WO2014017570A1 - 変形性関節症予防又は治療用組成物 - Google Patents

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WO2014017570A1
WO2014017570A1 PCT/JP2013/070134 JP2013070134W WO2014017570A1 WO 2014017570 A1 WO2014017570 A1 WO 2014017570A1 JP 2013070134 W JP2013070134 W JP 2013070134W WO 2014017570 A1 WO2014017570 A1 WO 2014017570A1
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WO
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cartilage
fish cartilage
molecular weight
proteoglycan
amount
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PCT/JP2013/070134
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French (fr)
Inventor
陽治 加藤
脇谷　滋之
友香子 花田
山本　和司
Original Assignee
国立大学法人弘前大学
株式会社脇谷メディカルサイエンス
サンスター株式会社
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Priority to JP2014526987A priority patent/JP6218732B2/ja
Priority to SG11201500211PA priority patent/SG11201500211PA/en
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1706—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from fish
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K35/60—Fish, e.g. seahorses; Fish eggs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing or treating osteoarthritis.
  • Osteoarthritis is a joint disease associated with chronic arthritis, and is a disease that causes destruction of cartilage and proliferative changes in bone and cartilage due to degenerative degeneration of joint components. Especially for knee osteoarthritis, it is estimated that the number of affected individuals on X-ray diagnosis is about 25 million, of which more than 8 million feel pain.
  • An object of the present invention is to provide means for preventing or treating osteoarthritis.
  • the present inventors have surprisingly found that high molecular weight proteoglycans are useful for the prevention or treatment of osteoarthritis, and have further improved the present invention.
  • Item 4 The fish cartilage water extract according to any one of Items 1 to 3, wherein the fish cartilage water extract is a fish cartilage water extract in which 7% by mass or more of uronic acid is derived from proteoglycan having a molecular weight of 5 million or more. Composition. Item 5. Item 5. The composition according to any one of Items 1 to 4, wherein the fish cartilage water extract is a fish cartilage hot water extract. Item 6. Item 6. The composition for preventing or treating osteoarthritis according to any one of Items 1 to 5, wherein the fish cartilage is salmon cartilage or trout cartilage.
  • osteoarthritis can be prevented or treated by ingestion.
  • FIG. 1 It is a photograph of a frozen salmon nasal cartilage block.
  • the mass placed in the center of the plastic container is a frozen salmon nasal cartilage block.
  • the uronic acid amount chromatogram and the 280 nm protein amount chromatogram of the fish cartilage water extract (lyophilized product: sample 1) containing high molecular weight proteoglycan are shown.
  • the uronic acid amount chromatogram and the 280 nm protein amount chromatogram of a commercially available proteoglycan are shown.
  • the outline of a test sample administration schedule with respect to an osteoarthritis model mouse is shown.
  • mouth which each test sample was administered is shown.
  • a compound in which glycosaminoglycan is bound to a protein in a comb tooth shape is also called a proteoglycan monomer (the protein in the proteoglycan monomer is called a core protein). Particularly in vivo, it is considered that this proteoglycan monomer forms an aggregate bound to hyaluronic acid via a link protein, and the aggregate is also called a proteoglycan aggregate.
  • proteoglycan as used herein is used to encompass proteoglycan monomers and proteoglycan aggregates.
  • Hyaluronic acid is a kind of glycosaminoglycan.
  • composition for preventing or treating osteoarthritis of the present invention contains a fish cartilage extract containing high molecular weight proteoglycan.
  • the fish cartilage water extract contained in the osteoarthritis prevention or treatment composition of the present invention contains a high molecular weight proteoglycan.
  • the high molecular weight proteoglycan referred to in the present specification is specifically a proteoglycan having a molecular weight of 1.8 million or more, and preferably has a molecular weight of 2.5 million or more, 3 million or more, 4 million or more, 5 million or more, 6 million or more, 7 million or more. 8 million or more, 9 million or more, 10 million or more, 11 million or more, 12 million or more, 14 million or more, 15 million or more, 16 million or more, 17 million or more, 18 million or more, 19 million or more, or More than 20 million proteoglycans.
  • a higher molecular weight is preferable, and a molecular weight of 5 million or more is particularly preferable.
  • the fish cartilage water extract is treated by gel filtration chromatography under the following conditions, and the amount of uronic acid (reflecting the amount of proteoglycan) contained in each obtained fraction is quantified by the carbazole sulfate method, and the chromatogram based on the amount of uronic acid is used. By making a gram, it is possible to confirm the presence of proteoglycans having a molecular weight or more. Such a chromatogram based on the amount of uronic acid may be hereinafter referred to as “uronic acid amount chromatogram”.
  • the amount of contained protein can be converted into a relative value (that is, a value reflecting the amount of contained protein), and a chromatogram based on the absorbance can be drawn.
  • a chromatogram may be referred to as a “280 nm protein amount chromatogram”.
  • Sepharose CL-2B is 2% cross-linked agarose, particle size 60-200 ⁇ m (by laser diffraction scattering method), CAS Registry Number 65099-79-8.)
  • Buffer 0.1M phosphate buffer (pH 7.1, containing 0.2M NaCl)
  • Apply sample amount Fish cartilage water extract 4mg (dry mass conversion) (used by dissolving in 1mL buffer)
  • Flow rate 0.15mL / min
  • Fraction fraction 1mL / tube
  • Molecular weight calibration curve The following various dextran molecular weight markers were subjected to gel filtration chromatography under the same conditions as described above, and the absorbance of each fraction (reflecting the amount of dextran) by the phenol / sulfuric acid method, which is a well-known method for sugar detection.
  • the fraction from which each marker was eluted refers to the fraction from which each marker was eluted most. In other words, it is the fraction corresponding to the peak top in the chromatogram reflecting the amount of dextran when each dextran molecular weight marker is gel filtered.
  • ⁇ Dextran molecular weight marker> Dextran from Leuconostoc mesenteroides (mol wt 5,000,000-40,000,000) (SIGMA): for measuring void volume of columns, 20000 kDa Dextran Standard 1,400,000 (SIGMA) ⁇ ⁇ ⁇ 1400kDa Dextran Standard 670,000 (SIGMA) ⁇ ⁇ ⁇ 670kDa Dextran Standard 410,000 (SIGMA) ⁇ ⁇ ⁇ 410kDa Dextran Standard 270,000 (SIGMA) ⁇ ⁇ ⁇ 270kDa
  • SIGMA Leuconostoc mesenteroides
  • the pretreatment is performed by eluting Dextran from Leuconostoc mesenteroides itself according to the above [gel filtration chromatography conditions], collecting molecules having a molecular weight of 20,000 kDa or more, and freeze-drying them. Specifically, in the chromatogram reflecting the amount of dextran, which was created by measuring the absorbance of each fraction by the phenol / sulfuric acid method, the fraction corresponding to the peak that first appeared was collected and freeze-dried (this Can be used to recover and freeze-dry molecules with a molecular weight of 20,000 kDa or more). This freeze-dried product is actually used as a marker (for measuring void volume of the column).
  • the absorbance measurement for obtaining a chromatogram reflecting the amount of dextran follows the method (phenol-sulfuric acid method) described in Hodge, JE and Hookter, B. T., Method in Carbohydrate Chemistry, 1, 338 (1962). Specifically, this is performed as follows. [1] Add 500 ⁇ L of the sample aqueous solution to a 105 ⁇ 15 mm test tube. [2] Add 500 ⁇ L of a phenol reagent (5 v / v% aqueous phenol solution) and stir. [3] Add 2.5 mL of concentrated sulfuric acid and immediately stir vigorously for 10 seconds. [4] Leave at room temperature for 20 minutes or more. [5] The absorption at 490 nm is measured with a spectrophotometer.
  • the carbazole sulfate method is a method in which a carbazole solution, which is a coloring pigment of uronic acid (glucuronic acid (GlcA), iduronic acid, etc.), is added to a measurement sample, and the absorbance is measured using a spectrophotometer.
  • a carbazole solution which is a coloring pigment of uronic acid (glucuronic acid (GlcA), iduronic acid, etc.)
  • GlcA glucuronic acid
  • iduronic acid iduronic acid
  • This is a well-known method for calculating the amount of uronic acid.
  • a calibration curve is prepared using a standard solution of glucuronic acid with a defined concentration, and the glucuronic acid content in the sample is determined. More specifically, this is performed as follows. 2.5 mL of a reagent prepared by dissolving 0.95 g of sodium borate decahydrate in 100 mL of concentrated sulfuric acid is placed in a test tube and cooled on
  • the total amount of uronic acid (quantified by carbazole sulfate method) contained in the fish cartilage extract of the present invention in terms of dry mass 10% by mass or more is preferably derived from proteoglycan having a molecular weight of 1.8 million or more.
  • the amount of uronic acid contained in a proteoglycan having a molecular weight of 1.8 million or more in terms of dry mass is preferably 10% by mass or more of the total amount of uronic acid contained in the extract. .
  • the amount of uronic acid contained in proteoglycan having a molecular weight of 5 million or more in terms of dry mass is preferably 7% by mass or more of the total amount of uronic acid contained in the extract. More preferably, it is 10 mass% or more, 13 mass% or more, 16 mass% or more, 20 mass% or more, 24 mass% or more, 27 mass% or more, 30 mass% or more, 34 mass% or more, or 37 mass% or more. is there. The larger the ratio, the better.
  • the proportion of the uronic acid contained in the proteoglycan having a specific molecular weight (assumed to be X) or more occupies the total amount of uronic acid contained in the extract is determined from the peak area of the uronic acid chromatogram described above. Can be sought. Specifically, an area ratio occupied by uronic acid having a molecular weight of X or more may be obtained with respect to the entire peak area of the uronic acid amount chromatogram. More specifically, the vertical axis represents the amount of uronic acid, and the horizontal axis represents fraction No.
  • a perpendicular line is drawn so as to pass through a fraction containing a proteoglycan having a molecular weight of X, and the area of the peak part containing a proteoglycan having a higher molecular weight is divided into the peak parts divided by the perpendicular line. What percentage of the area should be calculated.
  • the uronic acid contained in the fish cartilage extract of the present invention is assumed to be contained in a sugar chain separated from proteoglycan in addition to that contained in proteoglycan.
  • the amount of uronic acid (measured by the carbazole sulfate method) contained in the fish cartilage water extract of the present invention is preferably 5% by mass or more, more preferably 7.5% by mass or more, in terms of dry mass. More preferably, it is 10% by mass or more, still more preferably 12.5% by mass or more, still more preferably 15% by mass or more, and particularly preferably 17.5% by mass or more.
  • GlcA which is an abbreviation for glucuronic acid, may be expressed as “GlcA ( ⁇ g)” or the like when indicating the amount of uronic acid.
  • the glycosaminoglycan in the proteoglycan contained in the fish cartilage water extract is considered to be almost chondroitin sulfate. It is known that the approximate amount of chondroitin sulfate can be obtained by multiplying the amount of uronic acid by a factor of 2.593. Therefore, the approximate amount of proteoglycan contained in the fish cartilage water extract of the present invention can be calculated by multiplying the amount of uronic acid by a coefficient of 2.593.
  • the fish cartilage water extract of the present invention is extracted from fish cartilage (fish cartilage).
  • fish of the Salmonidae family is preferable, and specific examples include trout (caraft trout, cherry trout, salmon trout, etc.), salmon (white salmon, sockeye salmon, coho salmon, trout salmon, steel head, etc.) and the like. Sharks, cod, etc. can also be used. Salmon or trout is particularly preferable.
  • the cartilage is not particularly limited, but head cartilage, particularly nasal cartilage is preferable. In addition, since the head is usually discarded when fish (especially salmon and trout) is processed into food products and the like, there is an advantage that the cost of obtaining the head cartilage is low and that it can be stably supplied in large quantities.
  • Fish cartilage may be subjected to extraction as it is from cartilage collected from a living body, or may be subjected to extraction after being refined (more specifically, fragmented or powdered). Further, as described below, the fish cartilage may be degreased using an organic solvent such as ethanol before extraction. In this way, proteoglycans (including high molecular weight proteoglycans) can be extracted with water. Alternatively, when performing water extraction, a fish cartilage water extract that is more effective can be obtained by heating the water or using hot water or boiling water.
  • fish cartilage can be directly extracted from cartilage collected from a living body. It is preferable to store frozen until it is used for extraction.
  • the freezing method is not particularly limited, and a known freezing method can be used. For example, a method of storing fish cartilage at about ⁇ 20 to ⁇ 80 ° C. for about 24 to 72 hours using a freezer can be exemplified. Fish cartilage that has been degreased (ie, fat removed) can also be used. Use of the degreased product is preferable in that a highly purified fish cartilage water extract with less lipid contamination can be obtained. Examples of the degreasing method include a method of obtaining “degreased fish cartilage” described below.
  • the fragmented fish cartilage is a fragment of fish cartilage.
  • the fragmentation can be performed by a known method.
  • fish cartilage preferably frozen fish cartilage
  • the fragmentation operation is preferably performed at as low a temperature as possible.
  • it is preferable that the fragmented fish cartilage has a temperature at which it can be kept frozen. Specifically, 0 degreeC or less can be illustrated.
  • the fragmented fish cartilage is preferably frozen fragmented fish cartilage (frozen fragmented fish cartilage) from the viewpoint of extraction efficiency.
  • the frozen fragmented fish cartilage can be obtained by (i) freezing the fish cartilage and then fragmenting it, or (ii) freezing the fish cartilage and then freezing it. Those are particularly preferred.
  • the freezing method is not particularly limited, and a known freezing method can be used. For example, a method of storing fish cartilage at about ⁇ 20 to ⁇ 80 ° C. for about 24 to 72 hours using a freezer can be exemplified.
  • the fragmented fish cartilage or the frozen fragmented fish cartilage is preferably about 0.001 to 0.5 g, more preferably about 0.005 to 0.3 g, and still more preferably about 0.01 to 0.1 g per piece.
  • the fragmentation operation is preferably performed so that such a small piece can be obtained (by examining the equipment conditions used, the equipment usage conditions for obtaining such small pieces can be easily determined).
  • Powdered fish cartilage is a powdered fish cartilage (fish cartilage powder). Powdering can be performed by a known method. For example, fish cartilage (preferably frozen fish cartilage) can be pulverized using a known blender or mill. The powdering operation is preferably performed at as low a temperature as possible (for example, 0 ° C. or lower).
  • the powdered fish cartilage is preferably frozen powdered fish cartilage (frozen powdered fish cartilage) from the viewpoint of extraction efficiency.
  • the frozen powdered fish cartilage can be obtained by (i ′) freezing and then powdering the fish cartilage, or (ii ′) freezing and then freezing the fish cartilage, (i ′) Those obtained by are particularly preferred.
  • the freezing method is not particularly limited, and a known freezing method can be used. For example, a method of storing fish cartilage at about ⁇ 20 to ⁇ 80 ° C. for about 24 to 72 hours using a freezer can be exemplified.
  • the powder has a particle size of about 10 to 1000 ⁇ m, preferably about 50 to 500 ⁇ m, more preferably about 100 to 200 ⁇ m (measured by a laser diffraction scattering method).
  • a powder containing particles is desirable. It is preferable that a large amount (for example, 50% by mass or more, preferably 70% by mass or more) of particles having these particle sizes is contained in the powder.
  • a known method can be used as a degreasing method.
  • a method for degreasing fish cartilage in the above ( ⁇ ) for example, a method of exposing fish cartilage to running water (for example, running water from a tap) for about 1 to 24 hours is exemplified.
  • Fish cartilage can be obtained by a known method.
  • fish tissue preferably fish head
  • tissues other than cartilage preferably nasal cartilage
  • Examples include a method of removing, or a method of removing nasal cartilage immediately after thawing the frozen salmon head and further washing and degreasing it by exposing it to running water for about 1 to 24 hours.
  • a method of degreasing the fragmented fish cartilage or powdered fish cartilage for example, a method of extracting and removing lipids with an organic solvent is exemplified.
  • the organic solvent include ethanol, hexane, acetone and the like.
  • the method described in JP-A-2009-173702 can be preferably used. That is, for example, powdered defatted fish cartilage can be obtained by a method including the following steps A to E, and this can be used in the present invention (more detailed conditions are also described in JP2009-173702A). ).
  • fragmented fish cartilage or powdered fish cartilage (frozen fragmented skimmed fish cartilage or frozen powdered skimmed fish cartilage) that has been both frozen and degreased. These can be obtained, for example, by freezing degreased fish cartilage and cutting or pulverizing it.
  • degreasing methods can be applied not only to fragmented fish cartilage or powdered fish cartilage but also to cartilage itself collected from a living body.
  • Fish cartilage (including fragmented fish cartilage and powdered fish cartilage.
  • fragmented fish cartilage and powdered fish cartilage may be collectively referred to as “miniaturized fish cartilage”) is subjected to water extraction.
  • water used for water extraction include Milli-Q water, distilled water, deionized water, purified water, tap water, and the like.
  • the pH of the extracted water is usually about 5.5 to 8.0, preferably about 6.0 to 7.5, and more preferably about 6.5 to 7.5. It is not preferable to dissolve a substance whose pH is greatly changed, such as an acid, an alkali, or a base.
  • the high molecular weight proteoglycan decreases or disappears. It is preferable not to add any alkali compounds. In addition, although a limited interpretation is not desired, it is speculated that this may be caused by the collapse of the proteoglycan aggregate during the extraction process due to the influence of the acid compound or the alkali compound.
  • fish cartilage is placed in water for an appropriate time (for example, 30 minutes or more, preferably about 30 minutes to 24 hours, more preferably about 1 to 12 hours, still more preferably about 2 to 6 hours, still more preferably. It can be carried out by immersing for about 3 to 4 hours.
  • the amount of water is not particularly limited, for example, the amount is sufficient to immerse the fragmented fish cartilage or powdered fish cartilage to be extracted.
  • the solution may be left standing or stirred. It is preferable to stir.
  • the temperature of water during extraction is not particularly limited, but is preferably 50 ° C or higher, more preferably 70 ° C or higher. Therefore, it may be heated at the time of extraction or may be preheated before extraction.
  • the heating temperature (that is, the temperature of the water used) is preferably about 50 to 100 ° C., more preferably about 70 to 100 ° C., further preferably about 80 to 100 ° C., and still more preferably 90 to 100 ° C.
  • the degree is illustrated.
  • when heating since high molecular weight proteoglycan may be decomposed
  • the extraction time interval in each extraction water when replacing the extraction water is, for example, every 15 minutes to 4 hours, preferably about 30 minutes to 2 hours or 1 hour.
  • water preferably heated water
  • a quantity of water (preferably heated water) that can be immersed in all of the fish cartilage is added to the fish cartilage, and the mixture is allowed to stand for 1 hour, and this water is recovered”.
  • There is a method of repeating the process four times in this case, water extraction is performed for a total of 4 hours).
  • the fish cartilage water extract can be obtained by collecting the liquid part.
  • the liquid portion can be collected by, for example, performing centrifugation (for example, centrifugation at 5000 rpm, 20 minutes, and centrifugation at 4 ° C.) or continuous centrifugation, and collecting the supernatant.
  • the liquid (supernatant) may be used as it is as the fish cartilage water extract of the present invention, or may be further purified (for example, degreased) by a known method. Or you may concentrate by the vacuum distillation method etc. Alternatively, it may be dried or powdered by freeze drying, spray drying, or the like.
  • a fish cartilage extract containing high molecular weight proteoglycan obtained as described above is preferably used in a composition for preventing or treating osteoarthritis.
  • the composition for preventing or treating osteoarthritis of the present invention contains a fish cartilage extract containing high molecular weight proteoglycan.
  • the composition for preventing or treating osteoarthritis of the present invention is preferably used in the pharmaceutical field and food field.
  • the composition (hereinafter sometimes referred to as “the pharmaceutical composition according to the present invention”) contains a high molecular weight proteoglycan. It may consist only of a fish cartilage water extract, or may further contain other components.
  • a pharmaceutically acceptable base, carrier, additive for example, an excipient, a binder, a disintegrant, a lubricant, a solvent, a sweetener, Coloring agents, flavoring agents, flavoring agents, surfactants, humectants, preservatives, pH adjusters, thickening agents, and the like
  • additive for example, an excipient, a binder, a disintegrant, a lubricant, a solvent, a sweetener, Coloring agents, flavoring agents, flavoring agents, surfactants, humectants, preservatives, pH adjusters, thickening agents, and the like
  • Such bases, carriers, additives and the like are specifically described in, for example, Pharmaceutical Additives Dictionary 2007 (Pharmaceutical Daily Inc.), and for example, those described therein can be used.
  • preparations such as tablets, coated tablets, powders, granules, fine granules, capsules, pills, solutions, suspensions, emulsions, jellies, chewables, soft tablets, etc. may be prepared by conventional methods. Can do.
  • the amount of fish cartilage water extract containing high molecular weight proteoglycan in the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited as long as the effect of preventing or treating osteoarthritis is exhibited, and the fish cartilage water preferred per day is preferable. It can set suitably according to the intake of an extract.
  • the amount is preferably 0.0005 to 100% by mass, more preferably 0.005 to 90% by mass, and still more preferably 0.05 to 80% by mass.
  • the subject to which the pharmaceutical composition according to the present invention is administered is a patient with osteoarthritis, and a patient with knee osteoarthritis is particularly preferable.
  • the severity of the patient is not particularly limited, and can be preferably used for any of the early patient, middle-term patient, and late-stage patient. Furthermore, it can also be used prophylactically (ie as a prophylactic agent) for people who are likely to suffer from osteoarthritis, such as the elderly.
  • the administration time of the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited, and for example, the administration time can be appropriately selected in consideration of the preparation form, patient age, patient symptom level, and the like.
  • the administration form is preferably oral administration. In the case of patients who are difficult to administer via the mouth, such as those who have difficulty swallowing, they may be delivered directly to the stomach through gastrostomy.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention can be appropriately selected according to the age of the patient, the degree of symptoms of the patient, other conditions, and the like.
  • the amount of high molecular weight proteoglycan in the pharmaceutical composition is preferably in the range of preferably 1 to 1000 mg, more preferably 10 to 300 mg per adult day.
  • the administration can be performed once or a plurality of times (preferably 2 to 3 times) a day.
  • the composition for preventing osteoarthritis of the present invention is a fish cartilage containing a high molecular weight proteoglycan.
  • the water extract itself may be used, or a base / carrier / additive that is acceptable in food hygiene and other ingredients / materials that can be used as a food additive.
  • Examples of such food additives include, but are not limited to, liquids, powders, flakes, granules, and pastes.
  • the amount of the fish cartilage extract containing high molecular weight proteoglycan in the food additive according to the present invention is not particularly limited as long as the osteoarthritis prevention or treatment action is exhibited, but preferably 0.0005 to 100 mass. %, More preferably 0.005 to 90% by mass, still more preferably 0.05 to 80% by mass.
  • Such a food additive according to the present invention is ingested by eating a food to which the food additive is added.
  • the said addition may be performed during food preparation or manufacture, and may be performed immediately before eating cooked food or while eating.
  • the food additive exhibits an osteoarthritis prevention effect when taken orally in this manner.
  • each condition such as a food additive intake subject according to the present invention and a high molecular weight proteoglycan intake, is not particularly limited, but is preferably the same as the pharmaceutical composition according to the present invention described above, for example.
  • fish cartilage water extract containing high molecular weight proteoglycan is powdered by freeze drying or spray drying, for example, and beverages (juice etc.), confectionery (eg gum, gummi, chocolate, candy, biscuits, Cookies, rice crackers, rice crackers, puddings, jelly, apricot tofu, etc.), breads, soups (including powdered soups, etc.), processed foods and other various foods and beverages.
  • beverages eg gum, gummi, chocolate, candy, biscuits, Cookies, rice crackers, rice crackers, puddings, jelly, apricot tofu, etc.
  • breads e.g., soups (including powdered soups, etc.), processed foods and other various foods and beverages.
  • the amount of the fish cartilage extract containing high molecular weight proteoglycan in the food and drink according to the present invention is not particularly limited as long as the osteoarthritis prevention action can be exerted, but is preferably 0.0005 to 100% by mass.
  • the amount is preferably 0.005 to 90% by mass, more preferably 0.05 to 80% by mass.
  • the food and drink according to the present invention can be preferably used for the prevention of osteoarthritis.
  • each condition such as an ingestion target and an intake amount of the high molecular weight proteoglycan is not particularly limited, but for example, it is preferably the same as the above-described pharmaceutical composition according to the present invention.
  • the hospital food is a meal served when hospitalized, the sick food is a meal for the sick, and the care food is a meal for the care recipient.
  • the food / beverage products according to the present invention can be particularly preferably used as hospital foods, sick foods or nursing foods for patients who have been hospitalized or treated at home due to osteoarthritis or who are receiving nursing care.
  • a person who is highly likely to suffer from osteoarthritis, such as an elderly person can also take it prophylactically.
  • the present invention is a modification characterized by orally ingesting or ingesting the osteoarthritis prevention or treatment composition of the present invention for osteoarthritis patients and persons who are highly likely to suffer from osteoarthritis.
  • Methods for improving and treating osteoarthritis are also provided. Specifically, this method is carried out by orally administering or ingesting the above-mentioned composition for preventing or treating osteoarthritis of the present invention.
  • each condition such as oral administration or intake is as described above.
  • proteoglycan-containing water extract was obtained from salmon nasal cartilage by the following procedure. For salmon nasal cartilage, thaw the frozen salmon head, immediately remove the nasal cartilage, wash and degrease it by running in running water for 6 hours, then remove meat pieces with tweezers and wash with water by hand. Nasal cartilage was used.
  • the salmon nasal cartilage was stored in a freezer and frozen, and this was used as a “frozen salmon nasal cartilage block”.
  • a photograph of the frozen salmon nasal cartilage block is shown in FIG.
  • one frozen salmon nasal cartilage block is roughly a lump with a size of ⁇ 2.5 ⁇ 1.5-4.5 ⁇ 2 cm and a weight of 1.71-6.91 g (per 7 pieces) The average weight was 3.701 g).
  • Proteoglycans were extracted by heating frozen salmon nasal cartilage blocks at 100 ° C. Specifically, extraction was performed as follows. Add 2500 mL of distilled water to a total of about 1000 g of frozen salmon nasal cartilage block, heat at 100 ° C for 3 hours, centrifuge them at 8,000 rpm for 30 minutes at 4 ° C, and remove insoluble matter (residues). The supernatant was removed and collected. The collected supernatant was subjected to suction filtration using filter paper, and the obtained filtrate was freeze-dried to obtain a freeze-dried product containing proteoglycan. The freeze-dried product was crushed with a cutter mill, powdered, and subjected to the following analysis. About 65 g of the powder was obtained. The powdered proteoglycan-containing lyophilized product is referred to as “Sample 1”.
  • FIG. 2 shows a diagram in which the uronic acid amount chromatogram and the 280 nm protein amount chromatogram are overlaid. In the total amount of sample 1 (about 65 g), the amount of uronic acid was about 12 g.
  • FIG. 2 also shows the position of the fraction from which each dextran molecular weight marker was eluted in the uronic acid amount chromatogram. Since the fractionation amount of gel filtration chromatography was 1 mL / tube as shown below, the horizontal axis “Elution Volume (mL)” in FIG. Reflect. [Gel filtration chromatography conditions] Column: Sepharose CL-2B packed column (Sepharose CL-2B used as a carrier packed in a ⁇ 1cm x 50cm column. Sepharose CL-2B has a dextran fraction range of 100 to 20,000 kDa and can be obtained from GE Healthcare, etc.
  • Sepharose CL-2B is 2% cross-linked agarose, particle size 60-200 ⁇ m (by laser diffraction scattering method), CAS Registry Number 65099-79-8.)
  • Buffer 0.1M phosphate buffer (pH 7.1, containing 0.2M NaCl) Apply sample amount: 1mg / ml as uronic acid Flow rate: 0.15mL / min Fraction fraction: 1mL / tube
  • Molecular weight calibration curve As a molecular weight marker, gel filtration chromatography was performed for the following various dextrans under the same conditions as described above (however, the amount of sample applied was 1 mg / 1 mL buffer), and the absorbance (dextran amount of each fraction was determined by the phenol / sulfuric acid method. Reflected) was measured and a calibration curve was created.
  • ⁇ Dextran molecular weight marker Dextran from Leuconostoc mesenteroides (mol wt 5,000,000-40,000,000) (SIGMA): for measuring void volume of columns, 20000 kDa Dextran Standard 1,400,000 (SIGMA) ⁇ ⁇ ⁇ 1400kDa Dextran Standard 670,000 (SIGMA) ⁇ ⁇ ⁇ 670kDa Dextran Standard 410,000 (SIGMA) ⁇ ⁇ ⁇ 410kDa Dextran Standard 270,000 (SIGMA) ⁇ ⁇ ⁇ 270kDa
  • SIGMA Leuconostoc mesenteroides
  • the pretreatment was performed by eluting Dextran from Leuconostoc mesenteroides itself according to the above [Gel filtration chromatography conditions] (apply amount is the amount for marker), collecting molecules having a molecular weight of 20 million or more, and lyophilizing. .
  • the fraction corresponding to the first peak appeared was collected and freeze-dried (this Can be used to recover and freeze-dry molecules with a molecular weight of 20,000 kDa or more). This freeze-dried product was actually used as a marker (for measuring the void volume of the column).
  • Sample 1 contains a high molecular weight proteoglycan having a molecular weight of at least 1.8 million or more, particularly a molecular weight of 5 million or more.
  • FIG. 3 shows a diagram in which the uronic acid amount chromatogram and the 280 nm protein amount chromatogram are overlaid.
  • FIG. 3 also shows the position of the fraction from which each dextran molecular weight marker was eluted in the uronic acid amount chromatogram.
  • Example 2 the commercially available proteoglycans contained almost no proteoglycans having a molecular weight of 1.8 million or more, and especially no proteoglycans having a molecular weight of 5 million or more.
  • the commercially available proteoglycan is hereinafter referred to as “Sample 2”.
  • the ratio of the uronic acid amount contained in proteoglycans having a molecular weight of 1.8 million or more in Sample 1 and Sample 2 to the uronic acid amount in the entire sample was calculated based on the uronic acid chromatograms shown in FIG. 2 and FIG. Specifically, in the uronic acid chromatogram shown in FIG. 2 and FIG. 3, the area ratio occupied by uronic acid having a molecular weight of 1.8 million or more was calculated with respect to the entire peak area. More specifically, a perpendicular line was drawn to the eluate amount point corresponding to a molecular weight of 1.8 million, and the area ratio of the two parts when the chromatogram was divided was determined. Similarly, the ratio of the amount of uronic acid contained in proteoglycans having a molecular weight of 5 million or more in Sample 1 and Sample 2 to the amount of uronic acid in the entire sample was also calculated. The results are shown in Table 1.
  • Osteoarthritis model mice were prepared by the following procedure. 6-week-old C57bl6 mice (male: about 20-22g) were purchased from Japan SLC Co., Ltd. Ketalar (50mg / ml) 0.3ml + Seractal (2%) 0.1ml subcutaneously on the thigh of the mice After injection, general anesthesia was performed, and the area around the knee joint was removed to prepare for surgery. The right hind paw of the mouse was subjected to anterior cruciate ligament amputation and medial meniscus resection, while the left hind paw was incised as in the right but the ligament and meniscus were not injured, and were sutured as is. Sham surgery). This produced a moderato model mouse with anterior cruciate ligament cutting and meniscal partial excision.
  • each sample (sample 1 or sample 2) has the amount shown in Table 2 in a general feed for laboratory animals (CE-2: Nippon Claire Co., Ltd.). The total amount was 4 g.
  • Sample 2 contained an excipient, it was formulated so as to contain 5 mg as a proteoglycan (Table 2).
  • the test was advanced according to the following schedule. That is, a model mouse was fed with a diet in which each sample was mixed for 4 weeks after the operation, and was kept at 5 animals / cage in an environment of room temperature 23 ⁇ 2 ° C. and humidity 50-60% during the feeding period. There were no restrictions on behavior and food intake, and it was free. The amount of food intake was measured when the food was changed every week, and the amount of food intake / animal per day was estimated. An outline of the test schedule is shown in FIG. In addition, the control group which ingested only the general feed for experimental animals (CE-2) was examined similarly.
  • hematoxylin and eosin staining (HE staining) and safranin O staining were performed.
  • Safranin O is a basic pigment and binds to acidic glycosaminoglycan to give an orange color, and is therefore used as an index of cartilage tissue.
  • the three items "Safranin O" (staining range: indicates glycosaminoglycan content), "chondrocyte (chondrocyte number)", and "Structure (cartilage surface structure)” was scored (by 3 evaluators), and the average value was used to evaluate joint cartilage site damage.
  • Statistical analysis was performed according to the multiple comparison Bonferroni / Dunn method.
  • Mankin score is highly reliable for reasons such as 1) comparison with human cases, 2) changes over time, etc., and is generally used as a method for evaluating cartilage degeneration. Is the way it is. Table 3 shows the criteria for each item of modified Mankinscore used in this study.
  • Table 4 shows the measurement results of food intake and body weight (both average values) for each group.
  • FIGS. 6a to 6d show the results of analyzing the above three items using Mankin score (three evaluators) in FIGS. 6a to 6d.
  • OA is the control result
  • low concentration PG is the result of group 1
  • medium concentration PG is the result of group 2
  • high concentration PG is the result of group 3
  • PG of other companies is the group.
  • the results of 4 are shown respectively.
  • 6a shows the analysis result of “SafraninfranO”
  • FIG. 6b shows the analysis result of “chondrocyte (chondrocyte number)”
  • FIG. 6c shows the analysis result of “Structure (structure of cartilage surface)”
  • FIG. The analysis results of the total score of these three items are shown respectively. Note that the description of the number n described in 6a is common to FIGS.

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Abstract

　本発明は変形性関節症の予防又は治療の手段を提供することを課題とする。　本発明により分子量１８０万以上のプロテオグリカンを含有する魚類軟骨水抽出物を含む、変形性関節症予防又は治療用組成物が提供される。

Description

変形性関節症予防又は治療用組成物
　本発明は、変形性関節症予防又は治療用組成物に関する。
　変形性関節症（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ＯＡ）は、慢性の関節炎を伴う関節疾患で、関節の構成要素の退行変性により、軟骨の破壊と、骨や軟骨の増殖性変化を来たす疾患である。特に変形性膝関節症については、Ｘ線診断上の罹患者数は約2500万人、その中で痛みを感じている人は800万人以上にものぼると推定されている。
　このような現状にも関わらず、現在のところ変形性関節症に関しては、痛み止めや関節内への直接ヒアルロン酸注射などの対症療法しかなく、進行を止めることが事実上不可能であり、症状が重症化すると、手術せざるを得ないという状態になってしまう。このような状況下において、有効な治療薬又は治療法が強く要望されている。
特開２００７－２６２１０３号公報 特開２００９－２７４９５５号公報
　本発明は、変形性関節症の予防又は治療の手段を提供することを課題とする。
　本発明者らは、驚くべき事に、高分子量のプロテオグリカンが、変形性関節症の予防又は治療に有用であることを見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
分子量１８０万以上のプロテオグリカンを含有する魚類軟骨水抽出物を含む、変形性関節症予防又は治療用組成物。
項２．
分子量５００万以上のプロテオグリカンを含有する魚類軟骨水抽出物を含む、項１に記載の変形性関節症予防又は治療用組成物。
項３．
前記魚類軟骨水抽出物が、含有するウロン酸のうち、１０質量％以上が分子量１８０万以上のプロテオグリカンに由来するウロン酸である魚類軟骨水抽出物である、項１又は２に記載の組成物。
項４．
前記魚類軟骨水抽出物が、含有するウロン酸のうち、７質量％以上が分子量５００万以上のプロテオグリカンに由来するウロン酸である魚類軟骨水抽出物である、項１～３のいずれかに記載の組成物。
項５．
魚類軟骨水抽出物が、魚類軟骨熱水抽出物である、項１～４のいずれかに記載の組成物。項６．
魚類軟骨がサケ軟骨又はマス軟骨である、項１～５のいずれかに記載の変形性関節症予防又は治療用組成物。
　本発明に係る変形性関節症予防又は治療用組成物によれば、経口摂取することで、変形性関節症を予防又は治療することができる。
凍結サケ鼻軟骨ブロックの写真である。プラスチック容器の中央に配置された塊が凍結サケ鼻軟骨ブロックである。 高分子量プロテオグリカンを含有する魚類軟骨水抽出物（凍結乾燥物：サンプル１）の、ウロン酸量クロマトグラム及び２８０ｎｍタンパク質量クロマトグラムを示す。 市販プロテオグリカンの、ウロン酸量クロマトグラム及び２８０ｎｍタンパク質量クロマトグラムを示す。 変形性関節症モデルマウスに対する被験サンプル投与スケジュールの概要を示す。 各被験サンプルが投与された変形性関節症モデルマウスの、膝関節部分をSafranin O染色した画像を示す。 各被験サンプルを経口摂取した変形性関節症モデルマウスについて、modified Mankin scoreによる「Safranin O」の評価の解析結果を示すグラフである。 各被験サンプルを経口摂取した変形性関節症モデルマウスについて、modified Mankin scoreによる「chondrocyte（軟骨細胞数）」の評価の解析結果を示すグラフである。 各被験サンプルを経口摂取した変形性関節症モデルマウスについて、modified Mankin scoreによる「Structure（軟骨表面の構造）」の評価の解析結果を示すグラフである。 各被験サンプルを経口摂取した変形性関節症モデルマウスについて、modified Mankin scoreによる「Safranin O」、「chondrocyte（軟骨細胞数）」及び「Structure（軟骨表面の構造）」の合計スコアの解析結果を示すグラフである。
　以下、本発明について、さらに詳細に説明する。
　プロテオグリカンは、グリコサミノグリカン（ムコ多糖）及びタンパク質が結合した構造を有する化合物である。グリコサミノグリカンは、２糖の繰り返し構造を有する酸性糖であり、具体的にはコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸等が例示できる。これら酸性糖成分が有する２糖の繰り返し構造において、当該２糖のうち通常１つはアミノ糖、もう１つはウロン酸である。従って、プロテオグリカンの検出には、ウロン酸検出法の常法の１つであるカルバゾール硫酸法を用いることができる。
　また、タンパク質に、櫛の歯状にグリコサミノグリカンが結合した化合物はプロテオグリカンモノマーとも呼ばれる（プロテオグリカンモノマーにおける当該タンパク質はコアタンパク質と呼ばれる。）。特に生体内では、このプロテオグリカンモノマーがリンクタンパク質を介してヒアルロン酸と結合した会合体を形成していると考えられており、当該会合体はプロテオグリカン集合体（proteoglycanaggregate）とも呼ばれる。本明細書における用語「プロテオグリカン」は、プロテオグリカンモノマー及びプロテオグリカン集合体を包含する意味で用いられる。なお、ヒアルロン酸もグリコサミノグリカンの一種である。
　本発明の変形性関節症予防又は治療用組成物は、高分子量のプロテオグリカンを含有する魚類軟骨水抽出物を含む。
　本発明の変形性関節症予防又は治療用組成物に含まれる魚類軟骨水抽出物は、高分子量プロテオグリカンを含有する。本明細書でいう高分子量プロテオグリカンとは、具体的には分子量１８０万以上のプロテオグリカンであり、好ましくは分子量２５０万以上、３００万以上、４００万以上、５００万以上、６００万以上、７００万以上、８００万以上、９００万以上、１０００万以上、１１００万以上、１２００万以上、１３００万以上、１４００万以上、１５００万以上、１６００万以上、１７００万以上、１８００万以上、１９００万以上、又は２０００万以上のプロテオグリカンである。分子量が大きいものほど好ましく、特に分子量５００万以上が好ましい。魚類軟骨水抽出物を、下記条件のゲル濾過クロマトグラフィーにより処理し、得られる各フラクションに含まれるウロン酸量（プロテオグリカン量を反映する）をカルバゾール硫酸法で定量し、当該ウロン酸量に基づくクロマトグラムを作成することにより、上記の分子量以上のプロテオグリカンの存在を確認することができる。このようなウロン酸量に基づくクロマトグラムを以下「ウロン酸量クロマトグラム」ということがある。また、各フラクションの２８０ｎｍでの吸光度を測定することで、含まれるタンパク質量を相対値化し（すなわち、含まれるタンパク質量を反映する値とし）、当該吸光度に基づくクロマトグラムを描くこともできる。このようなクロマトグラムを以下「２８０ｎｍタンパク質量クロマトグラム」ということがある。
〔ゲル濾過クロマトグラフィー条件〕
カラム： SepharoseCL-2B 充填カラム（Sepharose CL-2Bを担体としてφ1cm×50cmのカラムに充填したもの。Sepharose CL-2Bのデキストランの分画範囲は100～20,000kDaであり、GE Healthcare社等から入手できる。Sepharose CL-2Bは、２％架橋アガロース、粒子径６０～２００μｍ（レーザー回折散乱法による）、CAS登録番号65099-79-8である。）
バッファー： 0.1Mリン酸緩衝液（pＨ 7.1, 0.2M NaCl含有）
アプライサンプル量：魚類軟骨水抽出物4mg（乾燥質量換算）（１ｍＬバッファーに溶解させて使用）
流速： 0.15ｍＬ/min
分画フラクション量： 1ｍＬ/tube
分子量検量線：次の各種デキストラン分子量マーカーについて上記と同様の条件でゲル濾過クロマトグラフィーを行い、糖検出のための周知の方法であるフェノール・硫酸法により各フラクションの吸光度（デキストラン量を反映する）を測定し、各マーカーが溶出されたフラクションを求め、当該条件のゲル濾過クロマトグラフィーの各フラクションに含まれる成分の分子量を反映する検量線を作成する。“各マーカーが溶出されたフラクション”とは、各マーカーが最も多く溶出されたフラクションをいう。換言すれば、各デキストラン分子量マーカーをゲル濾過した際の、デキストラン量を反映するクロマトグラムにおけるピークトップに相当するフラクションである。
　　　＜デキストラン分子量マーカー＞
　　　Dextran from Leuconostoc mesenteroides（mol wt 5,000,000－40,000,000）（SIGMA）・・・カラムのvoid volume測定用、20000kDa
　　　Dextran Standard 1,400,000（SIGMA）・・・1400kDa
　　　Dextran Standard 670,000（SIGMA）　・・・670kDa
　　　Dextran Standard 410,000（SIGMA）　・・・410kDa
　　　Dextran Standard 270,000（SIGMA）　・・・270kDa
　但し、Dextran from Leuconostoc mesenteroidesについては、これに含まれる低分子のデキストランを除去する前処理を行った後、マーカーとして用いる。当該前処理は、上述の〔ゲル濾過クロマトグラフィー条件〕によりDextran from Leuconostoc mesenteroidesそのものを溶出させ、分子量20,000kDa以上の分子を回収し、凍結乾燥させることで行う
。具体的には、フェノール・硫酸法により各フラクションの吸光度を測定して作成した、デキストラン量を反映するクロマトグラムにおいて、最初に出現したピークに相当するフラクションを回収し、これを凍結乾燥する（これにより、分子量20,000kDa以上の分子を
回収、凍結乾燥できると考えられる）。この凍結乾燥物を実際にマーカー（カラムのvoidvolume測定用）として用いる。
　デキストラン量を反映するクロマトグラムを得るための吸光度測定は、Hodge, J. E. and Hofreiter, B. T., Method in Carbohydrate Chemistry, 1, 338 (1962)に記載の方法（フェノール・硫酸法）に従う。具体的には、次のようにして行う。
〔１〕105×15mmの試験管に試料水溶液を500μＬ加える。
〔２〕フェノール試薬（5 v/v%フェノール水溶液）を500μＬ加え、撹拌する。
〔３〕濃硫酸を２．５ｍＬ加え、すぐに１０秒間激しく撹拌する。
〔４〕室温に２０分以上放置する。
〔５〕分光光度計で４９０ｎｍの吸収を測定する。
　なお、カルバゾール硫酸法とは、ウロン酸（グルクロン酸（ＧｌｃＡ）、イズロン酸等）の発色色素であるカルバゾール溶液を測定検体に添加し、分光光度計を用いて吸光度を測定し、当該吸光度を基にウロン酸量を算出する周知の方法である。濃度を規定したグルクロン酸標準溶液を用いて検量線を作成し、検体中のグルクロン酸含量を求める。より具体的には、次のようにして行う。ホウ酸ナトリウム・１０水和物０．９５ｇを濃硫酸１００ｍＬに溶解した試薬２．５ｍＬを試験管にとり、氷冷する。これに被検体０．５ｍＬ（２～２０μｇのウロン酸を含むようにするのが好ましい）を静かに重層する。室温以上にならないように水冷しながらよく攪拌する。ガラス球で蓋をした後に、沸騰湯浴中で１０分間加熱し、室温まで水冷する。これに、カルバゾール１２５ｍｇを無水メチルアルコール１００ｍＬに溶解した試薬を０．１ｍＬ加えて混合し、更に１５分間沸騰湯浴中で加熱する。その後、室温まで水冷し530ｎｍにおける吸光度を測定する。ブランクは蒸留水０．５ｍＬを用いる。同時に、グルクロン酸を用いて検量線を作成する。（下述する実施例のカルバゾール硫酸法も、ここに記載した方法で行った。）
　乾燥質量換算で、本発明の魚類軟骨水抽出物に含まれるウロン酸量（カルバゾール硫酸法により定量）全量のうち、１０質量％以上は、分子量１８０万以上のプロテオグリカンに由来するのが好ましい。換言すれば、本発明の魚類軟骨水抽出物は、乾燥質量換算で、分子量１８０万以上のプロテオグリカンが含むウロン酸量が、抽出物に含まれるウロン酸全量の１０質量％以上であることが好ましい。より好ましくは、１５質量％以上、２０質量％以上、２５質量％以上、３０質量％以上、３５質量％以上、４０質量％以上、４５質量％以上、５０質量％以上、又は５５質量％以上である。当該割合は大きい程好ましい。
　また、本発明の魚類軟骨水抽出物は、乾燥質量換算で、分子量２５０万以上のプロテオグリカンが含むウロン酸量が、抽出物に含まれるウロン酸全量の１０質量％以上であることが好ましい。より好ましくは、１５質量％以上、２０質量％以上、２５質量％以上、３０質量％以上、３５質量％以上、４０質量％以上、４５質量％以上、５０質量％以上、５５質量％以上、又は６０質量％以上である。当該割合は大きい程好ましい。
　また、本発明の魚類軟骨水抽出物は、乾燥質量換算で、分子量５００万以上のプロテオグリカンが含むウロン酸量が、抽出物に含まれるウロン酸全量の７質量％以上であることが好ましい。より好ましくは、１０質量％以上、１３質量％以上、１６質量％以上、２０質量％以上、２４質量％以上、２７質量％以上、３０質量％以上、３４質量％以上、又は３７質量％以上である。当該割合は大きいほど好ましい。
　なお、特定の分子量（仮にＸとする）以上のプロテオグリカンが含むウロン酸量が、抽出物に含まれるウロン酸全量のどの程度の割合を占めるのかは、上述したウロン酸量クロマトグラムのピーク面積から求めることができる。具体的には、当該ウロン酸量クロマトグラムのピーク面積全体に対して、分子量Ｘ以上のウロン酸が占める面積割合を求めればよい。より具体的には、縦軸がウロン酸量、横軸がフラクションＮｏ．であるウロン酸量クロマトグラムにおいて、分子量Ｘのプロテオグリカンを含むフラクションを通るように垂線を引き、その垂線で分断されたピーク部分のうち、分子量のより大きいプロテオグリカンを含むピーク部分の面積が、ピーク全体の面積のどの程度の割合を占めるかを求めればよい。
　なお、本発明の魚類軟骨水抽出物に含まれるウロン酸は、プロテオグリカンに含まれるものの他、プロテオグリカンから分断された糖鎖に含まれるもの等も想定される。
　また、本発明の魚類軟骨水抽出物に含まれるウロン酸量（カルバゾール硫酸法により測定）は、乾燥質量換算で、当該抽出物の好ましくは５質量％以上、より好ましくは７．５質量％以上、さらに好ましくは１０質量％以上、よりさらに好ましくは１２．５質量％以上、なお好ましくは１５質量％以上、特に好ましくは１７．５質量％以上である。なお、本明細書（特に図表）において、ウロン酸量を示す際にグルクロン酸の略記であるＧｌｃＡを用いて「ＧｌｃＡ（μｇ）」などと表す場合がある。なお、魚類軟骨水抽出物に含まれるプロテオグリカン中のグリコサミノグリカンは、ほぼコンドロイチン硫酸と考えられる。そして、おおよそのコンドロイチン硫酸量は、ウロン酸量に係数２．５９３を乗ずることで求められることが知られている。よって、本発明の魚類軟骨水抽出物に含まれるおおよそのプロテオグリカン量は、ウロン酸量に係数２．５９３を乗ずることで算出できる。
　本発明の魚類軟骨水抽出物は、魚類軟骨（魚類の軟骨）から抽出される。魚類としては、サケ科サケ属の魚が好ましく、具体的にはマス（カラフトマス、サクラマス、サツキマス等）、サケ（シロザケ、ベニザケ、ギンザケ、マスノスケ、スチールヘッド等）、等が例示される。また、サメ、タラ等も用いることができる。特にサケ又はマスが好ましい。また、軟骨としては、特に制限されないが、頭部軟骨、中でも鼻軟骨が好ましい。また、通常、魚類（特にサケやマス）が食品製品等へ加工される際に頭部は廃棄されることから、頭部軟骨の入手コストは安く、大量に安定供給され得るという利点もある。
　抽出は、水を用いて行われる。魚類軟骨は、生体から採取した軟骨をそのまま抽出に供してもよく、微細化（より具体的には、小片化又は粉末化）してから抽出に供してもよい。また、下述するように、抽出前に例えばエタノールなどの有機溶媒を用いて魚類軟骨に脱脂処理を施しても良い。このようにして、水によりプロテオグリカン（高分子量プロテオグリカンを含む）を抽出することができる。また、あるいは、水抽出を行う際、水を加熱しつつ行なうことにより、もしくは熱水や沸騰水を用いることにより、効率的により効果が高い魚類軟骨水抽出物を得ることができる。
　上記の通り、魚類軟骨は、生体から採取した軟骨をそのまま抽出に供することができる。抽出に供するまで、凍結して保存しておくことが好ましい。凍結方法は特に制限されず、公知の凍結方法を用いることができる。例えば、フリーザーを用いて、魚類軟骨を－２０～－８０℃程度で２４～７２時間程度保存する方法が例示できる。また、魚類軟骨は、脱脂（すなわち脂肪除去）処理されているものを用いることもできる。脱脂処理されたものを用いることで、脂質の混入が少ない精製度の高い魚類軟骨水抽出物を得ることができる点で好ましい。脱脂処理方法としては、下述する「脱脂処理された魚類軟骨」を得る方法が例示できる。
　小片化魚類軟骨は、魚類軟骨を小片化したものである。小片化は、公知の方法により行うことができる。例えば、公知のブレンダーやミル等の機器を用いて、魚類軟骨（好ましくは凍結魚類軟骨）を小片化することができる。小片化操作は、できるだけ低温で行うことが好ましい。例えば、小片化された魚類軟骨が凍結状態を保持可能な温度であることが好ましい。具体的には０℃以下が例示できる。
　また、小片化魚類軟骨は、抽出効率の観点からは、凍結された小片化魚類軟骨（凍結小片化魚類軟骨）であることが好ましい。凍結小片化魚類軟骨は、（ｉ）魚類軟骨を凍結した後小片化することで、又は（ｉｉ）魚類軟骨を小片化した後凍結することで、得ることができるが、（ｉ）により得られるものが特に好ましい。凍結方法は特に制限されず、公知の凍結方法を用いることができる。例えば、フリーザーを用いて、魚類軟骨を－２０～－８０℃程度で２４～７２時間程度保存する方法が例示できる。
　小片化魚類軟骨又は凍結小片化魚類軟骨は、１小片あたり０．００１～０．５ｇ程度が好ましく、０．００５～０．３ｇ程度がより好ましく、０．０１～０．１ｇ程度がさらに好ましい。小片化操作は、このような小片が得られるように行われるのが好ましい（使用機器条件を検討することにより、このような小片が得られる機器使用条件は簡単に決定できる）。
　粉末化魚類軟骨は、魚類軟骨を粉末化したもの（魚類軟骨粉末）である。粉末化は、公知の方法により行うことができる。例えば、公知のブレンダーやミル等の機器を用いて、魚類軟骨（好ましくは凍結魚類軟骨）を粉末化することができる。粉末化操作は、できるだけ低温（例えば０℃以下）で行うことが好ましい。
　また、粉末化魚類軟骨は、抽出効率の観点からは、凍結された粉末化魚類軟骨（凍結粉末化魚類軟骨）であることが好ましい。凍結粉末化魚類軟骨は、（ｉ’）魚類軟骨を凍結した後粉末化することで、又は（ｉｉ’）魚類軟骨を粉末化した後凍結することで、得ることができるが、（ｉ’）により得られるものが特に好ましい。凍結方法は特に制限されず、公知の凍結方法を用いることができる。例えば、フリーザーを用いて、魚類軟骨を－２０～－８０℃程度で２４～７２時間程度保存する方法が例示できる。
　なお、「粉末」は「小片」に比べて、小さいものを指すが、明確に区別することを意図する訳ではない。魚類軟骨を微細化したもののうち、比較的大きめの欠片のものを「小片」、比較的小さめの欠片のものを「粉末」と称している。従って、特に制限される訳ではないが、粉末としては、粒径約１０～１０００μｍ程度、好ましくは５０～５００μｍ程度、より好ましくは１００～２００μｍ程度（レーザー回折散乱法により測定）の粒径を有する粒子を含む粉末が望ましい。これらの粒径を有する粒子は、粉末中多く（例えば５０質量％以上、好ましくは７０質量％以上）含まれることが好ましい。
　用いられる小片化魚類軟骨又は粉末化魚類軟骨は、脱脂（すなわち脂肪除去）されているものも使用できる。つまり、小片化脱脂魚類軟骨又は粉末化脱脂魚類軟骨も使用できる。脱脂処理されたものを用いることで、脂質の混入が少ない精製度の高い魚類軟骨水抽出物を得ることができるからである。小片化脱脂魚類軟骨又は粉末化脱脂魚類軟骨は、（α）脱脂処理された魚類軟骨を小片化又は粉末化することにより、あるいは（β）魚類軟骨を小片化又は粉末化した後に脱脂処理することにより、得ることができる。
　脱脂方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、上記（α）において魚類軟骨を脱脂処理する方法としては、例えば、魚類軟骨を１～２４時間程度流水（例えば水道蛇口からの流水）にさらす方法が例示される。また、魚類軟骨の入手は公知の方法で行うことができ、例えば魚類組織（好ましくは魚類頭部）を水に１～２４時間程度漬けて膨潤させ、軟骨（好ましくは鼻軟骨）以外の組織を除去する方法や、あるいは、凍結サケ頭部を解凍後、直ちに鼻軟骨を取り出し、さらに流水に１～２４時間程度さらして洗浄及び脱脂する方法が例示される。肉片等が残存する場合は、ピンセット等により残存する肉片等を取り除くことが好ましい。なお、この段階では魚類軟骨は小片化又は粉末化されていないため、流水にさらす等しても、ほとんどプロテオグリカンは抽出されないと考えられる。また、下記の（β）の場合と同様に、有機溶媒により脂質を抽出除去する方法も用いることができる。
　また、例えば、（β）において、小片化魚類軟骨又は粉末化魚類軟骨を脱脂処理する方法としては、例えば、有機溶媒により脂質を抽出除去する方法が例示される。有機溶媒としては、エタノール、ヘキサン、アセトン等が例示される。より具体的には、上記（β）の方法として、特開２００９－１７３７０２号公報に記載される方法を好ましく用いることができる。つまり、例えば、以下の工程Ａ～Ｅを含む方法により、粉末化脱脂魚類軟骨を得、これを本発明に用いることができる（より詳細な条件も特開２００９－１７３７０２号公報に記載されている）。
Ａ．凍結した水棲動物組織（魚類組織）を破砕し、これに水を加え、温度０～２０℃、ｐＨ４．８～７で処理する工程
Ｂ．Ａの固液混合物を遠心分離し、最上部の脂質層と中間層の水層を取り除き、沈殿物を回収する工程
Ｃ．沈殿物を乾燥し、微粉末化する工程
Ｄ．得られた乾燥微粉末に、溶媒としてヘキサン、アセトン又はエタノールを加え、残存脂質を抽出除去する工程
Ｅ．溶媒を除去する工程
　なお、凍結処理及び脱脂処理が両方なされた小片化魚類軟骨又は粉末化魚類軟骨（凍結小片化脱脂魚類軟骨又は凍結粉末化脱脂魚類軟骨）を用いるのが、さらに好ましい。これらは、例えば、脱脂処理された魚類軟骨を凍結し、これを小片化又は粉末化することにより得ることができる。
　これらの脱脂方法は、小片化魚類軟骨又は粉末化魚類軟骨だけでなく、生体から採取した軟骨そのものにも適用できる。
　魚類軟骨（小片化魚類軟骨及び粉末化魚類軟骨を含む。なお、以下小片化魚類軟骨及び粉末化魚類軟骨まとめて「微細化魚類軟骨」ということがある。）は水抽出に供される。水抽出に用いる水（以下「抽出水」という場合がある）としては、例えば、ミリＱ水、蒸留水、脱イオン水、精製水、水道水等が例示される。また、抽出水のｐＨは、通常５．５～８．０程度、好ましくはｐＨ６．０～７．５程度、より好ましくはｐＨ６．５～７．５程度である。酸やアルカリ、塩基類などｐＨを大きく変動される物質を溶解させるのは好ましくない。なお、有機酸や無機酸等の酸化合物や水酸化ナトリウム等のアルカリ化合物を抽出水に添加すると、高分子量プロテオグリカン（特に分子量が１０００万を超える高分子量プロテオグリカン）が減少若しくは消失するため、酸化合物やアルカリ化合物は添加しないことが好ましい。なお、限定的な解釈を望むものではないが、これは、酸化合物やアルカリ化合物の影響により、抽出処理中にプロテオグリカン集合体が崩壊することが原因ではないかと推測される。
　水抽出は、例えば、魚類軟骨を水に適当時間（例えば３０分以上、好ましくは３０分～２４時間程度、より好ましくは１～１２時間程度、さらに好ましくは２～６時間程度、よりさらに好ましくは３～４時間程度）浸漬させることで行うことができる。水の量は、特に制限されないが、例えば抽出に供される小片化魚類軟骨又は粉末化魚類軟骨が全て水に浸かる程度の量が例示される。水抽出の際、静置してもよいし、撹拌してもよい。撹拌することが好ましい。また、抽出時の水の温度は、特に制限はされないが、好ましくは５０℃以上、より好ましくは７０℃以上である。そのため、抽出時に加温してもよいし、抽出前に予め温めておいてもよい。加熱温度（すなわち用いる水の温度）は、具体的には、好ましくは５０～１００℃程度、より好ましくは７０～１００℃程度、さらに好ましくは８０～１００℃程度、よりさらに好ましくは９０～１００℃程度が例示される。また、加圧下で加熱してもよい。また、加熱を行う場合は、高分子量プロテオグリカンが熱により分解されるおそれがあるため、加熱された抽出水を抽出処理中に置換してもよい。抽出水を置換する場合の各抽出水における抽出時間間隔は、例えば１５分～４時間毎、好ましくは３０分～２時間又は1時間程度が例示される。好ましい一態様としては、魚類軟骨に、これらを全量浸漬できる量の水（好ましくは加熱された水）を加え、３～４時間加熱しつつ静置若しくは撹拌する、という方法が挙げられる。また、他の好ましい一態様としては、“魚類軟骨に、これらを全量浸漬できる量の水（好ましくは加熱された水）を加え、１時間加熱しつつ静置し、この水を回収する”という工程を４回繰り返す方法が挙げられる（この場合、合計４時間の水抽出を行うことになる）。
　水抽出後は、液体部分を回収することで、魚類軟骨水抽出物を得ることができる。液体部分の回収は、例えば遠心分離（例えば５０００ｒｐｍ、２０分、４℃での遠心分離が例示できる）処理や連続遠心分離処理などを行い、上清を回収することで行い得る。当該液体（上清）をそのまま本発明の魚類軟骨水抽出物として用いてもよいし、公知の方法により更に精製（例えば脱脂）してもよい。あるいは、減圧蒸留法等により、濃縮してもよい。またあるいは、凍結乾燥法やスプレードライ法等により、乾燥や粉末化してもよい。
　例えば上記のようにして得られる、高分子量プロテオグリカンを含有する魚類軟骨水抽出物は、変形性関節症予防又は治療用組成物に好ましく用いられる。
　本発明の変形性関節症予防又は治療用組成物は、高分子量プロテオグリカンを含有する魚類軟骨水抽出物を含む。本発明の変形性関節症予防又は治療用組成物は、医薬分野及び食品分野で好ましく用いられる。
　本発明の変形性関節症予防又は治療用組成物を医薬分野にて用いる場合、当該組成物（以下「本発明に係る医薬組成物」と記載することがある）は、高分子量プロテオグリカンを含有する魚類軟骨水抽出物のみからなるものでもよいし、さらに他の成分を配合したものでもよい。例えば、本発明に係る医薬組成物においては、必要に応じて薬学的に許容される基剤、担体、添加剤（例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、溶剤、甘味剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、界面活性剤、保湿剤、保存剤、ｐＨ調整剤、粘稠化剤等）等を配合することができる。このような基剤、担体、添加剤等は、例えば医薬品添加物辞典２００７（株式会社薬事日報社）に具体的に記載されており、例えばこれに記載されるものを用いることができる。また、常法により、例えば錠剤、被覆錠剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゼリー剤、チュアブル剤、ソフト錠剤等の製剤に調製することができる。
　本発明に係る医薬組成物における高分子量プロテオグリカンを含有する魚類軟骨水抽出物の配合量は、変形性関節症予防又は治療効果が発揮される限り特に制限されず、一日当たりの好ましい当該魚類軟骨水抽出物の摂取量に応じて適宜設定できる。好ましくは０．０００５～１００質量％、より好ましくは０．００５～９０質量％、さらに好ましくは０．０５～８０質量％である。
　本発明に係る医薬組成物を投与する対象は、変形性関節症患者であり、特に変形性膝関節症患者が好ましい。患者の重症度は特に制限されず、初期患者、中期患者、後期患者いずれの患者にも好ましく用いることができる。さらに、高齢者等、変形性関節症を患う可能性の高い人に対して、予防的に（すなわち予防薬として）用いることもできる。
　本発明に係る医薬組成物の投与時期は特に限定されず、例えば製剤形態、患者の年齢、患者の症状の程度等を考慮して適宜投与時期を選択することが可能である。また、投与形態は経口投与が好適である。なお、嚥下困難者等、口を経て投与することが困難な患者の場合、胃瘻等を通じて直接胃へ送達してもよい。
　本発明に係る医薬組成物の投与量は、患者の年齢、患者の症状の程度、その他の条件等に応じて適宜選択され得る。通常当該医薬組成物中の高分子量プロテオグリカン量が、成人一日あたり好ましくは１～１０００ｍｇ、より好ましくは１０～３００ｍｇの範囲となる量を目安とするのが好ましい。なお、１日１回又は複数回（好ましくは２～３回）に分けて投与することができる。
　本発明の変形性関節症予防用組成物を食品添加剤として用いる場合、当該組成物（以下「本発明に係る食品添加剤」と記載することがある）は、高分子量プロテオグリカンを含有する魚類軟骨水抽出物そのものであってもよいし、これと食品衛生学上許容される基剤、担体、添加剤や、その他食品添加剤として利用され得る成分・材料が適宜配合されたものでもよい。また、このような食品添加剤の形態としては、例えば液状、粉末状、フレーク状、顆粒状、ペースト状のものが挙げられるがこれらに限定されない。具体的には、調味料（醤油、ソース、ケチャップ、ドレッシング等）、フレーク（ふりかけ）、焼き肉のたれ、スパイス、ルーペースト（カレールーペースト等）等が例示できる。このような食品添加剤は、常法に従って適宜調製することができる。本発明に係る食品添加剤における高分子量プロテオグリカンを含有する魚類軟骨水抽出物の配合量は、変形性関節症予防又は治療作用が発揮される限り特に制限されないが、好ましくは０．０００５～１００質量％、より好ましくは０．００５～９０質量％、さらに好ましくは０．０５～８０質量％である。
　このような本発明に係る食品添加剤は、該食品添加剤が添加された食品を食べることにより摂取される。なお、当該添加は食品調理中又は製造中に行ってもよいし、調理済みの食品を食べる直前又は食べながら行ってもよい。当該食品添加剤はこのようにして経口摂取することにより、変形性関節症予防効果を発揮する。なお、本発明に係る食品添加剤の摂取対象、含有高分子量プロテオグリカンの摂取量等の各条件は、特に制限されないが、例えば上述した本発明に係る医薬組成物と同様であることが好ましい。
　本発明の変形性関節症予防用組成物を飲食品として用いる場合、当該組成物（以下「本発明に係る飲食品」と記載することがある）は、高分子量プロテオグリカンを含有する魚類軟骨水抽出物、及び食品衛生学上許容される基剤、担体、添加剤、その他食品として利用され得る成分・材料等が適宜配合されたものである。例えば、高分子量プロテオグリカンを含有する魚類軟骨水抽出物を含む、加工食品、飲料、健康食品（栄養機能食品、特定保健用食品等）、サプリメント、病者用食品（病院食、病人食又は介護食等）等が例示できる。また、高分子量プロテオグリカンを含有する魚類軟骨水抽出物を例えば凍結乾燥やスプレードライするなどして、粉末状とし、飲料類（ジュース等）、菓子類（例えばガム、グミ、チョコレート、キャンディー、ビスケット、クッキー、おかき、煎餅、プリン、ゼリー、杏仁豆腐等）、パン類、スープ類（粉末スープ等を含む）、加工食品等の各種飲食品に含有させたものであってもよい。
　なお、健康食品（栄養機能食品、特定保健用食品等）、サプリメントとして、本発明に係る飲食品を調製する場合は、継続的な摂取が行いやすいように、例えば顆粒、カプセル、錠剤（チュアブル剤等を含む）、飲料（ドリンク剤）等の形態に調製することが好ましく、なかでもカプセル、タブレット、錠剤の形態が摂取の簡便さの点からは好ましいが、特にこれらに限定されるものではない。顆粒、カプセル、錠剤等の形態の、本発明に係る飲食品は、薬学的及び／又は食品衛生学的に許容される担体等を用いて、常法に従って適宜調製することができる。また、他の形態に調製する場合であっても、従来の方法に従えばよい。
　本発明に係る飲食品における高分子量プロテオグリカンを含有する魚類軟骨水抽出物の配合量は、変形性関節症予防作用が発揮され得る限り特に制限されないが、好ましくは０．０００５～１００質量％、より好ましくは０．００５～９０質量％、さらに好ましくは０．０５～８０質量％である。
　本発明に係る飲食品は、変形性関節症予防のために好ましく用いることができる。また、摂取対象、含有高分子量プロテオグリカンの摂取量等の各条件は、特に制限はされないが、例えば上述した本発明に係る医薬組成物と同様であることが好ましい。
　なお、病院食とは病院に入院した際に供される食事であり、病人食は病人用の食事であり、介護食とは被介護者用の食事である。本発明に係る飲食品は、変形性関節症で入院、自宅療養等されている患者、あるいは介護を受けられている患者用の病院食、病人食又は介護食として特に好ましく用いることができる。また、高齢者など、変形性関節症を患う可能性の高い人が予防的に摂取することもできる。
　本発明は、変形性関節症患者及び変形性関節症を患う可能性の高い人に対し、本発明の変形性関節症予防又は治療用組成物を経口投与又は経口摂取することを特徴とする変形性関節症の改善方法及び治療方法をも提供する。当該方法は、具体的には、前述の本発明の変形性関節症予防又は治療用組成物を経口投与又は経口摂取することで実施される。なお、当該方法における、経口投与又は摂取量等の各条件は前述の通りである。
　以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。
プロテオグリカンの調製
　以下の手順により、サケ鼻軟骨からプロテオグリカン含有水抽出物を得た。サケ鼻軟骨としては、凍結サケ頭部を解凍後、直ちに鼻軟骨を取り出し、さらに流水に６時間さらして洗浄及び脱脂した後、さらにピンセットで肉片等を取り除き、手で水洗いして得られたサケ鼻軟骨を用いた。
　サケ鼻軟骨をフリーザーに保存して凍結させ、これを「凍結サケ鼻軟骨ブロック」として用いた。当該凍結サケ鼻軟骨ブロックの写真を図１に示す。なお、用いたサケ頭部の大きさにもよるが、凍結サケ鼻軟骨ブロック１個は、およそ、大きさ 2.5×1.5 ～ 4.5×2 cm、重さ 1.71 ～ 6.91 gの塊（7個あたりの平均の重さは3.701g）であった。
　凍結サケ鼻軟骨ブロックを100℃で加熱することによりプロテオグリカンを抽出した。
具体的には、次のようにして抽出を行った。凍結サケ鼻軟骨ブロック合計約1000gに対し2500mLの蒸留水を加え、100℃で3時間加熱し、それらを遠心分離機により8,000rpm、30分、4℃で遠心分離し、不溶物（残渣）を取り除き上清を回収した。回収上清を、濾紙を用いて吸引濾過し、得られた濾液を凍結乾燥し、プロテオグリカン含有凍結乾燥物を得た。当該凍結乾燥物を、カッターミルで破砕し、粉末状にして、以下の分析に供した。当該粉末は、約６５ｇ得られた。なお、当該粉末状のプロテオグリカン含有凍結乾燥物を、「サンプル１」とする。
分子量の検討
　サンプル１を、下記条件のゲル濾過クロマトグラフィーにより各フラクションに分離した。そして、各フラクションに含まれるウロン酸量をカルバゾール硫酸法により定量した。また、各フラクションの２８０ｎｍでの吸光度を測定し、当該吸光度を、含まれるタンパク質量を反映する値とした。そして、これらの結果を基にして、ウロン酸量クロマトグラム及び２８０ｎｍタンパク質量クロマトグラムを描いた。ウロン酸量クロマトグラム及び２８０ｎｍタンパク質量クロマトグラムを重ねて描いた図を図２に示す。なお、サンプル１全量（約６５ｇ）中、ウロン酸量は約１２ｇであった。
　また、図２には、ウロン酸量クロマトグラムにおいて各デキストラン分子量マーカーが溶出されたフラクションの位置も、併せて示す。なお、ゲル濾過クロマトグラフィーの分画フラクション量は下記の通り 1ｍＬ/tubeとしたため、図２の横軸「Elution Volume(mL)」は、フラクションＮｏ．も反映する。
〔ゲル濾過クロマトグラフィー条件〕
カラム： SepharoseCL-2B 充填カラム（Sepharose CL-2Bを担体としてφ1cm×50cmのカラムに充填したもの。Sepharose CL-2Bのデキストランの分画範囲は100～20,000kDaであ
り、GE Healthcare社等から入手できる。Sepharose CL-2Bは、２％架橋アガロース、粒子径６０～２００μｍ（レーザー回折散乱法による）、CAS登録番号65099-79-8である。）
バッファー： 0.1Mリン酸緩衝液（pＨ 7.1, 0.2M NaCl含有）
アプライサンプル量：ウロン酸として1mg/ml
流速： 0.15ｍＬ/min
分画フラクション量： 1ｍＬ/tube
分子量検量線：分子量マーカーとして、次の各種デキストランについて上記と同様の条件（但しサンプルアプライ量は１ｍｇ／１ｍＬバッファー）でゲル濾過クロマトグラフィーを行い、フェノール・硫酸法により各フラクションの吸光度（デキストラン量を反映する）を測定し、検量線を作成した。
　　　＜デキストラン分子量マーカー＞
　　　Dextran from Leuconostoc mesenteroides（mol wt 5,000,000－40,000,000）（SIGMA）・・・カラムのvoid volume測定用、20000kDa
　　　Dextran Standard 1,400,000（SIGMA）・・・1400kDa
　　　Dextran Standard 670,000（SIGMA）　・・・670kDa
　　　Dextran Standard 410,000（SIGMA）　・・・410kDa
　　　Dextran Standard 270,000（SIGMA）　・・・270kDa
　但し、Dextran from Leuconostoc mesenteroidesについては、当該マーカーに含まれる低分子のデキストランを除去する前処理を行った後、用いた。当該前処理は、上述の〔ゲル濾過クロマトグラフィー条件〕（アプライ量はマーカー用の量）によりDextran from Leuconostoc mesenteroidesそのものを溶出させ、分子量２０００万以上の分子を回収し、凍結乾燥させることで行った。具体的には、フェノール・硫酸法により各フラクションの吸光度を測定して作成した、デキストラン量を反映するクロマトグラムにおいて、最初に出現したピークに相当するフラクションを回収し、これを凍結乾燥した（これにより、分子量20,000kDa以上の分子を回収、凍結乾燥できると考えられる）。この凍結乾燥物を実際にマーカー（カラムのvoid volume測定用）として用いた。
　デキストラン量を反映するクロマトグラムを得るための吸光度測定は、Hodge, J. E. and Hofreiter, B. T., Method in Carbohydrate Chemistry, 1, 338 (1962)に記載の方法（フェノール・硫酸法）に従った。具体的には、次のようにして行った。
〔１〕105×15mmの試験管に試料水溶液を500μＬ加える。
〔２〕フェノール試薬（5 v/v%フェノール水溶液）を500μＬ加え、撹拌する。
〔３〕濃硫酸を２．５ｍＬ加え、すぐに１０秒間激しく撹拌する。
〔４〕室温に２０分以上放置する。
〔５〕分光光度計で４９０ｎｍの吸収を測定する。
　得られた検量線は（y = －4.3446Ln(x)＋56.68 ； Ｒ２＝０．９８２３）であり、Ｒ２値から考えて、分子量とフラクションNo.（即ち溶出液量）はよく相関していることがわかった。
　図２に示されるように、サンプル１には、少なくとも分子量１８０万以上、特に分子量５００万以上の高分子量のプロテオグリカンが含まれることがわかった。 
　また、「プロテオグリカン」として市販されている製品を対照として、同様に検討を行った。ウロン酸量クロマトグラム及び２８０ｎｍタンパク質量クロマトグラムを重ねて描いた図を図３に示す。また、図３には、ウロン酸量クロマトグラムにおいて各デキストラン分子量マーカーが溶出されたフラクションの位置も、併せて示す。当該検討において作成した検量線は（y = －3.943Ln(x)＋59.069 ； Ｒ２＝０．９９７８）であり、Ｒ２値から考えて、分子量とフラクションNo.（即ち溶出液量）はよく相関していた。図３に示されるように、市販のプロテオグリカンには、分子量１８０万以上のプロテオグリカンはほとんど含まれず、特に分子量５００万以上のプロテオグリカンは全く含まれないことがわかった。なお、当該市販のプロテオグリカンを、以下「サンプル２」とする。
　さらに、サンプル１及びサンプル２における分子量１８０万以上のプロテオグリカンが含むウロン酸量が、サンプル全体のウロン酸量に占める割合について、図２及び図３に示されるウロン酸クロマトグラムを基に算出した。具体的には、図２及び図３に示されるウロン酸クロマトグラムにおいて、ピーク面積全体に対して、分子量１８０万以上のウロン酸が占める面積割合を算出した。より具体的には、分子量１８０万に相当する溶出液量点に垂線を引き、該クロマトグラムを分割した際の２部分の面積比を求めた。また、同様にして、サンプル１及びサンプル２における分子量５００万以上のプロテオグリカンが含むウロン酸量が、サンプル全体のウロン酸量に占める割合についても算出した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
変形性関節症に対する効果の検討
＜モデルマウスの作製＞
　　変形性関節症モデルマウスを以下の手順にて作製した。6週齢のC57bl6マウス（雄：約20～22g）を日本エスエルシー株式会社から購入し、当該マウスの大腿部に、ケタラール(50mg/ml) 0.3ml + セラクタール(2％）0.1ml を皮下注射して全身麻酔をかけ、膝関節周辺を除毛し、手術準備を行った。マウスの右後足は、前十字靭帯切断および内側半月板切除を行い、一方左後足は、右と同様に関節胞を切開したが靭帯や半月板は傷つけず、そのまま縫合し、sham operation（偽手術）とした。これにより、前十字靭帯の切断と半月板部分切除を行った、中程度（moderato）の障害のモデルマウスを作製した。
＜モデルマウスに対する被験サンプルの摂取＞
　表２に示されるようにマウスを４群に分けた（ｎ＝１０）。また、マウス１匹の１日あたりの摂食量を４ｇと仮定し、実験動物用一般飼料（CE-2：日本クレア株式会社）に各サンプル（サンプル１又はサンプル２）が表２の量となるように配合し、合計量を４ｇとした。ただし、サンプル２に関しては、賦形剤が含まれていたため、プロテオグリカンとして５ｍｇを含むよう、配合した（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　そして、上記のモデルマウス作製のために行った手術の後、次の通りのスケジュールで試験を進めた。すなわち、モデルマウスに各サンプルを混合した飼料を手術後４週間摂取させ、その摂食期間中は、室温23±2℃、湿度50-60%の環境下で5匹/ケージで飼育した。
行動や摂食に関しては制限せず、自由とした。摂食量は１週間毎に餌を交換する際に測定し、1日あたりの摂食量/匹を概算した。当該試験スケジュールの概要を図４に示す。なお、実験動物用一般飼料（CE-2）のみを摂食させたコントロール群も同様に検討を行った。
　手術から4週間後、麻酔下（ケタラール(50mg/ml) 0.3ml + セラクタール(2％）0.1ml を皮下注射）においてマウスの心臓からの採血及び、膝関節部分の切り出しを行った。手術時と同様に除毛した後、大腿骨と頚骨をそれぞれ切断し、方向を揃えてサンプルパックに１つずつ入れ、4%パラホルムアルデヒド中で24時間固定した。その後、EDTA（0.5mol）にて3週間脱灰して、パラフィンにて包埋、約5μｍの厚さで脱灰標本を作成した。切片作製後、ヘマトキシリン・エオジン染色（HE染色）及び、サフラニンO（Safranin O）染色
を行った。Safranin Oは、塩基性色素であり、酸性のグリコサミノグリカンと結合してオレンジ色を呈するため、軟骨組織の指標として用いられる。染色後、modified Mankin score（修正マンキンスコア）を用いて「Safranin O（染色範囲：グリコサミノグリカン量を示す）」「chondrocyte（軟骨細胞数）」「Structure（軟骨表面の構造）」の3項目をスコア化し（評価者3名による）、その平均値を用いて関節軟骨部位損傷の評価を行った。統計学的解析は、多重比較のBonferroni/Dunn法に従って行った。
　なお、Mankin scoreとは、1)ヒトの症例との比較がなされている、2)経時的な変化が調べられているなどといった理由から信頼性が高く、一般的に軟骨変性の評価法として汎用されている方法である。本検討で用いたmodified Mankin scoreの各項目の基準を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
＜検討結果＞
　各グループの摂食量及び体重の測定結果（いずれも平均値）を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
　また、各群のSafranin O染色後の画像（代表例）を図５に示す。
　また、組織画像を基に、上記3つの項目についてMankin scoreを用いてスコア化（評価者は３名）を行い解析した結果を図６ａ～ｄに示す。なお、図６ａ～ｄにおいては、ＯＡはコントロールの結果を、低濃度ＰＧはグループ１の結果を、中濃度ＰＧはグループ２の結果を、高濃度ＰＧはグループ３の結果を、他社ＰＧはグループ４の結果を、それぞれ示す。また、図６ａは「Safranin O」の解析結果を、図６ｂは「chondrocyte（軟骨細胞数）」の解析結果を、図６ｃは「Structure（軟骨表面の構造）」の解析結果を、図６ｄはこれら３項目の合計スコアの解析結果を、それぞれ示す。なお、６ａに記載のｎ数の記載は図６ｂ～ｄに共通である。
　これらの結果から、サンプル１は有意に変形性関節症モデルマウスの軟骨の損傷を抑制していることが確認できた。一方で、サンプル２には、軟骨損傷抑制効果は見られなかった。
　以上のことから、低分子量のプロテオグリカンの経口摂取によっては、変形性関節症に対する効果は得られない一方、分子量が１８０万以上（なかでも好ましくは５００万以上）のプロテオグリカンを経口摂取することにより、変形性関節症の予防又は治療を行い得ることがわかった。

Claims (6)

  1. 分子量１８０万以上のプロテオグリカンを含有する魚類軟骨水抽出物を含む、変形性関節症予防又は治療用組成物。
  2. 分子量５００万以上のプロテオグリカンを含有する魚類軟骨水抽出物を含む、請求項１に記載の変形性関節症予防又は治療用組成物。
  3. 前記魚類軟骨水抽出物が、含有するウロン酸のうち、１０質量％以上が分子量１８０万以上のプロテオグリカンに由来するウロン酸である魚類軟骨水抽出物である、請求項１又は２に記載の組成物。
  4. 前記魚類軟骨水抽出物が、含有するウロン酸のうち、７質量％以上が分子量５００万以上のプロテオグリカンに由来するウロン酸である魚類軟骨水抽出物である、請求項１～３のいずれかに記載の組成物。
  5. 魚類軟骨水抽出物が、魚類軟骨熱水抽出物である、請求項１～４のいずれかに記載の組成物。
  6. 魚類軟骨がサケ軟骨又はマス軟骨である、請求項１～５のいずれかに記載の変形性関節症予防又は治療用組成物。
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