CN104507484A - 变形性关节病预防或治疗用组合物 - Google Patents

Abstract

本发明以提供变形性关节病的预防或治疗手段作为课题。根据本发明，可以提供一种变形性关节病预防或治疗用组合物，其包含鱼类软骨水提取物，所述鱼类软骨水提取物含有分子量为180万以上的蛋白聚糖。

Description

变形性关节病预防或治疗用组合物

技术领域

本发明涉及一种变形性关节病预防或治疗用组合物。

背景技术

变形性关节病(Osteoarthritis：OA)是伴随慢性关节炎的关节疾病，是由于关节的构成要素的退变而引起软骨的破坏、骨或软骨的增殖性变化的疾病。特别是变形性膝关节病，X射线诊断的患者数有约2500万人，推测其中感到疼痛的人达到800万人以上。

尽管是这样的现状，但现在对变形性关节病只能止痛、向关节内直接注射透明质酸等对症疗法，实际上不可能停止病症发展，如果症状加剧，则不得不进行手术。在这种状況下，非常需要有效的治疗药或治疗法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2007-262103号公报

专利文献2：日本特开2009-274955号公报

发明内容

发明要解决的问题

本发明以提供变形性关节病的预防或治疗手段作为课题。

解决问题的手段

本发明人等惊奇地发现，高分子量的蛋白聚糖在变形性关节病的预防或治疗中有用，进一步进行不断的改良，从而完成了本发明。

即本发明例如包含以下各项所述的主题。

项1.

一种变形性关节病预防或治疗用组合物，其包含鱼类软骨水提取物，其中，所述鱼类软骨水提取物含有分子量为180万以上的蛋白聚糖。

项2.

如项1所述的变形性关节病预防或治疗用组合物，其包含鱼类软骨水提取物，其中，所述鱼类软骨水提取物含有分子量为500万以上的蛋白聚糖。

项3.

如项1或2所述的组合物，其中，在所述鱼类软骨水提取物所含有的糖醛酸中，10质量％以上为来源于分子量为180万以上的蛋白聚糖的糖醛酸。

项4.

如项1～3中任一项所述的组合物，其中，在所述鱼类软骨水提取物所含有的糖醛酸中，7质量％以上为来源于分子量为500万以上的蛋白聚糖的糖醛酸。

项5.

如项1～4中任一项所述的组合物，其中，鱼类软骨水提取物是鱼类软骨热水提取物。

项6.

如项1～5中任一项所述的变形性关节病预防或治疗用组合物，其中，鱼类软骨是鲑鱼软骨或鳟鱼软骨。

发明效果

根据本发明的变形性关节病预防或治疗用组合物，通过经口摄取可以预防或治疗变形性关节病。

附图说明

图1是冷冻鲑鱼鼻软骨块的照片。配置在塑料容器中央的块是冷冻鲑鱼鼻软骨块。

图2表示含有高分子量蛋白聚糖的鱼类软骨水提取物(冷冻干燥物：样品1)的糖醛酸量色谱图和280nm蛋白质量色谱图。

图3表示市售蛋白聚糖的糖醛酸量色谱图和280nm蛋白质量色谱图。

图4表示对变形性关节病模型鼠给予被测样品的计划表概要。

图5表示将给予了各被测样品的变形性关节病模型鼠的膝关节部分进行番红O染色后的图像。

图6a是表示对于经口摄取各被测样品后的变形性关节病模型鼠进行改良Mankin评分的“番红O”评价的分析结果的图表。

图6b是表示对于经口摄取各被测样品后的变形性关节病模型鼠进行改良Mankin评分的“软骨细胞数(Chondrocyte)”评价的分析结果的图表。

图6c是表示对于经口摄取各被测样品后的变形性关节病模型鼠进行改良Mankin评分的“软骨表面结构(Structure)”评价的分析结果的图表。

图6d是表示对于经口摄取各被测样品后的变形性关节病模型鼠进行改良Mankin评分的“番红O”、“软骨细胞数(Chondrocyte)”和“软骨表面结构(Structure)”合计评分的分析结果的图表。

具体实施方式

以下，对本发明进一步详细地进行说明。

蛋白聚糖是具有糖胺聚糖(粘多糖)与蛋白质键合的结构的化合物。糖胺聚糖是具有二糖的重复单元结构的酸性糖，具体而言，可以例示出硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素等。这些酸性糖成分所具有的二糖重复单元结构中，通常该二糖中一个是氨基糖，另一个是糖醛酸。因此，在蛋白聚糖的检测中，可以使用作为糖醛酸检测法常规方法之一的硫酸咔唑法。

此外，糖胺聚糖以梳齿状与蛋白质键合而成的化合物也称为蛋白聚糖单体(蛋白聚糖单体中的该蛋白质称为核蛋白质)。特别是认为在生物体内，此蛋白聚糖单体经由连接蛋白质形成与透明质酸键合的缔合体，该缔合体也称为蛋白聚糖聚合体(proteoglycan aggregate)。本说明书中的术语“蛋白聚糖”以包括蛋白聚糖单体和蛋白聚糖聚合体的含义使用。再者，透明质酸也是糖胺聚糖的一种。

本发明的变形性关节病预防或治疗用组合物包含鱼类软骨水提取物，其中，所述鱼类软骨水提取物含有高分子量的蛋白聚糖。

本发明的变形性关节病预防或治疗用组合物中包含的鱼类软骨水提取物含有高分子量蛋白聚糖。本说明书所称的高分子量蛋白聚糖具体而言是指分子量为180万以上的蛋白聚糖，优选分子量为250万以上、300万以上、400万以上、500万以上、600万以上、700万以上、800万以上、900万以上、1000万以上、1100万以上、1200万以上、1300万以上、1400万以上、1500万以上、1600万以上、1700万以上、1800万以上、1900万以上或2000万以上的蛋白聚糖。分子量越大越优选，特别优选分子量为500万以上。利用下述条件的凝胶过滤色谱法处理鱼类软骨水提取物，将得到的各馏分中含有的糖醛酸量(反映蛋白聚糖量)用硫酸咔唑法进行定量，根据该糖醛酸量制成色谱图，由此可以确认上述分子量以上的蛋白聚糖的存在。以下，有时将这样的基于糖醛酸量的色谱图称为“糖醛酸量色谱图”。此外，通过测定各馏分在280nm下的吸光度，使所含有的蛋白质量相对值化(即反映含有的蛋白质量的值)，从而也可以绘制出基于该吸光度的色谱图。以下，有时将这样的色谱图称为“280nm蛋白质量色谱图”。

〔凝胶过滤色谱法条件〕

色谱柱：琼脂糖凝胶(Sepharose)CL-2B填充色谱柱(以琼脂糖凝胶CL-2B作为载体填充到的色谱柱中而成。琼脂糖凝胶CL-2B的葡聚糖分离范围为100～20,000kDa，可以从GE Healthcare公司等获得。琼脂糖凝胶CL-2B是2％交联琼脂糖，粒径为60～200μm(利用激光衍射散射法)，CAS登录号为65099-79-8。)

缓冲液：0.1M磷酸缓冲液(pH 7.1，含有0.2M NaCl)

进样量：鱼类软骨水提取物4mg(以干燥质量换算)(溶解于1mL缓冲液中使用)

流速：0.15mL/min

馏分分离量：1mL/试管

分子量标准曲线：对于下述各种葡聚糖分子量标记物，在与上述同样的条件下进行凝胶过滤色谱法处理，利用作为用于糖检测的公知方法的酚-硫酸法来测定各馏分的吸光度(反映葡聚糖量)，求出洗脱了各标记物的馏分，制成反映该条件下凝胶过滤色谱各馏分中所含有的成分的分子量的标准曲线。“洗脱了各标记物的馏分”是指各标记物最多被洗脱的馏分。换言之，是指相当于使各葡聚糖分子量标记物在凝胶过滤时反映葡聚糖量的色谱图中峰顶的馏分。

<葡聚糖分子量标记物>

来自肠膜状明串珠菌的葡聚糖(Dextran from Leuconostocmesenteroides)(分子量5,000,000-40,000,000)(SIGMA)...色谱柱的孔隙体积(void volume)测定用，20,000kDa

葡聚糖标准品1,400,000(SIGMA)...1400kDa

葡聚糖标准品670,000(SIGMA)...670kDa

葡聚糖标准品410,000(SIGMA)...410kDa

葡聚糖标准品270,000(SIGMA)...270kDa

但是，对于来自肠膜状明串珠菌的葡聚糖，在进行了将其所含有的低分子的葡聚糖去除的前处理之后，作为标记物使用。该前处理如下进行：利用上述的〔凝胶过滤色谱条件〕使来自肠膜状明串珠菌的葡聚糖本身洗脱，回收分子量为20,000kDa以上的分子，使其冷冻干燥。具体而言，在利用酚-硫酸法测定各馏分的吸光度而制成的反映葡聚糖量的色谱图中，将相当于最开始出现的峰的馏分进行回收，将其冷冻干燥(由此，认为可以将分子量为20,000kDa以上的分子进行回收并冷冻干燥)。将此冷冻干燥物作为实际上的标记物(色谱柱的孔隙体积测定用)使用。

为了获得反映葡聚糖量的色谱图，吸光度测定按照Hodge，J.E.andHofreiter，B.T.，Method in Carbohydrate Chemistry，1338(1962)中记载的方法(酚-硫酸法)进行。具体而言，如下进行。

〔1〕在105×15mm的试管中加入试样水溶液500μL。

〔2〕加入酚试剂(5v/v％酚醛水溶液)500μL，并进行搅拌。

〔3〕加入浓硫酸2.5mL，立即剧烈搅拌10秒钟。

〔4〕室温下放置20分钟以上。

〔5〕使用分光光度计测定490nm的吸收。

再者，硫酸咔唑法是一种公知的方法，该方法将作为糖醛酸(葡萄糖醛酸(GlcA)、艾杜糖醛酸等)发色色素的咔唑溶液添加到测定样品中，使用分光光度计测定吸光度，并基于该吸光度算出糖醛酸量。使用规定浓度的葡萄糖醛酸标准溶液制成标准曲线，求出样品中的葡萄糖醛酸含量。更具体而言，如下进行。将十水四硼酸钠0.95g溶解在浓硫酸100mL得到的试剂2.5mL取到试管中并冰浴冷却。将被检体0.5mL(优选含有2～20μg糖醛酸)轻轻地叠置于其中。水浴冷却使其温度不会达到室温以上并同时充分搅拌。用玻璃球将其盖上后，在沸水浴中加热10分钟，再水浴冷却至室温。在其中加入将咔唑125mg溶解于无水甲醇100mL而成的试剂0.1mL并进行混合，并且在沸水浴中加热15分钟。之后，水浴冷却至室温，测定530nm的吸光度。使用0.5mL蒸馏水作为空白对照。同时，使用葡萄糖醛酸制成标准曲线。(下述实施例的硫酸咔唑法也按照此处记载的方法进行。)

以干燥质量换算，本发明的鱼类软骨水提取物中含有的糖醛酸量(利用硫酸咔唑法定量)总量中，优选10质量％以上为来源于分子量为180万以上的蛋白聚糖。换言之，本发明的鱼类软骨水提取物以干燥质量换算，优选分子量为180万以上的蛋白聚糖含有的糖醛酸量占提取物中含有的糖醛酸总量的10质量％以上。更优选为15质量％以上、20质量％以上、25质量％以上、30质量％以上、35质量％以上、40质量％以上、45质量％以上、50质量％以上或55质量％以上。该比例越大越优选。

此外，本发明的鱼类软骨水提取物以干燥质量换算，优选分子量为250万以上的蛋白聚糖含有的糖醛酸量占提取物中含有的糖醛酸总量的10质量％以上。更优选为15质量％以上、20质量％以上、25质量％以上、30质量％以上、35质量％以上、40质量％以上、45质量％以上、50质量％以上、55质量％以上或60质量％以上。该比例越大越优选。

此外，本发明的鱼类软骨水提取物以干燥质量换算，优选分子量为500万以上的蛋白聚糖含有的糖醛酸量占提取物中含有的糖醛酸总量的7质量％以上。更优选为10质量％以上、13质量％以上、16质量％以上、20质量％以上、24质量％以上、27质量％以上、30质量％以上、34质量％以上或37质量％以上。该比例越大越优选。

再者，特定分子量(假设为X)以上的蛋白聚糖含有的糖醛酸量占提取物中含有的糖醛酸总量的何种程度的比例可以由上述糖醛酸量色谱图的峰面积求出。具体而言，只要求出分子量X以上的糖醛酸占该糖醛酸量色谱图峰面积整体的面积比例即可。更具体而言，在纵轴为糖醛酸量、横轴为馏分编号的糖醛酸量色谱图中，穿过含有分子量X的蛋白聚糖的馏分画垂线，在被该垂线分割的峰部分中，只要求出包含分子量较大的蛋白聚糖的峰部分的面积占峰整体面积的何种程度的比例即可。

再者，本发明的鱼类软骨水提取物中含有的糖醛酸除了蛋白聚糖中含有的以外，设想还有从蛋白聚糖上断掉的糖链中含有的糖醛酸等。

此外，本发明的鱼类软骨水提取物中含有的糖醛酸量(利用硫酸咔唑法测定)以干燥质量换算，优选为该提取物的5质量％以上，更优选为7.5质量％以上，进一步优选为10质量％以上，更进一步优选为12.5质量％以上，再优选为15质量％以上，特别优选为17.5质量％以上。再者，本说明书(特别是图表)中，在表示糖醛酸量时，有时用葡萄糖醛酸的简写GlcA以“GlcA(μg)”等来表示。再者，认为鱼类软骨水提取物中含有的蛋白聚糖中的糖胺聚糖基本上都是硫酸软骨素。已知硫酸软骨素的大概量可以用糖醛酸量乘以系数2.593来求出。因而，本发明的鱼类软骨水提取物中含有的蛋白聚糖量的大概量可以用糖醛酸量乘以系数2.593来计算。

本发明的鱼类软骨水提取物由鱼类软骨(鱼类的软骨)来提取。作为鱼类，优选为鲑鱼科鲑鱼属的鱼，具体而言，可例示出鳟鱼(细鳞大马哈鱼、樱鳟、五月鳟等)、鲑鱼(白鲑、红鲑、银鲑、大鳞大马哈鱼、虹鳟等)等。此外，也可以使用鲨鱼、鳕鱼等。特别优选为鲑鱼或鳟鱼。此外，作为软骨，虽然没有特别限制，但优选为头部软骨、尤其是鼻软骨。此外，由于在将鱼类(特别鲑鱼或鳟鱼)加工成食品产品等时通常将头部丢弃，因此还存在头部软骨的获得成本低、可以大量且稳定供给的优点。

使用水来进行提取。鱼类软骨可以将取自于生物体的软骨直接用于提取，也可以将其微细化(更具体而言，小块化或粉末化)后再用于提取。此外，如下所述，也可以在提取前使用例如乙醇等有机溶剂对鱼类软骨实施脱脂处理。如此进行，可以通过水提取蛋白聚糖(含有高分子量蛋白聚糖)。此外，或者在进行水提取时，通过在将水加热的同时进行提取，或者通过使用热水或沸水，可以高效率且更有效果地得到鱼类软骨水提取物。

如上所述，鱼类软骨可以将取自于生物体的软骨直接用于提取。到用于提取时，优选为冷冻保存。冷冻方法没有特别限制，可以使用公知的冷冻方法。例如，可以例示出使用冷冻机，将鱼类软骨在-20～-80℃左右下保存24～72小时左右的方法。此外，鱼类软骨可以使用经脱脂(即去除脂肪)处理的软骨。通过使用经脱脂处理的鱼类软骨，可以得到脂质混入较少的提纯度高的鱼类软骨水提取物，从此角度考虑为优选。作为脱脂处理方法，可以例示出下述得到“脱脂处理后的鱼类软骨”的方法。

小块化鱼类软骨是将鱼类软骨小块化而成。小块化可以利用公知的方法进行。例如，可以使用公知的搅拌器、研磨机等机器，将鱼类软骨(优选冷冻鱼类软骨)进行小块化。小块化操作优选尽可能地在低温下进行。例如，优选为能够使小块化后的鱼类软骨保持冷冻状态的温度。具体而言，可以例示出0℃以下。

此外，从提取效率的角度考虑，小块化鱼类软骨优选为冷冻后的小块化鱼类软骨(冷冻小块化鱼类软骨)。冷冻小块化鱼类软骨虽然可以通过(i)将鱼类软骨冷冻后使其小块化、或者通过(ii)将鱼类软骨小块化后再冷冻来获得，但特别优选为通过(i)获得。冷冻方法没有特别限制，可以使用公知的冷冻方法。例如，可以例示出使用冷冻机，将鱼类软骨在-20～-80℃左右下保存24～72小时左右的方法。

小块化鱼类软骨或冷冻小块化鱼类软骨，每小片优选为0.001～0.5g左右，更优选为0.005～0.3g左右，进一步优选为0.01～0.1g左右。小块化操作优选为为了得到这样的小片而进行的操作(通过对使用机器条件进行研究，可以简单地确定得到这样小片的机器使用条件)。

粉末化鱼类软骨是将鱼类软骨粉末化而得的产物(鱼类软骨粉末)。粉末化可以通过公知的方法进行。例如，可以使用公知的搅拌器或研磨机等机器，将鱼类软骨(优选冷冻鱼类软骨)粉末化。粉末化操作优选尽可能在低温(例如0℃以下)下进行。

此外，从提取效率的角度考虑，粉末化鱼类软骨优选为冷冻后的粉末化鱼类软骨(冷冻粉末化鱼类软骨)。冷冻粉末化鱼类软骨虽然可以通过(i’)将鱼类软骨冷冻后使其粉末化、或者(ii’)将鱼类软骨粉末化后再冷冻而获得，但特别优选通过(i′)来获得。冷冻方法没有特别限制，可以使用公知的冷冻方法。例如，可以例示出使用冷冻机，将鱼类软骨在-20～-80℃左右下保存24～72小时左右的方法。

再者，“粉末”虽然比起“小片”是指更小的物体，但并不是想明确地区分两者。将鱼类软骨微细化后的产物中，将比较大的碎片称为“小片”，将比较小的碎片称为“粉末”。因此，虽然并不特别限制，但作为粉末，最好包含具有如下粒径的粒子粉末：即约10～1000μm左右、优选为50～500μm左右、更优选为100～200μm左右(利用激光衍射散射法测定)。优选在粉末中含有许多(例如50质量％以上、优选为70质量％以上)具有这些粒径的粒子。

所用的小块化鱼类软骨或粉末化鱼类软骨可以使用经脱脂(即去除脂肪)的鱼类软骨。即，也可以使用小块化脱脂鱼类软骨或粉末化脱脂鱼类软骨。因为通过使用经脱脂处理的鱼类软骨，可以得到脂质混入较少的提纯度高的鱼类软骨水提取物。小块化脱脂鱼类软骨或粉末化脱脂鱼类软骨可以(α)通过将经脱脂处理的鱼类软骨小块化或粉末化、或者(β)通过将鱼类软骨小块化或粉末化后经脱脂处理而获得。

作为脱脂方法可以使用公知的方法。例如，作为在上述(a)中对鱼类软骨进行脱脂处理的方法，例如，可例示出将鱼类软骨用流水冲洗1～24小时左右(例如来自自来水水龙头的流水)的方法。此外，鱼类软骨的获取可以通过公知的方法进行，例如可以例示出如下方法：将鱼类组织(优选为鱼类头部)在水中浸渍1～24小时左右使其膨润，再将软骨(优选为鼻软骨)以外的组织去除的方法；或者，将冷冻鲑鱼头部解冻后，立即取出鼻软骨，进一步用流水冲洗1～24小时左右进行清洗和脱脂的方法。在残留有肉片等时，优选利用镊子等去除残留的肉片等。再者，在此步骤鱼类软骨尚未被小块化或粉末化，因此认为即使用流水冲洗等，也几乎无法提取蛋白聚糖。此外，与下述(β)的情况同样地，也可以使用利用有机溶剂来提取去除脂质的方法。

此外，例如在(β)中，作为将小块化鱼类软骨或粉末化鱼类软骨进行脱脂处理的方法，例如，可例示出利用有机溶剂提取去除脂质的方法。作为有机溶剂，可例示出乙醇、己烷、丙酮等。更具体而言，作为上述(β)的方法，可以优选使用日本特开2009-173702号公报中记载的方法。即，例如利用包含以下工序A～E的方法得到粉末化脱脂鱼类软骨，可以将其用于本发明(更详细的条件也同日本特开2009-173702号公报中记载的条件)。

A.将冷冻的水生动物组织(鱼类组织)粉碎，向其中加入水，在温度0～20℃、pH4.8～7下进行处理的工序；

B.对A的固液混合物进行离心分离，去除最上面的脂质层和中间层的水层，回收沉淀物的工序；

C.对沉淀物进行干燥，微粉末化的工序；

D.在得到的干燥微粉末中，加入作为溶剂的己烷、丙酮或乙醇，提取去除残留脂质的工序；

E.去除溶剂的工序。

再者，进一步优选使用进行了冷冻处理和脱脂处理两者的小块化鱼类软骨或粉末化鱼类软骨(冷冻小块化脱脂鱼类软骨或冷冻粉末化脱脂鱼类软骨)。以上这些，例如可以通过将经脱脂处理的鱼类软骨冷冻，再将其小块化或粉末化而得到。

这些脱脂方法不仅可应用于小块化鱼类软骨或粉末化鱼类软骨，也可应用于取自于生物体的软骨本身。

鱼类软骨(包含小块化鱼类软骨和粉末化鱼类软骨。再者，以下有时将小块化鱼类软骨和粉末化鱼类软骨统称为“微细化鱼类软骨”。)被用于水提取。作为水提取时使用的水(以下，有时称为“提取水”)，例如，可例示出Milli-Q水、蒸馏水、去离子水、纯化水、自来水等。此外，提取水的pH通常为5.5～8.0左右、优选为pH6.0～7.5左右、更优选为pH6.5～7.5左右。不优选将酸或碱、盐类等溶解而使pH大幅变动的物质。再者，如果将有机酸或无机酸等酸化合物、或者氢氧化钠等碱化合物添加到提取水，则高分子量蛋白聚糖(特别是分子量超过1000万的高分子量蛋白聚糖)减少或消失，因此优选不添加酸化合物、碱化合物。再者，虽然并不希望是限定性的解释，但推测其是通过酸化合物、碱化合物的影响，使提取处理中蛋白聚糖聚合体崩解的原因。

水提取，例如可以通过使鱼类软骨在水中浸渍适当的时间(例如30分以上、优选为30分～24小时左右、更优选为1～12小时左右、进一步优选为2～6小时左右、更进一步优选为3～4小时左右)来进行。水量虽然没有特别限制，但例如可例示出用于提取的小块化鱼类软骨或粉末化鱼类软骨全部浸在水中程度的量。水提取时，可以静置，也可以搅拌。优选进行搅拌。此外，提取时水的温度虽然没有特别限制，但优选为50℃以上、更优选为70℃以上。因此，既可以在提取时进行加热，也可以在提取前预先加热。加热温度(即使用的水的温度)，具体而言可例示出优选为50～100℃左右、更优选为70～100℃左右、进一步优选为80～100℃左右、更进一步优选为90～100℃左右。此外，也可以在加压下加热。此外，在进行加热时，由于有可能导致高分子量蛋白聚糖因热而分解，因此可以在提取处理中更换加热了的提取水。在更换提取水时，各提取水的提取时间间隔，例如可例示出每隔15分～4小时、优选为每隔30分～2小时或1小时左右。作为优选的一种方式，可举出如下的方法：在鱼类软骨中加入可以将其全部浸渍的量的水(优选为加热了的水)，在加热3～4小时的同时静置或搅拌。此外，作为其他优选的一种方式，可举出如下的方法：将“在鱼类软骨中加入可以将其全部浸渍的量的水(优选为加热了的水)，在加热1小时的同时静置，将该水回收”这样的工序重复4次(在此情况下，合计进行了4小时的水提取)。

水提取后，通过回收液体部分，可以得到鱼类软骨水提取物。液体部分的回收可以通过例如离心分离(例如可例示以5000rpm、20分钟、在4℃下的离心分离)处理、连续离心分离处理等，回收上清来进行。该液体(上清)既可以直接作为本发明的鱼类软骨水提取物来使用，也可以利用公知的方法进一步纯化(例如脱脂)。或者，也可以利用减压蒸馏法等进行浓缩。此外，或者也可以利用冷冻干燥法、喷雾干燥法等，进行干燥、粉末化。

例如上述得到的含有高分子量蛋白聚糖的鱼类软骨水提取物优选用于变形性关节病预防或治疗用组合物。

本发明的变形性关节病预防或治疗用组合物包含鱼类软骨水提取物，其中，所述鱼类软骨水提取物含有高分子量的蛋白聚糖。本发明的变形性关节病预防或治疗用组合物优选用于医药领域和食品领域。

将本发明的变形性关节病预防或治疗用组合物用于医药领域时，该组合物(以下，有时记载为“本发明的医药组合物”)既可以只由含有高分子量蛋白聚糖的鱼类软骨水提取物组成，也可以进一步混合其他成分。例如，本发明的医药组合物中，根据需要可以混合药学上可以接受的基质、载体、添加剂(例如赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、溶剂、甜味剂、着色剂、矫味剂、矫臭剂、表面活性剂、保湿剂、防腐剂、pH调节剂、增稠剂等)等。像这样的基质、载体、添加剂等，例如在医药品添加物辞典2007(株式会社药事日报社)中有具体记载，例如可以使用其中所记载的成分。此外，根据常规方法，可以制成例如片剂、包衣片剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、胶囊剂、丸剂、液体剂、混悬剂、乳剂、胶冻剂(jelly agent)、咀嚼剂、软片剂等制剂。

本发明的医药组合物中含有高分子量蛋白聚糖的鱼类软骨水提取物的混合量只要能发挥变形性关节病预防或治疗效果，就没有特别限制，可根据每日优选的该鱼类软骨水提取物的摄取量来适当设定。优选为0.0005～100质量％、更优选为0.005～90质量％、进一步优选为0.05～80质量％。

给药本发明的医药组合物的对象是变形性关节病患者，特别是优选为变形性膝关节病患者。患者的重症度没有特别限制，初期患者、中期患者、后期患者任一的患者都可以优选使用。进一步，对于老年人等患变形性关节病可能性高的人，也可以预防性地(即作为预防药)使用。

本发明的医药组合物的给药时期没有特别限制，例如可对制剂形态、患者年龄、患者症状的程度等进行考虑而选择适当的给药时期。此外，给药形态优选为经口给药。再者，如果是咽下困难者等经口给药困难的患者时，也可以通过胃瘘管等直接送到胃里。

本发明的医药组合物的给药量可根据患者年龄、患者症状的程度、其他条件等来适当选择。通常该医药组合物中的高分子量蛋白聚糖量优选为将成人每日优选为1～1000mg、更优选为10～300mg的范围的量为基准。再者，可以分为1日1次或多次(优选为2～3次)给药。

将本发明的变形性关节病预防用组合物作为食品添加剂使用时，该组合物(以下，有时记载为“本发明的食品添加剂”)既可以是含有高分子量蛋白聚糖的鱼类软骨水提取物本身，也可以是将该提取物与作为在食品卫生学上所容许的基质、载体、添加剂、或其他食品添加剂而可利用的成分/材料等适当混合而得的组合物。此外，作为像这样的食品添加剂的形态，虽然例如可举出液状、粉末状、薄片状、颗粒状、糊状，但并不限于这些。具体而言，可以例示出调味料(酱油、沙司、番茄酱、调料(dressing)等)、薄片(鱼粉拌紫菜)、烤肉的调料汁、香辛料、面糊(咖喱面糊等)等。像这样的食品添加剂可根据常规方法来适当制备。本发明的食品添加剂中含有高分子量蛋白聚糖的鱼类软骨水提取物的混合量只要能发挥变形性关节病预防或治疗作用，就没有特别限制，但优选为0.0005～100质量％、更优选为0.005～90质量％、进一步优选为0.05～80质量％。

像这样的本发明的食品添加剂通过食用添加该食品添加剂的食品而被摄取。再者，该添加既可以在食品烹调中或制造中进行，也可以在即将食用烹调完的食品之前或在食用的同时进行。该食品添加剂通过这样经口摄取，发挥变形性关节病预防效果。再者，本发明的食品添加剂的摄取对象、含有高分子量蛋白聚糖的摄取量等各条件，虽然没有特别限制，但优选例如与上述的本发明的医药组合物相同。

将本发明的变形性关节病预防用组合物作为饮食品使用时，该组合物(以下，有时记载为“本发明的饮食品”)可以是将含有高分子量蛋白聚糖的鱼类软骨水提取物与作为食品卫生学上允许的作为基质、载体、添加剂、其他食品而可利用的成分/材料等适当混合而得的组合物。例如，可以例示出包含含有高分子量蛋白聚糖的鱼类软骨水提取物、加工食品、饮料、健康食品(营养功能食品、特定保健用食品等)、补充剂、患者用食品(医院食物、病人食物或护理食物等)等。此外，将含有高分子量蛋白聚糖的鱼类软骨水提取物进行例如冷冻干燥或喷雾干燥等，使其成为粉末状，也可以使其含在饮料类(果汁等)、点心类(例如口香糖、软糖、巧克力、糖果、饼干、曲奇饼干、年糕片、脆饼干、布丁、果冻、杏仁豆腐等)、面包类、汤类(包含粉末汤料等)、加工食品等各种饮食品中。

再者，作为健康食品(营养功能食品、特定保健用食品等)、补充剂，制备本发明的饮食品时，为了容易进行连续摄取，优选制成例如颗粒、胶囊、片剂(包含咀嚼剂等)、饮料(饮剂)等形态，其中从摄取的简便性的角度考虑优选为胶囊、药片、片剂的形态，但并不特别限定于这些。颗粒、胶囊、片剂等形态的本发明的饮食品可以使用药学上和/或食品卫生学上允许的载体等，根据常规方法来适当制备。此外，即使制成其他形态时，也只要按照以往的方法即可。

本发明的饮食品中含有高分子量蛋白聚糖的鱼类软骨水提取物的混合量只要能发挥变形性关节病预防作用，就没有特别限制，但优选为0.0005～100质量％、更优选为0.005～90质量％、进一步优选为0.05～80质量％。

本发明的饮食品可优选用于变形性关节病预防。此外，摄取对象、含有高分子量蛋白聚糖摄取量等各条件虽然没有特别限制，但优选为例如与上述的本发明的医药组合物相同。

再者，医院食物是指在医院入院时提供的饭菜，患者食物是患者用的饭菜，护理食物是指被护理者用的饭菜。本发明的饮食品可以特别优选使用作为因变形性关节病入院、在家养病等患者，或者接受护理的患者用的医院食物、患者食物或护理食物。此外，老年人等患变形性关节病可能性高的人可以进行预防性摄取。

本发明提供变形性关节病的改善方法和治疗方法，其特征在于，对变形性关节病患者和患变形性关节病可能性高的人，经口给药或经口摄取本发明的变形性关节病预防或治疗用组合物。该方法具体而言，通过经口给药或经口摄取上述的本发明的变形性关节病预防或治疗用组合物来实施。再者，该方法中经口给药或摄取量等各条件如上所述。

实施例

以下，对本发明作具体的说明，但是本发明并不限于下述的示例。

蛋白聚糖的制备

根据以下步骤，从鲑鱼鼻软骨得到含有蛋白聚糖的水提取物。作为鲑鱼鼻软骨，使用如下方法得到的鲑鱼鼻软骨：将冷冻鲑鱼头部解冻后，立即取出鼻软骨，进一步用流水冲洗6小时进行清洗和脱脂后，进一步用镊子除去肉片等，用手水洗而得到。

将鲑鱼鼻软骨保存在冷冻机中使其冷冻，将其作为“冷冻鲑鱼鼻软骨块”使用。该冷冻鲑鱼鼻软骨块的照片如图1所示。再者，虽然与使用的鲑鱼头部的大小有关，1个冷冻鲑鱼鼻软骨块大约是大小为2.5×1.5～4.5×2cm、重量为1.71～6.91g的块(每7个的平均重量为3.701g)。

通过100℃下加热冷冻鲑鱼鼻软骨块提取蛋白聚糖。

具体而言，如下进行提取。相对于冷冻鲑鱼鼻软骨块合计约1000g加入2500mL蒸馏水，100℃下加热3小时，将其通过离心分离机以8,000rpm、30分、4℃下离心分离，除去不溶物(残渣)回收上清。将回收的上清用滤纸抽滤，将得到的滤液冷冻干燥，得到含有蛋白聚糖的冷冻干燥物。将该冷冻干燥物用切碎机粉碎成粉末状，用于以下分析。得到该粉末约65g。再者，将该粉末状的含有蛋白聚糖的冷冻干燥物作为“样品1”。

分子量的研究

将样品1利用下述条件的凝胶过滤色谱法分离出各馏分。而且，将各馏分中含有的糖醛酸量利用硫酸咔唑法进行定量。此外，测定各馏分的280nm的吸光度，将该吸光度作为反映所含蛋白质量的值。而且，基于这些结果，绘制糖醛酸量色谱图和280nm蛋白质量色谱图。将糖醛酸量色谱图和280nm蛋白质量色谱图重叠绘制的图如图2所示。再者，样品1总量(约65g)中糖醛酸量约为12g。

此外，图2中，也一并显示糖醛酸量色谱图中各葡聚糖分子量标记物被洗脱的馏分位置。再者，凝胶过滤色谱法的馏分分离量如下述为1mL/试管，因此图2的横轴“洗脱体积(Elution Volume)(mL)”也反映馏分编号。

〔凝胶过滤色谱条件〕

色谱柱：琼脂糖凝胶CL-2B填充色谱柱(以琼脂糖凝胶CL-2B作为载体填充到的色谱柱中而成。琼脂糖凝胶CL-2B的葡聚糖分离范围为100～20,000kDa，可以从GE Healthcare公司等获得。琼脂糖凝胶CL-2B是2％交联琼脂糖，粒径为60～200μm(利用激光衍射散射法)，CAS登录号为65099-79-8。)

缓冲液：0.1M磷酸缓冲液(pH 7.1，含有0.2MNaCl)

进样量：以糖醛酸计为1mg/mL

流速：0.15mL/min

馏分分离量：1mL/试管

分子量标准曲线：作为分子量标记物，对于下述各种葡聚糖，在与上述相同的条件下(但进样量为1mg/1mL缓冲液)进行凝胶过滤色谱法处理，利用酚-硫酸法来测定各馏分的吸光度(反映葡聚糖量)，制成标准曲线。

<葡聚糖分子量标记物>

来自肠膜状明串珠菌的葡聚糖(分子量5,000,000-40,000,000)(SIGMA)...色谱柱的孔隙体积测定用、20000kDa

葡聚糖标准品1，400,000(SIGMA)...1400kDa

葡聚糖标准品670,000(SIGMA)...670kDa

葡聚糖标准品410,000(SIGMA)...410kDa

葡聚糖标准品270,000(SIGMA)...270kDa

但是，对于来自肠膜状明串珠菌的葡聚糖，在进行去除该标记物中含有的低分子葡聚糖的前处理后使用。该前处理利用上述的〔凝胶过滤色谱条件〕(进样量为标记物用的量)使来自肠膜状明串珠菌的葡聚糖本身洗脱，回收分子量为2000万以上的分子，再进行冷冻干燥，由此来进行。具体而言，在利用酚-硫酸法测定各馏分的吸光度而制成的反映葡聚糖量的色谱图中，将相当于最开始出现的峰的馏分进行回收，将其冷冻干燥(由此，认为可以将分子量为20,000kDa以上的分子进行回收并冷冻干燥)。将此冷冻干燥物作为实际上的标记物(色谱柱的孔隙体积测定用)使用。

为了获得反映葡聚糖量的色谱图，吸光度测定按照Hodge，J.E.andHofreiter，B.T.，Method in Carbohydrate Chemistry，1338(1962)中记载的方法(酚-硫酸法)进行。具体而言，如下进行。

〔1〕在105×15mm的试管中加入试样水溶液500μL。

〔2〕加入酚试剂(5v/v％酚醛水溶液)500μL，并进行搅拌。

〔3〕加入浓硫酸2.5mL，立即剧烈搅拌10秒钟。

〔4〕室温下放置20分钟以上。

〔5〕使用分光光度计测定490nm的吸收。

得到的标准曲线是(y＝-4.3446Ln(x)+56.68；R²＝0.9823)，由R²值考虑，可知分子量与馏分编号(即洗脱液量)相关性良好。

如图2所示那样，可知样品1中含有至少分子量为180万以上、特别是分子量为500万以上的高分子量蛋白聚糖。

此外，将作为“蛋白聚糖”的市售产品作为对照，进行相同的研究。将糖醛酸量色谱图和280nm蛋白质量色谱图重叠绘制的图如图3所示。此外，图3中，也一并显示糖醛酸量色谱图中各葡聚糖分子量标记物被洗脱的馏分的位置。该研究中制成的标准曲线是(y＝-3.943Ln(x)+59.069；R²＝0.9978)，由R²值考虑，分子量与馏分编号(即洗脱液量)相关性良好。如图3所示那样，可知市售的蛋白聚糖中几乎不含分子量为180万以上的蛋白聚糖，特别是完全不含分子量为500万以上的蛋白聚糖。再者，以下将该市售的蛋白聚糖作为“样品2”。

进一步，样品1和样品2中分子量为180万以上的蛋白聚糖含有的糖醛酸量占样品整体的糖醛酸量的比例可基于如图2和图3所示的糖醛酸色谱图计算。具体而言，如图2和图3所示的糖醛酸色谱图中，计算出分子量为180万以上的糖醛酸占峰面积整体的面积比例。更具体而言，向相当于分子量为180万的洗脱液量点画垂线，求出分割该色谱图时2部分的面积比。此外，同样也可计算样品1和样品2中分子量为500万以上的蛋白聚糖含有的糖醛酸量占样品整体的糖醛酸量的比例。结果如表1所示。

[表1]

分子量	500万以上	180万以上
			样品1	37.9％	55.8％
样品2	0.0％	3.0％

对变形性关节病效果的研究

<模型鼠的制作>

变形性关节病模型鼠按照以下步骤制成。6周龄的C57b16小鼠(雄：约20～22g)从日本SLC株式会社购入，对该小鼠大腿部皮下注射盐酸氯胺酮(Ketalar)(50mg/mL)0.3mL+二甲苯胺噻嗪(2％)0.1mL进行全身麻醉，将膝关节周边除毛，进行手术准备。小鼠的右后足进行前十字韧带切断和内侧半月板切除，另一左后足进行与右面相同地切开关节囊，不损伤切开关节囊后的韧带或半月板，直接进行缝合，作为假手术(shamoperation)。由此，进行前十字韧带的切断和半月板部分切除，制成中等程度(moderato)障碍的模型鼠。

<对于模型鼠的被测样品的摄取>

如表2所示那样，将小鼠分为4组(n＝10)。此外，1只小鼠的每日摄食量假定为4g，实验动物用一般饲料(CE-2：日本CLEA株式会社)中按表2的量混合各样品(样品1或样品2)，总量为4g。但是，关于样品2，由于含有赋形剂，因此混合成含有蛋白聚糖5mg(表2)。

[表2]

然后，为制作上述的模型鼠进行手术后，按照如下的计划表进行试验。即，手术后使模型鼠摄取混合了各样品的饲料4周，该摄食期间中在室温23±2℃、湿度50-60％的环境下以5只/笼进行饲养。

不限制行动、摄食，可自由进行。摄食量在每周更换饵食时测定，估算每日的摄食量/只。该试验计划表的概要如图4所示。再者，只摄食实验动物用一般饲料(CE-2)的对照组也进行相同的研究。

手术后4周后，麻醉下(皮下注射盐酸氯胺酮(50mg/mL)0.3mL+二甲苯胺噻嗪(2％)0.1mL)进行从小鼠心脏的采血和膝关节部分的切除。与手术时同样地进行除毛后，将大腿骨和颈骨分别切断，使方向一致地一个一个地放入样品盒中，在4％多聚甲醛中固定24小时。之后，用EDTA(0.5mol)脱钙3周，用石蜡包埋，制成约5μm厚度的脱钙标本。切片制作后，进行苏木精-伊红染色(HE染色)和番红O(Safranin O)染色。番红O是碱性色素，由于与酸性的糖胺聚糖结合呈现橙黄色，因此用作软骨组织的指标。染色后，使用改良Mankin评分(Modified Mankin score)对“番红O(染色范围：表示糖胺聚糖量)”、“软骨细胞数(Chondrocyte)”、“软骨表面结构(Structure)”3项目进行评分(3名评价者评分)，用其平均值进行关节软骨部位损伤的评价。统计学分析按照多重比较的Bonferroni/Dunn法进行。

再者，Mankin评分从1)可与人病例进行比较、2)可检查经时变化等的理由来看可靠性高，是一般作为软骨变性评价法的通用方法。本研究使用的改良Mankin评分的各项目标准如表3所示。

[表3]

<研究结果>

各组的摄食量和体重的测定结果(均为平均值)如表4所示。

[表4]

	摄食量(g/日)	体重(g)刚手术后	体重(g)手术4周后
				对昭	3.6	未记录	未记录
组1	5.18	22.59	25.59
				组2	4.93	21.92	25.43
组3	4.68	20.98	24.25
				组4	4.90	21.14	24.58

此外，各组的番红O染色后的图像(代表例)如图5所示。

此外，基于组织图像，对上述3个项目使用Mankin评分进行评分(3名评价者)，分析的结果如图6a～d所示。再者，图6a～d中，OA表示对照的结果，低浓度PG表示组1的结果，中浓度PG表示组2的结果，高浓度PG表示组3的结果，其他公司PG表示组4的结果。此外，图6a表示“番红O”的分析结果，图6b表示“软骨细胞数(Chondrocyte)”的分析结果，图6c表示“软骨表面结构(Structure)”的分析结果，图6d表示此3项的合计评分的分析结果。再者，6a记载的n数的记载在图6b～d中共通。

从这些结果可确认到样品1能显著抑制变形性关节病模型鼠的软骨损伤。另一方面，样品2中没有看到软骨损伤抑制效果。

由以上可知，通过经口摄取低分子量的蛋白聚糖，对变形性关节病未能取得效果，另一方面，通过经口摄取分子量为180万以上(其中，优选为500万以上)的蛋白聚糖，可以进行变形性关节病的预防或治疗。

Claims (6)

1.一种变形性关节病预防或治疗用组合物，其包含鱼类软骨水提取物，其中，所述鱼类软骨水提取物含有分子量为180万以上的蛋白聚糖。

2.如权利要求1所述的变形性关节病预防或治疗用组合物，其包含鱼类软骨水提取物，其中，所述鱼类软骨水提取物含有分子量为500万以上的蛋白聚糖。

3.如权利要求1或2所述的组合物，其中，在所述鱼类软骨水提取物所含有的糖醛酸中，10质量％以上为来源于分子量为180万以上的蛋白聚糖的糖醛酸。

4.如权利要求1～3中任一项所述的组合物，其中，在所述鱼类软骨水提取物所含有的糖醛酸中，7质量％以上为来源于分子量为500万以上的蛋白聚糖的糖醛酸。

5.如权利要求1～4中任一项所述的组合物，其中，鱼类软骨水提取物是鱼类软骨热水提取物。

6.如权利要求1～5中任一项所述的变形性关节病预防或治疗用组合物，其中，鱼类软骨是鲑鱼软骨或鳟鱼软骨。