CN110840830A - 一种抗ctla-4单克隆抗体的注射制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体提供了一种抗CTLA‑4单克隆抗体的注射制剂，制剂包括药效分子和缓冲溶液，药效分子为蛋白含量为2‑50mg/ml的抗CTLA‑4单克隆抗体，缓冲溶液包括：缓冲盐、蛋白保护剂、等渗调节剂和非离子型表面活性剂，缓冲溶液的pH值为6.5－7.5。本发明为抗CTLA‑4单克隆抗体提供了良好的存储环境，不仅能够保证抗体药物结构的稳定性，而且能够有效降低制剂中抗体聚集物的生成速率，保证了生物药物的疗效；药效分子抗CTLA‑4单克隆抗体具有较强的亲和力和良好的生物活性，能够与CTLA‑4抗原特异性结合，增强T细胞对各种抗原的反应性，进而用于治疗各种癌症疾病。

Description

一种抗CTLA-4单克隆抗体的注射制剂
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种抗CTLA-4单克隆抗体的注射制剂。
背景技术
众所周知，黑色素瘤是临床上较为常见的皮肤黏膜和色素膜肿瘤，恶性程度极高，黑色素瘤晚期患者的生存期为7～9个月，1年内的生存率仅为25％。在过去30年，黑色素瘤发病率明显增加，死亡率也在持续性上升。据世界卫生组织(WHO)统计，每年死于皮肤癌的患者大约有66000人，其中80％死于黑色素瘤。目前，对于晚期黑色素瘤的治疗主要有化学疗法和免疫疗法，化学疗法的效果通常并不理想，非特异性的免疫疗法也很少能产生持续性的疗效。
细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)是T淋巴细胞表面的受体，是抑制T细胞活化的共刺激分子，当T细胞表面受体CTLA-4与APC上的B7分子结合后，会抑制T细胞的活化，从而抑制T细胞的过度活化。CTLA-4蛋白在机体内的过度表达与很多疾病特别是肿瘤有着密切的关系，如黑色素瘤、白血病、部分胃癌和食道癌、利什曼病等。经研究，抗CTLA-4单克隆抗体可广泛用于抗肿瘤的免疫治疗，为此，抗CTLA-4单克隆抗体是肿瘤免疫治疗的研究热点及方向。目前仅百时美施贵宝(Bristol-Myers Squibb，BMS)研发的Ipilimumab获得了批准上市，临床数据中，Ipilimumab能够针对不可切除的或转移性的黑色素瘤有治疗效果。
此外，和大多数蛋白分子一样，抗CTLA-4单克隆抗体具有不稳定性，会经历多种化学和物理降解，与传统合成的小分子药物相比，生物分子具有复杂的一级、二级、三级等高级结构，而蛋白质的高级结构非常脆弱，容易发生结构变化，如变性、聚集和沉淀，这些降解的产物会对生物制药的安全性产生很大的影响，特别是一些蛋白聚集物会激发人体的免疫反应，轻者会降低生物药物的疗效，重者甚至会造成病人的死亡。抗体药物不仅仅需要在生产的时候能得到高纯度的产品，还要在运输、储存和使用过程中保持结构稳定，保持抗体的高级结构是发挥它们生物学活性的最基本要求，为此，急需开发一种既能够满足患者需求，降低药物副作用又能够保证抗CTLA-4单克隆抗体的结构长期稳定性的注射制剂。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明公开了一种既能够降低药物副作用，又具有较高药效，且在运输、储存和使用过程中均能够保证结构稳定性的抗CTLA-4单克隆抗体的注射制剂。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种抗CTLA-4单克隆抗体的注射制剂，所述制剂包括药效分子和缓冲溶液，所述药效分子为蛋白含量2-50mg/ml的抗CTLA-4单克隆抗体，所述缓冲溶液包括以下含量的成分：
Figure BDA0002247569020000021
其中，所述缓冲溶液的pH值为6.5－7.5。
本发明提供的抗CTLA-4单克隆抗体的注射制剂通过在缓冲溶液中添加特定含量的缓冲盐、蛋白保护剂、等渗调节剂和非离子型表面活性剂为抗CTLA-4单克隆抗体提供了适宜的存储环境，蛋白保护剂与等渗调节剂共同配合调节缓冲溶液渗透压，并通过缓冲盐为药效分子提供了适宜的pH值，各成分之间协同配合，有效避免制剂在存储或运输过程中抗CTLA-4单克隆抗体变性、聚集和沉淀，提高抗体的物理稳定性，降低潜在的安全性风险，有效保证了制剂的长期稳定性。
进一步的，所述抗CTLA-4单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，且所述抗CTLA-4单克隆抗体选自以下任意一种：
(N-1)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9；
(N-2)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9；
(N-3)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9；
(N-4)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9；
(N-5)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:10；
(N-6)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:6，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:10；
(N-7)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:10；
(N-8)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:8，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:10。
本发明利用噬菌体抗体库展示技术和高通量筛选的方法，筛选出活性较好，亲和力较高的抗CTLA-4的全人源单克隆抗体，上述筛选的抗体能够与CTLA-4抗原特异性结合，增强T细胞对各种抗原的反应性，进而用于治疗各种由CTLA-4抗原引起的癌症疾病。
进一步的，所述抗CTLA-4单克隆抗体的蛋白含量为10-20mg/ml。
通过大量实验验证，抗CTLA-4单克隆抗体的蛋白含量在10-20mg/ml的范围内，能够保证抗CTLA-4单克隆抗体的药效，过多或过少均有可能达不到很好的药效。
进一步的，所述单克隆抗体还包括重链恒定区，所述重链恒定区为人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中的一种；
优选的，所述重链恒定区为人的IgG1。
本发明通过大量的实验，选择人的IgG1作为抗CTLA-4单克隆抗体的重链恒定区，不仅能够提高抗体的稳定性，而且能够有效延长抗体半衰期。
进一步的，所述缓冲盐包括磷酸缓冲液、Tris-盐酸缓冲液和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中的一种；
优选的，所述缓冲盐在所述制剂中的含量为10-20mM；
优选的，所述缓冲溶液的pH值为7.0－7.5。
本发明为了能够为抗CTLA-4单克隆抗体提供适宜的存储环境，同时添加的辅料不影响药物长期保存的稳定性，能够为抗CTLA-4单克隆抗体提供适宜的pH值，本发明经过大量实验，筛选磷酸缓冲液、Tris-盐酸缓冲液和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中的一种或多种作为缓冲盐，并筛选出特定含量，为抗CTLA-4单克隆抗体提供了适宜的存储环境。
进一步的，所述蛋白保护剂包括蔗糖、甘露醇、α-海藻糖、精氨酸、甘氨酸、脯氨酸中的一种。
优选的，所述蛋白保护剂为α-海藻糖。
通过大量实验验证，α-海藻糖能够有效提高抗CTLA-4单克隆抗体的稳定性，保证了抗CTLA-4单克隆抗体的活性，避免了抗体的蛋白聚集和沉淀，有效保证了药效。
进一步的，所述等渗调节剂为氯化钠。
优选的，所述等渗调节剂在所述制剂中的含量为50-100mM。
进一步的，所述非离子型表面活性剂包括吐温20、吐温80、泊洛沙姆中的一种。
优选的，所述非离子型表面活性剂在所述制剂中的含量为0.008-0.01％(w/v)。
优选的，所述非离子型表面活性剂为泊洛沙姆。
本发明还提供了一种抗CTLA-4单克隆抗体的注射制剂在制备治疗癌症疾病药物中的应用，所述癌症疾病包括黑色素瘤、前列腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃肠道癌或肝癌。
本发明的有益效果如下：本发明提供的注射制剂通过缓冲溶液中缓冲盐、蛋白保护剂、等渗调节剂、非离子型表面活性剂相互作用，协同配合，为抗CTLA-4单克隆抗体提供了良好的存储环境，在贮存和运输过程中，不仅能够保证抗体药物结构的稳定性，而且能有效降低制剂中抗体的聚集物的生成速率，保证了生物药物的疗效，同时，本发明中的药效分子抗CTLA-4单克隆抗体具有较强的亲和力和良好的生物活性，能够与CTLA-4抗原特异性结合，增强T细胞的活性，进而用于治疗各种癌症疾病，癌症疾病包括但不局限于下列肿瘤：黑色素瘤、前列腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃肠道癌、肝癌等；此外，本发明提供的注射制剂的制备成本低廉，工艺简单，无需特殊设备和苛刻条件，易于规模化生产。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的抗体生物淘选方法中pScFvDisb-s的质粒图谱；
图2为本发明实验一中梯度ELISA抗CTLA-4单链抗体的相对亲和力的比较图；
图3为本发明实验二中提供的抗CTLA-4全抗体的表达质粒pTSE的图谱；
图4为本发明实验三中抗CTLA-4单克隆抗体与CTLA-4抗原结合能力比较图；
图5为本发明实验四中抗CTLA-4全抗体与细胞表面CTLA-4抗原的结合特异性分析的线条图；
图6为本发明实验五中混合淋巴细胞反应(MLR)测试抗CTLA-4抗体活性比较图。
具体实施方式
下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本发明实施例1提供的一种抗CTLA-4单克隆抗体的注射制剂，制剂包括药效分子和缓冲溶液，药效分子为蛋白含量2-50mg/mL的抗CTLA-4单克隆抗体，
缓冲溶液包括以下含量的成分：
缓冲溶液的pH值为6.5－7.5。
其中：缓冲盐包括磷酸缓冲液、Tris-盐酸缓冲液和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中的一种；蛋白保护剂包括蔗糖、甘露醇、海藻糖、精氨酸、甘氨酸、脯氨酸中的一种；等渗调节剂为氯化钠；非离子型表面活性剂包括吐温20、吐温80、泊洛沙姆中的一种。
其中，抗CTLA-4单克隆抗体是利用全合成ScFv单链噬菌体抗体库获得特异性抗体的方法构建而成，这种全人源的特异性结合CTLA-4抗原的单克隆抗体是利用噬菌体抗体库技术筛选得到的，抗CTLA-4单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，具体的抗CTLA-4单链抗体的生物淘选方法如下：
步骤一：采用一系列基因克隆的方法对载体pComb3载体(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)进行改造，使之用于噬菌体单链抗体库的构建和表达。改造后的载体命名为pScFvDisb-s，其质粒图谱如图1所示，并以此载体为基础，构建全合成噬菌体抗体库。
步骤二：以CTLA-4为抗原包被免疫管，抗原包被量为2μg/500μl/管，4℃包被过夜，将噬菌体抗体库加入免疫管中进行抗原抗体结合，噬菌体投入量约为109～1012个，室温反应1h后，使用PBST-PBS洗去未结合的噬菌体，通过0.1M pH 2.2的Glycine-HCl洗脱，最后使用1.5M pH 8.8的Tris-HCl中和洗脱下来的噬菌体抗体溶液至pH 7.0左右。
步骤三：将上述中和后的噬菌体感染10mL生长至对数期的TG1菌液，37℃培养箱中静置30min，取出部分菌液进行梯度稀释，涂布于2YTAG平板上，同时计算噬菌体产出量。剩余的菌液离心弃上清，将菌体沉淀重悬于少量培养基，吸出后涂布于2YTAG大平板，为下一轮筛选做准备。
步骤四：将上述感染后涂板的菌体从大平板上刮下，接菌至2YTAG液体培养基，摇至对数期后加入M13辅助噬菌体超感染，28℃培养过夜扩增噬菌体，PEG6000-NaCl沉降纯化噬菌体用于下一轮筛选。按照此方法共进行三轮噬菌体库富集筛选后备用。
步骤五：CTLA-4噬菌体单链抗体阳性克隆的筛选：经过三轮筛选后，挑取分隔良好的单克隆菌落，接种于加有2YTAG液体培养基的96孔深孔板，在37℃，220rpm的条件下培养至其对数生长期，每孔加入约1010的辅助噬菌体M13KO7，在37℃的温度条件下静止感染30min后，在4000rpm且4℃温度条件下离心15min，弃去上清，菌体用2YTAK重悬沉淀，在28℃且220rpm的条件下培养过夜，吸取扩增后的噬菌体上清液进行ELISA鉴定，筛选得到亲和力较高的单克隆抗体，分别命名为N-1、N-2、N-3、N-4、N-5、N-6、N-7、N-8，将上述得到的单克隆抗体送至擎科生物科技有限公司进行基因测序确定为正确的抗体序列。
上述筛选得到的8株单克隆抗体N-1、N-2、N-3、N-4、N-5、N-6、N-7、N-8均可作为药效分子，经过测序，8株单克隆抗体序列如下：
(N-1)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO:9；
(N-2)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO:9；
(N-3)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO:9；
(N-4)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO:9；
(N-5)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO:10；
(N-6)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:6，轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO:10；
(N-7)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO:10；
(N-8)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:8，轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO:10。
具体的，SEQ ID NO:1(N-1中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSGYNGNWVRQAPGKGLEWVTFISYDGLNDVKADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARRYRWWGKAMDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:2(N-2中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSIFKRWVRQAPGKGLEWVTFISYDGLDHINGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARRYRWWGKAMDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:3(N-3中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSGIFSSWVRQAPGKGLEWVTFISYDSLKQKDGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARRYRWWGKAMDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:4(N-4中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSAFYNPWVRQAPGKGLEWVTFISYDGVYFHFGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARRYRWWGKAMDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:5(N-5中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSGFFNRWVRQAPGKGLEWVTFISYDALKDFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARRYRWWGKAMDYWGPGTLVTVSS；
SEQ ID NO:6(N-6中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSNTLRWVRQAPGKGLEWVTFISYDSLFLDQGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARRYRWWGKAMDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:7(N-7中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSGIYCNWVRQAPGKGLEWVTFISYDSILNVIADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARRYRWWGKAMDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:8(N-8中重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSGFSICWVRQAPGKGLEWVTFISYDGLLFLIADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARRYRWWGKAMDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:9(N-1～4中轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKSSQSVIDSKGYTYLGWYLQKPGQSPQLLIYLGTQKSSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQRGHIPITFGQGTKLEIK；
SEQ ID NO:10(N-5～8中轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQTVFDSHGQTYLQWYLQKPGQSPQLLIYGASRQVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQVWHLPITFGQGTKLEIK。
上述筛选的抗CTLA-4单克隆抗体还包括重链恒定区，重链恒定区为人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中的一种；优选的，重链恒定区为人的IgG1。
实施例2
本发明实施例2提供了一种抗CTLA-4单克隆抗体的注射制剂，该注射制剂在实施例1的基础上进一步限定了药效分子的蛋白含量为10-20mg/mL。
实施例3
本发明实施例3提供了一种抗CTLA-4单克隆抗体的注射制剂，该注射制剂在实施例1的基础上进一步限定了缓冲盐在制剂中的含量为10-20mM。
实施例4
本发明实施例4提供了一种抗CTLA-4单克隆抗体的注射制剂，该注射制剂在实施例1的基础上进一步限定了缓冲溶液的pH值为7.0－7.5。
实施例5
本发明实施例5提供了一种抗CTLA-4单克隆抗体的注射制剂，该注射制剂在实施例1的基础上进一步限定了蛋白保护剂为α-海藻糖。
实施例6
本发明实施例6提供了一种抗CTLA-4单克隆抗体的注射制剂，该注射制剂在实施例1的基础上进一步限定了等渗调节剂在制剂中的含量为50-100mM。
实施例7
本发明实施例7提供了一种抗CTLA-4单克隆抗体的注射制剂，该注射制剂在实施例1的基础上进一步限定了非离子型表面活性剂在制剂中的含量为0.008-0.01％(w/v)。
实施例8
本发明实施例8提供了一种抗CTLA-4单克隆抗体的注射制剂，该注射制剂在实施例1的基础上进一步限定了非离子型表面活性剂为泊洛沙姆。
实施例9
本发明实施例9提供了一种抗CTLA-4单克隆抗体的注射制剂在制备治疗癌症疾病药物中的应用，癌症疾病包括黑色素瘤、前列腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃肠道癌或肝癌。
实验一、梯度稀释噬菌体ELISA比较实施例1中得到的抗CTLA-4单克隆抗体的亲和力
将实施例1中获得的8株单克隆抗体(N-1、N-2、N-3、N-4、N-5、N-6、N-7、N-8)进行单克隆噬菌体的展示和纯化，然后进行噬菌体梯度稀释ELISA实验鉴定亲和力，选择上市产品Yervoy的核心专利EP2829609A1提供的抗CTLA-4单克隆抗体作为阳性对照，具体方法如下：
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被CTLA-4，100ng/孔/100μl，在4℃温度条件下包被过夜，使用PBST洗涤三次，将实施例1中筛选得到的8株抗CTLA-4单克隆抗体和专利EP2829609A1提供的抗CTLA-4单克隆抗体分别用PBST四倍梯度稀释，每孔加入100μl稀释后的样品，室温静置1小时。用PBST洗涤ELISA板，将PBST稀释后的HRP-anti-M13单克隆抗体加入ELISA板中，室温放置1h。TMB显色试剂盒显色，室温显色10分钟。用2M H2SO4终止后，450nm/630nm读数。
如图2所示，筛选出的8株不同的单克隆抗体均能够与CTLA-4进行结合，而且相对专利EP2829609A1提供的抗CTLA-4单克隆抗体，本发明提供的单克隆抗体与CTLA-4结合能力强，具有更高的亲和力。
实验二、抗CTLA-4全抗体的制备
将实施例1筛选出来的8株单克隆抗体的重链VH和轻链Vκ基因分别克隆至装有重链和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)，重链恒定区为人IgG1恒定区(氨基酸序列见SEQ ID NO:11)，轻链恒定区为κ链恒定区(氨基酸序列见SEQ ID NO:12)，pTSE载体结构如图3所示，制备过程参见CN103525868A说明书第3页第[0019]段。
SEQ ID NO:11(人的IgG1的恒定区序列)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG；
SEQ ID NO:12(κ链的轻链恒定区序列)：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC；
瞬时转染HEK293E细胞，进行全抗体表达，使用AKTA仪器通过protein A亲和柱纯化获得8株单克隆抗体的全抗体蛋白(全抗N-1、全抗N-2、全抗N-3、全抗N-4、全抗N-5、全抗N-6、全抗N-7、全抗N-8)，同时使用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。
实验三、全抗体与CTLA-4的结合实验
用pH 9.6的碳酸盐缓冲液包被CTLA-4，100ng/孔/100μl，在4℃温度条件下包被过夜，用300μl/孔PBST洗涤三次，再加入实验二中得到的不同稀释浓度的全抗体和专利EP2829609A1提供的抗CTLA-4单克隆抗体，所有抗体的起始最高浓度均是10μg/mL，分别经过5倍稀释后每个全抗体均做8个梯度，在37℃温度条件下孵育2-3h。用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入用PBST 1:5000稀释的anti-human IgG-HRP，在37℃的温度条件下孵育1h。用300μl/孔PBST洗涤八次，TMB显色试剂盒显色，100μl/孔，室温显色10min，然后用2M H2SO4终止。在450nm/630nm下读数，并计算对应的EC50值，具体数据如表1所示。
表1全抗体与CTLA-4的结合实验测量的EC50值
NAME N-1 N-2 N-3 N-4 N-5 N-6 N-7 N-8 EP2829609A1
EC50(ng/ml) 162.7 109.6 263.6 92.24 68.86 127.4 86.53 164.4 689.0
通过表1数据及如图4所示，筛选出的8株不同的单克隆抗体的全抗体均能与CTLA-4进行结合，本发明提供的8株不同的单克隆抗体的EC50值均明显低于专利EP2829609A1提供的抗CTLA-4单克隆抗体的全抗体，说明本发明提供的单克隆抗体与CTLA-4结合的亲和力较高，具有较好的活性，此外，从图4还可以得出，这8株全抗体中N-5的全抗体的活性最好，而且EC50值最低，说明其与CTLA-4结合能力最好，亲和力最高，活性最好。
实验四、全抗体与细胞表面CTLA-4的结合特异性分析
本发明采用过表达CTLA-4抗原的CHO细胞来检测不同的抗CTLA-4单克隆抗体与细胞表面CTLA-4的结合情况，用人的IgG(hIgG)作为同型对照，选择上市产品Yervoy的核心专利EP2829609A1提供的抗CTLA-4单克隆抗体的全抗体作为阳性对照，具体方法如下：离心收集细胞。同时稀释各种抗体，最高浓度为20μg/mL，4倍梯度稀释。将收集的细胞用PBS+1％BSA洗三遍，再加PBS+1％BSA重悬细胞，然后铺细胞于96孔板中，每孔1×105个细胞，加入100μl稀释好的抗CTLA-4单克隆抗体和阳性对照、同型对照，室温孵育1小时；离心去上清液，用PBS洗涤细胞三遍，再用稀释好的Alexa488标记的抗人IgG FC抗体溶液重悬细胞，室温避光孵育1小时，再次使用PBS洗涤三遍，再用100ul PBS重悬，用流式细胞仪检测荧光强度。结果用Graphpad Prism分析，并计算对应的EC50值，具体数据如表2所示。
表2全抗体与细胞表面CTLA-4的结合特异性分析测量的EC50值
NAME N-1 N-2 N-3 N-4 N-5 N-6 N-7 N-8 EP2829609A1 hIgG
EC50(ng/ml) 7.095 8.946 8.963 11.12 6.118 7.047 7.925 6.492 92.65 ——
通过表2数据及如图5所示，本发明实施例4制备的8株全抗体的EC50值均明显低于专利EP2829609A1提供的抗CTLA-4单克隆抗体的全抗体，说明本发明提供的8株抗体均能结合细胞表达的CTLA-4抗原，而且这8株全抗体中N-5的全抗体的EC50值最低，说明其与CTLA-4抗原特异性结合能力最好，亲和力最强，活性最好。
实验五、混合淋巴细胞反应(MLR)测试抗CTLA-4单克隆抗体活性
按密度梯度离心法分离新鲜外周血PBMC，磁珠分选CD14+ T细胞；用20ng/mL GM-CSF与10ng/mL IL-4的培养基培养CD14+ T细胞，每2天换液，7-10d诱导成为树突状DC细胞。在DC使用前两天，加入25ng/mL的TNF-α诱导DC为成熟的DC细胞，收集成熟的DC细胞，配制成细胞密度为1x105个/mL细胞悬液。从新鲜PBMC中磁珠分选出CD4+ T细胞，计数，制成细胞密度为1x106个/mL细胞悬液。将CD4+ T细胞与DC细胞各取100ul，按比例10∶1加入96孔板。
将实施例4制备的8株抗CTLA-4全抗体、专利EP2829609A1提供的抗CTLA-4全抗体作为阳性对照和用人的IgG(hIgG)作为同型对照，分别进行4倍梯度稀释，每株全抗体均设置6个梯度，各取50ul加入到96孔板中，5天后，cck8测试CD4+ T细胞增殖，在450nm下读数，并计算对应的EC50值，具体数据如表3所示：
表3混合淋巴细胞反应(MLR)测试抗CTLA-4单克隆抗体活性中测量的EC50值
NAME N-1 N-2 N-3 N-4 N-5 N-6 N-7 N-8 EP2829609A1 hIgG
EC50(mol/L) 7.343E-09 8.308E-09 1.418E-08 1.538E-08 4.946E-09 6.67E-09 6.307E-09 7.318E-09 8.513E-08 ——
通过表3数据及如图6所示，本发明筛选出的8株不同的抗CTLA-4全抗体的EC50值均明显低于专利EP2829609A1提供的抗CTLA-4全抗体，说明本发明提供的抗CTLA-4全抗体的活性均高于专利EP2829609A1提供的抗CTLA-4全抗体。说明本发明提供的抗CTLA-4单克隆抗体的活性较好，亲和力较强。此外，从图6还可以看出，本发明筛选出的8株单克隆抗体中，抗CTLA-4单克隆抗体N-5的活性最高。
实验六、稳定性实验测试
抗CTLA-4单克隆抗体注射制剂的制备方法：首选通过实验一至五中选择与CTLA-4的结合能力最高、活性最好的抗CTLA-4单克隆抗体N-5作为药效分子备用，然后通过超滤管将分离纯化好的抗CTLA-4单克隆抗体N-5换液至缓冲溶液样品中，并将缓冲溶液样品浓缩后稀释至5mg/ml，用0.22μm过滤器无菌过滤，分装至20ml西林瓶中，10ml/瓶。
(1)不同缓冲盐对制剂稳定性影响
通过上述方法配置成不同成分含量的15种抗CTLA-4单克隆抗体注射制剂作为实验例样品，通过上述方法配置成不同成分含量的1种抗CTLA-4单克隆抗体注射制剂作为对照例样品，不同实验例和对照例提供的制剂包括以下含量的成分：
表4不同pH值和不同缓冲盐制备的抗CTLA-4单克隆抗体注射制剂的具体成分含量表
Figure BDA0002247569020000121
将表4中的实验例样品和对照例样品同时放置40℃的样品分别于第2周和第4周取出进行分析检测，检测项目包括SEC-HPLC和CEX-HPLC。
分析检测方法：总聚集体检测，采用大小排阻层析高效液相色谱法分析；电荷异构体：采用阳离子交换色谱法测定电荷异构体主峰含量。
通过大小排阻层析高效液相色谱法(SEC-HPLC)考察抗CTLA-4单克隆抗体的注射制剂在40℃条件下放置1周、2周和4周后的蛋白总聚集水平，通过CEX-HPLC方法考察抗CTLA-4单克隆抗体的注射制剂在40℃条件下放置2周和4周后的主峰含量，从而确定抗体稳定的最适缓冲液和最佳pH值。以试验起始(0w)、放置1w、2w和4w的蛋白总聚集体及主峰含量，计算主峰下降速率(％/周)；数据汇总如下表5所示。
表5实验例和对照例提供的抗体在不同pH值和不同缓冲盐下稳定性数据汇总表
Figure BDA0002247569020000131
通过表5数据得知，抗CTLA-4单克隆抗体的注射制剂在40℃条件下加速4周，从总聚集体及电荷异构体主峰含量下降速率考察，本发明提供的抗CTLA-4单克隆抗体在磷酸缓冲液、Tris-盐酸缓冲液和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中相对较为稳定，与对照例1相比，本发明提供的抗CTLA-4单克隆抗体适宜的pH范围为6.5－7.5，任意超出该范围，蛋白稳定性将降低，与其他实验例相比，可以发现，本发明提供的磷酸缓冲液更为稳定，而且最适宜pH范围在7.0～7.5之间最为稳定。
(2)不同蛋白稳定剂及等渗调节剂对制剂稳定性影响
通过实验一至五中选择与CTLA-4的结合能力最高、活性最好的抗CTLA-4单克隆抗体N-5作为药效分子备用，然后通过上述制剂制备方法配置成不同成分含量的14种抗CTLA-4单克隆抗体注射制剂作为实验例样品，通过上述方法配置成不同成分含量的1种抗CTLA-4单克隆抗体注射制剂作为对照例样品，不同实验例和不同对照例提供的制剂包括以下含量的成分：
表6不同蛋白保护剂和不同等渗调节剂制备的抗CTLA-4单克隆抗体注射制剂的具体成分含量表
实验例 药效分子 缓冲盐 蛋白保护剂 等渗调节剂 非离子型表面活性剂 pH值
实验例1 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 5％(w/v)精氨酸 — 0.02％(w/v)吐温80 7.3
实验例2 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 5％(w/v)甘氨酸 — 0.02％(w/v)吐温80 7.3
实验例3 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 5％(w/v)甘露醇 — 0.02％(w/v)吐温80 7.3
实验例4 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 10％(w/v)蔗糖 — 0.02％(w/v)吐温80 7.3
实验例5 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 10％(w/v)α-海藻糖 — 0.02％(w/v)吐温80 7.3
实验例6 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 3％(w/v)精氨酸 50mM氯化钠 0.02％(w/v)吐温80 7.3
实验例7 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 3％(w/v)甘氨酸 25mM氯化钠 0.02％(w/v)吐温80 7.3
实验例8 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 3％(w/v)甘露醇 35mM氯化钠 0.02％(w/v)吐温80 7.3
实验例9 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 3％(w/v)蔗糖 50mM氯化钠 0.02％(w/v)吐温80 7.3
实验例10 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 3％(w/v)α-海藻糖 50mM氯化钠 0.02％(w/v)吐温80 7.3
实验例11 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 1％(w/v)精氨酸 80mM氯化钠 0.02％(w/v)吐温80 7.3
实验例12 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 1％(w/v)甘氨酸 90mM氯化钠 0.02％(w/v)吐温80 7.3
实验例13 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 1％(w/v)蔗糖 100mM氯化钠 0.02％(w/v)吐温80 7.3
实验例14 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 1％(w/v)α-海藻糖 100mM氯化钠 0.02％(w/v)吐温80 7.3
对照例1 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 5％(w/v)乳糖 — 0.02％(w/v)吐温80 7.3
将上述表6提供的实验例样品和对照例样品同时放置40℃的样品分别于第2周和第4周取出进行分析检测，检测项目包括SEC-HPLC和CEX-HPLC。
表7实验例和对照例提供的抗体在不同蛋白保护剂和不同等渗调节剂下稳定性数据汇总表
Figure BDA0002247569020000141
Figure BDA0002247569020000151
从表7中可以看出，综合SEC-HPLC和CEX-HPLC的结果，在磷酸缓冲液，且pH7.3条件下，添加不同等渗调节剂，通过对照例1与其他实施例相比，对照例1的纯度和主峰含量下降均较快，稳定性较差，其他实施例中添加的表面活性剂与对照例1相比较为稳定，尤其实施例10，其纯度和主峰含量的变化率较小，所以本发明提供的等渗调节剂任意更换一种将有可能导致稳定性降低，而通过实验例1-14相比，实施例10提供的抗CTLA-4单克隆抗体制剂中，蛋白保护剂为含3％(w/v)α-海藻糖，等渗调节剂为含有50mM的氯化钠，其在放置4周后，纯度和主峰含量下降较少，说明其稳定性较高，为此，本发明优选的，蛋白保护剂优选为3％(w/v)α-海藻糖，等渗调节剂优选为50mM的氯化钠。
(3)不同非离子型表面活性剂对制剂稳定性影响
通过实验一至五中选择与CTLA-4的结合能力最高、活性最好的抗CTLA-4单克隆抗体N-5作为药效分子备用，然后通过上述制剂制备方法配置成不同成分含量的15种抗CTLA-4单克隆抗体注射制剂作为实验例样品，通过上述方法配置成不同成分含量的1种抗CTLA-4单克隆抗体注射制剂作为对照例样品，不同实验例和不同对照例提供的制剂包括以下含量的成分：
表8不同非离子表面活性剂制备的抗CTLA-4单克隆抗体注射制剂的具体成分含量表
实验例 药效分子 缓冲盐 蛋白保护剂 等渗调节剂 非离子型表面活性剂 pH值
实验例1 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 3％(w/v)α-海藻糖 50mM氯化钠 0.005％(w/v)吐温80 7.3
实验例2 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 3％(w/v)α-海藻糖 50mM氯化钠 0.008％(w/v)吐温80 7.3
实验例3 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 3％(w/v)α-海藻糖 50mM氯化钠 0.01％(w/v)吐温80 7.3
实验例4 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 3％(w/v)α-海藻糖 50mM氯化钠 0.015％(w/v)吐温80 7.3
实验例5 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 3％(w/v)α-海藻糖 50mM氯化钠 0.02％(w/v)吐温80 7.3
实验例6 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 3％(w/v)α-海藻糖 50mM氯化钠 0.005％(w/v)吐温20 7.3
实验例7 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 3％(w/v)α-海藻糖 50mM氯化钠 0.008％(w/v)吐温20 7.3
实验例8 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 3％(w/v)α-海藻糖 50mM氯化钠 0.01％(w/v)吐温20 7.3
实验例9 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 3％(w/v)α-海藻糖 50mM氯化钠 0.015％(w/v)吐温20 7.3
实验例10 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 3％(w/v)α-海藻糖 50mM氯化钠 0.02％(w/v)吐温20 7.3
实验例11 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 3％(w/v)α-海藻糖 50mM氯化钠 0.005％(w/v)泊洛沙姆 7.3
实验例12 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 3％(w/v)α-海藻糖 50mM氯化钠 0.008％(w/v)泊洛沙姆 7.3
实验例13 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 3％(w/v)α-海藻糖 50mM氯化钠 0.01％(w/v)泊洛沙姆 7.3
实验例4 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 3％(w/v)α-海藻糖 50mM氯化钠 0.015％(w/v)泊洛沙姆 7.3
实验例15 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 3％(w/v)α-海藻糖 50mM氯化钠 0.02％(w/v)泊洛沙姆 7.3
对照例1 15mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 3％(w/v)α-海藻糖 50mM氯化钠 0.01％(w/v)吐温40 7.3
将表8提供的实验例样品和对照例样品同时放置40℃的样品分别于第2周和第4周取出进行分析检测，检测项目包括SEC-HPLC和CEX-HPLC。
表9实验例和对照例提供的抗体在不同非离子表面活性剂下稳定性数据汇总表
Figure BDA0002247569020000161
表9可以看出，本发明提供的非离子表面活性剂包含的吐温80、吐温20和泊洛沙姆均能够保证本发明提供的制剂的稳定性，通过上述实验例与对照例1相比，说明非离子表面活性剂中任意选择其他一种将有可能导致制剂在4周后纯度和主峰含量下降，同时，实验例1-15相比，说明本发明优选的表面活性剂为泊洛沙姆时，其纯度和主峰含量在4周后下降较小，相对吐温80和吐温20较稳定，通过实施例1-15相比，说明实验例12中选择的表面活性剂为泊洛沙姆且含量为0.008％(w/v)时，抗CTLA-4单克隆抗体注射制剂均具有很好的稳定性。非离子型表面活性剂含量太低起不到分散作用，含量太高可能产生副作用，影响制剂输注的安全性。
(4)不同抗体蛋白浓度对制剂的影响
通过实验一至五中选择与CTLA-4的结合能力最高、活性最好的抗CTLA-4单克隆抗体N-5作为药效分子备用，然后通过上述制剂制备方法配置药效分子不同含量的6种抗CTLA-4单克隆抗体注射制剂作为实验例样品，不同实验例样品提供的制剂包括以下含量的成分：
表10不同抗体蛋白含量制备的抗CTLA-4单克隆抗体注射制剂的具体成分含量表
实验例 药效分子 缓冲盐 蛋白保护剂 等渗调节剂 非离子型表面活性剂 pH值
实验例1 2mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 3％(w/v)α-海藻糖 50mM氯化钠 0.008％(w/v)泊洛沙姆 7.3
实验例2 6mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 3％(w/v)α-海藻糖 50mM氯化钠 0.008％(w/v)泊洛沙姆 7.3
实验例3 10mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 3％(w/v)α-海藻糖 50mM氯化钠 0.008％(w/v)泊洛沙姆 7.3
实验例4 20mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 3％(w/v)α-海藻糖 50mM氯化钠 0.008％(w/v)泊洛沙姆 7.3
实验例5 30mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 3％(w/v)α-海藻糖 50mM氯化钠 0.008％(w/v)泊洛沙姆 7.3
实验例6 50mg/mL抗CTLA-4单克隆抗体N-5 20mM磷酸缓冲液 3％(w/v)α-海藻糖 50mM氯化钠 0.008％(w/v)泊洛沙姆 7.3
将表10提供的实验例样品在40℃的环境下放置，并于第2周和第4周取出进行分析检测，检测项目包括SEC-HPLC和CEX-HPLC。
表11不同实验例提供的抗体在抗体蛋白不同含量下稳定性数据汇总表
Figure BDA0002247569020000171
从表11可以看出，在不同的蛋白浓度下，上述不同浓度的抗体蛋白的抗CTLA-4单克隆抗体注射制剂的纯度和电荷异构体主峰含量均有很好的稳定性。但是通过对比，但随着浓度的增加或减少，总聚集体也在增加，本发明提供的最优抗体蛋白浓度为10-20mg/ml为最适宜制剂浓度。
通过实验六，筛选出能够使抗CTLA-4单克隆抗体结构最稳定的缓冲溶液成分及最优选的成分含量，通过上述制备方法制备成抗CTLA-4单克隆抗体的注射制剂，该制剂包括药效分子和缓冲溶液，药效分子为蛋白含量为2-50mg/mL的抗CTLA-4单克隆抗体N-5，
缓冲溶液包括以下含量的成分：
Figure BDA0002247569020000181
缓冲溶液的pH值为7.3。
实验七、处方验证实验
将实验六中筛选得到的最优的辅料和药效成分制成的抗CTLA-4单克隆抗体注射制剂进行处方验证试验，处方验证试验包括冻融稳定性试验和振摇稳定性试验。
(1)冻融稳定性试验
将上述抗JY041抗体注射制剂浓缩至5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、50mg/ml，进行冻融稳定性试验，分别冻融1、2、3次。考察制剂外观、蛋白总聚集体和电荷异构体主峰含量，结果如下表12所示。
表12抗体制剂冻融稳定性结果汇总
Figure BDA0002247569020000182
Figure BDA0002247569020000191
(2)振摇稳定性试验：
将上述抗CTLA-4单克隆抗体注射制剂浓缩至5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、50mg/ml，进行振摇稳定性试验，分别进行室温水平振摇(80-120rpm)和圆周振摇(30rpm)3天。考察制剂外观、蛋白总聚集体和电荷异构体主峰含量，结果如下表13所示。
表13抗体制剂振摇稳定性试验结果汇总
从表12至13可以看出，从外观可以看出，不同浓度蛋白经过冻融试验及振摇试验均澄清透明，无可见异物，蛋白物理稳定性良好；从总聚集体可以看出，不同浓度蛋白均很稳定，聚集体未增加，振摇试验可以看出，不同浓度蛋白均很稳定；从电荷异构体主峰含量可以看出，不同浓度蛋白经过冻融试验及振摇试验均未有明显变化。由以上实验证明，抗CTLA-4单克隆抗体注射制剂的蛋白浓度在2-50mg/ml，均很稳定，更优选为10-20mg/ml。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京东方百泰生物科技有限公司
<120> 一种抗CTLA-4单克隆抗体的注射制剂
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Asn Gly Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Leu Asn Asp Val Lys Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Arg Trp Trp Gly Lys Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ile
20 25 30
Phe Lys Arg Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Leu Asp His Ile Asn Gly Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Arg Trp Trp Gly Lys Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ile
20 25 30
Phe Ser Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Ser Leu Lys Gln Lys Asp Gly Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Arg Trp Trp Gly Lys Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Phe
20 25 30
Tyr Asn Pro Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Val Tyr Phe His Phe Gly Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Arg Trp Trp Gly Lys Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Phe
20 25 30
Phe Asn Arg Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Ala Leu Lys Asp Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Arg Trp Trp Gly Lys Ala Met Asp Tyr Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asn
20 25 30
Thr Leu Arg Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Ser Leu Phe Leu Asp Gln Gly Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Arg Trp Trp Gly Lys Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ile
20 25 30
Tyr Cys Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Ser Ile Leu Asn Val Ile Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Arg Trp Trp Gly Lys Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Phe
20 25 30
Ser Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Phe Leu Ile Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Tyr Arg Trp Trp Gly Lys Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 9
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Ile Asp Ser
20 25 30
Lys Gly Tyr Thr Tyr Leu Gly Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Thr Gln Lys Ser Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Arg
85 90 95
Gly His Ile Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 10
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 10
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Val Phe Asp Ser
20 25 30
His Gly Gln Thr Tyr Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Arg Gln Val Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Val
85 90 95
Trp His Leu Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 11
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 11
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Homo sapiens)
<400> 12
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105

Claims (10)

1.一种抗CTLA-4单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述制剂包括药效分子和缓冲溶液，所述药效分子为蛋白含量2-50mg/ml的抗CTLA-4单克隆抗体，所述缓冲溶液包括以下含量的成分：
Figure FDA0002247569010000011
其中，所述缓冲溶液的pH值为6.5－7.5。
2.如权利要求1所述的抗CTLA-4单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述抗CTLA-4单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，且所述抗CTLA-4单克隆抗体选自以下任意一种：
(N-1)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9；
(N-2)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9；
(N-3)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9；
(N-4)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9；
(N-5)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:10；
(N-6)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:6，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:10；
(N-7)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:10；
(N-8)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:8，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:10。
3.如权利要求2所述的抗CTLA-4单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述抗CTLA-4单克隆抗体的蛋白含量为10-20mg/ml。
4.如权利要求2所述的抗CTLA-4单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述单克隆抗体还包括重链恒定区，所述重链恒定区为人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中的一种；
优选的，所述重链恒定区为人的IgG1。
5.如权利要求1所述的抗CTLA-4单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述缓冲盐包括磷酸缓冲液、Tris-盐酸缓冲液和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中的一种或多种组合；
优选的，所述缓冲盐在所述制剂中的含量为10-20mM；
优选的，所述缓冲溶液的pH值为7.0－7.5。
6.如权利要求1所述的抗CTLA-4单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述蛋白保护剂包括蔗糖、甘露醇、α-海藻糖、精氨酸、甘氨酸、脯氨酸中的一种。
7.如权利要求6所述的抗CTLA-4单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述蛋白保护剂为α-海藻糖。
8.如权利要求1所述的抗CTLA-4单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述等渗调节剂为氯化钠；
优选的，所述等渗调节剂在所述制剂中的含量为50-100mM。
9.如权利要求1所述的抗CTLA-4单克隆抗体的注射制剂，其特征在于，所述非离子型表面活性剂包括吐温20、吐温80、泊洛沙姆中的一种或多种组合；
优选的，所述非离子型表面活性剂在所述制剂中的含量为0.008-0.01％(w/v)；
优选的，所述非离子型表面活性剂为泊洛沙姆。
10.一种抗CTLA-4单克隆抗体的注射制剂在制备治疗癌症疾病药物中的应用，所述癌症疾病包括黑色素瘤、前列腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、胃肠道癌或肝癌。
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