JPWO2014017570A1 - 変形性関節症予防又は治療用組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
項1.
分子量180万以上のプロテオグリカンを含有する魚類軟骨水抽出物を含む、変形性関節症予防又は治療用組成物。
項2.
分子量500万以上のプロテオグリカンを含有する魚類軟骨水抽出物を含む、項1に記載の変形性関節症予防又は治療用組成物。
項3.
前記魚類軟骨水抽出物が、含有するウロン酸のうち、10質量%以上が分子量180万以上のプロテオグリカンに由来するウロン酸である魚類軟骨水抽出物である、項1又は2に記載の組成物。
項4.
前記魚類軟骨水抽出物が、含有するウロン酸のうち、7質量%以上が分子量500万以上のプロテオグリカンに由来するウロン酸である魚類軟骨水抽出物である、項1〜3のいずれかに記載の組成物。
項5.
魚類軟骨水抽出物が、魚類軟骨熱水抽出物である、項1〜4のいずれかに記載の組成物。項6.
魚類軟骨がサケ軟骨又はマス軟骨である、項1〜5のいずれかに記載の変形性関節症予防又は治療用組成物。
〔ゲル濾過クロマトグラフィー条件〕
カラム: SepharoseCL-2B 充填カラム(Sepharose CL-2Bを担体としてφ1cm×50cmのカラムに充填したもの。Sepharose CL-2Bのデキストランの分画範囲は100〜20,000kDaであり、GE Healthcare社等から入手できる。Sepharose CL-2Bは、2%架橋アガロース、粒子径60〜200μm(レーザー回折散乱法による)、CAS登録番号65099-79-8である。)
バッファー: 0.1Mリン酸緩衝液(pH 7.1, 0.2M NaCl含有)
アプライサンプル量:魚類軟骨水抽出物4mg(乾燥質量換算)(1mLバッファーに溶解させて使用)
流速: 0.15mL/min
分画フラクション量: 1mL/tube
分子量検量線:次の各種デキストラン分子量マーカーについて上記と同様の条件でゲル濾過クロマトグラフィーを行い、糖検出のための周知の方法であるフェノール・硫酸法により各フラクションの吸光度(デキストラン量を反映する)を測定し、各マーカーが溶出されたフラクションを求め、当該条件のゲル濾過クロマトグラフィーの各フラクションに含まれる成分の分子量を反映する検量線を作成する。“各マーカーが溶出されたフラクション”とは、各マーカーが最も多く溶出されたフラクションをいう。換言すれば、各デキストラン分子量マーカーをゲル濾過した際の、デキストラン量を反映するクロマトグラムにおけるピークトップに相当するフラクションである。
Dextran from Leuconostoc mesenteroides(mol wt 5,000,000−40,000,000)(SIGMA)・・・カラムのvoid volume測定用、20000kDa
Dextran Standard 1,400,000(SIGMA)・・・1400kDa
Dextran Standard 670,000(SIGMA) ・・・670kDa
Dextran Standard 410,000(SIGMA) ・・・410kDa
Dextran Standard 270,000(SIGMA) ・・・270kDa
但し、Dextran from Leuconostoc mesenteroidesについては、これに含まれる低分子のデキストランを除去する前処理を行った後、マーカーとして用いる。当該前処理は、上述の〔ゲル濾過クロマトグラフィー条件〕によりDextran from Leuconostoc mesenteroidesそのものを溶出させ、分子量20,000kDa以上の分子を回収し、凍結乾燥させることで行う
。具体的には、フェノール・硫酸法により各フラクションの吸光度を測定して作成した、デキストラン量を反映するクロマトグラムにおいて、最初に出現したピークに相当するフラクションを回収し、これを凍結乾燥する(これにより、分子量20,000kDa以上の分子を
回収、凍結乾燥できると考えられる)。この凍結乾燥物を実際にマーカー(カラムのvoidvolume測定用)として用いる。
〔1〕105×15mmの試験管に試料水溶液を500μL加える。
〔2〕フェノール試薬(5 v/v%フェノール水溶液)を500μL加え、撹拌する。
〔3〕濃硫酸を2.5mL加え、すぐに10秒間激しく撹拌する。
〔4〕室温に20分以上放置する。
〔5〕分光光度計で490nmの吸収を測定する。
A.凍結した水棲動物組織(魚類組織)を破砕し、これに水を加え、温度0〜20℃、pH4.8〜7で処理する工程
B.Aの固液混合物を遠心分離し、最上部の脂質層と中間層の水層を取り除き、沈殿物を回収する工程
C.沈殿物を乾燥し、微粉末化する工程
D.得られた乾燥微粉末に、溶媒としてヘキサン、アセトン又はエタノールを加え、残存脂質を抽出除去する工程
E.溶媒を除去する工程
プロテオグリカンの調製
以下の手順により、サケ鼻軟骨からプロテオグリカン含有水抽出物を得た。サケ鼻軟骨としては、凍結サケ頭部を解凍後、直ちに鼻軟骨を取り出し、さらに流水に6時間さらして洗浄及び脱脂した後、さらにピンセットで肉片等を取り除き、手で水洗いして得られたサケ鼻軟骨を用いた。
具体的には、次のようにして抽出を行った。凍結サケ鼻軟骨ブロック合計約1000gに対し2500mLの蒸留水を加え、100℃で3時間加熱し、それらを遠心分離機により8,000rpm、30分、4℃で遠心分離し、不溶物(残渣)を取り除き上清を回収した。回収上清を、濾紙を用いて吸引濾過し、得られた濾液を凍結乾燥し、プロテオグリカン含有凍結乾燥物を得た。当該凍結乾燥物を、カッターミルで破砕し、粉末状にして、以下の分析に供した。当該粉末は、約65g得られた。なお、当該粉末状のプロテオグリカン含有凍結乾燥物を、「サンプル1」とする。
サンプル1を、下記条件のゲル濾過クロマトグラフィーにより各フラクションに分離した。そして、各フラクションに含まれるウロン酸量をカルバゾール硫酸法により定量した。また、各フラクションの280nmでの吸光度を測定し、当該吸光度を、含まれるタンパク質量を反映する値とした。そして、これらの結果を基にして、ウロン酸量クロマトグラム及び280nmタンパク質量クロマトグラムを描いた。ウロン酸量クロマトグラム及び280nmタンパク質量クロマトグラムを重ねて描いた図を図2に示す。なお、サンプル1全量(約65g)中、ウロン酸量は約12gであった。
〔ゲル濾過クロマトグラフィー条件〕
カラム: SepharoseCL-2B 充填カラム(Sepharose CL-2Bを担体としてφ1cm×50cmのカラムに充填したもの。Sepharose CL-2Bのデキストランの分画範囲は100〜20,000kDaであ
り、GE Healthcare社等から入手できる。Sepharose CL-2Bは、2%架橋アガロース、粒子径60〜200μm(レーザー回折散乱法による)、CAS登録番号65099-79-8である。)
バッファー: 0.1Mリン酸緩衝液(pH 7.1, 0.2M NaCl含有)
アプライサンプル量:ウロン酸として1mg/ml
流速: 0.15mL/min
分画フラクション量: 1mL/tube
分子量検量線:分子量マーカーとして、次の各種デキストランについて上記と同様の条件(但しサンプルアプライ量は1mg/1mLバッファー)でゲル濾過クロマトグラフィーを行い、フェノール・硫酸法により各フラクションの吸光度(デキストラン量を反映する)を測定し、検量線を作成した。
Dextran from Leuconostoc mesenteroides(mol wt 5,000,000−40,000,000)(SIGMA)・・・カラムのvoid volume測定用、20000kDa
Dextran Standard 1,400,000(SIGMA)・・・1400kDa
Dextran Standard 670,000(SIGMA) ・・・670kDa
Dextran Standard 410,000(SIGMA) ・・・410kDa
Dextran Standard 270,000(SIGMA) ・・・270kDa
但し、Dextran from Leuconostoc mesenteroidesについては、当該マーカーに含まれる低分子のデキストランを除去する前処理を行った後、用いた。当該前処理は、上述の〔ゲル濾過クロマトグラフィー条件〕(アプライ量はマーカー用の量)によりDextran from Leuconostoc mesenteroidesそのものを溶出させ、分子量2000万以上の分子を回収し、凍結乾燥させることで行った。具体的には、フェノール・硫酸法により各フラクションの吸光度を測定して作成した、デキストラン量を反映するクロマトグラムにおいて、最初に出現したピークに相当するフラクションを回収し、これを凍結乾燥した(これにより、分子量20,000kDa以上の分子を回収、凍結乾燥できると考えられる)。この凍結乾燥物を実際にマーカー(カラムのvoid volume測定用)として用いた。
〔1〕105×15mmの試験管に試料水溶液を500μL加える。
〔2〕フェノール試薬(5 v/v%フェノール水溶液)を500μL加え、撹拌する。
〔3〕濃硫酸を2.5mL加え、すぐに10秒間激しく撹拌する。
〔4〕室温に20分以上放置する。
〔5〕分光光度計で490nmの吸収を測定する。
<モデルマウスの作製>
変形性関節症モデルマウスを以下の手順にて作製した。6週齢のC57bl6マウス(雄:約20〜22g)を日本エスエルシー株式会社から購入し、当該マウスの大腿部に、ケタラール(50mg/ml) 0.3ml + セラクタール(2%)0.1ml を皮下注射して全身麻酔をかけ、膝関節周辺を除毛し、手術準備を行った。マウスの右後足は、前十字靭帯切断および内側半月板切除を行い、一方左後足は、右と同様に関節胞を切開したが靭帯や半月板は傷つけず、そのまま縫合し、sham operation(偽手術)とした。これにより、前十字靭帯の切断と半月板部分切除を行った、中程度(moderato)の障害のモデルマウスを作製した。
表2に示されるようにマウスを4群に分けた(n=10)。また、マウス1匹の1日あたりの摂食量を4gと仮定し、実験動物用一般飼料(CE-2:日本クレア株式会社)に各サンプル(サンプル1又はサンプル2)が表2の量となるように配合し、合計量を4gとした。ただし、サンプル2に関しては、賦形剤が含まれていたため、プロテオグリカンとして5mgを含むよう、配合した(表2)。
行動や摂食に関しては制限せず、自由とした。摂食量は1週間毎に餌を交換する際に測定し、1日あたりの摂食量/匹を概算した。当該試験スケジュールの概要を図4に示す。なお、実験動物用一般飼料(CE-2)のみを摂食させたコントロール群も同様に検討を行った。
を行った。Safranin Oは、塩基性色素であり、酸性のグリコサミノグリカンと結合してオレンジ色を呈するため、軟骨組織の指標として用いられる。染色後、modified Mankin score(修正マンキンスコア)を用いて「Safranin O(染色範囲:グリコサミノグリカン量を示す)」「chondrocyte(軟骨細胞数)」「Structure(軟骨表面の構造)」の3項目をスコア化し(評価者3名による)、その平均値を用いて関節軟骨部位損傷の評価を行った。統計学的解析は、多重比較のBonferroni/Dunn法に従って行った。
各グループの摂食量及び体重の測定結果(いずれも平均値)を表4に示す。
Claims (6)
- 分子量180万以上のプロテオグリカンを含有する魚類軟骨水抽出物を含む、変形性関節症予防又は治療用組成物。
- 分子量500万以上のプロテオグリカンを含有する魚類軟骨水抽出物を含む、請求項1に記載の変形性関節症予防又は治療用組成物。
- 前記魚類軟骨水抽出物が、含有するウロン酸のうち、10質量%以上が分子量180万以上のプロテオグリカンに由来するウロン酸である魚類軟骨水抽出物である、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記魚類軟骨水抽出物が、含有するウロン酸のうち、7質量%以上が分子量500万以上のプロテオグリカンに由来するウロン酸である魚類軟骨水抽出物である、請求項1〜3のいずれかに記載の組成物。
- 魚類軟骨水抽出物が、魚類軟骨熱水抽出物である、請求項1〜4のいずれかに記載の組成物。
- 魚類軟骨がサケ軟骨又はマス軟骨である、請求項1〜5のいずれかに記載の変形性関節症予防又は治療用組成物。
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