JP2017081851A - 血管新生阻害剤 - Google Patents
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Abstract
Description
(実験方法)
不死化ヒト臍帯静脈内皮細胞株(EA.hy926)を、基底膜成分(BME)(Trevigen Inc.MD,USA)で作られたゲル上で培養することにより、管腔形成を誘導した。具体的には、0.05mLのBMEを96穴プレートの各ウェルに入れ、37℃で30分間保持してゲル化させた後、0.1mLの199培地に約5,000細胞数のEA.hy926を懸濁した液を、各ウェルのゲル上に重層した。この際、199培地に、水に溶解したサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンをウロン酸換算で0から1mg/mLの各種の濃度になるように添加した。37℃で16〜24時間培養した後、位相差顕微鏡にてゲル上に形成された血管様の管状網の写真を撮影し、画像分析プログラムImageJ(NIH,USA)とAngiogenesis−Analyzer plug−in(Gilles Carpentier.ImageJ contribution:Angiogenesis Analyzer.ImageJ News,5 October 2012.)を用いて管様構造の総数と総延長を測定した。
図1のAにサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンを添加しない場合の血管様の管状網の写真を示し、Bにサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンをウロン酸換算で1mg/mLの濃度になるように添加した場合の写真を示す。また、サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンをウロン酸換算で0から1mg/mLの各種の濃度になるように添加した場合の管様構造の総数と総延長の測定結果を図2のAとBにそれぞれ示す(被験物質を添加しない場合の測定結果を100%とした相対値)。図1から明らかなように、サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンは、血管様の管状網の形成を効果的に阻害した。また、図2から明らかなように、サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンのヒト血管内皮細胞の管腔形成に対する阻害作用は濃度依存的であり、ウロン酸換算で1mg/mLの濃度になるように添加した場合、血管新生を約70%阻害した。
(実験方法)
サメ軟骨に由来するコンドロイチン硫酸(コンドロイチン硫酸C:生化学工業 Cat.No.400675)について、実施例1と同様にして血管新生阻害作用を調べた。
図3の右にサメ軟骨に由来するコンドロイチン硫酸をウロン酸換算で1mg/mLの濃度になるように添加した場合の管様構造の総数と総延長の測定結果を示す(「コンドロイチン硫酸」のカラム)。また、図3の中央にサケ鼻軟骨プロテオグリカンをウロン酸換算で1mg/mLの濃度になるように添加した場合の管様構造の総数と総延長の測定結果を示す(「プロテオグリカン」のカラム)。図3から明らかなように、サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンは血管新生を約70%阻害したが、サメ軟骨に由来するコンドロイチン硫酸は血管新生を約35%しか阻害しなかった(被験物質を添加しない場合の測定結果を100%(左の「未処理」のカラム)とした相対値)。
水に溶解して5分間煮沸したサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンについて、実施例1と同様にして血管新生阻害作用を調べたところ、熱処理による作用の低下は認められず、熱処理していないサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンと同程度の作用を持っていた(図4)。
(実験方法)
96穴プレートの各ウェルにて、約5,000細胞数のEA.hy926を、10%のウシ胎児血清(FBS)を含む199培地で、37℃で24時間培養した。培地を各ウェルより除去した後、水に溶解したサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンをウロン酸換算で0から1mg/mLの各種の濃度になるように添加した199培地を各ウェルに入れ、さらに37℃で24時間培養した。その後、各ウェルに0.01mLのCell counting reagent SF(ナカライ)を加え、さらに37℃で1時間培養し、マイクロプレートリーダーにて450nmの吸光度を測定した。
図5にサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンをウロン酸換算で0から1mg/mLの各種の濃度になるように添加した場合の細胞生存率を示す(被験物質を添加しない場合の細胞生存率を100%とした相対値)。図5から明らかなように、サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンをウロン酸換算で1mg/mLの濃度になるように添加してヒト血管内皮細胞を培養しても、その生育に影響を与えることはなかった。
(実験方法)
12穴プレートの各ウェルにて、約760,000細胞数のEA.hy926を、10%のウシ胎児血清(FBS)を含む199培地で、37℃で24時間培養した。培地を各ウェルより除去した後、水に溶解したサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンをウロン酸換算で1mg/mLの濃度になるように添加した、0.5%のFBSと0.5%のウシ血清アルブミン(BSA)を含む199培地を各ウェルに入れ、さらに37℃で24時間培養した。その後、細胞から全RNAをRNeasy mini kit(QIAGEN)を用いて抽出した。全RNAからHigh−Capacity cDNA Reverse Transcription Kits(Applied Biosystems)を用いてcDNAを合成し、このcDNAを鋳型としてFastStart Universal Probe Master(Roche)とTaqMan probe(Applied Biosystems)を用い、StepOne plusシステムによってリアルタイムPCRを行い、GAPDH遺伝子を内部標準遺伝子として各種のマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)遺伝子の発現量を推定した。なお、実験に用いたTaqMan probeのIDは次の通りである。
MMP−1 :Hs00899658_m1
MMP−2 :Hs01548727_m1
MMP−3 :Hs00968305_m1
MMP−7 :Hs01042796_m1
MMP−9 :Hs00957555_m1
MMP−14:Hs01037009_g1
GAPDH :Hs02758991_g1
図6にMMP−1、MMP−2、MMP−14のmRNAの発現量を示す(被験物質を添加しない場合の発現量を1とした相対値)。図6から明らかなように、サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンは、MMP−1、MMP−2、MMP−14のmRNAの発現量を20〜25%低下させた。なお、MMP−3、MMP−7、MMP−9のmRNAの発現量は微量であり、解析が困難であった。
(実験方法)
0.3mgのサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンを、タンパク質分解酵素であるアクチナーゼE(1mg/mLアクチナーゼE(科研製薬)、100mM Tris−HCl,pH8.0、10mM CaCl2)を用いて37℃で18時間処理し、コアタンパク質を分解した後、5分間煮沸することにより酵素反応を停止することで、タンパク質分解産物を得た。また、0.3mgのサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンを、糖鎖分解酵素であるコンドロイチナーゼABC(300mUコンドロイチナーゼABC(Sigma−Aldrich)、50mM Tris−HCl,pH8.0、60mM CH3COONa、0.02%BSA)を用いて37℃で48時処理し、グリコサミノグリカンを分解した後、5分間煮沸することにより酵素反応を停止することで、糖鎖分解産物を得た。また、0.3mgのサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンを、コンドロイチナーゼABCを用いて37℃で48時処理し、グリコサミノグリカンを分解した後、5分間煮沸することにより酵素反応を停止してから、引き続きアクチナーゼEを用いて37℃で18時間処理し、コアタンパク質を分解した後、5分間煮沸することにより酵素反応を停止することで、糖鎖・タンパク質分解産物を得た。それぞれの分解産物について、実施例1と同様にして血管新生阻害作用を調べた。
それぞれの分解産物をサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンをウロン酸換算で1mg/mLの濃度になるように添加した場合に相当する濃度で添加した場合の管様構造の総数と総延長の測定結果と、サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンをウロン酸換算で1mg/mLの濃度になるように添加した場合の管様構造の総数と総延長の測定結果を、図7にそれぞれ示す(被験物質を添加しない場合の測定結果を100%とした相対値)。図7から明らかなように、サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンを酵素分解することで、血管新生阻害作用を高めることができることがわかった(酵素反応を停止するための熱処理によって作用は低下しない)。血管新生阻害作用の上昇の程度は、タンパク質分解産物よりも糖鎖分解産物の方が大きかった。糖鎖・タンパク質分解産物の血管新生阻害作用は、糖鎖分解産物の血管新生阻害作用と同程度であった。
サケ鼻軟骨由来プロテオグリカン、乳糖、でんぷん、カルボキシメチルセルロース、タルク、ステアリン酸マグネシウムの各成分をよく混合してから打錠することで製造した。
サケ鼻軟骨由来プロテオグリカン、乳糖、でんぷん、ステアリン酸マグネシウムの各成分をよく混合してからカプセルに充填することで製造した。
Claims (1)
- サケ軟骨に含まれるプロテオグリカンおよび/またはその酵素分解産物を有効成分とする血管新生阻害剤。
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