KR20150013414A - 알긴산을 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

알긴산을 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알긴산을 유효성분으로 포함하는 골관절염 또는 골다공증의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것으로, 상기 골관절염 또는 골다공증의 치료 또는 예방용 조성물은 의약 조성물일 수 있다. 또한, 본 발명은 알긴산을 유효성분으로 포함하는 골관절염 또는 골다공증 개선 또는 예방용 식품조성물에 관한 것이다. 본 발명은 알긴산의 분자량 및 만뉴로네이트와 글루로네이트과 관련하여 골관절염 또는 골다공증의 치료, 예방 또는 개선에 최적의 조건을 확인한 것으로, 인체에 무해한 알긴산을 유효성분으로 포함하여 부작용이 없을 뿐 아니라, 골관절염 또는 골다공증 치료효과도 우수하여, 골관절염 또는 골다공증 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

알긴산을 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 조성물 {A COMPOSITION FOR THE TREATMENT OR PREVENTION OF OSTEOARTHRITS COMPRISING AN EXTRACT OF CRINUM ASIATICUM}
본 발명은 골관절염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
연골은 탄력성 있는 조직으로서 두 개의 뼈를 서로 연결하고, 관절부위에 운동성을 부여하며, 충격완화의 역할을 한다. 특히, 관절 연골은 결합조직으로서 프로티오글리칸(proteoglycan)과 타입 II 콜라겐의 매트릭스에 임베딩되어 있는 연골세포를 포함한다.
상기 연골조직이 손상되는 경우, 뼈끼리의 직접적인 마찰, 관절의 뻣뻣함, 관절 연골운동의 점진적 저하 또는 연골부위의 빈발성 통증이 유발될 수 있다.
상기 연골조직의 손상에 의한 관절 질병, 특히 골관절염은 연골 기능의 손실이 수반되는 질병으로, 가장 일반적인 관절염 증상 중의 하나이며, 많은 사람들이 상기 골관절염 증상을 가지고 있는 것으로 알려져 있다.
*상기 골관절염은 여러 가지 다른 명칭, 예를 들면 퇴행성 관절 질환, 골관절증, 비후성 관절염 또는 퇴행성 관절염 등으로 알려져 있다. 상기 골관절염은 손가락, 팔꿈치, 무릎 또는 발목과 같은 주요 관절에서의 연골 조직의 만성 진행성 파괴로 특징 지울 수 있다.
상기 골관절염의 초기 병인은 명확히 알려져 있지 않지만, 일반적으로 관절연골 매트릭스 내의 동화작용 및 이화작용과 관련된 대사기전의 변화나 불균형에 의해 연골 파괴가 초래되는 것으로 알려져 있다.
상기 골관절염과 같은 관절질환에서는 과잉의 이화작용 및 동화작용의 부족현상이 분명하게 나타나며, 이는 대사 평형의 불균형을 초래한다. 일 예로, 연골세포에 의한 이화작용의 증가로, 관절연골 매트릭스 내의 이화활성이 동화활성을 능가하게 되면, 프로티오글리칸과 타입 II 콜라겐의 구조적 파괴로 인해, 전체 매트릭스의 감소가 초래되는 것으로 알려져 있다.
현재까지 퇴행성 변화가 이미 발생한 관절을 정상 관절로 복구하는 것은 매우 어려운 것으로 알려져 있으며, 골관절염의 치료법의 경우 여러 한계점이 있는 것으로 알려져 있다.
구체적으로, 수술적 치료와 관련하여, 관절경에 의한 수술 방법의 경우 그 효과의 지속 여부가 일정하지 않고, 인공 관절 치환술의 경우 인공 관절의 수명이 제한적이기 때문에 향후 재치환술이 필요로 하고, 수술 과정에 있어 출혈이나 감염 등의 합병증이 발생할 수 있는 문제점이 있다.
최근까지 골관절염의 치료와 관련하여 약물 요법 등의 보존적 치료를 통하여 증상을 완화시키거나, 생활 습관이나 과체중 등 관절염의 악화 요인을 개선함으로써 추가적인 관절염의 진행을 막아주는 방법이 주로 시행되고 있다. 일 예로, 충분한 양의 글루코사민 화합물을 투여하면 골관절염의 소견을 보이는 관절 내 연골의 보호 또는 실제적인 질적 향상이 이루어질 수 있는 것으로 알려져 있다. 특히, 글리코사미노글리칸(GAG)의 이당류 유닛의 기본 구성분의 하나인 글루코사민 설페이트(glucosamine sulfate)는 연골세포에서 프로티오글리칸 생성을 통계적으로 유의하게 촉진시키는 것으로 나타났다. 그러나, 상기 글루코사민 화합물은 타입 Ⅱ 콜라겐을 생성에는 비교적 영향이 없는 것으로 알려져 있다.
따라서, 다른 부작용 없이 골관절염의 치료 즉, 골관절을 회복시키거나 관절을 복구시킬수 있는 천연물 유래 활성성분을 이용한 대체요법 연구가 활발히 진행되고 있다.
골조직은 교원섬유, 수산화 인회석 등의 무기질로 구성된 세포외기질(extra cellular matrix)과 조골세포, 파골세포, 골세포 등 여러 종류의 세포들로 구성되어 있는 매우 복잡하고 활동적인 조직으로서, 조골세포와 파골세포의 작용을 매개로 일생 동안 끊임없이 형성과 흡수를 반복하며 골재형성 과정을 진행해 나간다.
상기 교원섬유는 인체를 구성하고 있는 가장 많은 요소 중 하나로, 뼈뿐만 아니라, 진피, 인대, 건, 연골, 근막 또는 혈관 등의 결합조직에 광범위하게 분포되어 있다. 상기 교원섬유의 주성분은 콜라겐(collagen)이라고 하는 경섬유 단백질이다. 상기 콜라겐의 성숙한 가교물질인 피리디놀린(pyridinoline)과 디옥시피리디놀린은 파골세포에 의한 골질 파괴시 소변으로 유리되어 배설되며 이들은 골과 연골에 주로 존재하기 때문에 이는 골 대사 변질, 골 종양, 골관절염과 같은 각가지 병리행태에서 골분해의 평가를 위한 확실한 바이오마커(biomaker)로써 임상에 이용되고 있다.
상기 골재형성 과정은 PTH(parathyroid hormone), 칼시토닌(calcitonin), 에스트로겐 등과 같은 호르몬과 IGF-I(insulinlike growth factor I) 등의 골조직에서 분비되는 다양한 성장인자, TNF-α(tumor necrosis factor-α) 등과 같은 사이토카인을 통해 조골세포와 파골세포의 활성 균형을 조절하며 항상성을 유지시킨다.
그러나, 유전적, 생리적, 환경적 인자의 변화와 더불어 조골세포의 활성도가 약화되어 골형성이 감소하거나 파골세포의 활성도 강화로 골흡수가 증가되는 경우, 또는 두 가지 요소가 동시에 작용되는 경우에 골대사 질환이 발생하게 된다.
골다공증은 대표적인 골대사 질환으로, 동일 연령과 성별의 정상인에 비해 골량이 현저히 감소된 상태로 골의 구성성분의 양적 감소를 주 병변으로 하는 대사성 골 질환을 의미한다. 릭스(Riggs)와 멜톤(Melton) 등은 50세 이후의 골다공증을 제1형 골다공증(폐경기성 골다공증, postmenopausal osteoporosis) 또는 원발성 골다공증과 제2형 골다공증(노인성 골다공증, senile osteoporosis) 또는 속발성 골다공증으로 분류하였다.
상기 폐경기성 골다공증은 에스트로겐(Estrogen) 결핍에 의한 골다공증으로, 에스트로겐 결핍에 의하여 골의 무기질 성분의 감소와 교원섬유의 조성의 변화 등으로 인해 골절이 쉽게 일어날 수 있는 조건이 되는 질환을 의미한다.
골다공증의 치료방법으로는 현재 칼슘보충제, 비타민 D 대사산물과 티아자이드(thiazide) 이뇨제 요법, 칼시토닌 요법, 비스포스포네이트(bisphosphonate) 요법, 에스트로겐 요법 등이 이용되고 있으나, 아직까지 감소된 골량을 완전히 회복시킬 수 있는 약물이 없어 골다공증은 치료보다 예방의 중요성이 강조되고 있다.
또한, 폐경기성 골다공증 치료를 위해 사용되는 에스트로겐 유사물질의 경우, 장기간 사용 시 오심, 체중증가, 불규칙한 자궁출혈, 자궁내막암 및 유방암과 같은 부작용을 유발하기도 하여 최근에는 그 위험성을 보완하기 위해 다른 부작용 없이 골손실을 최소화하면서 골형성을 촉진할 수 있는 한약재 및 식품 등의 천연물 유래 활성성분을 이용한 대체요법 연구가 활발히 진행되고 있다.
알긴산(alginic acid, alginate)은 알긴산은 α-L-글루론산(guluronate)과 C5 에피머(epimer)인 β-D-만뉴론산(1,4'-β-D-mannuronate)이 α-1,4 결합 또는 β-1,4 결합으로 이루어진 hetero형 다당류로, pG block(polyguluronate block), pM block(polymannuronate block) 및 pM/G stretch 형식으로 결합된 복잡한 당중합체이다.
상기 알긴산은 주로 갈조류의 세포벽을 구성하고 있으므로, 갈조류로부터 추출하여 수득할 수 있다. 상기 알긴산은 젤형성능, 고점성, 필름형성능 등의 독특한 물리적 특성이 있어서 예로부터 광범위하게 사용되어 왔다.
예를 들어, 식품산업, 인쇄산업 및 제약산업을 포함한 다양한 산업분야에서 안정제, 점질제 또는 겔화제로 사용되고, 미립구, 비드, 마이크로캡슐 또는 정제 등과 같은 약물전달시스템의 원료로 사용되며, 조직공학에서 매트릭스 담체 등으로 사용되어 왔다.
또한, 알긴산은 비만 억제, 장의 연동운동 촉진을 통한 변비 치유, 항콜레스테롤 억제, 체내의 중금속 흡수와 제거 또는 유해물질의 독성 억제와 같은 다양한 생리활성이 보고되어, 기존 용도에 추가로 기능성 식품소재로 활용하기 위한 연구가 진행되고 있다.
또한, 상처를 보호하는 창상피복재 및 지혈 등의 생리활성효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있을 뿐만 아니라, 최근 알긴산 유래 올리고당의 항균/항암 작용, 면역 증강, 항콜레스테롤 효과, 항응고 효과 등 다양한 생체조절 기능에 대해 보고되었다.
KR 10-1177009 B KR 10-0840988 B KR 10-0740169 B
본 발명은 인체에도 무해한 천연물질을 유효성분으로 포함하는 골관절염 치료, 개선 또는 예방용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알긴산을 유효성분으로 포함하는 골관절염 또는 골다공증의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.
상기 알긴산은 알긴산의 평균 중량평균 분자량(Mw)이 1,500 내지 5,000, 바람직하게는 2,400 내지 2,600인 것일 수 있다.
상기 알긴산은 알긴산의 평균 중량평균 분자량(Mw)이 1,500 내지 5,000이고, 알긴산의 만뉴로네이트와 글루로네이트의 중량비율(M/G)이 2.0 내지 3.4, 바람직하게는 2.3 내지 2.7인 것일 수 있다.
상기 알긴산은 알긴산의 만뉴로네이트와 글루로네이트의 중량비율(M/G)이 1.6 내지 3.8, 바람직하게는 2.0 내지 3.4, 더욱 바람직하게는 2.3 내지 2.7인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 알긴산을 유효성분으로 포함하는 골관절염 또는 골다공증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 상기 식품 조성물은 식품, 식품첨가제 또는 음료일 수 있다.
상기 알긴산은 알긴산의 평균 중량평균 분자량(Mw)이 1,500 내지 5,000이고, 알긴산의 만뉴로네이트와 글루로네이트의 중량비율(M/G)이 1.6 내지 3.8인 것일 수 있다.
상기 알긴산은 알긴산의 평균 중량평균 분자량(Mw)이 1,500 내지 5,000, 바람직하게는 2,400 내지 2,600인 것일 수 있다.
또한, 상기 알긴산은 알긴산의 평균 중량평균 분자량(Mw)이 1,500 내지 5,000이고, 알긴산의 만뉴로네이트와 글루로네이트의 중량비율(M/G)이 1.6 내지 3.8, 바람직하게는 2.0 내지 3.4, 더욱 바람직하게는 2.3 내지 2.7인 것일 수 있다.
상기 알긴산은 알긴산의 만뉴로네이트와 글루로네이트의 중량비율(M/G)이 1.6 내지 3.8, 바람직하게는 2.0 내지 3.4, 더욱 바람직하게는 2.3 내지 2.7인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 알긴산의 용도(Use), 구체적으로 알긴산의 골관절염 또는 골다공증의 치료, 개선 또는 예방용 용도를 제공한다.
상기 알긴산은 알긴산의 평균 중량평균 분자량(Mw)이 1,500 내지 5,000, 바람직하게는 2,400 내지 2,600인 것일 수 있다.
상기 알긴산은 알긴산의 평균 중량평균 분자량(Mw)이 1,500 내지 5,000이고, 알긴산의 만뉴로네이트와 글루로네이트의 중량비율(M/G)이 1.6 내지 3.8, 바람직하게는 2.0 내지 3.4, 더욱 바람직하게는 2.3 내지 2.7인 것일 수 있다.
상기 알긴산은 알긴산의 만뉴로네이트와 글루로네이트의 중량비율(M/G)이 1.6 내지 3.8, 바람직하게는 2.0 내지 3.4, 더욱 바람직하게는 2.3 내지 2.7인 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 인체 안전성이 확보된 골관절염 또는 골다공증의 치료, 개선 또는 예방 효과가 있는 천연물 유래의 물질을 연구하던 중, 콜라겐 및 프로테오글리칸의 생성을 촉진시킬 수 있는 천연물 유래의 물질을 탐색해 왔으며, 상기 탐색 과정에서 갈조류로부터 추출될 수 있는 천연물인 알긴산의 경우 분자량과 알긴산을 구성하는 구성당인 만뉴로네이트(mannuronate, M)와 글루로네이트(guluronate, G)의 비율에 따라 콜라겐 생성 촉진능 및 프로테오글리칸의 생성 촉진능이 상이하다는 것이 확인되었다.
구체적으로, 중량 평균분자량(Mw)이 2,500인 경우, 중량 평균분자량이 98,000인 경우에 비하여 현저하게 콜라겐 및 프로테오글리칸의 생성을 촉진하고, 상기 알긴산에 포함된 만뉴로네이트(mannuronate, M)와 글루로네이트(guluronate, G)의 비율이 중량비를 기준으로 2.5 내지 3.2의 범위, 가장 바람직하게는 2.5에서 콜라겐 생성 촉진능 및 프로테오글리칸의 생성 촉진능이 가장 우수하다는 것을 확인하였고, 추가로 실험동물을 이용하여 관절 손상의 개선여부를 확인한 결과, 상기 글루로네이트 대비 만뉴로네이트의 비율이 중량비를 기준으로 2.5 : 1(만뉴로네이트 : 글루로네이트) 내지 3.2 : 1(만뉴로네이트 : 글루로네이트), 가장 바람직하게는 2.5 : 1(만뉴로네이트 : 글루로네이트)인 알긴산의 관절 손상 개선 효능이 가장 우수하다는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 알긴산을 유효성분으로 포함하는 골관절염 또는 골다공증 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.
상기 알긴산은 알긴산의 평균 중량평균 분자량(Mw)이 1,500 내지 5,000, 바람직하게는 2,000 내지 4,000, 더욱 바람직하게는 2,000 내지 3,000, 더더욱 바람직하게는 2,400 내지 2,600인 것일 수 있다.
상기 분자량(g/mol)은 평균 분자량일 수 있으며, 상기 측정된 분자량은 중량평균 분자량(Mw)이다.
상기 알긴산은 만뉴로네이트(mannuronate, M)와 글루로네이트(guluronate, G)의 비율이 중량비를 기준으로 1.6 내지 3.8, 바람직하게는 2.0 내지 3.4, 더욱 바람직하게는 2.2 내지 3.2, 더더욱 바람직하게는 2.5 내지 3.2 또는 2.3 내지 2.7, 가장 바람직하게는 2.5일 수 있다.
이러한 의미에서, 상기 알긴산은 만뉴로네이트(mannuronate, M)와 글루로네이트(guluronate, G)의 비율 즉, 중량을 기준으로 글루로네이트(guluronate, G) 대비 만뉴로네이트(mannuronate, M)의 비율이 1.6 내지 3.8 : 1(만뉴로네이트 : 글루로네이트), 바람직하게는 2.0 내지 3.4 : 1(만뉴로네이트 : 글루로네이트), 더욱 바람직하게는 2.2 내지 3.2 : 1(만뉴로네이트 : 글루로네이트), 더더욱 바람직하게는 2.5 내지 3.2 : 1(만뉴로네이트 : 글루로네이트) 또는 2.3 내지 2.7 : 1(만뉴로네이트 : 글루로네이트), 가장 바람직하게는 2.5 : 1(만뉴로네이트 : 글루로네이트)일 수 있다.
또한, 상기 알긴산은 중량평균 분자량(Mw)이 1,500 내지 5,000, 바람직하게는 2,000 내지 4,000, 더욱 바람직하게는 2,000 내지 3,000, 더더욱 바람직하게는 2,400 내지 2,600이고, 상기 알긴산을 구성하는 구성당인 만뉴로네이트(mannuronate, M)와 글루로네이트(guluronate, G)의 비율이 중량비를 기준으로 1.6 내지 3.8, 바람직하게는 2.0 내지 3.4, 더욱 바람직하게는 2.2 내지 3.2, 더더욱 바람직하게는 2.5 내지 3.2 또는 2.3 내지 2.7, 가장 바람직하게는 2.5일 수 있다.
본 발명의 알긴산은 상기 성분 외에 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유한 알긴산을 포함하는 조성물일 수 있다. 상기 알긴산을 포함하는 조성물에는 상기 성분들이 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다. 상기 추가성분의 함량은 바람직하게는 상기 알긴산 100 중량부 당 0.1 내지 20,000 중량부 범위에서 추가될 수 있다.
본 발명에서 골관절염(osteoarthrits)이란 관절을 보호하고 있는 연골의 점직전인 손상이나 퇴행성 변화로 인해 관절을 이루는 뼈와 인대 등에 손상이 생겨 염증과 통증이 발생하는 질환을 의미한다.
본 발명에 있어서, 골관절염은 퇴행성 관절염(Degenerative arthritis), 류마티스 관절염, 골관절증 또는 퇴행변성 관절 질병을 포함될 수 있으며, 일 예로 퇴행성 관절염일 수 있다.
상기 골관절염은 관절연골 매트릭스 내의 동화작용 및 이화작용과 관련된 대사기전의 변화나 불균형에 의해 연골 파괴가 초래되는 것으로 알려져 있다. 일 예로, 연골세포에 의한 이화작용의 증가로, 관절연골 매트릭스 내의 이화활성이 동화활성을 능가하게 되면, 프로티오글리칸과 타입 II 콜라겐의 구조적 파괴로 인해, 전체 매트릭스의 감소가 초래되는 것으로 알려져 있다.
상기 골관절염의 진행과 관련하여,연골 매트릭스에서 염증의 원인이 되는 일산화질소의 생성, 인터루킨-1(IL-1)이나 매트릭스 메탈로프로티나아제(MMPs)의 생성에 의하여 타입 Ⅱ 콜라겐과 프로티오글리칸 생성이 억제되거나 파괴됨으로써, 연골 매트릭스에 부정적인 영향이 끼쳐져, 결과적으로 골관절의 퇴화가 촉진되거나 골관절염의 발생 또는 진행되게 된다.
상기 퇴행성 관절염은 황막관절에 발생하는 퇴행성 비염증성 질환으로, 상기 퇴행성 관절염은 특발성 관절염 또는 속발성 관절염으로 구분된다.
상기 특발성 관절염은 특별한 기질적 원인 없이 나이, 성별, 유전적 요소, 비만 또는 특정 관절 부위 등의 요인에 따라 발생하는 것으로, 일차성 관절염이라고 불리운다. 상기 속발성 관절염은 관절 연골에 손상을 줄수 있는 외상, 질병 및 기형 등이 원인이 되는 것으로, 세균성 관절염이나 결핵성 관절염 등에 의해 관절 연골이 파괴된 경우 또는 심한 충격이나 반복적인 가벼운 외상 후에 발생되는 경우를 말하며, 이차성 관절염이라고 불리운다.
본 발명에서 골다공증(osteoporosis)이란 골소공증 또는 골 조송증이라고도 하며, 동일 연령과 성별의 정상인에 비해 골 량이 현저히 감소된 상태로 골의 구성성분의 양적감소를 주 병변으로 하는 대사성 골 질환을 의미한다.
본 발명에 있어서, 골다공증에는 폐경기성 골다공증, 노인성 골다공증 및 골 취약증을 포함될 수 있으며, 바람직하게는 폐경기성 골다공증일 수 있다.
상기 골다공증은 주로, 뼈조직의 감소로 뼈에 구멍이 나거나 칼슘염의 감소로 기인하여 뼈가 얇아지고 약해지는 현상을 수반한다. 따라서, 골다공증이 있는 환자는 뼈의 골절이 잘 발생하게 된다.
상기 골다공증, 특히 폐경기성 골다공증은 에스트로겐 분비의 감소와 관련된 것으로 알려져 있다. 보다 구체적으로, 월경이 일어나지 않는 폐경 상태에서는 여성호르몬인 에스트로겐의 분비가 감소하게 되며, 상기의 에스트로겐의 분비량의 감소는 뼈의 파골세포(osteoclast)의 활동을 증가시켜 뼈의 파괴를 촉진하고 뼈의 칼슘침작을 감소시키며, 콜라겐의 생성량을 감소시키기 때문인 것으로 보고되고 있다.
보다 상세하게는, 골 형성을 위해서는 칼슘(Ca)의 공급 및 콜라겐(Collagen)의 합성이 필수적으로 요구되기는 하나, 갱년기 즉, 여성의 폐경기성 골다공증의 경우 골 자체의 형성 문제보다는 골 흡수와 관련된 체내의 비정상적 호르몬 현상에 기인한 것이므로 칼슘의 부족 보다는 에스트로겐의 부족에 따른 콜라겐 합성의 저해가 원인인 것으로 보고 되고 있다.
즉, 폐경기에 의해 에스트로겐이 부족하게 되면 콜라겐의 합성이 줄어들고 칼슘의 골 침착이 감소하므로 골 흡수가 증가되어 골다공증이 유발할 수 있는 것으로 보고 되고 있다. 따라서, 폐경기성 골다공증은 단순한 칼슘의 식이 섭취만으로는 이를 치유할 수 없는 것으로 보고 되고 있다.
발명의 알긴산, 구체적으로 만뉴로네이트(mannuronate, M)와 글루로네이트(guluronate, G)의 비율이 2.5 또는 3.2인 알긴산은 해당 만뉴로네이트(mannuronate, M)와 글루로네이트(guluronate, G)의 비율이 2.5 미만이거나, 3.2를 초과한 비율을 갖는 알긴산에 비하여, 골관절 개선 기능 및 골형성 기능이 우수한 것으로 확인되었다. 구체적으로, 연골세포를 통하여 확인한 결과, 콜라겐 합성 및 프로테오글리칸의 합성을 촉진할 수 있음이 확인되었고, 골관절증을 유발한 실험동물을 이용하여 확인한 결과, 골조직의 재생을 개선할 수 있는 것이 확인되었다.
본 발명의 골관절염 또는 골다공증의 예방 또는 치료용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 알긴산을 0.001 내지 99.99중량%, 바람직하게는 0.1 내지 99 중량%로 포함할 수 있으며, 상기 골관절염 또는 골다공증의 예방 또는 치료용 조성물의 사용방법 및 사용목적에 따라 유효성분의 함량을 적절히 조절할 수 있다.
상기 조성물은 알긴산 외에 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. 상기 조성물에는 상기 성분들이 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다. 상기 추가성분의 함량은 바람직하게는 상기 알긴산 100 중량부 당 0.1 내지 20 중량부 범위에서 추가할 수 있다.
상기 알긴산을 유효성분으로 포함하는 골관절염 또는 골다공증 치료 또는 예방용 조성물은 골관절염 또는 골다공증 치료 또는 예방용 의약조성물 또는 약학조성물일 수 있다.
이러한 측면에서, 본 발명은 상기 알긴산을 유효성분으로 포함하고, 골관절염 또는 골다공증이나 골관절염 또는 골다공증 관련 질병의 치료 또는 예방 효과를 가진 의약조성물일 수 있다.
본 발명의 알긴산을 유효성분으로 포함하는 골관절염 또는 골다공증이나 골관절염 또는 골다공증 관련 질병의 치료 또는 예방용 의약조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 알긴산을 0.001 내지 99.99중량%, 바람직하게는 0.1 내지 99 중량%로 포함할 수 있다.
상기 골관절염 또는 골다공증이나 골관절염 또는 골다공증 관련 질병의 예방 또는 치료용 조성물은 그 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
상기 알긴산을 유효성분으로 포함하는 골관절염 또는 골다공증이나 골관절염 또는 골다공증 관련 질병의 예방 또는 치료용 의약조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 현탁제, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형물로 사용될 수 있다.
상기 알긴산을 유효성분으로 포함하는 골관절염 또는 골다공증이나 골관절염 또는 골다공증 관련 질병의 예방 또는 치료용 의약조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
상기 알긴산을 유효성분으로 포함하는 골관절염 또는 골다공증이나 골관절염 또는 골다공증 관련 질병의 예방 또는 치료용 의약조성물이 경구투여를 위한 고형제제인 경우, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
또한, 상기 골관절염 또는 골다공증이나 골관절염 또는 골다공증 관련 질병의 예방 또는 치료용 의약조성물이 경구투여를 위한 액상제제인 경우, 상기 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
상기 알긴산을 유효성분으로 포함하는 골관절염 또는 골다공증이나 골관절염 또는 골다공증 관련 질병의 예방 또는 치료용 의약조성물의 바람직한 투여량은 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 알긴산을 기준으로 1일 0.0001 내지 1000 mg/kg으로, 보다 효과적이기 위해서는 0.01 내지 100 mg/kg으로 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 다른 측면에서, 본 발명은 상기 알긴산을 유효성분으로 포함하고, 골관절염 또는 골다공증이나 골관절염 또는 골다공증 관련 질병의 개선 또는 예방 효과를 가진 식품조성물일 수 있다.
상기 식품조성물에 유효성분으로 포함되는 알긴산은 알긴산의 평균 중량평균 분자량(Mw)이 1,500 내지 5,000, 바람직하게는 2,000 내지 4,000, 더욱 바람직하게는 2,000 내지 3,000, 더더욱 바람직하게는 2,400 내지 2,600인 것일 수 있다.
상기 분자량(g/mol)은 평균 분자량일 수 있으며, 상기 측정된 분자량은 중량평균 분자량(Mw)이다.
상기 알긴산은 만뉴로네이트(mannuronate, M)와 글루로네이트(guluronate, G)의 비율(M/G)이 중량비를 기준으로 1.6 내지 3.8, 바람직하게는 2.0 내지 3.4, 더욱 바람직하게는 2.2 내지 3.2, 더더욱 바람직하게는 2.5 내지 3.2 또는 2.3 내지 2.7, 가장 바람직하게는 2.5일 수 있다.
구체적으로, 상기 식품조성물에 유효성분으로 포함되는 알긴산은 중량평균 분자량(Mw)이 1,500 내지 5,000, 바람직하게는 2,000 내지 4,000, 더욱 바람직하게는 2,000 내지 3,000, 더더욱 바람직하게는 2,400 내지 2,600이고, 상기 알긴산을 구성하는 구성당인 만뉴로네이트(mannuronate, M)와 글루로네이트(guluronate, G)의 비율(M/G)이 중량비를 기준으로 1.6 내지 3.8, 바람직하게는 2.0 내지 3.4, 더욱 바람직하게는 2.2 내지 3.2, 더더욱 바람직하게는 2.5 내지 3.2 또는 2.3 내지 2.7, 가장 바람직하게는 2.5일 수 있다.
본 명세서에서 식품이란 함은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 건강 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 의도이다.
본 발명의 알긴산을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실,채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
본 발명에서 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다.
상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함하는 의도이다.
상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 알긴산을 유효성분으로 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기의 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 1 g 내지 20 g, 바람직하게는 5 g 내지 12 g이다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하지 않지만, 본 발명의 알긴산 100 중량부 당 0 내지 20,000 중량부 범위에서 선택될 수 있다.
본 발명에서 기능성 음료란 음료에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 음료의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 음료 군이나 음료 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 음료를 의미한다.
상기 기능성 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 알긴산을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 1 g 내지 20 g, 바람직하게는 5 g 내지 12 g일 수 있다.
또한, 골관절염 또는 골다공증의 개선 또는 예방을 목적으로 하는 식품 조성물에 있어서, 상기 알긴산의 양은 전체 식품 중량의 0.01 중량% 내지 15 중량%로 포함할 수 있으며, 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 g 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 g 내지 1 g의 비율로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 알긴산의 용도(Use), 구체적으로 알긴산의 골관절염 또는 골다공증의 치료, 개선 또는 예방용 용도에 관한 것이다.
상기 알긴산은 알긴산의 평균 중량평균 분자량(Mw)이 1,500 내지 5,000, 바람직하게는 2,400 내지 2,600인 것일 수 있다.
상기 알긴산은 알긴산의 평균 중량평균 분자량(Mw)이 1,500 내지 5,000이고, 알긴산의 만뉴로네이트와 글루로네이트의 중량비율(M/G)이 1.6 내지 3.8, 바람직하게는 2.0 내지 3.4, 더욱 바람직하게는 2.2 내지 3.2, 더더욱 바람직하게는 2.5 내지 3.2 또는 2.3 내지 2.7, 가장 바람직하게는 2.5일 수 있다.
상기 알긴산은 알긴산의 만뉴로네이트와 글루로네이트의 중량비율(M/G)이 1.6 내지 3.8, 바람직하게는 2.0 내지 3.4, 더욱 바람직하게는 2.2 내지 3.2, 더더욱 바람직하게는 2.5 내지 3.2 또는 2.3 내지 2.7, 가장 바람직하게는 2.5일 수 있다.
상기 알긴산, 구체적으로, 중량평균 분자량(Mw)이 1,500 내지 5,000, 바람직하게는 2,000 내지 4,000, 더욱 바람직하게는 2,000 내지 3,000, 더더욱 바람직하게는 2,400 내지 2,600이고, 상기 알긴산을 구성하는 구성당인 만뉴로네이트(mannuronate, M)와 글루로네이트(guluronate, G)의 비율이 중량비를 기준으로 1.6 내지 3.8, 바람직하게는 2.0 내지 3.4, 더욱 바람직하게는 2.2 내지 3.2, 더더욱 바람직하게는 2.5 내지 3.2 또는 2.3 내지 2.7, 가장 바람직하게는 2.5인 알긴산은 다른 범위의 분자량 또는 다른 범위의 만뉴로네이트와 글루로네이트의 비율을 갖는 알긴산에 비하여 연골세포에서의 현저하게 우수한 콜라겐 생성 촉진능 및 프로테오글리칸 생성 촉진능을 가지고, 골관절의 치료효과를 가지므로, 퇴행성 골관절염과 같은 골관절염 또는 골다공증이나 골관절염 또는 골다공증 관련 질환의 치료, 개선 또는 예방용 용도가 우수한 것으로 평가된다.
본 발명의 알긴산은 연골세포를 이용하여 실험한 결과, 분자량 또는 만뉴로네이트와 글루로네이트의 중량비율이 다른 범위를 갖는 알긴산에 비하여 현저하게 우수한 콜라겐 합성 촉진능 및 프로테오글리칸 합성 촉진능을 가지며, 골관절증을 유발시킨 동물실험을 통하여 확인한 결과, 골관절증 개선능이 현저하게 우수한 것이 확인되었으며, 상기 유효성분인 알긴산은 식품으로 이용되는 해조류인 갈조류로부터 제조될 수 있는 것으로 부작용에 대한 문제도 없을 것으로 예상되어, 골관절염 또는 골다공증 등의 새로운 예방 또는 치료제로서 매우 가치가 높을 것으로 판단된다.
도 1 내지 도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 알긴산 종류에 따른 실험동물의 골관절증 개선 여부를 확인한 사진으로, 상기 도 1은 위약을 투여한 대조군이고, 도 2는 알긴산의 만뉴로네이트와 글루로네이트의 중량비율(M/G)이 1.1인 알긴산을 투여한 실험동물의 대퇴부의 관절면을 촬영한 사진이며, 도 3은 알긴산의 만뉴로네이트와 글루로네이트의 중량비율(M/G)이 1.6인 알긴산을 투여한 실험동물의 대퇴부의 관절면을 촬영한 사진이고, 도 4는 알긴산의 만뉴로네이트와 글루로네이트의 중량비율(M/G)이 2.5인 알긴산을 투여한 실험동물의 대퇴부의 관절면을 촬영한 사진이며, 도 5는 알긴산의 만뉴로네이트와 글루로네이트의 중량비율(M/G)이 3.2인 알긴산을 투여한 실험동물의 대퇴부의 관절면을 촬영한 사진이고, 도 6은 알긴산의 만뉴로네이트와 글루로네이트의 중량비율(M/G)이 3.8인 알긴산을 투여한 실험동물의 대퇴부의 관절면을 촬영한 사진이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 기재한다. 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 알긴산 올리고당의 제조
5 L 발효관을 이용하여, 증류수 3,000 ml에 중량 평균 분자량(Mw)이 100,000에서 500,000을 갖는 알긴산나트륨(현대화성, 대한민국) 150 g을 첨가한 후, 알긴산나트륨을 완전히 용해하여 알긴산 나트륨 수용액을 제조하였다.
상기 발효관 온도를 35℃로 고정한 후 알긴산 분해효소(alginate lyase, sigma, USA,)를 15 mg(3,500 unit/g)을 첨가한 후, 20시간 동안 분해반응을 수행하였다.
상기 분해반응 후, 발효관 온도를 90℃로 승온하여 효소에 의한 분해반응을 정지시키고, 냉각수를 순환시켜 효소반응시킨 알긴산나트륨 수용액을 냉각시켰다. 상기 효소에 의한 분해반응을 수행한 알긴산 수용액으로부터 각 분자량 범위에 따른 알긴산을 수득하기 위하여, 한외여과막(Millipore UF filtration, MWCO 10,000)을 이용하여 여과를 수행하였다.
상기 한외여과막에 의해 수득된 알긴산의 분자량을 GPC(Gel Permeation Chromatography)법으로 측정한 결과, 상기 알긴산의 질량 평균분자량(Mw)이 2,500임을 확인하였다.
또한, 상기 알긴산 질량 평균분자량(Mw)이 98,000 및 2,500인 알긴산에 대하여, 각각 만뉴로네이트(mannuronate, M)와 글루로네이트(guluronate, G)의 비율을 중량비를 기준으로 측정하였다.
상기 알긴산의 만뉴로네이트와 글루로네이트의 중량비율(M/G ratio)은 알긴산(Alginate)으로부터 폴리 만뉴로네이트(poly-mannuronic acid, PMA)와 폴리 글루로네이트(poly-guluronic acid, PGA)를 부분 추출하여, 동결건조 후 무게를 측정한 후, 만뉴로네이트와 글루로네이트의 중량비율(M/G weigh ratio)을 결정하였다.
상기 폴리 만뉴로네이트(poly-mannuronic acid, PMA)와 폴리 글루로네이트(poly-guluronic acid, PGA)의 부분 추출방법(partial acid hydrolysis)은 Mahesh 등의 방법을 이용하여 수행하였다.
구체적으로, 각각 5 g의 알긴산에 0.25M H2SO4 125ml를 가하여, 상기 알긴산을 잘 녹인 후, 전자레인지(Microwave, MR-208, LG전자, 대한민국)를 이용하여 최대 출력(700W)으로 하여 4분간 가열하였다. 상기 가열된 알긴산 용액을 상온으로 냉각한 후, 여과지(Whatman NO.4)를 이용하여 여과하였다. 여과과정 후, 수득된 잔사를 0.1M Na2CO3로 용해시켰다. 상기 용액의 pH를 0.1M HCl를 이용하여 pH 2.85로 맞춘 후, 원심분리를 통하여 침전물을 회수하는 방법으로, 폴리 글루로네이트(poly-guluronic acid, PGA)를 수득하였다. 또한, 상기 원심분리 후, 수득한 상등액에 대해 pH를 0.1M HCl를 이용하여 pH 1.5로 맞춘 후, 원심분리를 통하여 침전물을 회수하는 방법으로, 침전된 폴리 만뉴로네이트(poly-mannuronic acid, PMA)를 수득하였다.
상기 수득한 폴리 글루로네이트 및 폴리 만뉴로네이트를 각각 pH 7.0으로 중화한 후, - 80℃에서 동결건조하여 각각의 무게를 측정하여, 만뉴로네이트와 글루로네이트의 중량비율(M/G ratio)을 결정하였다.
실시예 2: 연골세포 배양
2주령 토끼(한국생명과학연구소, 대한민국)의 무릎관절에서 연골을 채취하여, 배양액, 구체적으로 혈청-부재 DMEM 1.6 ml(Pharmacia Biotech. USA)에 상기 채취한 연골을 담근 후, 1% 콜라게나아제(Sigma, USA) 0.4 ml를 첨가하였다.
상기 콜라게나아제를 첨가한 연골이 담긴 배양액을 37℃의 CO2배양기에 넣은 후 30분마다 세포를 흔들어 주면서 6시간 정도 반응을 진행시켜, 연골조직에 있는 콜라겐을 콜라게아나아제로 분해함으로써, 연골조직의 연골세포를 단일 세포 단위로 분리하였다. 상기 과정을 수행한 후, 상기 연골이 담긴 배양액을 원심분리하여 상층액을 버리고, 완전배지(혈청-함유 DMEM)를 1 ml 넣어, 토끼 한 마리당 2 ml의 정상 배지(10% FBS DMEM)에 희석하여 세포 현탁액을 만들었다.
상기 세포 현탁액의 세포수를 계수한 후, 0.5 x 105cells/cm2세포밀도가 되도록 정상 배지(10% FBS DMEM)로 희석하고, 상기 희석하여 제조한 세포배양액을 각각의 디쉬(dish)에 분주한 후, 실험에 이용하였다.
실시예 3: 알긴산의 타입 Ⅱ 콜라겐의 합성 증진에 대한 효과
상기 실시예 2에서 분주한 연골세포가 담긴 각각의 디쉬를 대조군(미처리군), 저분자 알긴산(평균분자량 2,500, M/G 비율 1.6) 처리군 및 고분자 알긴산(평균분자량 98,000, M/G 비율 1.6) 처리군으로 나누고, 대조군은 아무 처리를 하지 않고, 저분자 알긴산 처리군과 고분자 알긴산 처리군은 각각 상기 알긴산을 100 ㎎/L씩 처리를 한 후, 상기 대조군, 저분자 알긴산 처리군 및 고분자 알긴산 처리군을 37℃의 CO2배양기에서 48시간 배양하였다. 상기 배양 후, 콜라겐에 대한 항체(Chemicon international, USA)를 이용하여, 웨스턴 블롯팅을 실시하였다(Peter B. Kaufma etal.,MolecularandCellularMethodsinBiologyandMedicine,108-121,CRCpress).
상기 웨스턴 블롯팅 결과 수득한 필름을 이용하여 발현된 단백질 양을 확인하였고, 확인된 단백질의 발현을 정량적으로 분석하기 위해 image J 2.0 프로그램(Quantity One®BIO-RAD,USA)을 이용하여 발현된 각각의 목적 단백질인 타입 Ⅱ 콜라겐과 internal control로 사용된 β-actin 양을 측정하고 β-actin을 각 단백질의 기준으로 정하여 정량을 유도해 내었다. 상기 정량 과정에서 대조군에서의 시료에서의 타입 Ⅱ 콜라겐과 β-actin의 함량을 calibrator로 정하여 정량하였다. 상기 실험을 총 3회 반복하였으며, 상기 3회 반복한 결과의 정량 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
구분 대조군 고분자 알긴산 저분자 알긴산
Relative Expression Level
(Collagen type II/actin) 		1.11 1.21 2.52
0.85 1.10 2.74
1.05 1.11 2.65
상기 표 1에서 볼 수 있듯이, 저분자 알긴산 처리군에서 연골세포에 의한 타입 Ⅱ 콜라겐의 발현이 대조군에 비해 발현도가 현저하게 상승된 것이 확인되었다. 그러나, 고분자 알긴산을 처리한 경우에는, 대조군에 비하여 타입 Ⅱ 콜라겐의 발현도에 변화가 거의 없음을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터, 저분자 알긴산이 연골세포를 활성화하여 타입 Ⅱ 콜라겐 합성을 향상시키는 반면, 고분자 알긴산은 타입 Ⅱ 콜라겐 합성에 미비한 영향을 주는 것이 확인되었다.
실시예 4: 알긴산의 프로테오글리칸의 합성 증진에 대한 효과
알긴산 분자량에 따라 연골조직 매트릭스를 형성하는 프로테오글리칸의 합성에 미치는 영향을 분석하기 위하여, 상기 실시예 3과 같이, 대조군(미처리군), 저분자 알긴산 처리군 및 고분자 알긴산 처리군으로 구분하여, 알시안 블루 염색분석법(Alcian Blue staining assay)으로 프로테오글리칸의 양을 측정하였다.
구체적으로, 상기 실시예 3과 같이, 대조군은 아무 처리를 하지 않고, 저분자 알긴산 처리군과 고분자 알긴산처리군은 각각 상기 알긴산을 100 ㎎/L씩 처리를 한 후, 상기 대조군, 저분자 알긴산 처리군 및 고분자 알긴산 처리군을 37℃의 CO2배양기에서 48시간 배양한 후, 상기 배양액의 OD 값을 측정하였다. 상기 실험을 총 3회 반복하였으며, 상기 3회 반복한 결과의 정량 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
구분 대조군 고분자 알긴산 저분자 알긴산
프로테오글리칸 농도(OD) 0.245 0.255 0.345
0.235 0.231 0.386
0.263 0.268 0.441
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 연골조직 매트릭스 분자인 프로테오글리칸을 측정하기 위하여 알시안 블루 염색법을 실시한 결과, 저분자 알긴산 처리군에서 프로테오글리칸의 양이 대조군에 비해 현저하게 증가하였으나, 고분자 알긴산 처리군의 경우에는 프로테오글리칸의 양이 유의적으로 증가하지 못한 것으로 확인되었다.
상기 결과로부터, 저분자 알긴산은 연골세포에 의한 프로테오글리칸의 합성을 촉진하는 반면, 고분자 알긴산은 프로테오글리칸의 합성에는 영향을 주지 못하는 것으로 확인되었다.
실시예 5: 알긴산의 M/G 비율에 따른 콜라겐의 합성 증진에 대한 효과
상기 실시예 3에서 콜라겐 합성을 촉진하는 것으로 확인된 저분자 알긴산(질량 평균분자량(Mw) 2,500)에서, 상기 알긴산을 구성하는 만뉴로네이트(mannuronate, M)와 글루로네이트(guluronate, G)의 비율을 글루로네이트와 만뉴로네이트의 중량비(M/G)로 구분하고, 상기 중량비(M/G)에 따른 콜라겐 합성능을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
우선, 상기 실시예 3과 같은 연골세포가 담긴 디쉬에 각각의 알긴산을 처리하여, 아무런 시료를 처리하지 않은 대조군(미처리군)과 M/G 비율이 1.1, 1.6, 2.1 및 2.5인 저분자 알긴산을 각각 100 ㎎/L씩 처리한 군으로 구분하여 저분자 알긴산을 처리한 후, CO2배양기를 이용하여 37℃ 조건에서 48시간 배양하였다. 상기 배양 후, 상기 실시예 3과 같은 방법으로 웨스턴 블롯팅을 실시하고, internal control로 사용된 β-actin 양에 대한 콜라겐 양을 측정한 후, 대조군의 각 단백질을 calibrator로 정하여 정량하여, 알긴산의 글루로네이트 대비 만뉴로네이트의 중량비(M/G)에 따른 타입 Ⅱ 콜라겐의 발현도를 측정하여, 표 3에 나타내었다.
구분 대조군 저분자 알긴산
M/G 비율
1.1 1.6 2.1 2.5 3.2 3.8
Relative Expression Level
(Collagen type II/actin) 		1.02 1.04 1.87 2.15 2.74 2.81 1.90
0.98 1.15 1.75 2.25 2.61 2.57 1.94
0.94 1.21 1.81 2.14 2.71 2.70 1.89
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 저분자 알긴산을 첨가한 경우, 콜라겐 합성량이 증가됨이 확인되었다. 특히, 알긴산의 글루로네이트 대비 만뉴로네이트의 중량비(M/G)가 증가함에 따라 콜라겐 합성량이 증가하다, 알긴산의 글루로네이트와 만뉴로네이트의 중량비(M/G)가 2.5인 알긴산을 첨가한 경우, 콜라겐 합성량이 가장 높은 것으로 확인되었으며, 알긴산의 글루로네이트 대비 만뉴로네이트의 중량비(M/G)가 3.2에서는 알긴산의 글루로네이트 대비 만뉴로네이트의 중량비(M/G)가 2.5 경우와 거의 유사한 정도를 나타내었으나, 알긴산의 글루로네이트 대비 만뉴로네이트의 중량비(M/G)가 3.8에서는 다시 콜라겐 합성량이 현저하게 감소된 것이 확인되었다.
상기 결과로부터, 글루로네이트 대비 만뉴로네이트의 중량비(M/G)는 1.6 내지 3.8의 범위에서 알긴산 무첨가 또는 실시예 3에서 확인된 고분자 알긴산을 첨가한 경우에 비하여 높은 콜라겐 생성 촉진능이 확인되었고, 콜라겐 합성량 생성 촉진에 적합한 글루로네이트 대비 만뉴로네이트의 중량비(M/G)는 2.5 내지 3.2 의 범위에서 상기 범위를 벗어나는 경우에 비하여 현저하게 우수한 콜라겐 생성 촉진능이 확인되었으며, 글루로네이트 대비 만뉴로네이트의 중량비(M/G)는 2.5의 경우가 가장 우수한 콜라겐 생성 촉진능을 갖는 것으로 확인되었다.
실시예 6: 알긴산의 M/G 비율에 따른 프로테오글리칸의 합성 증진에 대한 효과
본 발명의 저분자 알기산이 연골조직 매트릭스를 형성하는 프로테오글리칸의 합성에 미치는 영향을 분석하였다. 프로테오글리칸의 양을 측정하기 위하여 알시안 블루 염색분석법(Alcian Blue staining assay)을 실시하였다.
상기 실시예 4에서 프로테오글리칸 생성을 촉진하는 것으로 확인된 저분자 알긴산(질량 평균분자량(Mw) 2,500)에서, 상기 실시예 5와 같이 알긴산을 구성하는 만뉴로네이트(mannuronate, M)와 글루로네이트(guluronate, G)의 중량비(M/G)에 따른 프로테오글리칸 생성 촉진능을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
우선, 상기 실시예 5와 같이 아무런 시료를 처리하지 않은 대조군(미처리군)과 M/G 비율이 1.1, 1.6, 2.1 및 2.5인 저분자 알긴산을 각각 100 ㎎/L씩 처리한 군으로 구분한 연골세포를 CO2배양기를 이용하여 37℃ 조건에서 48시간 배양하였다. 상기 실시예 4와 같이, 상기 배양 후 상기 배양액의 OD 값을 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
구분 대조군 저분자 알긴산
M/G 비율
1.1 1.6 2.1 2.5 3.2 3.8
프로테오글리칸 농도(OD) 0.265 0.278 0.355 0.411 0.436 0.432 0.375
0.245 0.262 0.388 0.414 0.431 0.430 0.404
0.249 0.264 0.395 0.425 0.445 0.446 0.411
상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 저분자 알긴산을 첨가한 경우, 프로테오글리칸 생성량이 증가됨이 확인되었다. 특히, 알긴산의 글루로네이트 대비 만뉴로네이트의 중량비(M/G)가 증가함에 따라 프로테오글리칸 생성량이 증가하다, 알긴산의 글루로네이트 대비 만뉴로네이트의 중량비(M/G)가 2.5인 알긴산을 첨가한 경우, 프로테오글리칸 생성량이 가장 높은 것으로 확인되었으며, 알긴산의 글루로네이트 대비 만뉴로네이트의 중량비(M/G)가 3.2에서는 알긴산의 글루로네이트 대비 만뉴로네이트의 중량비(M/G)가 2.5 경우와 거의 유사한 정도를 나타내었으나, 알긴산의 글루로네이트 대비 만뉴로네이트의 중량비(M/G)가 3.8에서는 다시 프로테오글리칸 생성량이 현저하게 감소된 것이 확인되었다.
상기 결과로부터, 글루로네이트 대비 만뉴로네이트의 중량비(M/G)는 1.6 내지 3.8의 범위에서 알긴산 무첨가 또는 실시예 3에서 확인된 고분자 알긴산을 첨가한 경우에 비하여 높은 프로테오글리칸 생성능이 확인되었고, 프로테오글리칸 생성 촉진에 적합한 글루로네이트 대비 만뉴로네이트의 중량비(M/G)는 2.1 내지 3.2, 더욱 구체적으로 2.5 내지 3.2의 범위에서 상기 범위를 벗어나는 경우에 비하여 현저하게 우수한 프로테오글리칸 생성 촉진능이 확인되었으며, 글루로네이트 대비 만뉴로네이트의 중량비(M/G)는 2.5의 경우가 가장 우수한 프로테오글리칸 생성 촉진능을 갖는 것으로 확인되었다.
실시예 7: 동물모델을 이용한 골관절염 치료 효능 분석
실시예 7-1: 실험 동물의 사육
체중 3 kg 내지 3.5 kg의 뉴질랜드 흰색 토끼(New Zealand white rabbit, 자성, 한국생명과학연구소, 대한민국) 30마리를 5마리씩 6군으로 구분하여, 각각 분리된 철제 케이지에서 사육하였다. 상기 실험동물의 사육은 오전 7시부터 오후 7시까지 빛을 가하는 일정한 명암주기, 21℃ 내지 25℃의 온도 및 45% 내지 65%의 상대습도의 조건에서 사육하였으며, 실험동물의 사료는 일반적인 펠렛건조 사료(대한실험동물, 대한민국)를 사용하였고, 사료와 물은 상시로 섭취할 수 있게 하였다.
실시예 7-2: 골관절증 치료 효능 측정
상기 골관절증 치료 효능을 확인하기 위해, 상기 실시예 6-1에서 사육한 실험동물에 대해 골관절증을 유발하였다. 상기 골관절증 유발은 우측 후지의 전십자인대 절제 방법으로 실시하였다.
구체적으로, 자일라진 하이드로클로라이드(xylazine hydrochloride) 3 mg/kg 및 케타민 하이드로클로라이드(ketamine hydrochloride) 50 mg/kg을 근육주사하여 실험동물을 전신마취 한 후, 우측 후지부를 제모하고 70% 알코올 수용액과 10% 포비돈-요오드액을 이용하여 소독을 하였다. 상기 제모 및 소독을 수행한 우측 후지부 중, 무릎관절 내측부를 2 cm 절개하고 근막과 관절낭을 절개 후, 슬개골을 외측으로 젖혀서 전십자인대를 노출시켰다. 상기 노출된 전십자인대를 11호 블레이드를 이용하여 절제한 후, 생리식염수로 세척하였다. 상기 전십자인대 절제 후, 슬개골을 제위치시키고 관절낭과 근막을 4-0 흡수성 봉합사로 단속 봉합하고, 피부는 3-0 비흡수성 봉합사로 연속 및 단속 봉합하였다. 상기 10% 포비돈-요오드액으로 봉합부를 소독한 후, 항생제(enrofloxacin)를 5 mg/kg(실험동물의 체중) 함량으로 피하주사하였다.
상기 골관절증 유발시킨 실험동물에 대해서 알긴산을 경구투여하였다. 상기 경구투여는 5군으로 구부하여 수행하였다. 우선, 대조군은 생리식염수를 0.5 ml/㎏(Body Weith, B.W) 투여하였고, 실험군으로 상기 실시예 1에서 질량 평균분자량(Mw)이 2,500으로 확인된 저분자 알긴산을 만뉴로네이트(mannuronate, M)와 글루로네이트(guluronate, G)의 중량비율(M/G)로 상기 실시예 5 및 6과 같이 구분하여 경구투여하였다. 구체적으로, M/G 비율이 1.1인 저분자 알긴산 투여군, M/G 비율이 1.6인 저분자 알긴산 투여군, M/G 비율이 2.5 저분자 알긴산 투여군, M/G 비율이 3.2 저분자 알긴산 투여군 및 M/G 비율이 3.8 저분자 알긴산 투여군으로 알긴산 종류를 구분하고, 상기 각각의 알긴산 30 ㎎/㎏(B.W)을 0.5 ml/㎏(B.W) 생리식염수에 녹여 투여하였다.
상기 대조군 및 실험군은 모두 수술 후 다음날부터 5주째 되는 날까지 매일 경구투여 하였다.
상기 5주간 경구투여 후, 수술 후 6주째 상기 대조군 및 실험군에 속하는 모든 실험동물을 자일라진과 케타민으로 마취시킨 후 티오펜탈 소듐(thiopental sodium)을 심장내 주입하여 안락사 시킨 후 무릎 관절을 노출시켜 중간 대퇴부와 측면 대퇴부의 관절면을 육안으로 관찰하였다. 구체적으로, 상기 노출된 대퇴부의 관절면에 인디안 잉크를 도포하여 대퇴부 관절의 내측 및 외측에서 연골 결손부의 깊이를 확인하였고, 골관절염의 심각도(severity)는 1에서 4의 네 단계로 나누어 점수를 부여 하였다.
구체적으로, 1은 관절면이 정상으로 보이며 잉크가 묻지 않는 상태를 나타내고, 2는 겉보기엔 정상으로 보이나 잉크 도포시 연회색의 반점형태로 묻는 것을 나타내며, 3은 관절면이 우둘투둘하며 잉크 도포시 진한 검은 반점이 형성되는 것을 나타내고, 4는 연골하골이 드러난 것을 나타낸다.
상기 점수를 측정한 후, 각 군 별 5마리의 실험결과의 평균을 계산하였다. 객관적인 비교를 위해 2명의 관찰자가 이중맹검법으로 검사를 실시하였다. 상기 관찰한 실험동물의 연골 결손부를 촬영한 사진을 도 1 내지 도 6에 나타내었고, 상기 계산된 평균값을 하기 표 5에 나타내었다.
구분 대조군 저분자 알긴산
M/G 비율
1.1 1.6 2.5 3.2 3.8
중간 대퇴골 3.65± 0.8 3.25± 0.5 2.90± 0.3 2.52± 0.3 2.62± 0.3 3.05± 0.4
측부 대퇴골 3.42± 0.5 3.16± 0.6 2.75± 0.5 2.22± 0.3 2.18± 0.3 2.98± 0.4
총 평균 3.54± 0.7 3.21± 0.7 2.82± 0.4 2.37± 0.3 2.40± 0.3 3.02± 0.4
상기 도 1 및 표 5에 나타낸 바와 같이, 저분자 알긴산을 첨가한 경우에 대조군(도 1)에 비하여 현저한 골관절증 심각도의 감소현상이 확인되었다.
구체적으로, 글루로네이트 대비 만뉴로네이트의 중량비(M/G)가 1.6 내지 3.8(도 3 내지 도 6)의 범위에서 알긴산 무첨가 즉, 위약으로 식염수를 투여한 대조군(도 1) 또는 글루로네이트 대비 만뉴로네이트의 중량비(M/G)가 1.1(도 2)인 알긴산 첨가에 비하여 유의적인 골관절증 심각도 감소현상이 확인되었고, 글루로네이트 대비 만뉴로네이트의 중량비(M/G)가 2.5(도 4) 내지 3.2(도 5)의 범위에서 상기 범위를 벗어나는 경우에 비하여 현저하게 우수한 골관절증 개선 효능이 확인되었으며, 글루로네이트 대비 만뉴로네이트의 중량비(M/G)는 2.5(도 4)의 경우 전체 연골의 손상 부위가 깨끗이 개선되는 것을 확인할 수 있어서, 가장 우수한 골관절증 개선 효능을 가지는 것으로 확인되었다.
상기 동물 모델을 이용한 실시예 7의 결과는 시험관내 실험(invitro)에서 콜라겐 생성 촉진능 및 프로테오글리칸 생성 촉진능을 확인한 실시예 5 및 실시예 6과 동일한 경향의 결과를 갖는 것으로 확인되었다.

Claims (3)

  1. 알긴산의 평균 중량평균 분자량(Mw)이 2,400 내지 2,600이고, 알긴산의 만뉴로네이트와 글루로네이트의 중량비율(M/G)이 2.0 내지 3.4인 알긴산을 유효성분으로 포함하는 골다공증 치료 또는 예방용 의약조성물.
  2. 알긴산의 평균 중량평균 분자량(Mw)이 2,400 내지 2,600이고, 알긴산의 만뉴로네이트와 글루로네이트의 중량비율(M/G)이 2.0 내지 3.4인 알긴산을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 식품 조성물은 식품, 식품첨가제 또는 음료인 것인 골다공증 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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