋白酶水平。简言之,将384孔板在磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液中以1.0μg/ml用单克隆抗类胰蛋白酶抗体于4℃包被过夜,然后用90μl封闭缓冲液(1x PBS+1％牛血清清蛋白(BSA))于室温封闭至少1小时。在测定缓冲液(1X PBS pH 7.4,0.35M NaCl,0.5％BSA,0.05％
Figure BDA0002598124610001161
20(聚山梨酯20),0.25％3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS),5mM乙二胺四乙酸(EDTA),和百万分之15(PPM)PROCLINTM(广谱抗微生物剂))中1:100稀释血清或血浆样品,并一式三份添加至清洗后的板,并在摇动中于室温温育2小时。在测定法中使用重组类胰蛋白酶β1建立标准范围(7.8-500pg/ml)。在清洗后,添加测定稀释液(1x PBS pH 7.4,0.5％BSA,0.05％
Figure BDA0002598124610001162
20)中的生物素化抗人类胰蛋白酶(0.5μg/ml)并于室温温育1小时。在清洗后用链霉亲合素-过氧化物酶和底物四甲基联苯胺(TMB)显色。基于4参数(4P)拟合标准曲线解读数据。这种测定法的检测限度是大约7.8pg/ml。
D)统计
使用R软件(RCoreTeam,R:A Language an Environment for StatisticalComputing,2014)进行绘图和分析。
实施例2:活性类胰蛋白酶基因计数在中度至重度哮喘中是异质的
类胰蛋白酶是在肥大细胞中显著表达的颗粒蛋白且被认为是重要的哮喘介质,对肺功能具有值得注意的影响。编码有酶活性的类胰蛋白酶的基因TSPAB1和TPSB2具有多态性,而且我们先前已经描述了常见,失活,功能丧失突变的频率和样式(Trivedi et al.,J.Allergy Clin.Immunol.124:1099-1105e1-4,2009)。尽管出现现代全基因组分析,包括高密度SNP阵列和下一代测序,尚未很好地研究类胰蛋白酶基因座,因为这个区域的高同源性和重复性质不适合这些方法学,因而需要直接重测序。我们假设通过考虑TSPAB1和TPSB2的失活突变推断的活性类胰蛋白酶等位基因计数会影响肥大细胞衍生的类胰蛋白酶的表达并预测对肥大细胞相关疗法,例如抗IgE抗体
Figure BDA0002598124610001163
(奥马珠单抗)的临床响应。
我们评估来自BOBCAT,EXTRA,和MILLY研究的欧洲裔中度至重度哮喘受试者中的活性类胰蛋白酶等位基因计数(见实施例1)。与世界人口中的先前报告(Trivedi et al.,J.Allergy Clin.Immunol.124:1099-1105e1-4,2009)一致,功能丧失突变在我们的研究中的受试者中常见(图1)；88.3％的受试者(462人中的408人)具有至少一处功能丧失突变,产生1,2,或3个剩余活性类胰蛋白酶拷贝。在这些研究中没有观察到具有零活性拷贝的受试者,而且具有一个活性拷贝的受试者相对罕见(<1％,462人中的3人)。具有两个或三个活性类胰蛋白酶拷贝的受试者在我们的队列中是主流(88％,462人中的405人)；两个或三个活性拷贝的流行度相当(分别是,43％,462人中的199人；和45％,462人中的206人)。
观察到的活性类胰蛋白酶等位基因计数的分布与TPSAB1和TPSB2的特定等位基因连锁不平衡,导致功能障碍性类胰蛋白酶等位基因与功能性等位基因共遗传的发现一致(Trivedi等人,见上文)。如此,具有零或四个活性类胰蛋白酶等位基因计数的受试者预期是罕见的。总之,活性类胰蛋白酶等位基因计数在中度至重度哮喘患者中是异质的。
实施例3:哮喘外周类胰蛋白酶水平的活性类胰蛋白酶等位基因计数是蛋白质定量性状连锁(pQTL)
接下来,我们评估来自BOBCAT(图2A)和MILLY(图2B)研究的中度至重度哮喘中活性类胰蛋白酶拷贝数与总外周类胰蛋白酶水平的关系。在每一项研究中观察到显著的pQTL(P<0.0001),进一步联系活性类胰蛋白酶等位基因计数是类胰蛋白酶表达的根本决定因素,而且具有升高的活性类胰蛋白酶等位基因计数的哮喘受试者与升高的类胰蛋白酶表达水平有关。总之,这些数据表明外周类胰蛋白酶的表达水平(例如血液样品中的)与受试者的活性类胰蛋白酶等位基因计数有关。基于这种相关性,预期可使用类胰蛋白酶的表达水平(例如血液(例如血清或血浆)中的)来预测治疗响应(例如对抗IgE疗法或其它治疗干预的)。
实施例4:活性类胰蛋白酶等位基因计数预测对抗IgE疗法的哮喘FEV1响应
基于活性类胰蛋白酶等位基因计数与来自离体原代肥大细胞的活性类胰蛋白酶的表达和与哮喘患者中的总类胰蛋白酶的外周水平(见实施例3)有关的发现,我们假设活性类胰蛋白酶等位基因计数会预测哮喘中对肥大细胞相关疗法的临床响应。
Figure BDA0002598124610001171
(奥马珠单抗)是一种已批准的用于特应性哮喘的减轻哮喘恶化的抗IgE单克隆抗体疗法。由于阻断性IgE导致通过减少来自肥大细胞的IgE/FcεRI依赖性脱粒来改善临床哮喘,因此我们基于活性类胰蛋白酶等位基因计数对FEV1相对于基线的改善进行事后分析。由于在哮喘中主要(88％)观察到两个和三个活性类胰蛋白酶等位基因,而且因此具有一个或四个活性类胰蛋白酶等位基因的受试者相对罕见,因此我们将我们的研究群体二分为具有1或2个对3或4个活性类胰蛋白酶等位基因以提高统计效力。
具有一个或两个活性类胰蛋白酶等位基因的受试者到抗IgE疗法第12周派生显著的FEV1百分比改善(图3,均值±标准误差＝11.3(3,19.6)％,P＝0.009)。与之对比,具有三个或四个活性类胰蛋白酶等位基因的受试者并不派生来自抗IgE疗法的FEV1益处(图3)。这些观察结果持续贯穿研究48周。因此,与具有三个或四个拷贝数的受试者相比,具有一个或两个类胰蛋白酶活性等位基因的哮喘受试者对抗IgE
Figure BDA0002598124610001181
疗法派生显著的肺功能改善。
肥大细胞类胰蛋白酶显示出在体外通过提高收缩性和细胞分化而直接影响气道平滑肌,而且因此认为是气道阻塞的重要哮喘介质。这些数据提示抗IgE疗法可能在表达低水平的肥大细胞类胰蛋白酶(其可能通过IgE/FcεRI依赖性脱粒以及IgE/FcεRI不依赖性机制二者释放)的受试者中最有效。这些数据还指示可使用活性类胰蛋白酶等位基因计数作为预测性生物标志物来预测对哮喘治疗性干预的响应。例如,具有低活性类胰蛋白酶等位基因计数的患者很可能受益于用
Figure BDA0002598124610001182
(奥马珠单抗)的疗法。在其它例子中,具有高活性类胰蛋白酶等位基因计数的患者很可能受益于用类胰蛋白酶拮抗剂(例如抗类胰蛋白酶抗体)的疗法。
实施例5:在中度至重度哮喘中活性类胰蛋白酶等位基因计数并不与2型生物标志物有关
先前的研究显示在哮喘中2型生物标志物的表达水平为
Figure BDA0002598124610001183
(奥马珠单抗)疗法的治疗益处,即恶化率降低而富集(Hanania et al.,Am.J.Respir.Crit.CareMed.187:804-811,2013)。为了调查活性类胰蛋白酶等位基因计数如何涉及2型炎症的生物标志物,我们就基线时来自BOBCAT,EXTRA,和MILLY研究的受试者的活性类胰蛋白酶等位基因计数而言评估血清骨膜素水平,呼出一氧化氮分数(FeNO),和血液嗜曙红细胞计数的水平,而且没有观察到任何相关性(图4A-4C)。这些数据指示活性类胰蛋白酶等位基因计数和2型生物标志物独立选择不同哮喘病人子集。活性类胰蛋白酶拷贝数就水平2型炎症的生物标志物水平而言的独立性提示活性类胰蛋白酶拷贝数评估提供类胰蛋白酶和肥大细胞生物学的独特信息。例如,具有升高的活性类胰蛋白酶等位基因计数和低2型生物标志物水平的受试者(例如TH2低哮喘)可能受益于用肥大细胞定向疗法(例如包括类胰蛋白酶拮抗剂,IgE+B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,或蛋白酶活化的受体2(PAR2)拮抗剂的疗法)的治疗。相反,具有升高的活性类胰蛋白酶等位基因计数和高2型生物标志物水平的受试者(例如TH2高哮喘)可能受益于用TH2途径抑制剂和/或肥大细胞定向疗法的治疗。
其它实施方案
虽然为了清楚理解的目的已经通过举例说明较为详细地描述了前述发明,但是描述和例子不应解释为限制本发明的范围。通过援引明确完整收录本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容。
序列表
<110> 基因泰克公司（Genentech, Inc.）
<120> 用于肥大细胞介导的炎性疾病的治疗和诊断方法
<130> 50474-161WO2
<150> US 62/628,564
<151> 2018-02-09
<160> 45
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
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Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Arg Thr Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr His Ser Tyr Pro Leu Thr
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Val Tyr Tyr Ala Asp Thr Met
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Arg Arg Asn Tyr Asp Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
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Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
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Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
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Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
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Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
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Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
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Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<220>
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<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met
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Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
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Arg Thr Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
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Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr His Ser Tyr Pro Leu Thr
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Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
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Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
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Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
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Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
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Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
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Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
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Asn Arg Gly Glu Cys
210
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<223> 合成构建物
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
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Gly Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Phe Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Val Tyr Tyr Ala Asp Thr Met
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Thr Arg Arg Asn Tyr Asp Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
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Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
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Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
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Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
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Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
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Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
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Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
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Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
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<220>
<223> 合成构建物
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<223> 合成构建物
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<210> 14
<211> 14
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<223> 合成构建物
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Asp Pro Arg Gly Tyr Gly Ala Ala Leu Asp Arg Leu Asp Leu
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<210> 15
<211> 12
<212> PRT
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<223> 合成构建物
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Arg Phe Ser Leu Ile Gly Tyr
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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<220>
<223> 合成构建物
<400> 19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ile Lys Ser Val Tyr Asn Asn
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Arg Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
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Gly Asp Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<220>
<223> 合成构建物
<400> 20
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Arg Phe Ser Leu Ile Gly Tyr
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Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
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100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
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Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
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Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
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His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
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Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly
450
<210> 21
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 21
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ile Lys Ser Val Tyr Asn Asn
20 25 30
Arg Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Glu Thr Ser Ile Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Phe Asp Arg Ser
85 90 95
Gly Asp Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 22
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Arg Phe Ser Leu Ile Gly Tyr
20 25 30
Ala Ile Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Ser Ser Ala Ala Thr Thr Phe Tyr Ser Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Pro Arg Gly Tyr Gly Ala Ala Leu Asp Arg Leu Asp Leu Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr
210 215 220
Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440 445
<210> 23
<211> 275
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 23
Met Leu Asn Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Val Leu Ala Ser Arg Ala
1 5 10 15
Tyr Ala Ala Pro Ala Pro Gly Gln Ala Leu Gln Arg Val Gly Ile Val
20 25 30
Gly Gly Gln Glu Ala Pro Arg Ser Lys Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu
35 40 45
Arg Val His Gly Pro Tyr Trp Met His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile
50 55 60
His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Val Gly Pro Asp Val
65 70 75 80
Lys Asp Leu Ala Ala Leu Arg Val Gln Leu Arg Glu Gln His Leu Tyr
85 90 95
Tyr Gln Asp Gln Leu Leu Pro Val Ser Arg Ile Ile Val His Pro Gln
100 105 110
Phe Tyr Thr Ala Gln Ile Gly Ala Asp Ile Ala Leu Leu Glu Leu Glu
115 120 125
Glu Pro Val Asn Val Ser Ser His Val His Thr Val Thr Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Ser Glu Thr Phe Pro Pro Gly Met Pro Cys Trp Val Thr Gly Trp
145 150 155 160
Gly Asp Val Asp Asn Asp Glu Arg Leu Pro Pro Pro Phe Pro Leu Lys
165 170 175
Gln Val Lys Val Pro Ile Met Glu Asn His Ile Cys Asp Ala Lys Tyr
180 185 190
His Leu Gly Ala Tyr Thr Gly Asp Asp Val Arg Ile Val Arg Asp Asp
195 200 205
Met Leu Cys Ala Gly Asn Thr Arg Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser
210 215 220
Gly Gly Pro Leu Val Cys Lys Val Asn Gly Thr Trp Leu Gln Ala Gly
225 230 235 240
Val Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Gln Pro Asn Arg Pro Gly Ile
245 250 255
Tyr Thr Arg Val Thr Tyr Tyr Leu Asp Trp Ile His His Tyr Val Pro
260 265 270
Lys Lys Pro
275
<210> 24
<211> 275
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 24
Met Leu Asn Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Val Leu Ala Ser Arg Ala
1 5 10 15
Tyr Ala Ala Pro Ala Pro Gly Gln Ala Leu Gln Arg Val Gly Ile Val
20 25 30
Gly Gly Gln Glu Ala Pro Arg Ser Lys Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu
35 40 45
Arg Val His Gly Pro Tyr Trp Met His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile
50 55 60
His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Val Gly Pro Asp Val
65 70 75 80
Lys Asp Leu Ala Ala Leu Arg Val Gln Leu Arg Glu Gln His Leu Tyr
85 90 95
Tyr Gln Asp Gln Leu Leu Pro Val Ser Arg Ile Ile Val His Pro Gln
100 105 110
Phe Tyr Thr Ala Gln Ile Gly Ala Asp Ile Ala Leu Leu Glu Leu Glu
115 120 125
Glu Pro Val Lys Val Ser Ser His Val His Thr Val Thr Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Ser Glu Thr Phe Pro Pro Gly Met Pro Cys Trp Val Thr Gly Trp
145 150 155 160
Gly Asp Val Asp Asn Asp Glu Arg Leu Pro Pro Pro Phe Pro Leu Lys
165 170 175
Gln Val Lys Val Pro Ile Met Glu Asn His Ile Cys Asp Ala Lys Tyr
180 185 190
His Leu Gly Ala Tyr Thr Gly Asp Asp Val Arg Ile Val Arg Asp Asp
195 200 205
Met Leu Cys Ala Gly Asn Thr Arg Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser
210 215 220
Gly Gly Pro Leu Val Cys Lys Val Asn Gly Thr Trp Leu Gln Ala Gly
225 230 235 240
Val Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Gln Pro Asn Arg Pro Gly Ile
245 250 255
Tyr Thr Arg Val Thr Tyr Tyr Leu Asp Trp Ile His His Tyr Val Pro
260 265 270
Lys Lys Pro
275
<210> 25
<211> 233
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 25
Met Leu Asn Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Val Leu Ala Ser Arg Ala
1 5 10 15
Tyr Ala Ala Pro Ala Pro Gly Gln Ala Leu Gln Arg Val Gly Ile Val
20 25 30
Gly Gly Gln Glu Ala Pro Arg Ser Lys Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu
35 40 45
Arg Val Arg Asp Arg Tyr Trp Met His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile
50 55 60
His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Val Gly Pro Asp Val
65 70 75 80
Lys Asp Leu Ala Ala Leu Arg Val Gln Leu Arg Glu Gln His Leu Tyr
85 90 95
Tyr Gln Asp Gln Leu Leu Pro Val Ser Arg Ile Ile Val His Pro Gln
100 105 110
Phe Tyr Thr Ala Gln Ile Gly Ala Asp Ile Ala Leu Leu Glu Leu Glu
115 120 125
Glu Pro Val Asn Val Ser Ser His Val His Thr Val Thr Leu Pro Pro
130 135 140
Ala Ser Glu Thr Phe Pro Pro Gly Met Pro Cys Trp Val Thr Gly Trp
145 150 155 160
Gly Asp Val Asp Asn Asp Glu Arg Leu Pro Pro Pro Phe Pro Leu Lys
165 170 175
Gln Val Lys Val Pro Ile Met Glu Asn His Ile Cys Asp Ala Lys Tyr
180 185 190
His Leu Gly Ala Tyr Thr Gly Asp Asp Val Arg Ile Val Arg Asp Asp
195 200 205
Met Leu Cys Ala Gly Asn Thr Arg Arg Asp Ser Cys Gln Val Ala Thr
210 215 220
Ala Pro His Thr Phe Pro Ala Pro Ser
225 230
<210> 26
<211> 245
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 26
Ile Val Gly Gly Gln Glu Ala Pro Arg Ser Lys Trp Pro Trp Gln Val
1 5 10 15
Ser Leu Arg Val His Gly Pro Tyr Trp Met His Phe Cys Gly Gly Ser
20 25 30
Leu Ile His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Val Gly Pro
35 40 45
Asp Val Lys Asp Leu Ala Ala Leu Arg Val Gln Leu Arg Glu Gln His
50 55 60
Leu Tyr Tyr Gln Asp Gln Leu Leu Pro Val Ser Arg Ile Ile Val His
65 70 75 80
Pro Gln Phe Tyr Thr Ala Gln Ile Gly Ala Asp Ile Ala Leu Leu Glu
85 90 95
Leu Glu Glu Pro Val Asn Val Ser Ser His Val His Thr Val Thr Leu
100 105 110
Pro Pro Ala Ser Glu Thr Phe Pro Pro Gly Met Pro Cys Trp Val Thr
115 120 125
Gly Trp Gly Asp Val Asp Asn Asp Glu Arg Leu Pro Pro Pro Phe Pro
130 135 140
Leu Lys Gln Val Lys Val Pro Ile Met Glu Asn His Ile Cys Asp Ala
145 150 155 160
Lys Tyr His Leu Gly Ala Tyr Thr Gly Asp Asp Val Arg Ile Val Arg
165 170 175
Asp Asp Met Leu Cys Ala Gly Asn Thr Arg Arg Asp Ser Cys Gln Gly
180 185 190
Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Lys Val Asn Gly Thr Trp Leu Gln
195 200 205
Ala Gly Val Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Gln Pro Asn Arg Pro
210 215 220
Gly Ile Tyr Thr Arg Val Thr Tyr Tyr Leu Asp Trp Ile His His Tyr
225 230 235 240
Val Pro Lys Lys Pro
245
<210> 27
<211> 256
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 27
Ile Val Gly Gly Gln Glu Ala Pro Arg Ser Lys Trp Pro Trp Gln Val
1 5 10 15
Ser Leu Arg Val His Gly Pro Tyr Trp Met His Phe Cys Gly Gly Ser
20 25 30
Leu Ile His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Val Gly Pro
35 40 45
Asp Val Lys Asp Leu Ala Ala Leu Arg Val Gln Leu Arg Glu Gln His
50 55 60
Leu Tyr Tyr Gln Asp Gln Leu Leu Pro Val Ser Arg Ile Ile Val His
65 70 75 80
Pro Gln Phe Tyr Thr Ala Gln Ile Gly Ala Asp Ile Ala Leu Leu Glu
85 90 95
Leu Glu Glu Pro Val Lys Val Ser Ser His Val His Thr Val Thr Leu
100 105 110
Pro Pro Ala Ser Glu Thr Phe Pro Pro Gly Met Pro Cys Trp Val Thr
115 120 125
Gly Trp Gly Asp Val Asp Asn Asp Glu Arg Leu Pro Pro Pro Phe Pro
130 135 140
Leu Lys Gln Val Lys Val Pro Ile Met Glu Asn His Ile Cys Asp Ala
145 150 155 160
Lys Tyr His Leu Gly Ala Tyr Thr Gly Asp Asp Val Arg Ile Val Arg
165 170 175
Asp Asp Met Leu Cys Ala Gly Asn Thr Arg Arg Asp Ser Cys Gln Gly
180 185 190
Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Lys Val Asn Gly Thr Trp Leu Gln
195 200 205
Ala Gly Val Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Gln Pro Asn Arg Pro
210 215 220
Gly Ile Tyr Thr Arg Val Thr Tyr Tyr Leu Asp Trp Ile His His Tyr
225 230 235 240
Val Pro Lys Lys Pro Gly Asn Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
245 250 255
<210> 28
<211> 256
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 28
Ile Val Gly Gly Gln Glu Ala Pro Arg Ser Lys Trp Pro Trp Gln Val
1 5 10 15
Ser Leu Arg Val Arg Asp Arg Tyr Trp Met His Phe Cys Gly Gly Ser
20 25 30
Leu Ile His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Val Gly Pro
35 40 45
Asp Val Lys Asp Leu Ala Ala Leu Arg Val Gln Leu Arg Glu Gln His
50 55 60
Leu Tyr Tyr Gln Asp Gln Leu Leu Pro Val Ser Arg Ile Ile Val His
65 70 75 80
Pro Gln Phe Tyr Thr Ala Gln Ile Gly Ala Asp Ile Ala Leu Leu Glu
85 90 95
Leu Glu Glu Pro Val Asn Val Ser Ser His Val His Thr Val Thr Leu
100 105 110
Pro Pro Ala Ser Glu Thr Phe Pro Pro Gly Met Pro Cys Trp Val Thr
115 120 125
Gly Trp Gly Asp Val Asp Asn Asp Glu Arg Leu Pro Pro Pro Phe Pro
130 135 140
Leu Lys Gln Val Lys Val Pro Ile Met Glu Asn His Ile Cys Asp Ala
145 150 155 160
Lys Tyr His Leu Gly Ala Tyr Thr Gly Asp Asp Val Arg Ile Val Arg
165 170 175
Asp Asp Met Leu Cys Ala Gly Asn Thr Arg Arg Asp Ser Cys Gln Gly
180 185 190
Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Lys Val Asn Gly Thr Trp Leu Gln
195 200 205
Ala Gly Val Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Gln Pro Asn Arg Pro
210 215 220
Gly Ile Tyr Thr Arg Val Thr Tyr Tyr Leu Asp Trp Ile His His Tyr
225 230 235 240
Val Pro Lys Lys Pro Gly Asn Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
245 250 255
<210> 29
<211> 256
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 29
Ile Val Gly Gly Gln Glu Ala Pro Arg Ser Lys Trp Pro Trp Gln Val
1 5 10 15
Ser Leu Arg Val Arg Asp Arg Tyr Trp Met His Phe Cys Gly Gly Ser
20 25 30
Leu Ile His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Gly Pro
35 40 45
Asp Val Lys Asp Leu Ala Ala Leu Arg Val Gln Leu Arg Glu Gln His
50 55 60
Leu Tyr Tyr Gln Asp Gln Leu Leu Pro Val Ser Arg Ile Ile Val His
65 70 75 80
Pro Gln Phe Tyr Ile Ile Gln Thr Gly Ala Asp Ile Ala Leu Leu Glu
85 90 95
Leu Glu Glu Pro Val Asn Ile Ser Ser Arg Val His Thr Val Met Leu
100 105 110
Pro Pro Ala Ser Glu Thr Phe Pro Pro Gly Met Pro Cys Trp Val Thr
115 120 125
Gly Trp Gly Asp Val Asp Asn Asp Glu Pro Leu Ser Pro Pro Phe Pro
130 135 140
Leu Lys Gln Val Lys Val Pro Ile Met Glu Asn His Ile Cys Asp Ala
145 150 155 160
Lys Tyr His Leu Gly Ala Tyr Thr Gly Asp Asp Val Arg Ile Ile Arg
165 170 175
Asp Asp Met Leu Cys Ala Gly Asn Ser Gln Arg Asp Ser Cys Lys Gly
180 185 190
Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Lys Val Asn Gly Thr Trp Leu Gln
195 200 205
Ala Gly Val Val Ser Trp Asp Glu Gly Cys Ala Gln Pro Asn Arg Pro
210 215 220
Gly Ile Tyr Thr Arg Val Thr Tyr Tyr Leu Asp Trp Ile His His Tyr
225 230 235 240
Val Pro Lys Lys Pro Gly Asn Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
245 250 255
<210> 30
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 30
Phe Ser Leu Leu Arg Tyr
1 5
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 31
ctggtgtgca aggtgaatgg 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 32
aggtccagca ctcaggagga 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 33
gcaggtgagc ctgagagtcc 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 34
gggaccttca cctgcttcag 20
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 35
cagccagtga cccagcac 18
<210> 36
<211> 51
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<220>
<221> 混杂特征
<222> (26)..(26)
<223> n 是 g 或 a
<400> 36
ctgcaggcgg gcgtggtcag ctgggncgag ggctgtgccc agcccaaccg g 51
<210> 37
<211> 42
<212> DNA
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 37
cacacggtca ccctgccccc tgcctcagag accttccccc cc 42
<210> 38
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His Trp His Phe Ala Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 39
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 39
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 40
Gly Tyr Ser Trp Asn
1 5
<210> 41
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 41
Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 42
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 42
Gly Ser His Tyr Phe Gly His Trp His Phe Ala Val
1 5 10
<210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 43
Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn
1 5 10 15
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 44
Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser
1 5
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 45
Gln Gln Ser His Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5

Claims (190)

1.一种治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的方法,该患者已经鉴定为具有(i)包含处于或高于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数的基因型；或(ii)来自该患者的样品中处于或高于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平,该方法包含对具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者施用包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE+B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,蛋白酶活化的受体2(PAR2)拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法。
2.一种确定具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者是否很可能响应包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE+B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,蛋白酶活化的受体2(PAR2)拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法的方法,该方法包含:
(a)测定来自具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的样品中患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数；和
(b)基于该患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数将该患者鉴定为很可能响应包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE+B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法,其中处于或高于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数指示该患者具有升高的可能性是响应该疗法的。
3.一种确定具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者是否很可能响应包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE+B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,蛋白酶活化的受体2(PAR2)拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法的方法,该方法包含:
(a)测定来自具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平；和
(b)基于来自该患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平将该患者鉴定为很可能响应包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE+B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法,其中该样品中处于或高于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平指示该患者具有升高的可能性是响应该疗法的。
4.权利要求2或3的方法,进一步包含将该疗法施用于该患者。
5.权利要求1-4任一项的方法,其中该患者已经鉴定为具有来自该患者的样品中低于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平。
6.权利要求5的方法,其中作为单一疗法将该药剂施用于该患者。
7.权利要求1-4任一项的方法,其中该患者已经鉴定为具有来自该患者的样品中处于或高于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平。
8.权利要求7的方法,其中该方法进一步包含将另外的TH2途径抑制剂施用于该患者。
9.一种治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的方法,该患者已经鉴定为具有(i)包含低于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数的基因型；或(ii)来自该患者的样品中低于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平,该方法包含对具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者施用包含IgE拮抗剂或Fc厄普西隆受体(FcεR)拮抗剂的疗法。
10.一种确定具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者是否很可能响应包含IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的疗法的方法,该方法包含:
(a)测定来自具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的样品中患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数；和
(b)基于该患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数将该患者鉴定为很可能响应包含IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的疗法,其中低于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数指示该患者具有升高的可能性是响应该疗法的。
11.一种确定具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者是否很可能响应包含IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的疗法的方法,该方法包含:
(a)测定来自具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平；和
(b)基于来自该患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平将该患者鉴定为很可能响应包含IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的疗法,其中来自该患者的样品中低于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平指示该患者具有升高的可能性是响应该疗法的。
12.权利要求10或11的方法,进一步包含将该疗法施用于该患者。
13.权利要求10-12任一项的方法,其中该患者已经鉴定为具有来自该患者的样品中处于或高于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平。
14.权利要求13的方法,其中该方法进一步包含将另外的TH2途径抑制剂施用于该患者。
15.一种为具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者选择疗法的方法,该方法包含:
(a)测定来自具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的样品中该患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数；和
(b)为该患者选择:
(i)包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE+B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,蛋白酶活化的受体2(PAR2)拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法,如果该患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数处于或高于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的话,或
(ii)包含IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的疗法,如果该患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数低于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的话。
16.一种为具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者选择疗法的方法,该方法包含:
(a)测定来自具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平；和
(b)为该患者选择:
(i)包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE+B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,蛋白酶活化的受体2(PAR2)拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法,如果来自该患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平处于或高于类胰蛋白酶的参照水平的话,或
(ii)包含IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的疗法,如果来自该患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平低于类胰蛋白酶的参照水平的话。
17.权利要求15或16的方法,进一步包含将依照(b)选择的疗法施用于该患者。
18.权利要求15-17任一项的方法,其中该患者已经鉴定为具有来自该患者的样品中低于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平。
19.权利要求18的方法,其中作为单一疗法将该药剂施用于该患者。
20.权利要求15-17任一项的方法,其中该患者已经鉴定为具有来自该患者的样品中处于或高于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平,且该方法进一步包含选择包含TH2途径抑制剂的组合疗法。
21.权利要求20的方法,其中该方法进一步包含将TH2途径抑制剂施用于该患者。
22.一种用于评估具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者对用包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE+B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,蛋白酶活化的受体2(PAR2)拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法的治疗的响应的方法,该方法包含:
(a)测定在将包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE+B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法施用于具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者期间或之后的时间点来自该患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平；和
(b)基于该样品中类胰蛋白酶的表达水平与类胰蛋白酶的参照水平的比较维持,调节,或停止该治疗,
其中来自该患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平与参照水平相比的变化指示对用该疗法的治疗的响应。
23.权利要求22的方法,其中该变化是类胰蛋白酶的表达水平的升高且维持该治疗。
24.权利要求23的方法,其中该变化是类胰蛋白酶的表达水平的降低且调节或停止该治疗。
25.一种用于监测用包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE+B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,蛋白酶活化的受体2(PAR2)拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法治疗的具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的响应的方法,该方法包含:
(a)测定在将包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE+B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法施用于该患者期间或之后的时间点来自该患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平；和
(b)比较来自该患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平与类胰蛋白酶的参照水平,由此监测经历用该疗法的治疗的患者的响应。
26.权利要求25的方法,其中该变化是类胰蛋白酶的水平的升高且维持该治疗。
27.权利要求25的方法,其中该变化是类胰蛋白酶的表达水平的降低且调节或停止该治疗。
28.权利要求1,2,4-10,12-15,或17-21任一项的方法,其中该活性类胰蛋白酶等位基因计数是通过对该患者的基因组的TPSAB1和TPSB2基因座测序而测定的。
29.权利要求28的方法,其中该测序是Sanger测序或大量平行测序。
30.权利要求28或29的方法,其中通过包含下述步骤的方法对TPSAB1基因座测序:(i)在包含核苷酸序列5’-CTG GTG TGC AAG GTG AAT GG-3’(SEQ ID NO:31)的第一正向引物和包含核苷酸序列5’-AGG TCC AGC ACT CAG GAG GA-3’(SEQ ID NO:32)的第一反向引物存在下扩增来自该受试者的核酸以形成TPSAB1扩增子,和(ii)对该TPSAB1扩增子测序。
31.权利要求30的方法,其中对该TPSAB1扩增子测序包含使用该第一正向引物和该第一反向引物。
32.权利要求28-31任一项的方法,其中通过包含下述步骤的方法对TPSB2基因座测序:(i)在包含核苷酸序列5’-GCA GGT GAG CCT GAG AGT CC-3’(SEQ ID NO:33)的第二正向引物和包含核苷酸序列5’-GGG ACC TTC ACC TGC TTC AG-3’(SEQ ID NO:34)的第二反向引物存在下扩增来自该受试者的核酸以形成TPSB2扩增子,和(ii)对该TPSB2扩增子测序。
33.权利要求32的方法,其中对该TPSB2扩增子测序包含使用该第二正向引物和包含核苷酸序列5’-CAG CCA GTG ACC CAG CAC-3’(SEQ ID NO:35)的测序反向引物。
34.权利要求1,2,4-10,12-15,17-21,或28-33任一项的方法,其中该活性类胰蛋白酶等位基因计数是通过下述公式测定的:4–该患者的基因型中类胰蛋白酶α和类胰蛋白酶βIII移码(βIIIFS)等位基因的数目之和。
35.权利要求34的方法,其中类胰蛋白酶α是通过检测包含核苷酸序列CTGCAGGCGGGCGTGGTCAGCTGGG[G/A]CGAGGGCTGTGCCCAGCCCAACCGG(SEQ ID NO:36)的TPSAB1处的c733 G>A SNP而检测的,其中c733 G>A SNP处A的存在指示类胰蛋白酶α。
36.权利要求34或35的方法,其中类胰蛋白酶βIIIFS是通过检测包含核苷酸序列CACACGGTCACCCTGCCCCCTGCCTCAGAGACCTTCCCCCCC(SEQ ID NO:37)的TPSB2处的c980_981insC突变而检测的。
37.权利要求1,2,4-10,12-15,17-21,或28-36任一项的方法,其中该参照活性类胰蛋白酶等位基因计数是在一组具有该肥大细胞介导的炎性疾病的患者中测定的。
38.权利要求1,2,4-10,12-15,17-21,或28-37任一项的方法,其中该参照活性类胰蛋白酶等位基因计数是3。
39.权利要求1,2,4-8,15,18-21或28-38任一项的方法,其中该患者具有3或4的活性类胰蛋白酶等位基因计数。
40.权利要求9,10,12,15,18-21,或28-38任一项的方法,其中该患者具有0,1,或2的活性类胰蛋白酶等位基因计数。
41.权利要求1,3-9,11-14,或16-27任一项的方法,其中该类胰蛋白酶是类胰蛋白酶βI,类胰蛋白酶βII,类胰蛋白酶βIII,类胰蛋白酶αI,或其组合。
42.权利要求1,3-9,11-14,16-27,或41任一项的方法,其中该类胰蛋白酶的表达水平是蛋白质表达水平。
43.权利要求42的方法,其中该类胰蛋白酶的蛋白质表达水平是活性类胰蛋白酶的表达水平。
44.权利要求42的方法,其中该类胰蛋白酶的蛋白质表达水平是总类胰蛋白酶的表达水平。
45.权利要求42-44任一项的方法,其中该蛋白质表达水平是使用免疫测定法,酶联免疫吸附测定法(ELISA),Western印迹,或质谱术测定的。
46.权利要求1,3-9,11-14,16-27,或41任一项的方法,其中该类胰蛋白酶的表达水平是mRNA表达水平。
47.权利要求46的方法,其中该mRNA表达水平是使用聚合酶链式反应(PCR)方法或微阵列芯片测定的。
48.权利要求47的方法,其中该PCR方法是qPCR。
49.权利要求1,3-9,11-14,16-27,或41-48任一项的方法,其中该类胰蛋白酶的参照水平是在一组具有该肥大细胞介导的炎性疾病的个体中测定的水平。
50.权利要求49的方法,其中该类胰蛋白酶的参照水平是中值水平。
51.权利要求1-50任一项的方法,其中该来自患者的样品选自由血液样品,组织样品,痰样品,细支气管灌洗样品,粘膜衬里液(MLF)样品,支气管吸收样品,和鼻吸收样品组成的组。
52.权利要求51的方法,其中该血液样品是全血样品,血清样品,血浆样品,或其组合。
53.权利要求52的方法,其中该血液样品是血清样品或血浆样品。
54.权利要求1-8或15-53任一项的方法,其中该药剂是类胰蛋白酶拮抗剂。
55.权利要求54的方法,其中该类胰蛋白酶拮抗剂是类胰蛋白酶α拮抗剂或类胰蛋白酶β拮抗剂。
56.权利要求55的方法,其中该类胰蛋白酶拮抗剂是类胰蛋白酶β拮抗剂。
57.权利要求55或56的方法,其中该类胰蛋白酶β拮抗剂是抗类胰蛋白酶β抗体或其抗原结合片段。
58.权利要求57的方法,其中该抗体包含下述六种高变区(HVR):
(a)包含氨基酸序列DYGMV(SEQ ID NO:1)的HVR-H1；
(b)包含氨基酸序列FISSGSSTVYYADTMKG(SEQ ID NO:2)的HVR-H2；
(c)包含氨基酸序列RNYDDWYFDV(SEQ ID NO:3)的HVR-H3；
(d)包含氨基酸序列SASSSVTYMY(SEQ ID NO:4)的HVR-L1；
(e)包含氨基酸序列RTSDLAS(SEQ ID NO:5)的HVR-L2；和
(f)包含氨基酸序列QHYHSYPLT(SEQ ID NO:6)的HVR-L3。
59.权利要求57或58的方法,其中该抗体包含(a)包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少90％,至少95％,或至少99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变(VH)域；(b)包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少90％,至少95％,或至少99％同一性的氨基酸序列的轻链可变(VL)域；或(c)如(a)中的VH域和如(b)中的VL域。
60.权利要求59的方法,其中该VH域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
61.权利要求59的方法,其中该VL域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
62.权利要求59的方法,其中该VH域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列且该VL域包含SEQID NO:8的氨基酸序列。
63.权利要求57-62任一项的方法,其中该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链和(b)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链。
64.权利要求57-62任一项的方法,其中该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链和(b)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链。
65.权利要求57的方法,其中该抗体包含下述六种HVR:
(a)包含氨基酸序列GYAIT(SEQ ID NO:12)的HVR-H1；
(b)包含氨基酸序列GISSAATTFYSSWAKS(SEQ ID NO:13)的HVR-H2；
(c)包含氨基酸序列DPRGYGAALDRLDL(SEQ ID NO:14)的HVR-H3；
(d)包含氨基酸序列QSIKSVYNNRLG(SEQ ID NO:15)的HVR-L1；
(e)包含氨基酸序列ETSILTS(SEQ ID NO:16)的HVR-L2；和
(f)包含氨基酸序列AGGFDRSGDTT(SEQ ID NO:17)的HVR-L3。
66.权利要求57或65的方法,其中该抗体包含(a)包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少90％,至少95％,或至少99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变(VH)域；(b)包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少90％,至少95％,或至少99％同一性的氨基酸序列的轻链可变(VL)域；或(c)如(a)中的VH域和如(b)中的VL域。
67.权利要求66的方法,其中该VH域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
68.权利要求66的方法,其中该VL域包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
69.权利要求66的方法,其中该VH域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列且该VL域包含SEQID NO:19的氨基酸序列。
70.权利要求57或65-69任一项的方法,其中该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链和(b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链。
71.权利要求57或65-69任一项的方法,其中该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链和(b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链。
72.权利要求54-71任一项的方法,其中该疗法进一步包含IgE拮抗剂。
73.权利要求9-21或28-53任一项的方法,其中该药剂是FcεR拮抗剂。
74.权利要求73的方法,其中该FcεR拮抗剂是Bruton氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂。
75.权利要求74的方法,其中该BTK抑制剂是GDC-0853,阿卡替尼,GS-4059,spebrutinib,BGB-3111,或HM71224。
76.权利要求1-8或15-53任一项的方法,其中该药剂是IgE+B细胞消减性抗体。
77.权利要求76的方法,其中该IgE+B细胞消减性抗体是抗M1’域抗体。
78.权利要求1-8或15-53任一项的方法,其中该药剂是肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体。
79.权利要求1-8或15-53任一项的方法,其中该药剂是PAR2拮抗剂。
80.权利要求9-21或28-53任一项的方法,其中该药剂是IgE拮抗剂。
81.权利要求72或80的方法,其中该IgE拮抗剂是抗IgE抗体。
82.权利要求81的方法,其中该抗IgE抗体是IgE阻断性抗体和/或IgE消减性抗体。
83.权利要求82的方法,其中该抗IgE抗体包含下述六种HVR:
(a)包含氨基酸序列GYSWN(SEQ ID NO:40)的HVR-H1；
(b)包含氨基酸序列SITYDGSTNYNPSVKG(SEQ ID NO:41)的HVR-H2；
(c)包含氨基酸序列GSHYFGHWHFAV(SEQ ID NO:42)的HVR-H3；
(d)包含氨基酸序列RASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:43)的HVR-L1；
(e)包含氨基酸序列AASYLES(SEQ ID NO:44)的HVR-L2；和
(f)包含氨基酸序列QQSHEDPYT(SEQ ID NO:45)的HVR-L3。
84.权利要求82或83的方法,其中该抗IgE抗体包含(a)包含与SEQ ID NO:38的氨基酸序列具有至少90％,至少95％,或至少99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变(VH)域；(b)包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列具有至少90％,至少95％,或至少99％同一性的氨基酸序列的轻链可变(VL)域；或(c)如(a)中的VH域和如(b)中的VL域。
85.权利要求84的方法,其中该VH域包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
86.权利要求84的方法,其中该VL域包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
87.权利要求84的方法,其中该VH域包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列且该VL域包含SEQID NO:39的氨基酸序列。
88.权利要求81-87任一项的方法,其中该抗IgE抗体是奥马珠单抗
Figure FDA0002598124600000091
或XmAb7195。
89.权利要求88的方法,其中该抗IgE抗体是奥马珠单抗
Figure FDA0002598124600000101
90.权利要求5-8,13,14,18-21,或28-89任一项的方法,其中该2型生物标志物是TH2细胞相关细胞因子,骨膜素,嗜曙红细胞计数,嗜曙红细胞签名,FeNO,或IgE。
91.权利要求90的方法,其中该TH2细胞相关细胞因子是IL-13,IL-4,IL-9,或IL-5。
92.权利要求5-8,13,14,18-21,或28-91任一项的方法,其中该TH2途径抑制剂抑制白介素-2可诱导T细胞激酶(ITK),Bruton氏酪氨酸激酶(BTK),Janus激酶1(JAK1),GATA结合蛋白3(GATA3),IL-9,IL-5,IL-13,IL-4,IL-33,OX40L,TSLP,IL-25,IL-9受体,IL-5受体,IL-4受体α,IL-13受体α1,IL-13受体α2,OX40,TSLP-R,IL-7Rα,IL-17RB,ST2,CCR3,CCR4,CRTH2,Flap,Syk激酶；CCR4,TLR9,或GM-CSF。
93.权利要求1,4-9,12-14,或17-92任一项的方法,进一步包含将另外的治疗剂施用于该患者。
94.权利要求93的方法,其中该另外的治疗剂选自由皮质类固醇,IL-33轴结合拮抗剂,TRPA1拮抗剂,支气管扩张剂或哮喘症状控制药疗,免疫调控剂,酪氨酸激酶抑制剂,和磷酸二酯酶抑制剂组成的组。
95.权利要求94的方法,其中该另外的治疗剂是皮质类固醇。
96.权利要求94或95的方法,其中该皮质类固醇是吸入式皮质类固醇。
97.权利要求1-96任一项的方法,其中该肥大细胞介导的炎性疾病选自由哮喘,特应性皮炎,慢性自发性荨麻疹(CSU),系统性过敏反应,肥大细胞增多症,慢性阻塞性肺病(COPD),特发性肺纤维化(IPF),和嗜曙红细胞性食管炎组成的组。
98.权利要求97的方法,其中该肥大细胞介导的炎性疾病是哮喘。
99.权利要求98的方法,其中该哮喘是中度至重度哮喘。
100.权利要求97-99任一项的方法,其中该哮喘不受皮质类固醇控制。
101.权利要求97-100任一项的方法,其中该哮喘是TH2高哮喘或TH2低哮喘。
102.一种用于鉴定很可能响应包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE+B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,蛋白酶活化的受体2(PAR2)拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法的具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的试剂盒,该试剂盒包含:
(a)用于测定该患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数或用于测定来自该患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平的试剂；和,任选地,
(b)关于使用该试剂来鉴定很可能响应包含选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE+B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,PAR2拮抗剂,和其组合组成的组的药剂的疗法的具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的说明书。
103.权利要求102的试剂盒,其中该药剂是类胰蛋白酶拮抗剂,且该疗法进一步包含IgE拮抗剂。
104.一种用于鉴定很可能响应包含IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的疗法的具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的试剂盒,该试剂盒包含:
(a)用于测定该患者的活性类胰蛋白酶等位基因计数或用于测定来自该患者的样品中类胰蛋白酶的表达水平的试剂；和,任选地,
(b)关于使用该试剂来鉴定很可能响应包含IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的疗法的具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的说明书。
105.权利要求102-104任一项的试剂盒,进一步包含用于测定来自该患者的样品中2型生物标志物的水平的试剂。
106.供治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的方法中使用的选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE+B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,蛋白酶活化的受体2(PAR2)拮抗剂,和其组合组成的组的药剂,其中
(i)该患者的基因型已经测定为包含处于或高于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数；或
(ii)来自该患者的样品已经测定为具有处于或高于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平。
107.权利要求106的供使用的药剂,其中该患者已经测定为具有来自该患者的样品中低于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平,且该药剂供作为单一疗法使用。
108.权利要求106的供使用的药剂,其中该患者已经鉴定为具有来自该患者的样品中处于或高于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平,且该药剂供与TH2途径抑制剂组合使用。
109.供治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的方法中使用的选自IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂的药剂,其中
(i)该患者的基因型已经测定为包含低于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数；或
(ii)来自该患者的样品已经测定为具有低于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平。
110.权利要求109的供使用的药剂,其中该患者已经测定为具有来自该患者的样品中处于或高于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平,且该IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂供与另外的TH2途径抑制剂组合使用。
111.权利要求106-110任一项的供使用的药剂,其中该活性类胰蛋白酶等位基因计数是通过对该患者的基因组的TPSAB1和TPSB2基因座测序而测定的。
112.权利要求111的供使用的药剂,其中该测序是Sanger测序或大量平行测序。
113.权利要求111或112的供使用的药剂,其中通过包含下述步骤的方法对TPSAB1基因座测序:(i)在包含核苷酸序列5’-CTG GTG TGC AAG GTG AAT GG-3’(SEQ ID NO:31)的第一正向引物和包含核苷酸序列5’-AGG TCC AGC ACT CAG GAG GA-3’(SEQ ID NO:32)的第一反向引物存在下扩增来自该受试者的核酸以形成TPSAB1扩增子,和(ii)对该TPSAB1扩增子测序。
114.权利要求113的供使用的药剂,其中对该TPSAB1扩增子测序包含使用该第一正向引物和该第一反向引物。
115.权利要求111-114任一项的供使用的药剂,其中通过包含下述步骤的方法对该TPSB2基因座测序:(i)在包含核苷酸序列5’-GCA GGT GAG CCT GAG AGT CC-3’(SEQ IDNO:33)的第二正向引物和包含核苷酸序列5’-GGG ACC TTC ACC TGC TTC AG-3’(SEQ IDNO:34)的第二反向引物存在下扩增来自该受试者的核酸以形成TPSB2扩增子,和(ii)对该TPSB2扩增子测序。
116.权利要求115的供使用的药剂,其中对该TPSB2扩增子测序包含使用该第二正向引物和包含核苷酸序列5’-CAG CCA GTG ACC CAG CAC-3’(SEQ ID NO:35)的测序反向引物。
117.权利要求106-116任一项的供使用的药剂,其中该活性类胰蛋白酶等位基因计数是通过下述公式测定的:4–该患者的基因型中类胰蛋白酶α和类胰蛋白酶βIII移码(βIIIFS)等位基因的数目之和。
118.权利要求117的供使用的药剂,其中类胰蛋白酶α是通过检测包含核苷酸序列CTGCAGGCGGGCGTGGTCAGCTGGG[G/A]CGAGGGCTGTGCCCAGCCCAACCGG(SEQ ID NO:36)的TPSAB1处的c733 G>A SNP而检测的,其中c733 G>A SNP处A的存在指示类胰蛋白酶α。
119.权利要求117或118的供使用的药剂,其中类胰蛋白酶βIIIFS是通过检测包含核苷酸序列CACACGGTCACCCTGCCCCCTGCCTCAGAGACCTTCCCCCCC(SEQ ID NO:37)的TPSB2处的c980_981insC突变而检测的。
120.权利要求106-119任一项的供使用的药剂,其中该参照活性类胰蛋白酶等位基因计数是在一组具有该肥大细胞介导的炎性疾病的患者中测定的。
121.权利要求106-120任一项的供使用的药剂,其中该参照活性类胰蛋白酶等位基因计数是3。
122.权利要求106-121任一项的供使用的药剂,其中该患者具有3或4的活性类胰蛋白酶等位基因计数。
123.权利要求106-121任一项的供使用的药剂,其中该患者具有0,1,或2的活性类胰蛋白酶等位基因计数。
124.权利要求106-123任一项的供使用的药剂,其中该类胰蛋白酶是类胰蛋白酶βI,类胰蛋白酶βII,类胰蛋白酶βIII,类胰蛋白酶αI,或其组合。
125.权利要求106-124任一项的供使用的药剂,其中该类胰蛋白酶的表达水平是蛋白质表达水平。
126.权利要求125的供使用的药剂,其中该类胰蛋白酶的蛋白质表达水平是活性类胰蛋白酶的表达水平。
127.权利要求125的供使用的药剂,其中该类胰蛋白酶的蛋白质表达水平是总类胰蛋白酶的表达水平。
128.权利要求125-127任一项的供使用的药剂,其中该蛋白质表达水平是使用免疫测定法,酶联免疫吸附测定法(ELISA),Western印迹,或质谱术测定的。
129.权利要求106-124任一项的供使用的药剂,其中该类胰蛋白酶的表达水平是mRNA表达水平。
130.权利要求129的供使用的药剂,其中该mRNA表达水平是使用聚合酶链式反应(PCR)方法或微阵列芯片测定的。
131.权利要求130的供使用的药剂,其中该PCR方法是qPCR。
132.权利要求106-131任一项的供使用的药剂,其中该类胰蛋白酶的参照水平是在一组具有该肥大细胞介导的炎性疾病的个体中测定的水平。
133.权利要求132的供使用的药剂,其中该类胰蛋白酶的参照水平是中值水平。
134.权利要求106-133任一项的供使用的药剂,其中该来自患者的样品选自由血液样品,组织样品,痰样品,细支气管灌洗样品,粘膜衬里液(MLF)样品,支气管吸收样品,和鼻吸收样品组成的组。
135.权利要求134的供使用的药剂,其中该血液样品是全血样品,血清样品,血浆样品,或其组合。
136.权利要求135的供使用的药剂,其中该血液样品是血清样品或血浆样品。
137.权利要求106-108或111-136任一项的供使用的药剂,其中该药剂是类胰蛋白酶拮抗剂。
138.权利要求137的供使用的药剂,其中该类胰蛋白酶拮抗剂是类胰蛋白酶α拮抗剂或类胰蛋白酶β拮抗剂。
139.权利要求138的供使用的药剂,其中该类胰蛋白酶拮抗剂是类胰蛋白酶β拮抗剂。
140.权利要求138或139的供使用的药剂,其中该类胰蛋白酶β拮抗剂是抗类胰蛋白酶β抗体或其抗原结合片段。
141.权利要求140的供使用的药剂,其中该抗体包含下述六种高变区(HVR):
(a)包含氨基酸序列DYGMV(SEQ ID NO:1)的HVR-H1；
(b)包含氨基酸序列FISSGSSTVYYADTMKG(SEQ ID NO:2)的HVR-H2；
(c)含氨基酸序列RNYDDWYFDV(SEQ ID NO:3)的HVR-H3；
(d)包含氨基酸序列SASSSVTYMY(SEQ ID NO:4)的HVR-L1；
(e)包含氨基酸序列RTSDLAS(SEQ ID NO:5)的HVR-L2；和
(f)包含氨基酸序列QHYHSYPLT(SEQ ID NO:6)的HVR-L3。
142.权利要求140或141的供使用的药剂,其中该抗体包含(a)包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少90％,至少95％,或至少99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变(VH)域；(b)包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有至少90％,至少95％,或至少99％同一性的氨基酸序列的轻链可变(VL)域；或(c)如(a)中的VH域和如(b)中的VL域。
143.权利要求142的供使用的药剂,其中该VH域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
144.权利要求142的供使用的药剂,其中该VL域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
145.权利要求142的供使用的药剂,其中该VH域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列且该VL域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
146.权利要求140-145任一项的供使用的药剂,其中该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链和(b)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链。
147.权利要求140-145任一项的供使用的药剂,其中该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链和(b)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链。
148.权利要求140的供使用的药剂,其中该抗体包含下述六种HVR:
(a)包含氨基酸序列GYAIT(SEQ ID NO:12)的HVR-H1；
(b)包含氨基酸序列GISSAATTFYSSWAKS(SEQ ID NO:13)的HVR-H2；
(c)包含氨基酸序列DPRGYGAALDRLDL(SEQ ID NO:14)的HVR-H3；
(d)包含氨基酸序列QSIKSVYNNRLG(SEQ ID NO:15)的HVR-L1；
(e)包含氨基酸序列ETSILTS(SEQ ID NO:16)的HVR-L2；和
(f)包含氨基酸序列AGGFDRSGDTT(SEQ ID NO:17)的HVR-L3。
149.权利要求140或148的供使用的药剂,其中该抗体包含(a)包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少90％,至少95％,或至少99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变(VH)域；(b)包含与SEQ ID NO:19的氨基酸序列具有至少90％,至少95％,或至少99％同一性的氨基酸序列的轻链可变(VL)域；或(c)如(a)中的VH域和如(b)中的VL域。
150.权利要求149的供使用的药剂,其中该VH域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
151.权利要求149的供使用的药剂,其中该VL域包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
152.权利要求149的供使用的药剂,其中该VH域包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列且该VL域包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。
153.权利要求140或148-152任一项的供使用的药剂,其中该抗体包含(a)包含SEQ IDNO:20的氨基酸序列的重链和(b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链。
154.权利要求140或148-152任一项的供使用的药剂,其中该抗体包含(a)包含SEQ IDNO:22的氨基酸序列的重链和(b)包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链。
155.权利要求137-154任一项的供使用的药剂,其中该类胰蛋白酶拮抗剂要与IgE拮抗剂组合施用。
156.权利要求109-136任一项的供使用的药剂,其中该药剂是FcεR拮抗剂。
157.权利要求156的供使用的药剂,其中该FcεR拮抗剂是Bruton氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂。
158.权利要求157的供使用的药剂,其中该BTK抑制剂是GDC-0853,阿卡替尼,GS-4059,spebrutinib,BGB-3111,或HM71224。
159.权利要求106-108或111-136任一项的供使用的药剂,其中该药剂是IgE+B细胞消减性抗体。
160.权利要求159的供使用的药剂,其中该IgE+B细胞消减性抗体是抗M1’域抗体。
161.权利要求106-108或111-136任一项的供使用的药剂,其中该药剂是肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体。
162.权利要求106-108或111-136任一项的供使用的药剂,其中该药剂是PAR2拮抗剂。
163.权利要求109-136任一项的供使用的药剂,其中该药剂是IgE拮抗剂。
164.权利要求155或163的供使用的药剂,其中该IgE拮抗剂是抗IgE抗体。
165.权利要求164的供使用的药剂,其中该抗IgE抗体是IgE阻断性抗体和/或IgE消减性抗体。
166.权利要求165的供使用的药剂,其中该抗IgE抗体包含下述六种HVR:
(a)包含氨基酸序列GYSWN(SEQ ID NO:40)的HVR-H1；
(b)包含氨基酸序列SITYDGSTNYNPSVKG(SEQ ID NO:41)的HVR-H2；
(c)包含氨基酸序列GSHYFGHWHFAV(SEQ ID NO:42)的HVR-H3；
(d)包含氨基酸序列RASQSVDYDGDSYMN(SEQ ID NO:43)的HVR-L1；
(e)包含氨基酸序列AASYLES(SEQ ID NO:44)的HVR-L2；和
(f)包含氨基酸序列QQSHEDPYT(SEQ ID NO:45)的HVR-L3。
167.权利要求165或166的供使用的药剂,其中该抗IgE抗体包含(a)包含与SEQ ID NO:38的氨基酸序列具有至少90％,至少95％,或至少99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变(VH)域；(b)包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列具有至少90％,至少95％,或至少99％同一性的氨基酸序列的轻链可变(VL)域；或(c)如(a)中的VH域和如(b)中的VL域。
168.权利要求167的供使用的药剂,其中该VH域包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。
169.权利要求167的供使用的药剂,其中该VL域包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
170.权利要求167的供使用的药剂,其中该VH域包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列且该VL域包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。
171.权利要求164-170任一项的供使用的药剂,其中该抗IgE抗体是奥马珠单抗
Figure FDA0002598124600000171
或XmAb7195。
172.权利要求171的供使用的药剂,其中该抗IgE抗体是奥马珠单抗
Figure FDA0002598124600000172
173.权利要求107,108,或110-172任一项的供使用的药剂,其中该2型生物标志物是TH2细胞相关细胞因子,骨膜素,嗜曙红细胞计数,嗜曙红细胞签名,FeNO,或IgE。
174.权利要求173的供使用的药剂,其中该TH2细胞相关细胞因子是IL-13,IL-4,IL-9,或IL-5。
175.权利要求107,108,或110-174任一项的供使用的药剂,其中该TH2途径抑制剂抑制白介素-2可诱导T细胞激酶(ITK),Bruton氏酪氨酸激酶(BTK),Janus激酶1(JAK1),GATA结合蛋白3(GATA3),IL-9,IL-5,IL-13,IL-4,IL-33,OX40L,TSLP,IL-25,IL-9受体,IL-5受体,IL-4受体α,IL-13受体α1,IL-13受体α2,OX40,TSLP-R,IL-7Rα,IL-17RB,ST2,CCR3,CCR4,CRTH2,Flap,Syk激酶；CCR4,TLR9,或GM-CSF。
176.权利要求106-175任一项的供使用的药剂,其中配制该药剂或组合供与另外的治疗剂一起施用。
177.权利要求176的供使用的药剂,其中该另外的治疗剂选自由皮质类固醇,IL-33轴结合拮抗剂,TRPA1拮抗剂,支气管扩张剂或哮喘症状控制药疗,免疫调控剂,酪氨酸激酶抑制剂,和磷酸二酯酶抑制剂组成的组。
178.权利要求177的供使用的药剂,其中该另外的治疗剂是皮质类固醇。
179.权利要求177或178的供使用的药剂,其中该皮质类固醇是吸入式皮质类固醇。
180.权利要求106-179任一项的供使用的药剂,其中该肥大细胞介导的炎性疾病选自由哮喘,特应性皮炎,慢性自发性荨麻疹(CSU),系统性过敏反应,肥大细胞增多症,慢性阻塞性肺病(COPD),特发性肺纤维化(IPF),和嗜曙红细胞性食管炎组成的组。
181.权利要求180的供使用的药剂,其中该肥大细胞介导的炎性疾病是哮喘。
182.权利要求181的供使用的药剂,其中该哮喘是中度至重度哮喘。
183.权利要求180-182任一项的供使用的药剂,其中该哮喘不受皮质类固醇控制。
184.权利要求180-183任一项的供使用的药剂,其中该哮喘是TH2高哮喘或TH2低哮喘。
185.选自由类胰蛋白酶拮抗剂,IgE+B细胞消减性抗体,肥大细胞或嗜碱性细胞消减性抗体,蛋白酶活化的受体2(PAR2)拮抗剂,和其组合组成的组的药剂在制造用于治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的药物中的用途,其中
(i)该患者的基因型已经测定为包含处于或高于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数；或
(ii)来自该患者的样品已经测定为具有处于或高于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平。
186.权利要求185的用途,其中该药剂是类胰蛋白酶拮抗剂,且配制该药物供与IgE拮抗剂一起施用。
187.权利要求185或186的用途,其中该患者已经测定为具有来自该患者的样品中低于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平,且该药剂供作为单一疗法使用。
188.权利要求185或186的用途,其中该患者已经鉴定为具有来自该患者的样品中处于或高于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平,且该药剂供与TH2途径抑制剂组合使用。
189.IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂在制造用于治疗具有肥大细胞介导的炎性疾病的患者的药物中的用途,其中
(i)该患者的基因型已经测定为包含低于参照活性类胰蛋白酶等位基因计数的活性类胰蛋白酶等位基因计数；或
(ii)来自该患者的样品已经测定为具有低于类胰蛋白酶的参照水平的类胰蛋白酶的表达水平。
190.权利要求189的用途,其中该患者已经测定为具有来自该患者的样品中处于或高于2型生物标志物的参照水平的该2型生物标志物的水平,且该IgE拮抗剂或FcεR拮抗剂供与另外的TH2途径抑制剂组合使用。
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