CN114163528A - Cd47结合分子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种CD47结合分子及其应用。所述的CD47结合分子包括CD47抗体或来源于该抗体的能够免疫特异性结合CD47的生物活性片段，可为动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，所述CD47抗体的CDR包括抗人CD47抗体1C8的CDR中的至少一个CDR，其余所有CDR选自：抗人CD47抗体1C8的三个重链以及三个轻链CDR。本发明的CD47结合分子表现出只作用于肿瘤细胞而不影响正常细胞功能的高效低毒副作用。

Description

CD47结合分子及其应用
技术领域
本发明涉及能够免疫特异性地结合到CD47的分子，具体涉及CD47抗体及来源于该抗体的能够免疫特异性结合CD47的生物活性片段，以及它们在治疗和诊断肿瘤和其他CD47相关疾病中的应用。
背景技术
CD47是一种广泛表达在细胞表面的约50KD的跨膜糖蛋白，其结构主要包括胞外N端的一个IgV-like结构域，五个高度疏水的跨膜结构域和一个具有多种剪接形式的胞内肽段。CD47因其功能多与整合素相关，因此又被称为整合素相关蛋白(Integrin AssociatedProtein,IAP)。CD47在细胞自我识别过程中发挥着重要作用。
信号调节蛋白家族SIRPα是CD47重要的配体，它主要表达在神经元、树突细胞和巨噬细胞表面。SIRPα是一个单次跨膜的整合膜蛋白，胞外区含有三个IgV-like结构域，胞内肽段含有2个ITIM(immunoreceptor tyrosine inhibitory motif)模序。其中，N端IgV-like结构域介导SIRPα与CD47的IgV-like结构域相互作用，而胞内ITIM可招募并激活SHP-1/2(Src-homology 2(SH2)-domain-containing tyrosinephosphatases)。
CD47-SIRPα是机体内重要的“自我”识别信号。正常情况下当CD47结合SIRPα时发出“别吃我”信号，SIRPα胞内ITIM招募并激活SHP-1，通过SHP-1抑制下游酪氨酸激酶依赖的信号途径，调控巨噬细胞，抑制吞噬作用。但这一保护机制易被肿瘤细胞利用。人们最先在卵巢癌中发现CD47，随后相继在慢性骨髓白血病、急性髓性白血病、膀胱癌等肿瘤细胞中都发现CD47表达。并且肿瘤细胞中CD47的表达量要远比正常细胞高，过表达CD47帮助肿瘤细胞免受巨噬细胞的吞噬从而逃过固有免疫系统的监视。
肿瘤细胞通过高表达CD47骗过免疫系统，那么在理论上可以通过阻断CD47-SIRPα信号来促进免疫系统对肿瘤细胞的清除作用。事实上，通过抗CD47或SIRPα抗体来阻断CD47-SIRPα信号已经被证明确实可以促进肿瘤细胞的清除。因此，CD47作为一个潜在的肿瘤免疫治疗靶点受到了广泛的关注。目前，全球已经有多家公司在投入开发CD47抗体。其中进展较快的是Forty seven公司开发的Hu5F9。但是，由于CD47在体内广泛表达，抗体会影响机体内正常CD47的功能，因此CD47抗体在临床上出现的副作用成为了抗体开发的巨大挑战。本领域原有技术运用过程中产生的抗体，起初易出现血凝，随后出现与红细胞结合的副作用，这样就会在临床上浪费了大量的抗体，并且降低了药物的安全性，影响了疗效，像Hu5F9在临床试验中出现了红细胞毒性，另外还有些抗体表现出了T细胞毒性等。
因此，想要有效利用CD47-SIRPα这一信号来进行肿瘤免疫治疗，开发出只作用于肿瘤细胞而不影响正常细胞功能的高效低毒副作用的CD47抗体具有重要的临床意义。
发明内容
本发明的一个目的在于提供安全有效的CD47结合分子。
为了开发出只作用于肿瘤细胞而不影响正常细胞功能的高效低毒副作用的CD47结合分子，本发明利用兔单细胞RT-PCR技术，从免疫后的兔子体内成功分离到一株低亲和力低解离能力、低毒(基本上不与红细胞结合)、但能高效促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的兔源CD47抗体，本发明中称为1C8。细胞水平实验表明，该抗体能高效阻断CD47与配体SIRPα结合，有效促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞，同时具有低红细胞毒性的特点，本发明的这株细胞具有重要的临床开发价值。在此基础上，本发明进一步提供了嵌合抗体及人源化抗体。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种分子，该分子能够免疫特异性结合CD47，因此本发明中亦称其为CD47结合分子。具体而言，该分子包括CD47抗体或来源于该抗体的能够免疫特异性结合CD47的生物活性片段，其中所述CD47抗体的六个CDR包括抗人CD47抗体1C8的CDR中的至少一个CDR，其余所有CDR选自：
抗人CD47抗体1C8的三个重链以及三个轻链CDR。
本发明中，对所得到的CD47抗体1C8的氨基酸序列进行了分析，以鉴定CDR序列以及可能的会提供类似结合属性的变体CDR序列，以研究该抗体和来源于该抗体的能够特异性结合CD47的生物活性片段(抗原结合片段)。
根据本发明的具体实施方案，所述抗人CD47抗体1C8的三个重链以及三个轻链CDR的氨基酸序列包括：
重链CDR1：GFSLS SYA(SEQ ID NO:1)；
重链CDR2：SSIG DP(SEQ ID NO:2)；
重链CDR3：SYPGN GDLGR LD(SEQ ID NO:3)；
轻链CDR1：QSVY RNKY(SEQ ID NO:4)；
轻链CDR2：YAST(SEQ ID NO:5)；
轻链CDR3：AGDYS DDIEN A(SEQ ID NO:6)。
本发明中，“免疫特异性结合”是指，如果这种结合展现一种抗体结合至其同源抗原的特异性以及亲和力的话，则称一个分子能够“免疫特异性地结合”另一分子。如果这种结合涉及免疫球蛋白分子的抗原识别位点的话，则称抗体能够“免疫特异性地结合”至抗原(并且特别是人CD47)的一个靶区域或构造(“表位”)。免疫特异性地结合到一种具体的抗原的一种抗体可以按更低的亲和力结合到其他抗原，前提是如果该其他抗原具有由如通过例如免疫测定、
Figure BDA0003321014810000032
测定、或本领域中已知的其他测定确定的抗原识别位点所识别的一些序列或构造相似性的话，但不会结合至完全不相关的抗原。然而，优选地，抗体(及其抗原结合片段)将不与其他抗原发生交叉反应。抗体也可以按非免疫特异性的方式结合到其他分子，诸如结合到Fc受体(FcR)，凭借该分子的不涉及该抗原识别位点的其他区域/域中的结合域，诸如Fc区。
本发明中，一个分子“能够免疫特异性结合CD47”是指，该分子具有通过结合CD47而减弱或阻断该CD47与配体SIRPα结合的能力。
根据本发明的具体实施方案，来源于本发明的抗体的能够免疫特异性结合CD47的生物活性片段包括：
抗人CD47抗体1C8的三个重链以及三个轻链CDR。
本发明所用序列“变体”是指在一个或多个氨基酸残基处不同于所示的序列但保留所得到的分子的生物学活性(与原序列相比，基本上不改变生物学活性)的序列。
“保守修饰的变体”或“保守的氨基酸取代”是指本领域技术人员已知的氨基酸取代，进行这种取代通常不改变所得到的分子的生物学活性。一般而言，本领域技术人员公认在多肽非必需区的单个氨基酸取代基本上不改变生物学活性(参见例如W a t so n等，Molecula r Biology of the Gene(基因的分子生物学)，The Benjamin/CummingsPub.Co.，第224页(第四版，1987))。这样的例示性取代优选依照以下表1所示的取代来进行：
表1、例示性保守氨基酸取代
Figure BDA0003321014810000031
Figure BDA0003321014810000041
本发明中提供了具有CD47抗体1C8的CDR的抗体及其抗原结合片段，还提供了其变体。所述变体例如可为具有上表所列氨基酸残基取代的衍生的抗体及其抗原结合片段。这些衍生的变体包括展现与CD47抗体1C8的可变重链和/或轻链的氨基酸序列至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％一致的可变重链和/或可变轻链的氨基酸序列。此外，这些衍生的抗体及其抗原结合片段可包括展现与CD47抗体1C8的CDR的氨基酸序列至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％一致的CDR。两种氨基酸序列的百分比同一性的确定可以由BLAST蛋白比较来确定。
在本发明的一些具体实施方案中，一种抗体或其一个抗原结合片段包含上述CD47抗体1C8中的一、二、三、四、五、或更优选地所有六个CDR并且将展现免疫特异性结合至人CD47的能力。
本发明的CD47结合分子，其基本上不影响正常细胞功能。具体而言，基本上不具备红细胞毒性(基本上不与红细胞结合)。
本发明中，在结合或展现的效果的背景下使用的术语“基本上”旨在表示所观察到的效果是生理学或治疗相关的。因此，例如，如果阻滞的程度是生理学或治疗相关的话(例如如果这种程度大于完全阻滞的60％，大于完全阻滞的70％，大于完全阻滞的75％，大于完全阻滞的80％，大于完全阻滞的85％，大于完全阻滞的90％，大于完全阻滞的95％，或大于完全阻滞的97％)，一个分子能够基本上阻滞CD47的活性。类似地，如果此类免疫特异性以及表征是大于60％相同的，大于70％相同的，大于75％相同的，大于80％相同的，大于85％相同的，大于90％相同的，大于95％相同的，或大于97％相同的，则称一个分子与另一个分子具有基本上相同的免疫特异性和/或表征。
根据本发明的具体实施方案，本发明的抗体可以为动物源抗体，也可以为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
本发明中，“抗体”旨在表示具有一个“可变区”抗原识别位点的一个免疫球蛋白分子。术语“可变区”旨在将该免疫球蛋白的这种域与抗体广泛共享的域(例如一个抗体Fc域)区分。本发明中，术语一种抗体的“抗原结合片段”是指一种抗体的包含以下项的一个或多个部分：该抗体的互补决定区(“CDR”)以及任选地包括该抗体的“可变区”抗原识别位点、并且展现免疫特异性地结合抗原的能力的框架残基。此类片段包括Fab'、F(ab')2、Fv、单链(ScFv)，及其突变体、天然存在的变体，以及包括该抗体的“可变区”抗原识别位点以及一种异源蛋白(例如，毒素、针对不同抗原的抗原识别位点、酶、受体或受体配体等)的融合蛋白。本发明中，术语“片段”是指一种肽或多肽，该肽或多肽包括至少4个连续的氨基酸残基、至少10个连续的氨基酸残基、至少15个连续的氨基酸残基、至少20个连续的氨基酸残基、至少25个连续的氨基酸残基、至少40个连续的氨基酸残基、至少50个连续的氨基酸残基、至少60个连续的氨基残基、至少70个连续的氨基酸残基、至少80个连续的氨基酸残基、至少90个连续的氨基酸残基、至少100个连续的氨基酸残基、至少125个连续的氨基酸残基、至少150个连续的氨基酸残基、至少175个连续的氨基酸残基、至少200个连续的氨基酸残基、或至少250个连续的氨基酸残基的氨基酸序列。
人嵌合抗体、人源化抗体或人抗体对于在人体内使用是特别优选的，然而，可有利地采用动物源的抗体用于许多用途(例如，体外或原位检测测定，急性体内使用等)。完全人抗体对于人受试者的治疗性治疗是特别令人希望的。人类抗体可以通过在本领域中已知的多种方法来制造，包括使用衍生自人类免疫球蛋白序列的抗体文库的上述的噬菌体展示方法。
本发明中，“嵌合抗体”是其中抗体的不同部分衍生自不同的免疫球蛋白分子的分子，如具有衍生自一种非人抗体的可变区和人类免疫球蛋白恒定区的抗体。产生嵌合抗体的方法在本领域中是已知的。
本发明中，“人源化抗体”是指包括一个人框架区以及来自一种非人免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白称作“供体”并且提供框架的人免疫球蛋白称作“受体”。恒定区不需要存在，但如果它们存在，它们必须与人免疫球蛋白恒定区基本上相同，即至少约85％-90％、优选地约95％或更多是相同的。因此，除了可能的CDR外，人源化免疫球蛋白的所有部分基本上与天然人免疫球蛋白序列的相应部分相同。一种人源化抗体是包含人源化轻链以及人源化重链免疫球蛋白的一种抗体。例如，一种人源化抗体将不包含一种典型的嵌合抗体，因为，例如一种嵌合抗体的整个可变区是非人的。通过“人源化(humanization)”的过程一个供体抗体被“人源化”，因为预期所得到的人源化抗体结合到与提供该CDR的供体抗体针对的相同的抗原上。对于大部分，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中该受体的高变区残基被来自具有希望的特异性、亲和力、以及能力的一个非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长动物的高变区残基替代。在一些情况下，人类免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人类残基替换。此外，人源化抗体可以包括受体抗体或供体抗体中不存在的残基。作出这些修饰以进一步改进抗体性能。通常，该人源化抗体将包括基本上至少一个、并且典型地两个可变域的全部，其中这些高变区的全部或基本上全部对应于非人类免疫球蛋白的那些，并且FR的全部或基本上全部是人类免疫球蛋白序列的那些。该人源化抗体任选地也将包括一个免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是免疫特异性地结合到一个FcγRIIB多肽的人免疫球蛋白的那部分，其已通过引入氨基酸残基取代、缺失或添加(即，突变)改变。
本发明中，所述的抗体可以是单特异性的，还可以是双特异性的抗体、三特异性的抗体或具有更大的多特异性的抗体。
本发明中，为便于后期抗体人源化工作，将获得的动物源抗体IC8的可变区基因构建到带有人恒定区的抗体表达载体上；瞬时转染CHO细胞，重组表达获得两个IgG亚型的人兔嵌合抗体。
本发明中，获得的嵌合抗体的可变区序列如下：
1C8(CDR序列以加粗和加下划线示出)：
重链Hu1C8VH-0(H0)：
Figure BDA0003321014810000061
轻链Hu1C8VL-0(L0)：
Figure BDA0003321014810000071
本发明进一步对可变区进行了人源化。根据本发明的具体实施方案，设计了以下人源化抗体序列。
兔抗1C8人源化序列设计：
重链：
Hu1C8VH-1(H1)：
Figure BDA0003321014810000072
Hu1C8VH-2(H2)：
Figure BDA0003321014810000073
Hu1C8VH-3(H3)：
Figure BDA0003321014810000074
Hu1C8VH-4(H4)：
Figure BDA0003321014810000075
Hu1C8VH-5(H5)：
Figure BDA0003321014810000076
Hu1C8VH-6(H6)：
Figure BDA0003321014810000077
Hu1C8VH-7(H7)：
Figure BDA0003321014810000081
轻链：
Hu1C8VL-1(L1)：
Figure BDA0003321014810000082
Hu1C8VL-2(L2)：
Figure BDA0003321014810000083
Hu1C8VL-3(L3)：
Figure BDA0003321014810000084
Hu1C8VL-4(L4)：
Figure BDA0003321014810000085
Hu1C8VL-5(L5)：
Figure BDA0003321014810000086
Hu1C8VL-6(L6)：
Figure BDA0003321014810000087
根据本发明的具体实施方案，本发明的CD47结合分子包括：
(1)一个重链可变区，其中所述重链可变区具有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15中任一个的氨基酸序列，或在这些氨基酸序列基础上经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有基本上同等功能的氨基酸序列；和/或
(2)一个轻链可变区，其中所述轻链可变区具有SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16、SEQID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21中任一个的氨基酸序列，或在这些氨基酸序列基础上经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有基本上同等功能的氨基酸序列。
根据本发明的具体实施方案，本发明的CD47结合分子可以包括下表2中所列的人源化抗体的任一种或多种。
表2
Figure BDA0003321014810000091
Figure BDA0003321014810000101
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了编码本发明所述的CD47结合分子(例如所述CD47抗体或来源于该抗体的能够特异性结合CD47的生物活性片段)的多核苷酸。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了含有本发明上述多核苷酸的载体。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了含有本发明上述多核苷酸或含有上述载体的细胞。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种药物组合物，其包含本发明所述的CD47结合分子(例如CD47抗体或来源于该抗体的能够特异性结合CD47的生物活性片段)，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了所述的CD47结合分子或所述的药物组合物在制备用于治疗受试者的疾病的治疗剂中的应用，其中，所述疾病包括与细胞和组织CD47表达相关的疾病。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了所述的CD47结合分子在制备用于用于诊断受试者的疾病的诊断剂中的应用，其中，所述疾病包括与细胞和组织CD47表达相关的疾病。
根据本发明的具体实施方案，本发明的CD47结合分子可以是单独作为活性成分或与其他活性成分组合应用。例如，所述的CD47结合分子可用于制备成双特异性抗体或抗体药物偶联物(antibody-drug conjugate，ADC)等。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，与细胞和/或组织CD47表达相关的疾病包括癌症。具体地，所述癌症包括不限于：卵巢癌、肠癌、食管癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌、头颈部肿瘤、膀胱癌、结肠直肠癌、非霍奇金氏淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞性白血病、多毛细胞白血病(HCL)、T细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)、大粒淋巴细胞白血病、成人T细胞白血病、多发性骨髓瘤、(恶性)黑色素瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、骨髓瘤、单核细胞白血病、B细胞衍生白血病、T细胞衍生白血病、B细胞衍生淋巴瘤、T细胞衍生淋巴瘤、子宫内膜癌、肾癌、(良性)胎记瘤、前列腺癌、甲状腺癌、子宫颈癌、胃癌、肝癌和实体肿瘤中的一种或多种。
根据本发明的具体实施方案，体外结合实验表明，本发明的两种IgG亚型的1C8抗体都能很好的结合Human CD47和Cynomolgus CD47蛋白。相比于对照抗体，1C8抗体对CD47的亲和力较弱。在抗体与人活细胞表面的CD47结合的实验中发现，亲和力较弱的两种IgG亚型的1C8抗体不结合红细胞，但是能较好的结合肿瘤细胞。由于CD47在体内广泛表达，现有抗体普遍存在一定的红细胞毒性。根据本领域内现有技术产品，推测在一定程度上的低亲和力抗体有利于降低抗体的红细胞毒性。1C8抗体的亲和力虽然较低，不结合红细胞，但是对肿瘤细胞依然有很强的结合作用，因此它会是一个很好的低毒副作用的候选抗体。
另外，本发明还比较了抗体的中和活性。结果显示，两种IgG亚型的1C8抗体都能阻断Human CD47蛋白和SIRP-α的结合，亲和力较低的1C8抗体，其中和活性仅稍弱于Hu5F9。这说明，1C8的低亲和力对其中和活性的影响有限。
在红细胞血凝实验中，本发明发现Hu5F9在0.8μg/ml的浓度下就表现出了较为严重的红细胞凝集现象。另外1C8两个IgG亚型在最高浓度下也没有出现凝集现象，这说明1C8无论在中和活性方面还是在降低毒副作用上都比Hu5F9更具有临床优势。
在抗体细胞水平的功能评价中，本发明发现，在抗体的作用下，巨噬细胞都加强了对肿瘤细胞的吞噬作用，其中亚型1的1C8抗体的促吞噬效果最强，优于Hu5F9；亚型2的1C8抗体的促吞噬效果与Hu5F9接近。这一结果进一步验证了本发明的抗体在减轻了红细胞毒性的同时，抗体的功能依然保持较强的竞争力。
本发明对1C8抗体进行多轮人源化优化，获得了人源化抗体Hu1C8-H4L5。经过体外分子水平和细胞水平的实验证明，人源化抗体很好的继承母抗体的高效低毒的优良性质。
综上所述，本发明的CD47抗体高效低毒，可为临床上安全有效地阻断CD47-SIRPα信号提供新的选择。
附图说明
图1显示动物血清学检测结果。
图2为单细胞RT-PCR技术流程示意图。
图3A和图3B显示抗体与CD47蛋白结合活性检测结果。
图4A和图4B显示抗体与肿瘤细胞表面CD47蛋白结合活性检测结果。
图5A和图5B显示抗体阻断活性检测结果。
图6显示红细胞血凝实验结果。
图7A至图7D显示抗体与正常细胞表面CD47蛋白结合活性检测结果。
图8A和图8B显示抗体促进巨噬细胞吞噬实验结果。其中，图8A：用激光共聚焦高内涵细胞成像分析系统分析吞噬情况；图8B：将巨噬细胞消化下来用FACS检测吞噬情况。
图9显示一批次的人源化抗体与Human CD47结合能力检测结果。
图10A和图10B显示另一批次人源化抗体与人CD47蛋白结合与阻断能力检测结果。
图11显示另一批次人源化抗体与人CD47蛋白结合与阻断能力检测结果。
图12显示人源化后的1C8抗体与CD47结合能力。
图13显示人源化后的1C8抗体与肿瘤细胞结合能力。
图14显示人源化后的1C8抗体阻断能力。
图15显示人源化后的1C8抗体与正常细胞结合能力。
图16显示人源化后的1C8抗体血凝实验。
图17显示人源化抗体1C8促进巨噬细胞吞噬能力。其中，图片A：用激光共聚焦高内涵细胞成像分析系统分析吞噬情况；图片B：将巨噬细胞消化下来用FACS检测吞噬情况。
图18显示在NOD-SCID小鼠移植瘤模型中检测抗体抗肿瘤活性。
具体实施方式
本发明的内容可以通过参考下面的实例更容易理解，除非特别指明，这些实例是以说明的方式提供，而并非旨在限制本发明。
实验材料和方法
1.实验材料
1.1.动物
1)新西兰大白兔，饲养于上海腾达兔业专业合作社，按照上海腾达兔业专业合作社有关规定进行饲养和实验。
2)Balb/c雌性小鼠(购自灵畅公司，饲养于上海中科英沐生物科技有限公司，按照公司有关规定进行饲养和实验。
3)NOD-SCID免疫缺陷小鼠，购自百奥赛图，饲养于中科院上海生化细胞所SPF级动物房，按照中科院上海生化细胞所有关规定进行饲养和实验。
1.2.免疫抗原
Human CD47蛋白,His Tag(Acro Biosystems,cat:CD7-H5227)
1.3.载体、菌株及细胞
1)全人抗体表达载体IgH和Igκ(分别表达抗体heavy链、kappa链)由PatrickWilson实验室提供，载体序列见NCBI GenBank:FJ475055、FJ475056。
2)DH5α化学感受态购自擎科生物技术有限公司。
3)黑人Burkitt淋巴瘤细胞RAJI，人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞CCRF-CEM，人主动脉内皮细胞(HAEC)和人肾近端小管上皮细胞(RPTEC)均购自生化所细胞库。
4)人红细胞购于妙通(上海)生物科技有限公司和上海赛笠生物科技有限公司。
5)人PBMC购于妙通(上海)生物科技有限公司。
6)中国仓鼠卵巢细胞CHO购自Thermo Fisher Scientific。
1.4.结合分子及蛋白
1)Human CD47蛋白,His Tag(Acro Biosystems,cat:CD7-H5227)；
2)Goat anti-mouse IgG H&L-HRP(Abcam,cat:ab205719)；
3)Anti-Human IgG(Fc specific)结合分子(sigma-aldrich,cat:I2136)；
4)Anti-Rabbit IgG(Fc specific)结合分子(sigma-aldrich,cat:SAB3700872)；
5)HRP-Conjugated 6*His,His-Tag结合分子(Proteintech,cat:HRP-66005)；
6)FITC anti-human IgG(Biolegend,cat:409310)；
7)Fixable Viability Stain 780(BD HorizonTM,cat:565388)；
8)Fixable Viability Stain 510(BD HorizonTM,cat:564406)；
9)FITC anti-human CD14结合分子(Biolegend,cat:325603)；
10)BV421 Streptavidin(BD HorizonTM,cat:563259)；
11)7-AAD(BD HorizonTM,cat:559925)；
12)CellTraceTMViolet Cell Proliferation Kit(ThermoFisher Scientific,cat:C34557)；
13)2A1：参考专利申请文献序列表达(CN 105101997 A)；
14)AO176：参考专利申请文献序列表达(US 2019/0112373 A1)；
15)Hu5F9：参考专利申请文献序列表达(WO 2011/143624 A2)；
16)8D6：由中国科学院分子细胞科学卓越中心孙兵实验室提供；
17)Mouse CD47(Acro Biosystems,cat:CD7-M5251)；
18)Cynomolgus/Rhesus macaque CD47蛋白,His Tag(Acro Biosystems,cat:CD7-CD7-C52H1)；
19)Cynomolgus/Rhesus macaque CD47蛋白,Fc Tag(Acro Biosystems,cat:CD7-CD7-C5252)；
20)SIRPα-Fc(Acro Biosystems,cat:SIA-H5251)。
1.5.试剂耗材
哺乳动物淋巴细胞分离液购自Cedarlanelabs；PrimeSTAR HS DNA Polymerase、连接酶Solution I购自Takara公司；EcoRI、KpnI等DNA限制性内切酶购自Thermo FisherScientific；AgeI、SalI和BsiWI等DNA限制性内切酶购自NEB；MarkerⅡ和Marker IV购自北京Transgen生物技术有限公司；普通DNA离心柱型PCR产物纯化/凝胶DNA回收两用试剂盒购自擎科生物技术有限公司；FavorPrepTM离心柱型质粒小提试剂盒购自Favorgen；质粒大抽试剂盒Nucleobond xtra Maxiplus购自MACHEREY-NAGELMN公司；RNA抽提试剂盒RneasyMiNi Kit购自Qiagen；反转试剂盒ReverTra
Figure BDA0003321014810000151
qPCR RT Kit购自TOYOBO；纯化cDNA试剂盒
Figure BDA0003321014810000152
SV Gel and PCR Clean-Up System购自Promega；KOD Fx Neo Polymerase购自TOYOBO公司，Taq Ex Polymerase购自Takara公司；脂质体LipofectamineTM2000和LipofectamineTM3000购自Invitrogen；Gibco ExpiFectamineTMCHO转染试剂盒购自ThermoFisher Scientific；链霉亲和素SA购自Prospec bio；蛋白酶抑制剂购自Roche；细胞培养基Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)购自GIBCO；FreeStyleTM 293ExpressionMedium购自GIBCO；ExpiTMCHO expression medium购自Thermo Fisher Scientific；可变区基因PCR引物参考Novagen Ig-Primer Sets设计，由杰瑞生物技术(上海)有限公司合成，PAGE纯化；
Figure BDA0003321014810000155
Easy Vector Systems购自Promega；X-Gal购自翊圣生物；填料Protein G Agarose 4FF及填料Protein A Agarose 4FF购自AOGMA；层析柱Poly-PrepChromatography Columns购自BIO-RAD；EZ-
Figure BDA0003321014810000153
Sulfo-NHS-LC-Biotin购自ThermoFisher Scientific；SuperScriptTMIII First-Stand Synthesis System for RT-PCR购自Invitrogen；
Figure BDA0003321014810000154
Ribonuclease Inhibitor购自Promega；2×TransTaq High Fidelity(HiFi)PCR SuperMix II购自北京Transgen；n-Dodecylβ-D-maltoside购自Sigma；Papain购自Sigma；Aprotinin from bovine lung购自Sigma；ZebaTMSpin Desalting Columns购自Thermo Fisher Scientific；4％鸡红细胞购自上海榕柏生物技术公司；AmMagTM ProteinA magnetic BeadsAmicon购自金斯瑞；Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit(10kDa、30kDa及50kDa截留)购自Merck公司。
1.6.实验所用溶液
1)50×TAE Buffer:Tris base(三羟甲基氨基甲烷)242g，冰醋酸57.1mL，EDTA0.05mol，pH＝8.5，ddH2O定容到1000mL。
2)LB液体培养基：Tryptone(蛋白胨)10g，Yeast Extract(酵母粉)5g，NaCl 10g，加ddH2O至总体积为1000mL，121℃，20min。
3)LB板固体培养基：Tryptone(蛋白胨)10g，Yeast Extract(蛋白胨)5g，NaCl10g，Agar(琼脂粉)15g，加dd H2O至总体积为1000mL，121℃，20min。冷却至室温加入抗生素。
4)100mg/ml氨苄青霉素：称取1g氨苄青霉素，加dd H2O定容至10mL，0.22μm滤膜过滤，-20℃冻存。
5)1.5％(wt/vol)琼脂糖凝胶：称取1.5g琼脂糖至100mL TAE，微波炉加热溶解，冷却至60℃时，加入5μL Gel Stain(购自北京Transgen生物技术有限公司，10000×)，充分混匀。
6)30％甘油：30mL丙三醇(甘油)，加dd H2O定容至100mL，混匀，灭菌。
7)PBS缓冲液(20×)：NaCl 170g，Na2HPO4 11.3g，KH2PO4 2.7g，加水定容至1L，调节pH值至7.0。
8)ELISA包被液：NaHCO3 0.738g，Na2CO3 0.397g加水定容至250mL，pH＝9.5。
9)ELISA封闭液：2％BSA/PBS(wt/vol)，2g牛血清白蛋白至100mL PBS中，混匀。
10)ELISA洗涤液：1L PBS加入500μL Tween-20，混匀。
11)ELISA显色液：1×TMB ELISA Substrate Solution，购自ebioscience。
12)流式缓冲液：包含1mM EDTA和2％FBS的DPBS
13)SDS凝胶上样缓冲液：50mM Tris–HCl pH 6.8，2％SDS，10％glycerol，1％β-mercaptoethanol和0.1％bromophenol blue。
14)10×SDS-PAGE电泳缓冲液：Tris base(三羟甲基氨基甲烷)30g，Glycine144g，SDS 10g，定容至1L。
15)10×转移缓冲液：10×SDS-PAGE电泳缓冲液100mL，200mL甲醇，加ddH2O至1L，混匀使用。
16)TBST缓冲液：50mM Tris，150mM NaCl和0.1％Tween-20，pH 7.5。
17)显影液：Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate(ThermoFisher Scientific)。
18)20％乙醇：100mL乙醇和400mL蒸馏水混合。
19)结合缓冲液：20mM Sodium Phosphate Buffer,pH 7.0；4.372g Na2HPO4·7H2O，先用800mL蒸馏水溶解，用1M HCl或1M NaOH调pH至7.0，再加入蒸馏水定容至1L。
20)洗脱缓冲液：0.1M Glycine(甘氨酸)，pH 2.8，500mL 3.75g Glycine加入400mL蒸馏水溶解，再加入约1.4mL浓HCl调整pH为2.8，再用蒸馏水定容至500mL。
21)中和缓冲液：1M Tris，PH 9.0，12.1g Tris base先用80mL蒸馏水溶解，用1MHCL调整pH至9.0，再加入蒸馏水定容至100mL。
22)细胞冻存液：10％DMSO(二甲亚砜)+90％FBS。
23)2.5μg/ml TPCK-Trypsin：12.5mg加到50ml PBS中，制成100*2.5μg/ml TPCK-Trypsin溶液。Trypsin需避光保存。
24)pH4.8柠檬酸：首先用PBS把柠檬酸配成很高浓度的溶液，然后往转动中的PBS中滴加柠檬酸，调pH值到4.8.
25)4％多聚甲醛：称12g多聚甲醛粉末于30ml PBS中制成，用NaOH调pH为7.0-8.0之间。
26)考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-250 0.75g，100％乙醇135ml,冰醋酸30ml,ddH2O 135ml,搅拌均匀。
27)考马斯亮蓝脱色液:冰醋酸100ml,甲醇100ml,用dd H2O定容至1L，混匀备用。
1.7.实验仪器
1)Olympus IX71倒置荧光显微镜：上海巴斯德研究所图像解析平台所有。
2)PCR仪：购自Eppendorf公司。
3)蛋白质电泳仪：购自上海天能科技有限公司。
4)紫外可见分光光度计(NanoDrop ND1000)：购自Thermo公司。
5)酶标仪(Multiskan MK3)：购自Thermo公司。
6)Octet RED 96蛋白质相互作用工作站：使用上海生化与细胞研究所公共平台仪器，购自ForteBio。
7)蛋白纯化层析系统：使用上海生化与细胞研究所公共平台仪器，购自GE。
8)Operetta高通量细胞成像分析系统：使用上海生化与细胞研究所公共平台仪器，购自Perkin Eimer。
2.实验方法
2.1.动物免疫
选取两只体重为2-2.5kg的雄性兔子，用Human CD47抗原免疫3次。初次免疫，采用Freund’s完全佐剂；第2、3次免疫采用Freund’s不完全佐剂作为回忆刺激。每只兔子每次免疫1mg抗原，每次免疫之间间隔3周，在兔子皮下和皮内多点注射。
2.2.ELISA检测动物血清中CD47抗体滴度(titer)
取少量免疫后动物的血清样品。包被Human CD47-his蛋白于ELISA板，1μg/mL，每孔100μL，4℃过夜。次日PBST洗板3次。2％BSA封闭，每孔200μL，37℃，2h。去掉封闭液，拍干板子，上稀释后的动物血清样品，每孔100μL，37℃,1h。PBST洗板3次，上兔二抗检测兔血清，每孔100μL，37℃，1h。PBST洗板3次。加底物TMB 100μL/孔显色，加入1M HCl终止反应，每孔50μL。测定OD450，并进行数据处理。
2.3.抗原特异性兔源抗体基因获得及载体构建
兔子经过3次免疫刺激后第7天，抽取外周血，用哺乳动物淋巴细胞分离液密度梯度离心，分离得到外周血单核细胞(PBMC)。使用FITC-(IgM/CD4/CD8/Pan-T)-/APC-IgG+/PE-SA-CD47-biotin+为标记物，经流式细胞术获得特异性结合人CD47蛋白的记忆B细胞至96孔RT-PCR板中，每孔一个细胞。
将获得的单个记忆B细胞通过RT-PCR获得cDNA，然后通过Nested-PCR获得抗体基因可变区，跑琼脂糖核酸凝胶，将重轻链可以配对的胶块回收并将其连接到T-载体上，测序并通过IgBLAST网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/igblast/)检索获得抗体基因序列。接下来通过AgeI及SalI酶切位点，AgeI及BsiwI酶切位点将抗体重轻链基因分别连接到相应的含有人源抗体恒定区的表达载体IgH，Igκ上，构建得到人兔嵌合抗体表达载体。
2.4.抗体表达
瞬时转染CHO细胞，进行抗体表达。转染前一天(第-1天)，分种ExpiCHO-STM细胞，最终密度为3×106–4×106个活细胞/mL，使细胞过夜生长。次日(第0天)，测定活细胞密度和存活率百分比。细胞密度应达到约7×106–10×106个活细胞/mL，存活率应为95–99％，方可继续转染。将细胞稀释至最终密度为6×106个活细胞/mL。使用预冷的试剂(4℃)配制ExpiFectamineTMCHO/质粒DNA复合物。室温孵育ExpiFectamineTMCHO/质粒DNA复合物1–5分钟，然后将溶液慢慢转移至CHO细胞培养瓶中，在添加过程中轻轻晃动培养瓶。将细胞置于轨道摇床上(37℃培养箱含8％CO2的湿化空气条件下)培养。培养7-11天，待细胞死亡一半时即可收上清，开始纯化抗体。
2.5.抗体纯化
使用AmMagTM Protein A magnetic Beads纯化抗体。首先将收集的CHO细胞悬液4000rpm，4℃离心30min，收集上清待纯化。取适当体积的磁珠悬浮液，用含有0.5‰的吐温的结合缓冲液清洗磁珠。将上清与磁珠室温孵育过夜。收集磁珠，弃上清，用大体积结合缓冲液清洗磁珠2-3次。收集磁珠，用6倍磁珠体积的洗脱缓冲液洗脱磁珠，向洗脱下来的抗体溶液中加入中和buffer使洗脱下来的样品pH达7.5左右。将抗体溶液在5L 1XPBS中透析3次，即可将抗体浓缩分装保存至-80℃。
2.6.ELISA检测抗体结合CD47抗原活性
使用ELISA检测CHO系统表达纯化的抗体是否能结合CD47抗原(包括人/恒河猴CD47蛋白)。分别包被人/恒河猴CD47蛋白于ELISA板上，0.5μg/mL，每孔100μL，4℃过夜。次日PBST洗板3次。2％BSA封闭，每孔200μL，37℃,2h。去掉封闭液，拍干板子，上样，抗体样品从4μg/mL开始以2倍梯度稀释，每孔100μL，37℃,1h。PBST洗板3次，Anti-Human IgG(Fcspecific)antibody，1:8000稀释，每孔100μL，37℃，1h。PBST洗板3次。加底物TMB 100μL/孔显色，加入1M HCl终止反应，每孔50μL。测定OD450，并进行数据处理。
2.7.FACS检测抗体结合人活细胞表面CD47抗原活性
使用FACS检测CHO系统表达纯化的抗体是否能结合人活细胞表面的CD47。本发明选用了Raji和CCRF-CEM两种细胞进行检测。另外，为了鉴定抗体抗原识别的特异性，本发明也采用同样的方法检测抗体结合人红细胞(RBC)、人主动脉内皮细胞(HAEC)和人肾近端小管上皮细胞(RPTEC)的情况。
用流式缓冲液清洗并重悬细胞。抗体从100μg/mL开始5倍梯度稀释。抗体和细胞等体积混合，冰上孵育1h。用流式缓冲液清洗3遍，收集细胞，加抗体FITC anti-human IgG，冰上避光孵育30min。用流式缓冲液清洗1遍，再用PBS清洗1遍，加抗体Fixable ViabilityStain 780，冰上避光孵育30min。用流式缓冲液清洗2遍并重悬。用BD Fortessa检测分析。
2.8.抗体亲和力(Kd值)检测
利用OCTET RED 96检测抗体和人、恒河猴CD47抗原亲和力。首先将AHC sensor放到加有PBS的96孔黑板中浸泡至少10min，在此时间段内稀释抗原抗体，loading抗体浓度为5μg/ml；抗原设置浓度梯度，2倍梯度稀释900nM-450nM-225nM-112.5nM-56.3nM-28.1nM；将抗体、抗原、再生buffer及PBS buffer加到另一块黑板中，置于仪器上；设定程序，开始运行，程序为：baseline 180s-loading Ab 360s-baseline 180s-association 360s-disassociation 600s；软件分析数据，计算抗原抗体亲和力Kd值。
2.9.ELISA检测抗体中和CD47抗原活性
使用ELISA检测CD47抗体是否能阻断Human CD47和SIRP-α相互作用。包被SIRP-α-Fc蛋白于ELISA板，2μg/mL，每孔100μL，4℃过夜。次日PBST洗板3次。2％BSA封闭，每孔200μL，37℃,2h。同时，抗体与Human CD47-His混合孵育2h，其中抗体终浓度30μg/mL，3倍梯度稀释，CD47-His终浓度200ng/ml。去掉封闭液，拍干板子，将孵育液铺到ELISA板子上，每孔100μL，37℃,1h。PBST洗板3次，HRP-Conjugated 6*His作为二抗，1:5000稀释，每孔100μL，37℃，1h。PBST洗板3次。加底物TMB 100μL/孔显色，加入1M HCl终止反应，每孔50μL。测定OD450，并进行数据处理。
2.10.FACS检测抗体中和人活细胞表面CD47抗原活性
使用FACS检测CD47抗体是否能阻断人活细胞表面CD47和SIRP-α相互作用。本发明选用了Raji细胞进行检测。
首先对SIRP-α进行生物素化标记。取1×106个细胞，PBS洗涤3次，每次500g离心5min。CD47抗体从50μg/ml起3倍梯度稀释和5μg/ml SIRP-α-biotin孵育30min，PBS洗涤3次，每次500g离心5min。加入SA-BV421染料染色15min，PBS洗涤3次，每次500g离心5min，重悬，加入7-AAD染细胞活性。用BD Fortessa检测分析。
2.11.抗体的红细胞血凝反应活性
使用红细胞血凝实验检测CD47抗体是否能引起人红细胞的溶血现象。用PBS清洗并50倍重悬人红细胞。将CD47抗体从100μg/ml开始，5倍梯度稀释，共12个梯度。将抗体与红细胞1:1混合，室温孵育1-2h。观察是否出现溶血现象。
2.12.抗体促进巨噬细胞对肿瘤细胞系的吞噬作用
首先，将人的PBMC铺到96孔板中，每孔5.5*10^4个细胞，在50ng/ml M-CSF的刺激下分化成巨噬细胞，该过程需要6-7天。取CCRF-CEM细胞，用Cell trace 37℃避光染色20min，用含10％血清的1640培养基终止反应，然后清洗并重悬细胞备用。稀释CD47抗体备用。巨噬细胞清洗2-3次，洗掉未分化的细胞。先将稀释好的抗体加到巨噬细胞上，再将CCRF-CEM缓慢加入到巨噬细胞中，三者的混合物37℃避光孵育3h。用含10％血清的1640培养基清洗未被吞噬的CCRF-CEM。巨噬细胞用BD FITC mouse anti human CD14 HRP染色37℃避光染色30min。清洗细胞，用激光共聚焦高内涵细胞成像分析系统分析吞噬情况。或者也可将巨噬细胞消化下来用FACS检测吞噬情况。
2.13.抗体人源化
将分选的抗体序列比对人源抗体Germline数据库，选择四大类Germline序列作为模板，将动物来源抗体的CDR区嫁接到模板上，避免不常用或小类的Germline，避免引入不常用的重轻链配对方式。构建抗体结构模型，根据模型设计选择回复突变位点。回复突变以不影响抗体结构稳定，不影响抗体和抗原结合，不引入糖基化、磷酸化等修饰位点，不引入易被氧化、脱氨基化等位点，增强结构稳定性为原则。经过多轮设计优化，最终根据抗体的功能活性，稳定性，均一性以及可变区不含翻译后修饰等特点选择最优的人源化序列。
2.14.在NOD-SCID小鼠移植瘤模型中检测抗体抗肿瘤活性
在免疫缺陷小鼠身上接种肿瘤细胞Raji。待小鼠肿瘤体积长到70-100mm3，每隔一天腹腔注射CD47抗体，200μg每只，连续注射5-6次。同时每隔一天用游标卡尺测肿瘤大小，连续监测一个月左右，统计数据分析。
实施例1、抗人CD47动物源抗体、嵌合抗体及其制备与检测
1.动物免疫及动物血清中CD47抗体滴度检测
参照前述实验方法免疫动物，并通过ELISA检测免疫后动物血清中Human CD47特异性抗体滴度。
动物血清学检测结果请参见图1所示。结果显示兔子的血清可以结合Human CD47蛋白。证明本发明的免疫是有效的。
2.动物源抗体的筛选及嵌合抗体的制备
在确认动物已经被有效免疫之后，本发明通过兔单细胞RT-PCR技术获得特异性识别Human CD47蛋白的兔源抗体的基因，并构建体外表达载体，最后通过CHO瞬时表达系统获得抗体。具体方法请参见图2所示，主要包括：抽取Human CD47蛋白免疫后的兔子外周血30ml，分离出PBMC，通过流式细胞术分离出特异性结合Human CD47蛋白的记忆性B细胞；单细胞反转录PCR获得cDNA，然后通过两轮Nested-PCR获得单个细胞中抗体重轻链的可变区基因；将配对的抗体重轻链可变区基因测序，获得抗体基因的碱基序列；构建抗体表达载体：本发明将获得的抗体可变区基因构建到带有人恒定区的抗体表达载体上，构建了两种亚型的人兔嵌合表达载体；瞬时转染CHO细胞表达抗体；收集CHO细胞上清，用protein A通过亲和层析纯化抗体以获得纯度较高的抗体；对获得的抗体进行功能性评价以筛选出有效的抗体。最终，通过该技术，本发明成功获得一株中和Human CD47蛋白的单克隆抗体，本发明中命名为1C8，重组表达获得两个IgG亚型的人兔嵌合抗体，1C8-亚型1和1C8-亚型2。
本发明中，获得的两株嵌合抗体1C8的可变区序列如下(CDR序列以加粗和加下划线示出)：
重链Hu1C8VH-0(H0)：
Figure BDA0003321014810000221
轻链Hu1C8VL-0(L0)：
Figure BDA0003321014810000222
3.体外抗原抗体结合实验
为了确定抗体是否真能有效结合Human CD47蛋白以及抗体是否对恒河猴CD47蛋白具有交叉结合的能力，本发明用ELISA分别检测两种IgG亚型的1C8，抗体对两种抗原的结合活性，并以现有CD47抗体2A1、Hu5F9、AO176以及一个无关抗体8D6做对照。
结果显示，两种IgG亚型的1C8抗体都对Human CD4和恒河猴CD47蛋白都具有与Hu5F9相当的较好的结合活性，且优于AO176(图3A和图3B)。
为了研究抗体与Human CD47和恒河猴CD47蛋白的结合能力，本发明使用OCTETRED 96仪器检测抗体对两种抗原的亲和力。Loading抗体5μg/mL，流动相Human/CynomolgusCD47(H/Cy-CD47)抗原上样浓度范围0-900nM。使用AHC sensor，按照以下程序进行：baseline 180s-loading Ab 360s-baseline 180s-association 360s-disassociation600s。结果显示1C8两个亚型的抗体对CD47的亲和力都比较高，但总体都小于对照抗体，且对Human CD47的亲和力略强于对恒河猴CD47的亲和力(表3)。
表3:抗体亲和力(KD值)统计
Figure BDA0003321014810000223
为了进一步研究抗体是否能靶向肿瘤细胞表面的CD47，本发明使用FACS检测抗体与肿瘤细胞CCRF-CEM和Raji表面CD47的结合情况。结果显示，两种IgG亚型的1C8抗体对CCRF-CEM和Raji表面的CD47都能较好的结合，结合活性略弱于2A1和Hu5F9，但明显优于AO176(图4A和图4B)。
4.体外检测抗体对Human CD47蛋白的中和活性
为了检测抗体的中和活性，本发明用ELISA检测抗体是否能阻断Human CD47蛋白和SIRP-α的结合。结果显示，两种IgG亚型的1C8抗体都能阻断Human CD47蛋白和SIRP-α的结合，且阻断能力与对照抗体Hu5F9接近，且优于AO176(图5A)。
同时，为了检测抗体是否能阻断人活细胞表面的CD47蛋白与SIRP-α的结合。我们用FACS实验中检测了抗体对Raji细胞表面CD47的阻断能力。结果显示，两种亚型的1C8抗体对活细胞表面CD47也同样具有中和活性，且阻断能力也优于对照抗体AO176(图5B)。
5.红细胞血凝实验
为了评价抗体的红细胞毒性，本发明采用红细胞血凝实验来检测抗体是否能促进红细胞发生血凝反应。检测结果(图6)显示对照抗体Hu5F9在0.8μg/ml的浓度下就表现出了较为严重的红细胞凝集现象，而本发明的1C8两个IgG亚型，在最高浓度下也没有出现凝集现象。这说明本发明的抗体在缓解红细胞毒性的问题上有明显优势。
6.抗体抗原识别特异性评价
CD47在体内广泛表达并发挥着重要的生理功能。CD47抗体如果在体内结合到正常细胞表面有可能导致严重的生理毒性。为了检测本发明的抗体是否会非特异性的结合到正常的细胞上，本发明选取了正常人红细胞、肝癌病人红细胞以及人主动脉内皮细胞(HAEC)和人肾近端小管上皮细胞(RPTEC)，用FACS检测抗体和这些细胞的结合能力。
结果显示，两种亚型的1C8抗体，无论是对正常人还是肝癌病人的红细胞都没有明显的结合(图7A和图7B)，但弱于2A1和Hu5F9(图7C和图7D)。因此，可以认为在抗原识别特异性上，两种IgG亚型的1C8-抗体，优于2A1和Hu5F9。
7.抗体细胞水平的功能评价
为了研究抗体是否真的能促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。本发明将巨噬细胞与CCRF-CEM共培养，并用抗体孵育，分别用高内涵和FACS两种方式观察巨噬细胞的吞噬情况。
结果请参见图8A和图8B所示，其中，图8A：用激光共聚焦高内涵细胞成像分析系统分析吞噬情况；图8B：将巨噬细胞消化下来用FACS检测吞噬情况。结果发现，在抗体的作用下，巨噬细胞都加强了对肿瘤细胞的吞噬作用，其中1C8-亚型1的促吞噬效果最强，优于Hu5F9；1C8-亚型2的促吞噬效果与Hu5F9-接近；总体上看，本发明的抗体都优于AO176和2A1。
实施例2、抗体人源化
本实施例中，对可变区进行人源化。首先，抗体序列比对人源抗体Germline数据库，选择同源度高的IGHV3/IGKV1序列作为设计模版，将抗体CDR区嫁接到模版上；构建抗体结构模型，根据模型设计回复突变位点；经过多轮设计优化，最终根据抗体的功能活性、稳定性、均一性以及可变区不含翻译后修饰等特点选择最优的人源化抗体。
1.人源化抗体序列设计
兔抗1C8人源化序列设计：
重链：
Hu1C8VH-1(H1)：
Figure BDA0003321014810000241
Hu1C8VH-2(H2)：
Figure BDA0003321014810000242
Hu1C8VH-3(H3)：
Figure BDA0003321014810000243
Hu1C8VH-4(H4)：
Figure BDA0003321014810000244
Figure BDA0003321014810000251
Hu1C8VH-5(H5)：
Figure BDA0003321014810000252
Hu1C8VH-6(H6)：
Figure BDA0003321014810000253
Hu1C8VH-7(H7)：
Figure BDA0003321014810000254
轻链：Hu1C8VL-1(L1)：
Figure BDA0003321014810000255
Hu1C8VL-2(L2)：
Figure BDA0003321014810000256
Hu1C8VL-3(L3)：
Figure BDA0003321014810000257
Hu1C8VL-4(L4)：
Figure BDA0003321014810000258
Hu1C8VL-5(L5)：
Figure BDA0003321014810000259
Figure BDA0003321014810000261
TKVEIK(SEQ ID NO:20)
Hu1C8VL-6(L6)：
Figure BDA0003321014810000262
2.人源化抗体重组表达及与人CD47蛋白结合活性检测
将人源化的抗体序列重组表达，检测抗体对Human CD47在ELISA上的结合活性和中和活性。
本实施例选择了3条重链人源化序列Hu1C8-H1、H2、H3和2条轻链人源化序列Hu1C8-L1、L2，并且将它们重组表达获得6株人源化抗体(Hu1C8-H1L1、Hu1C8-H1L2、Hu1C8-H2L1、Hu1C8-H2L2、Hu1C8-H3L1、Hu1C8-H3L2)，检测其与人CD47蛋白结合活性。
结合活性评价发现，6株抗体与母抗体(1C8-H0L0)相比性质改变较大(图9)。
本发明进一步分析了抗体结合活性，推测1C8-的重轻链N端序列以及重链IMGT编号70位、92位氨基酸可能对抗体的结构维持比较重要。因此，针对这3个位置进行回复突变设计了第二批人源化序列(Hu1C8-H4、Hu1C8-H5；Hu1C8-L3)，并获得两株抗体Hu1C8-H4L3，Hu1C8-H5L3。抗体评价发现，人源化抗体Hu1C8-H4L3、Hu1C8-H5L3的结合活性与母抗体已十分接近(图10A)，但是，抗体的中和活性还明显弱于母抗体(图10B)。
本发明中，进一步将人源化序列(Hu1C8-H4、H5；Hu-1C8-L3)分别与母抗体序列(Hu1C8-H0；Hu1C8-L0)重组表达，获得3株重组抗体Hu1C8-H4L0、Hu1C8-H5L0、Hu1C8-H0L3。从结合活性看Hu1C8-H4L0、Hu1C8-H5L0与母抗体接近，Hu1C8-H0L3稍弱于母抗体(图11中的图片A)；从中和活性看，Hu1C8-H4L0、Hu1C8-H5L0同样与母抗体类似，但Hu1C8-H0L3明显弱于母抗体(图11中的图片B)。由此，本发明认为重链HuC8-H4、H5性质较优，基本不影响抗体功能，可以尝试在保证其性质不变的前提下，提高人源化程度；而轻链是当前影响抗体功能的主要原因，可以通过在轻链上继续回复突变来优化抗体。
进一步，本发明又设计了Hu1C8-H6、Hu1C8-H7；Hu1C8-L4、Hu1C8-L5、Hu1C8-L6，并获得抗体Hu1C8-H6L4、Hu1C8-H7L5、Hu1C8-H7L6(图11中的图片C、D)。与此同时，本发明用Hu1C8-H4、Hu1C8-H5与新的轻链组合得到Hu1C8-H4L4、Hu1C8-H4L5、Hu1C8-H4L6、Hu1C8-H5L4、Hu1C8-H5L5、Hu1C8-H5L6。发现Hu1C8-H4L5、Hu1C8-H5L6较好的保留了母抗体的性质(图11中的图片E、F)。
本发明还检测了Hu1C8-H4L5和Hu1C8-H5L6两株抗体的亲和力。结果见表4。
表4:人源化抗体亲和力(KD值)统计
Figure BDA0003321014810000271
3.人源化抗体体外功能评价
本发明通过一系列的体外实验将人源化抗体Hu1C8-H4L5与母抗体及对照抗体进行了比较。
从评价结果看，无论是分子水平还是细胞水平，人源化抗体与CD47的结合与中和活性与母抗体基本相同(图12，图13，图14，图15，图16)。从功能实验上看，人源化抗体在诱导巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的能力也无明显变化(图17)。
4.人源化抗体体内动物模型评价
4.1.抗体在NOD-SCID小鼠移植瘤模型中的抗肿瘤活性
为了能在体内评价抗体的抗肿瘤功能，本发明建立了NOD-SCID小鼠移植瘤模型。并以在鼠杂交瘤系统中筛选到的另一株CD47抗体637和一株无关抗体为例，检测了系统的可靠性。如图18，在移植瘤模型中，637处理的小鼠，肿瘤生长明显被抑制。证明637在体内能有效抑制肿瘤生长。
序列表
<110> 东曜药业有限公司
<120> CD47结合分子及其应用
<130> GAI21CN6611
<150> CN202110184017.7
<151> 2021-02-10
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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Tyr Ile Ser Ser Ile Gly Asp Pro Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Asn Gly
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35 40 45
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50 55 60
Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val
65 70 75 80
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20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Ser Ile Gly Asp Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
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100 105 110
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Val
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Ser Ile Gly Asp Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Asp Tyr Ser Asp
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Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
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Lys Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
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Asp Ile Glu Asn Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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Lys Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
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Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
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Gln Ser Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Asp Tyr Ser Asp
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Arg Asn
20 25 30
Lys Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Asp Tyr Ser Asp
85 90 95
Asp Ile Glu Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 21
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Hu1C8VL-6
<400> 21
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Val Tyr Arg Asn
20 25 30
Lys Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Asp Tyr Ser Asp
85 90 95
Asp Ile Glu Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110

Claims (14)

1.一种分子，该分子包括CD47抗体或来源于该抗体的能够免疫特异性结合CD47的生物活性片段，其中所述CD47抗体的六个CDR包括抗人CD47抗体1C8的CDR中的至少一个CDR，其余所有CDR选自：
抗人CD47抗体1C8的三个重链以及三个轻链CDR。
2.根据权利要求1所述的分子，其中：
所述抗人CD47抗体1C8的三个重链以及三个轻链CDR的氨基酸序列包括：
重链CDR1：GFSLS SYA(SEQ ID NO:1)；
重链CDR2：SSIG DP(SEQ ID NO:2)；
重链CDR3：SYPGN GDLGR LD(SEQ ID NO:3)；
轻链CDR1：QSVY RNKY(SEQ ID NO:4)；
轻链CDR2：YAST(SEQ ID NO:5)；
轻链CDR3：AGDYSDDIEN A(SEQ ID NO:6)。
3.根据权利要求1所述的分子，其中所述来源于该抗体的能够特异性结合CD47的生物活性片段包括：
抗人CD47抗体1C8的三个重链以及三个轻链CDR。
4.根据权利要求1所述的分子，其中所述抗体为动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
5.根据权利要求1所述的分子，其包括：
(1)一个重链可变区，其中所述重链可变区具有SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15中任一个的氨基酸序列，或在这些氨基酸序列基础上经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；和/或
(2)一个轻链可变区，其中所述轻链可变区具有SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21中任一个的氨基酸序列，或在这些氨基酸序列基础上经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
6.权利要求1所述的分子，其基本上不影响正常细胞功能，例如，基本上不具备红细胞毒性。
7.编码权利要求1～6任一项所述分子的生物活性片段的多核苷酸。
8.含有权利要求7所述多核苷酸的载体。
9.含有权利要求7所述多核苷酸或含有权利要求8所述载体的细胞。
10.一种药物组合物，其包含权利要求1～6任一项所述的分子，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
11.权利要求1～6任一项所述的分子或权利要求10所述的药物组合物在制备用于治疗受试者的疾病的治疗剂中的应用，其中，所述疾病包括与细胞和/或组织CD47表达相关的疾病。
12.根据权利要求11所述的应用，其中，权利要求1～6任一项所述的分子是单独作为活性成分或与其他活性成分组合应用；例如，权利要求1～6任一项所述的分子可用于制备成双特异性抗体或抗体药物偶联物。
13.权利要求1～6任一项所述的分子在制备用于诊断受试者的疾病的诊断剂中的应用，其中，所述疾病包括与细胞和/或组织CD47表达相关的疾病。
14.根据权利要求11-13任一项所述的应用，其中，与细胞和/或组织CD47表达相关的疾病包括癌症；
具体地，所述癌症包括不限于：卵巢癌、肠癌、食管癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌、头颈部肿瘤、膀胱癌、结肠直肠癌、非霍奇金氏淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞性白血病、多毛细胞白血病(HCL)、T细胞幼淋巴细胞白血病(T-PLL)、大粒淋巴细胞白血病、成人T细胞白血病、多发性骨髓瘤、(恶性)黑色素瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、骨髓瘤、单核细胞白血病、B细胞衍生白血病、T细胞衍生白血病、B细胞衍生淋巴瘤、T细胞衍生淋巴瘤、子宫内膜癌、肾癌、(良性)胎记瘤、前列腺癌、甲状腺癌、子宫颈癌、胃癌、肝癌和实体肿瘤中的一种或多种。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN111454359A (zh) * 2020-03-23 2020-07-28 倍而达药业（苏州）有限公司 Cd47抗体或其免疫活性片段及应用

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