CN116203146A - 一种抗lilrb4单克隆抗体电荷异质性的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种抗LILRB4单克隆抗体电荷异质性的检测方法，包括：检测样品配制成混合溶液；设置高效液相色谱仪的检测条件，进行分离并获得色谱图；基于色谱图，确定检测样品中电荷异质体的百分含量。本发明提供的抗LILRB4单克隆抗体有效抑制LILRB4抗原与其配体复合物的结合，阻断其与配体ApoE复合物的相互作用，进而阻止下游NF‑κB信号通路的激活和ARG1的释放，防止T细胞增殖的抑制，能够用于治疗癌症；本发明提供的方法使检测样品中的抗LILRB4单克隆抗体、酸性异构体和碱性异构体等各组分有效分离，能够实现批量检测，并计算出不同组分的含量，检测精密度高，能够评估抗LILRB4单克隆抗体的异质性。

Description

一种抗LILRB4单克隆抗体电荷异质性的检测方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种抗LILRB4单克隆抗体电荷异质性的检测方法。
背景技术
髓系细胞(myeloid cells)含量丰富且通常是免疫抑制性的重要来源，白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B蛋白(LILRBs)是一组I型跨膜糖蛋白，由于其免疫抑制功能，LILRBs被认为是髓系细胞的免疫检查点蛋白。LILRB4主要表达于单核细胞和单核急性髓性白血病细胞，且单核急性髓性白血病细胞表达水平更高。将LILRB4阳性(B4+)或阴性(B4-)的肿瘤细胞与病人T细胞或健康人T细胞共培养，发现LILRB4阳性细胞可抑制T细胞增殖。之后研究人员将肿瘤细胞上的LILRB4敲除，结果发现肿瘤细胞无法抑制T细胞增殖。当加入LILRB4抗体后，通过抗体阻断LILRB4靶点，发现能够增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，可减少白血病细胞向骨髓、肝脏以及脑渗透，减缓人源化小鼠体重的下降，并延长其寿命。
总的来说，LILRB4主要是改变了免疫抑制的微环境，从而抑制了T细胞活性，导致免疫逃逸这种情况的发生，并出现肿瘤细胞的增殖转移等不良后果。通过体外细胞实验以及人源化的小鼠模型实验，研究者发现LILRB4表达呈阳性的单核急性髓系白血病细胞能显著抑制T细胞增殖。因此开发针对LILRB4的抗体，可以有效缓解T细胞抑制，从而有效杀伤肿瘤细胞。
抗体类产品在生产及存储过程中会产生聚集、降解及修饰，从而导致产品产生变体。等电点改变和空间电荷分布差异所导致的异质性为电荷异质性，如氧化脱酰胺、糖基化、C末端赖氨酸截除、N末端焦谷氨酸环化、二硫键修饰、序列变异等，这些异质性产生的异构体会直接影响抗体药物的生物学活性、药代动力学、免疫原性以及结构稳定性等，对药物在临床使用时的有效性、安全性和保质期都会有潜在影响，所以在抗LILRB4单克隆抗体研发过程中，需要通过纯化工艺的不断优化，降低电荷异构体含量，进而得到高质量的抗LILRB4单克隆抗体，因此，为指导纯化过程中单克隆抗体的收集，评价抗体产品的稳定性，对抗LILRB4单克隆抗体电荷异质性的检测在抗体生产工艺中尤为重要。
单克隆抗体中电荷异质性的检测是基于单克隆抗体所带电荷的差异进行的分离检测，通常情况下，与主峰(Main peak)相比，等电点低于主峰的，被称为酸性异构体(Acidic variants)，等电点高于主峰的，被称为碱性异构体(Basic variants)。常用的检测方式有等电聚焦凝胶电泳(IEF)、阳离子交换色谱(CEX)、阴离子交换色谱、毛细管等电聚焦(CIEF)，以及成像毛细管等电聚焦(iCIEF)等。其中，IEF由于分离度低，手工操作要求高，逐渐被仪器方法所取代；在仪器方法中，CIEF和iCIEF均需要专门的设备，成本相对较高，并且不能对电荷异构体进行收集，在电荷异构体组分鉴定中不具有优势；而阴阳离子色谱法采用的是用途极为广泛、普及度极高的高效液相色谱仪，但是针对该方法并没有专门针对本发明提供的抗LILRB4单克隆抗体的电荷异质性检测，为了能够保证单克隆抗体产品质量的前提下，满足抗LILRB4单克隆抗体的批量生产，急需提供一种专门用于抗LILRB4单克隆抗体电荷异质性检测，且能够快速实现电荷异质体分离并能够准确计算电荷异质体含量的方法。
发明内容
为了指导纯化过程中对本发明提供的抗LILRB4单克隆抗体的收集，优化纯化条件，保证抗LILRB4单克隆抗体在生产工艺过程中的产品质量，本发明公开了一种针对抗LILRB4单克隆抗体电荷异质性的检测方法。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种抗LILRB4单克隆抗体电荷异质性的检测方法，所述方法包括以下步骤：
步骤一：将检测样品用第一流动相稀释配制成混合溶液，所述检测样品为抗LILRB4单克隆抗体；
步骤二：通过设置高效液相色谱仪的检测条件，并对所述混合溶液进行分离并获得色谱图；
步骤三：基于所述色谱图，进行归一化分析后确定所述检测样品中电荷异质体的百分含量；
其中，所述抗LILRB4单克隆抗体包括：氨基酸序列如SEQ ID No:1所示的重链互补决定区HCDR1、氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的重链互补决定区HCDR2、氨基酸序列如SEQID No:3所示的重链互补决定区HCDR3、氨基酸序列如SEQ ID No:4所示的轻链互补决定区LCDR1、氨基酸序列如SEQ ID No:5所示的轻链互补决定区LCDR2、氨基酸序列如SEQ ID No:6所示的轻链互补决定区LCDR3。
本发明提供的检测方法专门用于检测抗LILRB4单克隆抗体电荷异质性，主要是通过设置高效液相色谱仪的检测条件，较为准确、方便、快捷的分离抗LILRB4单克隆抗体产品中的异构体和蛋白，分离度较高，且能够收集电荷异构体组分用于质谱表征，该方法耐用性强，能够适用于不同批次的抗LILRB4单克隆抗体产品的快速检测分离速度快，出峰时间显著缩短，提高了检测效率，精密度高，分离效果好，实用性强。
其次，本发明通过对免疫文库的筛选得到了上述能够与LILRB4抗原高亲和力结合的抗LILRB4单克隆抗体，而且结合活性较好，从而阻断其与配体ApoE复合物的相互作用，进而阻止下游NF-κB信号通路的激活和ARG1的释放，防止T细胞增殖的抑制，及组织浸润的促进。
本发明的有益效果如下：本发明提供了专门针对本发明筛选得到的抗LILRB4单克隆抗体中电荷异质性的检测方法，首先，本发明筛选得到的抗LILRB4单克隆抗体能够有效抑制LILRB4抗原与其配体复合物的结合，从而阻断其与配体ApoE复合物的相互作用，进而阻止下游NF-κB信号通路的激活和ARG1的释放，防止T细胞增殖的抑制，及组织浸润的促进；此外，本发明筛选得到的抗LILRB4单克隆抗体能够用于治疗癌症，癌症包括但不限于急性髓系白血病(AML)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤(MM)、母细胞性浆细胞样树状突细胞肿瘤(BPDCN)、乳腺癌、肺癌或前列腺癌；其次，本发明为了能够保证抗LILRB4单克隆抗体药物质量和产品疗效的一致性和均一性，本发明筛选出最适宜抗LILRB4单克隆抗体的实验条件，使检测样品中的抗LILRB4单克隆抗体、酸性异构体和碱性异构体等各组分实现有效分离，通过该方法能够实现批量检测，且能够快速检测并计算出不同组分的含量，检测精密度较高，批次间差异较小，该方法能够用于评估抗LILRB4单克隆抗体的异质性，并将不同生产批次的抗LILRB4单克隆抗体的异质性控制在合理的范围内，用于指导纯化过程中对抗LILRB4单克隆抗体的收集，优化纯化条件，并保证抗LILRB4单克隆抗体在生产工艺过程中的产品质量。
附图说明
图1为本发明实施例2中pScFv-Disb-HS载体的质粒图谱；
图2为本发明实施例3中梯度稀释ELISA抗LILRB4噬菌体单克隆抗体相对亲和力的比较图；
图3为本发明实施例5中载体pTSE的图谱；
图4为本发明实施例5中鼠源抗体分子的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图5为本发明实施例6中鼠源抗体与LILRB4的结合能力比较图；
图6为本发明实施例8中鼠源抗体与人单核细胞白血病细胞(THP-1)表面LILRB4的结合能力比较图；
图7本发明实施例9中鼠源抗体与ApoE竞争结合LILRB4实验比较图；
图8为本发明实施例10中鼠源抗体抑制THP-1分泌ARG1实验比较图；
图9为本发明实施例15中嵌合抗体分子的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图10为本发明实施例15中人源化抗体分子的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图11为本发明实施例16中人源化抗体与LILRB4结合实验图；
图12为本发明实施例17中人源化抗体与THP-1细胞表面LILRB4的结合实验比较图；
图13为本发明实施例18中人源化抗体与ApoE竞争结合LILRB4实验比较图；
图14为本发明实施例19中人源化抗体抑制THP-1分泌ARG1实验比较图；
图15为本发明实施例20中人源化抗体分子的生物学活性检测(报告基因)实验比较图。
图16为本发明实施例22中对抗LILRB4单克隆抗体的电荷异构体检测图谱；
图17为本发明实施例23中对抗LILRB4单克隆抗体的电荷异构体检测图谱；
图18为本发明实施例24中对抗LILRB4单克隆抗体的电荷异构体检测图谱；
图1 9为本发明实施例25中对抗LILRB4单克隆抗体的电荷异构体检测图谱；
图20为本发明实施例26中对抗LILRB4单克隆抗体的电荷异构体检测图谱；
图21为本发明实施例27中对抗LILRB4单克隆抗体的电荷异构体检测图谱；
图22为本发明实施例28中对抗LILRB4单克隆抗体的电荷异构体检测图谱；
图23为本发明实施例29中对方法的专属性验证检测图谱。
具体实施方式
下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本发明提供了一种抗LILRB4单克隆抗体电荷异质性的检测方法，方法包括以下步骤：步骤一：将检测样品用第一流动相稀释配制成混合溶液，所述检测样品为抗LILRB4单克隆抗体；步骤二：通过设置高效液相色谱仪的检测条件，并对所述混合溶液进行分离并获得色谱图；步骤三：基于所述色谱图，进行归一化分析后确定所述检测样品中电荷异质体的百分含量；其中，所述抗LILRB4单克隆抗体包括：氨基酸序列如SEQ ID No：1所示的重链互补决定区HCDR1、氨基酸序列如SEQ ID No：2所示的重链互补决定区HCDR2、氨基酸序列如SEQIDNo：3所示的重链互补决定区HCDR3、氨基酸序列如SEQ ID No：4所示的轻链互补决定区LCDR1、氨基酸序列如SEQ ID No：5所示的轻链互补决定区LCDR2、氨基酸序列如SEQ ID No：6所示的轻链互补决定区LCDR3。
重链互补决定区HcDR1 重链互补决定区HcDR2 重链互补决定区HcDR3 轻链互补决定区LcDR1 轻链互补决定区LCDR2 轻链互补决定区LcDR3
SYTMS TISSGGTYTYYPDSVKG DGYDGFDY RSSQSLAHSNGNTYLH KVSNRFS SQSTLVPT
SEQ ID No：1 SEQ ID NO：2 SEQ ID NO：3 SEQ ID NO：4 SEQ ID NO：5 SEQ ID NO：6
实施例2鼠源抗体分子筛选
本发明通过用LILRB4抗原(LILRB4蛋白胞外段，后续实验所使用的用LILRB4抗原、蛋白均为用LILRB4胞外段)免疫小鼠，优化免疫方法，创建噬菌体展示库，具体噬菌体展示库的构建与筛选鉴定如下：
步骤一：LILRB4抗原免疫小鼠
1、实验动物：种属品系：BALB/c，雌性，小鼠；体重：18-20g；
实验动物提供商：亦康(北京)医药科技有限公司。
2、免疫：对小鼠进行免疫，免疫抗原为人LILRB4(南京金斯瑞生物科技有限公司合成基因，本公司构建载体并表达纯化)。
步骤二：噬菌体抗体库的构建：取效价较高的小鼠脾细胞，利用Trizol试剂(购买自Ambion，货号：15596026)，提取小鼠脾细胞中的总RNA，RT-PCR获得cDNA，以cDNA为模板，采用简并引物(所用简并引物参考文献：Journal of Immunological Methods 233(2000)167-177)进行PCR扩增，从而获得免疫小鼠抗体重链可变区(VH)基因库及轻链可变区(VL)基因库，轻重链分别双酶切，连接至同样分步骤酶切处理过的载体上，构建pScFv-Disb-HS-VH-VL基因库，pScFv-Disb-HS载体是采用一系列基因克隆的方法对载体pComb3载体(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)进行改造，使之用于噬菌体单链抗体库的构建和表达。改造后的载体命名pScFv-Disb-HS载体，获得其质粒图谱如图1所示，并以此载体为基础，构建小鼠免疫噬菌体抗体库。
步骤三：以LILRB4为抗原包被免疫管，抗原包被量为5μg/500μL/管，4℃包被过夜，再用4％脱脂奶粉/PBST分别封闭免疫管和免疫噬菌体抗体库，室温封闭1小时。封闭后的免疫噬菌体抗体库加入免疫管中进行抗原抗体结合，噬菌体投入量约为109～1012个，室温反应1小时后，使用PBST-PBS洗去未结合的噬菌体，通过0.1M pH 2.2的Glycine-HCl洗脱，最后使用1.5M pH8.8的Tris-HCl中和洗脱下来的噬菌体抗体溶液至pH7.0左右。
步骤四：将上述中和后的噬菌体感染10mL生长至对数期的TG1菌液，37℃培养箱中静置30分钟，取出部分菌液进行梯度稀释，涂布于2YTAG平板上，用于计算噬菌体产出量。剩余的菌液离心弃上清，将菌体沉淀重悬于少量培养基，吸出后涂布于2YTAG大平板，为下一轮筛选做准备。
步骤五：将上述感染后涂板的菌体从大平板上刮下，接菌至2YTAG液体培养基，摇至对数期后加入M13KO7辅助噬菌体超感染，在28℃条件下，220rpm培养过夜制备噬菌体，PEG/NaCl沉降纯化噬菌体用于下一轮筛选，共进行一轮噬菌体库富集筛选。
步骤六：LILRB4噬菌体单链抗体阳性克隆的筛选：经过一轮筛选后，挑取分隔良好的单克隆菌落，接种于加有2YTAG液体培养基的96孔深孔板，在37℃条件下，220rpm的条件下培养至其对数生长期，每孔加入约1010的辅助噬菌体M13KO7，在37℃的温度条件下静止感染30分钟。4000rpm，离心15分钟，弃去上清，菌体用2YTAK重悬沉淀，在28℃及220rpm的条件下培养过夜。4000rpm，4℃的条件下离心15分钟后，吸取扩增后的噬菌体上清进行ELISA鉴定，最终筛选得到2个亲和力较高的抗LILRB4鼠源抗体候选分子，分别命名为MA-Ⅰ和MB-Ⅰ，将上述得到的单克隆抗体进行基因测序确定为正确的抗体序列，经过测序，上述筛选到的2个单克隆抗体序列如下：
鼠源抗体分子 重链可变区序列 轻链可变区序列
MA-Ⅰ SEQ ID No:7 SEQ ID No:8
MB-Ⅰ SEQ ID No:9 SEQ ID No:10
具体的，SEQ ID No:7(MA-Ⅰ的重链可变区的氨基酸序列)：
EVQLQQSGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCTRDGYDGFDYWGQGTTLTVSS；
SEQ ID No:8(MA-Ⅰ的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVMTQTTLSLPVSPGDQASISCRSSQSLAHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTLVPTFGGGTKLEIK；
SEQ ID No:9(MB-Ⅰ的重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLQESGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTNYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSNGRTNYNEKFKTKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARWGQLGLREGYYAVDYWGQGTSVTVSS；
SEQ ID No:10(MB-Ⅰ的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVMTQSPSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPPTFGGGTKLEIK。
实施例3梯度稀释ELISA比较抗LILRB4噬菌体单克隆抗体的亲和力
将实施例2中获得的2个鼠源抗体分子(MA-Ⅰ和MB-Ⅰ)进行单克隆噬菌体的展示和纯化，然后进行噬菌体梯度稀释ELISA实验鉴定亲和力，具体方法如下：用pH 9.6的碳酸盐缓冲液包被LILRB4抗原，100ng/孔/100μL，在4℃温度条件下包被过夜，使用PBST洗涤三次，将实施例2中筛选得到的2个噬菌体单克隆抗体分别用PBST四倍梯度稀释，每孔加入100μL稀释后的样品，在室温下静置1小时。用PBST洗涤ELISA板，将PBST稀释后的HRP-anti-M13(购买自Bio-viewshine，货号：GE27-9421-01)单克隆抗体加入ELISA板中，在室温放置1小时。TMB显色试剂盒显色，室温显色10分钟，用2M H2SO4终止后，酶标仪在450nm/630nm下读数，并计算对应的半最大效应浓度(EC50)值，具体数据如下：
克隆 MA-Ⅰ MB-Ⅰ
EC50 1.635 1.936
通过上述数据及如图2所示，实施例2筛选出的2个不同的鼠源抗体候选分子均能够与LILRB4结合。
实施例4
本发明实施例4在实施例2的基础上进一步限定了鼠源抗体分子还包括重链恒定区和轻链恒定区，重链恒定区选自鼠的IgG1型、IgG2a型、IgG2b型或IgG3型的恒定区的一种，轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:15所示的鼠源Ck型的恒定区；IgG1型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:11所示，IgG2a型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:12所示，IgG2b型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:13所示，IgG3型的恒定区的氨基酸序列如SEQID No:14所示，具体序列如下：。
SEQ ID No:11(鼠IgG1型的重链恒定区氨基酸序列)：
AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPG；
SEQ ID No:12(鼠IgG2a型的重链恒定区氨基酸序列)：
AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK；
SEQ ID No:13(鼠IgG2b型的重链恒定区氨基酸序列)：
AKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK；
SEQ ID No:14(鼠IgG3型的重链恒定区氨基酸序列)：
ATTTAPSVYPLVPGCSDTSGSSVTLGCLVKGYFPEPVTVKWNYGALSSGVRTVSSVLQSGFYSLSSLVTVPSSTWPSQTVICNVAHPASKTELIKRIEPRIPKPSTPPGSSCPPGNILGGPSVFIFPPKPKDALMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVHVSWFVDNKEVHTAWTQPREAQYNSTFRVVSALPIQHQDWMRGKEFKCKVNNKALPAPIERTISKPKGRAQTPQVYTIPPPREQMSKKKVSLTCLVTNFFSEAISVEWERNGELEQDYKNTPPILDSDGTYFLYSKLTVDTDSWLQGEIFTCSVVHEALHNHHTQKNLSRSPELELNETCAEAQDGELDGLWTTITIFISLFLLSVCYSASVTLFKVKWIFSSVVQVKQTAIPDYRNMIGQGA；
SEQ ID No:15(鼠Ck型的轻链恒定区氨基酸序列)：
ADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVL NSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC。
实施例5抗LILRB4鼠源抗体分子制备
本发明实施例5在实施例4的基础上优选的限定了鼠源抗体分子包括鼠的IgG1型的重链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:11所示)和鼠Ck型的轻链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:15所示)。抗体制备方法具体如下：
1、在将实施例2筛选出来的2个单克隆抗体的VH和VL的编码基因分别克隆至装有重链和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)，优选的重链恒定区为鼠的IgG1型重链恒定区(氨基酸序列如SEQ ID No:11所示)，轻链恒定区为鼠Ck型的轻链恒定区(氨基酸序列如SEQ ID No:15所示)，pTSE载体结构如图3所示(pTSE载体制备过程参见CN103525868A说明书第3页第[0019]段)。
2、瞬时转染HEK293细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所，货号为GNHu43)，进行抗体表达，使用AKTA仪器通过protein A亲和柱纯化获得4个单克隆抗体，同时使用BCA试剂盒(购买自：北京汇天东方科技有限公司，货号：BCA0020)进行蛋白浓度测定，之后通过SDS-PAGE鉴定蛋白大小，结果如图4所示，从左侧到右侧依次为非还原MA-Ⅰ、还原MA-Ⅰ、非还原MB-Ⅰ、还原MB-Ⅰ鼠源抗LILRB4单克隆抗体及蛋白质分子量Marker，每条带的分子量大小与理论一致。
实施例6鼠源抗体与LILRB4的结合实验
用pH 9.6的碳酸盐缓冲液包被LILRB4，100ng/孔/100μL，在4℃的温度条件下过夜包被。用300μL/孔PBST洗涤五次，再加入1％BSA-PBST在37℃温度条件下封闭1小时，加入不同稀释浓度的MA-Ⅰ、MB-Ⅰ鼠源抗体，2种抗体的起始最高浓度均是50μg/mL，分别经过5倍梯度稀释，每个抗体共稀释12个梯度，在37℃温度条件下孵育1小时。用300μL/孔PBST洗涤五次，再加入用1％BSA-PBST 1:2000稀释的Goat Anti-Mouse IgG-HRP(购买自solarbio，货号：SE131)，在37℃温度条件下孵育1小时。TMB显色试剂盒显色，100μL/孔，室温显色8分钟，然后用2M H2SO4终止显色。酶标仪在450nm/630nm下读数，并计算对应的EC50值，具体数据如下：
克隆 MA-Ⅰ MB-Ⅰ
EC50(ng/mL) 8.347 12.80
通过上述数据及如图5所示，筛选出的2个不同鼠源抗体MA-Ⅰ和MB-Ⅰ均能与LILRB4结合。
实施例7鼠源抗体与LILR家族蛋白的结合实验
用pH 9.6的碳酸盐缓冲液包被LILRA1，LILRA2，LILRA3，LILRA4，LILRA5，LILRA6，LILRB1，LILRB2，LILRB3，LILRB4，LILRB5，100ng/孔/100μL，在4℃的温度条件下过夜包被。用300μL/孔PBST洗涤五次，再加入1％BSA-PBST在37℃温度条件下封闭1小时，随后加入100μL MA-Ⅰ和MB-Ⅰ鼠源抗体分子，2种抗体的浓度均是50μg/mL。在37℃温度条件下孵育1小时。用300μL/孔PBST洗涤五次，再加入用1％ BSA-PBST 1:2000稀释的Goat Anti-Mouse IgG-HRP(购买自solarbio，货号：SE131)，在37℃温度条件下孵育1小时。TMB显色试剂盒显色，100μL/孔，室温显色8分钟，然后用2M H2SO4终止显色。酶标仪在450nm/630nm下读数，具体数据如下：
Figure BDA0003995245780000081
通过上述数据得出，筛选出的2个不同鼠源抗体MA-Ⅰ和MB-Ⅰ均能与LILRB4特异性结合，且不与LILR家族其它蛋白结合。
实施例8鼠源抗体与人单核细胞白血病细胞(THP-1)表面LILRB4的结合实验
取50μL不同稀释浓度的MA-Ⅰ、MB-Ⅰ鼠源抗体，起始工作浓度为30μg/mL，3倍梯度稀释，共稀释10个梯度，加入96孔板V底板中。随后向孔中添加50μLTHP-1细胞悬浮液，浓度为2×106cells/mL，混匀。4℃条件下孵育1小时。随后每孔加入100μL PBS缓冲液，3000rpm离心5分钟弃上清。再次添加100μL/孔异硫氰酸荧光素(FITC)标记山羊抗鼠IgG(购买自北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：ZF-0312)(1:100稀释)。混匀后，4℃避光孵育30分钟。每孔加入100μL PBS缓冲液，3000rpm离心5分钟弃上清。再次添加100μL PBS缓冲液重悬细胞，流式细胞仪上机检测。收集数据并计算对应的EC50值，具体数据如下：
克隆 MA-Ⅰ MB-Ⅰ
EC50(ng/mL) 305.9 351.0
通过上述数据及如图6所示，筛选出的2个不同鼠源抗体MA-Ⅰ和MB-Ⅰ均能与THP-1细胞表面的LILRB4结合。
实施例9鼠源抗体与ApoE竞争结合LILRB4实验
取THP-1细胞，浓度为2×106cells/mL，铺于V底96孔板中，每孔添加50μL细胞悬浮液。随后向孔中添加50μL不同稀释浓度的MA-Ⅰ、MB-Ⅰ鼠源抗体，起始工作浓度为400μg/mL，5倍梯度稀释，共10个梯度。另外向孔中添加100μL0.4μg/mL FITC标记的ApoE蛋白。4℃条件下避光孵育1.5小时。随后每孔加入200μL PBS缓冲液，3000rpm离心5分钟弃上清。再次添加100μL PBS缓冲液重悬细胞，流式细胞仪上机检测。收集数据并计算对应的IC50值，具体数据如下：
克隆 MA-Ⅰ MB-Ⅰ
IC50(μg/mL) 0.2037 0.4399
通过上述数据及如图7所示，筛选出的2个不同的鼠源抗体MA-Ⅰ和MB-Ⅰ均能与ApoE竞争结合THP-1细胞表面的LILRB4。
实施例10鼠源抗体抑制THP-1分泌ARG1
取THP-1细胞，浓度为1×107cells/mL，铺于V底96孔板中，每孔添加50μL细胞悬浮液。先将不同浓度的MA-Ⅰ，MB-Ⅰ鼠源抗体和ApoE按照1:1比例，各50μL混合均匀。鼠源抗体起始工作浓度为400μg/mL，2倍梯度稀释，共8个梯度，ApoE工作终浓度为0.5μg/mL。随后向实验孔中添加50μL鼠源抗体与ApoE混合物。37℃条件下孵育20小时后，3000rpm离心5分钟。每孔取出40μL上清加入96孔平底板中，随后按照精氨酸酶活性检测试剂盒(购买自Sigma-Aldrich，货号：MAK112-1KT)配置并预热反应底物，每孔添加10μL反应底物混匀，37℃条件下反应1小时。每孔再次添加200μL反应终止液，并使用多功能酶标仪于450nm处读吸光度值。收集数据并计算对应的IC50值，具体数据如下：
克隆 MA-Ⅰ MB-Ⅰ
IC50(μg/mL) 23.86 45.97
通过上述数据及如图8所示，筛选出的2个不同的鼠源抗体MA-Ⅰ和MB-Ⅰ均能抑制THP-1细胞分泌ARG1。
实施例11
本发明实施例11进一步的限定了单克隆抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体分子，嵌合抗体分子包括鼠源抗体分子的重链可变区、鼠源抗体分子的轻链可变区和人源抗体恒定区。人源化抗体恒定区包括人源化抗体重链恒定区和人源化抗体轻链恒定区，人源化抗体重链恒定区选自人的IgG1型、IgG2型或IgG4型的恒定区的一种，人源化抗体轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:19所示的人Ck型的恒定区；IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:16所示，IgG2型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:17所示，IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:18所示。
SEQ ID No:16(人IgG1型的重链恒定区氨基酸序列)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
SEQ ID No:17(人IgG2型的重链恒定区氨基酸序列)：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
SEQ ID No:18(人的IgG4型的重链恒定区氨基酸序列)：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK；
SEQ ID No:19(人的Ck链的轻链恒定区氨基酸序列)：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN SQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE C。
实施例12嵌合抗体分子的制备
本发明实施例12在实施例11的基础上进一步限定了人源抗体恒定区包括人的IgG1型的重链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:16所示)和人Ck型的轻链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:19所示)。
具体的制备方法：将实施例2中免疫噬菌体抗体库筛选得到的抗体分子MA-Ⅰ的重链可变区VH(SEQ ID No:7)和轻链可变区VL基因(SEQ ID No:8)以及MB-Ⅰ的重链可变区VH(SEQ ID No:9)和轻链可变区VL基因(SEQ ID No:10)保持鼠源序列不变，分别克隆至装有重链恒定区和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)上，重链恒定区为人IgG1型(氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示)，轻链恒定区为人Ck型(氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示)。瞬时转染HEK293细胞(购买自：中国医学科学院基础医学研究所，货号为：GNHu43)，进行抗体表达，分别得到嵌合抗体CA-Ⅰ和CB-Ⅰ。嵌合抗体CA-Ⅰ和CB-Ⅰ蛋白通过SDS-PAGE鉴定结果如图9所示，从左侧到右侧依次为蛋白质分子量Marker，还原CA-Ⅰ，非还原CA-Ⅰ，还原CB-Ⅰ和非还原CB-Ⅰ抗LILRB4单克隆抗体，每条带的分子量大小与理论一致。
实施例13鼠源抗体分子MA-Ⅰ和MB-Ⅰ进行人源化
首先将实施例2中鼠源抗体分子MA-Ⅰ和MB-Ⅰ的序列和人抗体种系数据库(v-base)进行比较，寻找同源性较高的人抗体轻、重链种系作为候选序列，然后将鼠源抗体分子MA-Ⅰ和MB-Ⅰ的CDR序列移植到人源候选序列上进行同源建模。然后通过三维结构模拟计算可能对于维持CDR环状结构起重要作用的关键框架氨基酸残基，从而设计人源化抗体的回复突变。将设计好的包含回复突变的人源化抗体的轻、重链可变区分别由南京金斯瑞生物科技有限公司优化合成，然后再连接到瞬时表达载体上，对人源化得到的轻重链组合分析，得到如下人源化抗体分子：HA-Ⅰ，HA-Ⅱ，HA-Ⅲ，HB-Ⅰ，HB-Ⅱ，HB-Ⅲ，上述筛选到的6个单克隆抗体序列如下：
单克隆抗体 重链可变区 轻链可变区
HA-Ⅰ SEQ ID No:20 SEQ ID No:21
HA-Ⅱ SEQ ID No:22 SEQ ID No:23
HA-Ⅲ SEQ ID No:24 SEQ ID No:25
HB-Ⅰ SEQ ID No:26 SEQ ID No:27
HB-Ⅱ SEQ ID No:26 SEQ ID No:28
HB-Ⅲ SEQ ID No:26 SEQ ID No:29
具体的，SEQ ID No:20(HA-Ⅰ重链可变区的氨基酸序列)：
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGYDGFDYWGQGTTVTVSS；
SEQ ID No:21(HA-Ⅰ轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLAHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHVPTFGGGTKVEIK；
SEQ ID No:22(HA-Ⅱ重链可变区的氨基酸序列)：
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGYDGFDYWGQGTTVTVSS；
SEQ ID No:23(HA-Ⅱ轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLAHSNGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSTHVPTFGGGTKVEIK；
SEQ ID No:24(HA-Ⅲ重链可变区的氨基酸序列)：
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVATISSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDGYDGFDYWGQGTTVTVSS；
SEQ ID No:25(HA-Ⅲ轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLAHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLL IYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCSQSTHVPTFGGGTK VEIK；
SEQ ID No:26(HB-Ⅰ，HB-Ⅱ，HB-Ⅲ重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWMHWVRQAPGQGLEWIG EINPSNGRTNYNEKFKTRATLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWGQLGL REGYYAVDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID No:27(HB-Ⅰ轻链可变区的氨基酸序列)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTS RLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPPTFGGGTKVEIK；
SEQ ID No:28(HB-Ⅱ轻链可变区的氨基酸序列)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGGAVKLLIYYTS RLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYFCQQGNTLPPTFGGGTKVEIK；
SEQ ID No:29(HB-Ⅲ轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGGAVKLLIYYTS RLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYFCQQGNTLPPTFGGGTKVEIK。
实施例14
本发明实施例14在实施例13的基础上进一步的限定了人源化抗体恒定区包括人源化抗体重链恒定区和人源化抗体轻链恒定区，人源化抗体重链恒定区选自人的IgG1型、IgG2型或IgG4型的恒定区的一种，人源化抗体轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:19所示的人Ck型的恒定区；IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:16所示，IgG2型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:17所示，IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:18所示。
上述人源抗体恒定区具体序列与实施例11相同。
实施例15人源化抗体分子的制备
本发明实施例15在实施例14的基础上进一步的限定了人源抗体恒定区包括人IgG1型重链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:16所示)和人Ck型轻链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:19所示)。
将上述实施例13人源化得到的6个人源化抗体分子的重链VH和轻链VL的编码基因分别克隆至装有重链恒定区和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)，重链恒定区为人IgG1型(氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示)，轻链恒定区为Ck链(氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示)。
将人源化抗体分子HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HB-Ⅰ、HB-Ⅱ、HB-Ⅲ分别瞬时转染HEK293细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所，货号为GNHu43)，进行抗体表达，使用AKTA仪器通过protein A亲和柱纯化获得单克隆抗体，同时使用BCA试剂盒(购买自：北京汇天东方科技有限公司，货号：BCA0020)进行蛋白浓度测定，之后通过SDS-PAGE鉴定蛋白大小，结果如图10所示，从左侧到右侧依次为非还原HA-Ⅰ，还原HA-Ⅰ，非还原HA-Ⅱ，还原HA-Ⅱ，非还原HA-Ⅲ，还原HA-Ⅲ，蛋白质分子量Marker，非还原HB-Ⅰ，非还原HB-Ⅰ，非还原HB-Ⅱ，非还原HB-Ⅱ，非还原HB-Ⅲ和非还原HB-Ⅲ抗LILRB4单克隆抗体，每条带的分子量大小与理论一致。
实施例16人源化抗体与LILRB4结合实验
用pH 9.6的碳酸盐缓冲液包被LILRB4，100ng/孔/100μL，在4℃的温度条件下过夜包被。用300μL/孔PBST洗涤五次，再加入1％BSA-PBST在37℃温度条件下封闭1小时，加入不同稀释浓度的人源化抗体HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HB-Ⅰ、HB-Ⅱ、HB-Ⅲ和实施例12中制备的嵌合抗体CA-Ⅰ和CB-Ⅰ，8个抗体的起始最高浓度均是50μg/mL，分别经过5倍稀释后每个抗体均稀释12个梯度，在37℃温度条件下孵育1小时。用300μL/孔PBST洗涤五次，再加入用1％BSA-PBST 1:5000稀释的Goat Anti Human IgG-HRP(购买自北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：ZB-2304)，在37℃温度条件下孵育1小时。TMB显色试剂盒显色，100μL/孔，室温显色5分钟，然后用2M H2SO4终止显色。酶标仪在450nm/630nm下读数，并计算对应的EC50值，具体数据如下：
克隆 HA-Ⅰ HA-Ⅱ HA-Ⅲ HB-Ⅰ HB-Ⅱ HB-Ⅲ CA-Ⅰ CB-Ⅰ
EC50(ng/mL) 17.37 15.36 14.01 342.8 917.8 74.32 17.83 65.46
通过上述数据及实验结果如图11所示，6个不同的人源化抗体分子均能与LILRB4进行结合。其中HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ三个人源化单克隆抗体的亲和力比较接近。HB-Ⅰ、HB-Ⅱ、HB-Ⅲ三个人源化单克隆抗体中HB-Ⅲ的EC50值最低，说明其与LILRB4结合能力最好，亲和力最高。同时HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ的EC50值与嵌合抗体CA-Ⅰ相似，HB-Ⅲ的EC50值与嵌合抗体CB-Ⅰ相似，说明人源化后的HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ以及HB-Ⅲ保留了鼠源亲本抗体MA-Ⅰ和MB-Ⅰ与LILRB4的高亲和力。
实施例17人源化抗体与THP-1细胞表面LILRB4的结合实验
取50μL不同稀释浓度的HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HB-Ⅲ、CA-Ⅰ及CB-Ⅰ抗体，起始工作浓度为32μg/mL，2倍梯度稀释，共稀释12个梯度，加入96孔板V底板中。随后向孔中添加50μLTHP-1细胞悬浮液，浓度为2×106cells/mL，混匀。4℃条件下孵育1小时。随后每孔加入100μL PBS缓冲液，3000rpm离心5分钟弃上清。再次添加100μL/孔FITC标记山羊抗鼠IgG(购买自北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：ZF-0312)(1:100稀释)。混匀后，4℃避光孵育30分钟。每孔加入100μL PBS缓冲液，3000rpm离心5分钟弃上清。再次添加100μL PBS缓冲液重悬细胞，流式细胞仪上机检测。收集数据并计算对应的EC50值，具体数据如下：
克隆 HA-Ⅰ HA-Ⅱ HA-Ⅲ HB-Ⅲ CA-Ⅰ CB-Ⅰ
EC50(ng/mL) 181.5 178.7 185.7 385.9 200.3 445.3
通过上述数据及如图12所示，筛选出的4个人源化抗体均能与THP-1细胞表面的LILRB4结合。此外，这4个人源化抗体分子的EC50值与对应的嵌合抗体类似，说明人源化后的HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ以及HB-Ⅲ保留了鼠源亲本抗体MA-Ⅰ和MB-Ⅰ与LILRB4的高亲和力。
实施例18人源化抗体与ApoE竞争结合LILRB4实验
取THP-1细胞，浓度为2×106cells/mL，铺于V底96孔板中，每孔添加50μL细胞悬浮液。随后向孔中添加50μL不同稀释浓度的HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HB-Ⅲ人源化抗体，起始工作浓度为400μg/mL，5倍梯度稀释，共12个梯度。另外向孔中添加100μL 0.4μg/mL FITC标记的ApoE蛋白，4℃条件下避光孵育1.5小时。随后每孔加入200μL PBS缓冲液，3000rpm离心5分钟弃上清。再次添加100μL PBS缓冲液重悬细胞，流式细胞仪上机检测，收集数据并计算对应的IC50值，具体数据如下：
克隆 HA-Ⅰ HA-Ⅱ HA-Ⅲ HB-Ⅲ
IC50(μg/mL) 0.4797 2.752 2.559 0.4265
通过上述数据及如图13所示，筛选出的4个人源化抗体均能与ApoE竞争结合THP-1细胞表面的LILRB4。此外，HA-Ⅰ和HB-Ⅲ的IC50值最低，说明其能够有效的抑制ApoE与LILRB4的结合。
实施例19人源化抗体抑制THP-1分泌ARG1
取THP-1细胞，浓度为1×107cells/mL，铺于V底96孔板中，每孔添加50μL细胞悬浮液，先将不同浓度的HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HB-Ⅲ人源化抗体和ApoE按照1:1比例，各50μL混合均匀。人源化抗体的起始工作浓度为400μg/mL，2倍梯度稀释，共稀释8个梯度。ApoE的工作浓度为0.5μg/mL。随后向孔中添加50μL人源化抗体与ApoE混合物。37℃条件下孵育20小时后，3000rpm离心5分钟。每孔取出40μL上清加入96孔平底板中，随后按照精氨酸酶活性检测试剂盒(购买自Sigma-Aldrich，货号：MAK112-1KT)配置并预热反应底物，每孔添加10μL反应底物混匀，37℃条件下反应1小时。每孔再次添加200μL反应终止液，并使用多功能酶标仪于450nm处读吸光度值。收集数据并计算对应的IC50值，具体数据如下：
克隆 HA-Ⅰ HA-Ⅱ HA-Ⅲ HB-Ⅲ
IC50(μg/mL) 31.20 249.5 98.54 30.57
通过上述数据及如图14所示，筛选出的4个不同的人源化均能抑制THP-1细胞分泌ARG1。此外，本发明提供的4个人源化抗体分子中HA-Ⅰ和HB-Ⅲ的IC50值最低，说明其能够有效的抑制ARG1分泌。
实施例20人源化抗体分子的生物学活性检测(报告基因)
取THP-1-NF-κB-Luc工程细胞，浓度为2×106cells/mL，铺于V底96孔板中，每孔添加50μL细胞悬浮液。随后向孔中添加100μL不同稀释浓度的4种人源化抗体分子HA-Ⅰ、HA-Ⅱ、HA-Ⅲ、HB-Ⅲ，抗体起始工作浓度为200μg/mL，5倍梯度稀释，共计8个梯度。37℃条件下孵育2小时后，添加20μg/mL ApoE蛋白，50μL每孔。轻轻混匀细胞培养板，置于37℃条件箱孵育5小时。1000rpm离心5分钟，弃上清后，按照说明书每孔加入50μL Lysis Buffer(购买自Promega，货号：E2661)，室温作用10分钟充分裂解。每孔吸取10μL转移至384孔板中，每孔再加入等体积荧光底物(购买自Promega，货号：E2610)，室温反应5分钟，在酶标仪下读荧光数值，并计算对应的IC50值，具体数据如下：
克隆 HA-Ⅰ HA-Ⅱ HA-Ⅲ HB-Ⅲ
IC50(μg/mL) 0.7557 2.678 3.437 0.8302
通过上述数据及图15所示，筛选出的4个人源化抗体分子均能阻断ApoE与LILRB4的结合，进而抑制下游NF-κB信号通路的传导。此外，本发明提供的4个人源化抗体分子中HA-Ⅰ和HB-Ⅲ的IC50值最低，说明其能够有效的抑制下游信号通路传导。
实施例21
本发明实施例21在实施例1的基础上进一步限定了抗LILRB4单克隆抗体电荷异质性的检测方法，具体的，步骤二中，所述检测条件包括采用弱阳离子色谱柱，设置梯度洗脱条件，并通过第一流动相和第二流动相进行梯度洗脱，所述第一流动相为2-(N-吗啉)乙烷磺酸(MES)缓冲液，所述第二流动相为MES缓冲液和氯化钠溶液的混合物。
高效液相色谱仪为安捷伦高效液相色谱仪；弱阳离子色谱柱为PropacWCX-10色谱柱，且尺寸规格为4mm×250mm。抗LILRB4单克隆抗体为上述实施例2-20筛选得到的抗LILRB4单克隆抗体HA-Ⅰ。
实施例22-28
本发明在实施例21的基础上进一步限定抗LILRB4单克隆抗体电荷异质性的检测方法，抗LILRB4单克隆抗体为抗LILRB4单克隆抗体HA-Ⅰ，具体如下。
进一步梯度洗脱条件设置如下：
Figure BDA0003995245780000151
Figure BDA0003995245780000152
选择同批次的抗LILRB4单克隆抗体HA-Ⅰ作为检测样品，然后配制成混合溶液，通过上述实施例22-28的检测条件，对混合溶液进行分离并分析后获得色谱图，如图16-22。
综上，通过图16-22所示，实施例22-28中的检测条件，均对抗LILRB4单克隆抗体的电荷异构体起到了一定的分离效果，但以实施例28的效果最佳，在该检测条件下，抗体的酸性组分、主峰、碱性组分基本能够达到基线分离，为最优选的色谱检测条件。
实施例29方法的专属性验证
检测样品S1为稀释10倍的抗LILRB4单克隆抗体HA-Ⅰ制剂缓冲液；
检测样品S2为稀释至1.0mg/ml的抗LILRB4单克隆抗体HA-Ⅰ；
以上样品进行电荷异质性分析，每个样品进样1次，进样量50μl；
检测方法为实施例28提供的检测条件，同时检测方法与实施例1相同，检测图谱如23所示。
如图23可知，检测样品S1在10-20min范围内无明显有效吸收峰，对检测样品S2酸碱组分及主峰的检测不会产生影响，可以说明，本发明提供的抗LILRB4单克隆抗体HA-Ⅰ的异质性检测方法专属性良好。
实施例30方法的线性范围及准确性验证
检测样品：将抗LILRB4单克隆抗体HA-Ⅰ样品稀释成0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml、1.1mg/ml、1.2mg/ml，样品编号为(L1～L5)，分别上样50μl，上样量在(40～60μg)范围之内，检测方法为实施例28提供的检测条件，同时检测方法与实施例1相同。分别以酸性组分峰面积/碱性组分峰面积/主峰峰面积为纵坐标，上样浓度为横坐标绘制标准曲线并计算线性方程；依据线性方程计算每个浓度的样品对应的酸性组分/碱性组分/主峰理论峰面积。
回收率＝实测峰面积/理论峰面积*100％；
结果如下：
Figure BDA0003995245780000161
通过上述检测结果得出，在40～60μg范围内，主峰、酸性组分、碱性组分回收率均在98.7％-102.4％范围内，可以说明本发明提供的检测方法准确度较高。
实施例31方法的精密度验证
抗LILRB4单克隆抗体HA-Ⅰ样品稀释至1mg/ml，进行电荷异质性分析。检测方法为实施例28提供的检测条件，同时检测方法与实施例1相同。
重复性检测：在一个分析批内，配制6份样品(R1～R6)，每份样品进样1次。
中间精密度检测：安排2名测试人员3天内，进行电荷异质性检测精密度样品，每天配制6份样品(R1～R6)，每份样品进样1次。
测定结果如下：
重复性-百分含量数据表
Figure BDA0003995245780000171
中间精密度-百分含量数据表
Figure BDA0003995245780000172
通过上述数据可知，重复性：主峰峰面积百分比的RSD为0.13％；酸区峰面积百分比的RSD为0.68％，碱区峰面积百分比的RSD为0.93％。中间精密度：主峰峰面积百分比的RSD为0.25％；酸区、碱区峰面积百分比的RSD分别为1.03％和3.14％。本方法精密度良好。
为此可以说明，本发明提供的检测方法主要针对本发明提供的抗LILRB4单克隆抗体的异质性检测，同时该方法具有专属性，同时具有检测准确度较高，精确度较优，适合抗LILRB4单克隆抗体的检测及稳定性评价。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗LILRB4单克隆抗体电荷异质性的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤一：将检测样品用第一流动相稀释配制成混合溶液，所述检测样品为抗LILRB4单克隆抗体；
步骤二：通过设置高效液相色谱仪的检测条件，并对所述混合溶液进行分离并获得色谱图；
步骤三：基于所述色谱图，进行归一化分析后确定所述检测样品中电荷异质体的百分含量；
其中，所述抗LILRB4单克隆抗体包括：氨基酸序列如SEQ ID No:1所示的重链互补决定区HCDR1、氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的重链互补决定区HCDR2、氨基酸序列如SEQ IDNo:3所示的重链互补决定区HCDR3、氨基酸序列如SEQ ID No:4所示的轻链互补决定区LCDR1、氨基酸序列如SEQ ID No:5所示的轻链互补决定区LCDR2、氨基酸序列如SEQ ID No:6所示的轻链互补决定区LCDR3。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述抗LILRB4单克隆抗体为鼠源抗体分子，所述鼠源抗体分子包括氨基酸序列如SEQ IDNo:7所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID No:8所示的轻链可变区。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述鼠源抗体分子还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区选自鼠的IgG1型、IgG2a型、IgG2b型或IgG3型的恒定区的一种，所述轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:15所示的鼠源Ck型的恒定区；所述IgG1型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:11所示，所述IgG2a型的恒定区的氨基酸序列如SEQID No:12所示，所述IgG2b型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:13所示，所述IgG3型的恒定区的氨基酸序列如SEQ IDNo:14所示。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述抗LILRB4单克隆抗体为人源化抗体分子，所述人源化抗体分子选自以下任意一种：HA-Ⅰ：氨基酸序列如SEQ ID No:20所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID No:21所示的轻链可变区；
HA-Ⅱ：氨基酸序列如SEQ ID No:22所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID No:23所示的轻链可变区；
HA-Ⅲ：氨基酸序列如SEQ ID No:24所示的重链可变区，氨基酸序列如SEQ ID No:25所示的轻链可变区。
5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述人源化抗体分子还包括人源化抗体重链恒定区和人源化抗体轻链恒定区，所述人源化抗体重链恒定区选自人的IgG1型、IgG2型或IgG4型的恒定区的一种，所述人源化抗体轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:19所示的人Ck型的恒定区；所述IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:16所示，所述IgG2型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:17所示，所述IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:18所示。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤二中，所述检测条件包括采用弱阳离子色谱柱，设置梯度洗脱条件，并通过第一流动相和第二流动相进行梯度洗脱，所述第一流动相为2-(N-吗啉)乙烷磺酸(MES)缓冲液，所述第二流动相为MES缓冲液和氯化钠溶液的混合物。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述弱阳离子色谱柱为PropacWCX-10色谱柱。
8.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述第一流动相和第二流动相的流速为0.8-1.2ml/min；所述弱阳离子色谱柱的柱温为20℃-40℃。
9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述第一流动相的pH值为5.5-6.5，所述第一流动相为浓度为20-40mM的MES缓冲液；所述第二流动相的pH值为5.5-6.5，所述第二流动相为浓度为20-40mM的MES缓冲液和浓度为0.4-0.6M的氯化钠溶液的混合物；
优选的，所述第一流动相的pH值为5.8，所述第一流动相为浓度为20mM；所述第二流动相的pH值为5.8，所述第二流动相中氯化钠的浓度为0.5M。
10.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱条件设置如下：
Figure FDA0003995245770000031
/>
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