CN115015561A - 一种同时定量检测十二种细胞因子的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种同时定量检测十二种细胞因子的试剂盒，涉及体外免疫检测技术领域，包括工艺为捕获微球混合液制备、检测抗体制备、链霉亲和素‑PE制备、细胞因子标准品制备、样品稀释液制备。本试剂盒包括十二种细胞因子抗体包被的微球混合液、检测抗体、链霉亲和素‑PE、细胞因子标准品、样品稀释液和洗液。本发明能同时检测出样本中IL‑1β、IL‑2、IL‑4、IL‑5、IL‑6、IL‑8、IL‑10、IL‑12p70、IL‑17、TNF‑α、IFN‑γ、IFN‑α十二种细胞因子的浓度，解决检测一个样本中十二种细胞因子需要单独用十二种检测试剂检测的问题，实现单样本多重定量检测、节约时间和成本、检测浓度范围广、需要样本量少、步骤简单易操作、效率更高。
Description
技术领域
本发明涉及体外免疫检测技术领域，具体是指一种应用流式荧光发光法同时检测十二种细胞因子的方法及试剂盒。
背景技术
COVID-19是由SARS-CoV-2引起的一种新型病毒性肺炎，大部分感染者表现为无症状或者轻度症状，但其中大约10-20％感染者会发展为重症肺炎。新冠肺炎的主要死亡病因为呼吸衰竭、感染性休克、心力衰竭和肾功能衰竭。血清学研究表明，细胞因子风暴反应与新冠肺炎的严重程度和死亡率有关。因此，深入研究细胞因子的生物学功能和新冠肺炎患者细胞因子风暴反应的深机制，是有效治疗新冠肺炎并降低死亡率的关键。
流式细胞术是利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行多参数高通量检测、快速定量分析和分选的高新技术。流式荧光发光法是一种基于流式细胞检测的多重蛋白定量分析的检测方法，能够同时对单个样本中的多个指标进行检测。然而其他的细胞因子检测方法，比如酶联免疫检测、化学发光免疫检测等方法无法对同一个样本在同一个反应体系中区分不同的检测分子信号。当有检测多种细胞因子浓度时，需要单独进行检测，检测工作量和工作时间显著增加。因此，研发一种快速、高特异性、高灵敏度、能够同时检测多种细胞因子检测的试剂盒具有很大的必要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是现有技术操作繁琐、检测指标单一的技术问题，提供一种实现单样本多重定量检测、节约时间和成本、检测浓度范围广、需要样本量少、步骤简单易操作、效率更高的同时定量检测十二种细胞因子的方法及试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种同时定量检测十二种细胞因子的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括捕获微球混合液、检测抗体混合液、样品稀释液、标准品、检测试剂、链霉亲和素-PE及洗液。
作为改进，所述捕获微球混合液的制备方法如下：
S1：分别取12种不同尺寸大小和荧光强度的聚苯乙烯羧基化微球分别加入离心管中，离心，弃上清；
S2：加入去离子水，涡旋振荡混匀后，离心，弃上清，重复洗涤至少1次；
S3：加入磷酸盐缓液液重悬微球，涡旋振荡混匀；
S4：加入EDC和NHS溶液，涡旋振荡混匀，室温避光振荡孵育；
S5：孵育结束后，离心，弃上清；
S6：加入MES，涡旋振荡混匀，离心，弃上清，重复洗涤至少1次；
S7：加入MES，涡旋振荡混匀，加入细胞因子捕获抗体，室温避光振荡孵育；
S8：孵育结束后，离心，弃上清；
S9：加入磷酸盐缓冲液，涡旋振荡混匀，室温避光振荡孵育；
S10：孵育结束后，离心，弃上清；
S11：加入磷酸盐缓冲液，涡旋振荡混匀，离心，弃上清，重复洗涤至少1次；
S12：加入磷酸盐缓冲液，涡旋振荡混匀，流式细胞仪计数，调整微球浓度，避光保存，得到的即为12种包被不同细胞因子捕获抗体的微球；
S13：按比例制备十二种细胞因子捕获微球混合液。
作为改进，所述检测抗体混合液的制备方法为：
S1：将生物素预先溶解在DMSO中；
S2：分别将细胞因子检测抗体加入各个脱盐柱，离心，收集离心管中的细胞因子抗体；
S3：将抗体与生物素按比例加入生物素/DMSO溶液，与待标记的抗体混匀；
S4：室温避光孵育；
S5：孵育结束后，加入与生物素同体积的Tris-HCl，室温避光孵育；
S6：孵育结束后，用脱盐柱除去未反应的生物素；
S7：利用紫外分光光度计测定脱盐后的抗体浓度，分别得到12种细胞因子生物素标记抗体；
S8：利用抗体稀释液将12种细胞因子生物素标记抗体稀释，即为检测抗体混合液。
作为改进，所述样品稀释液的制备方法为向磷酸盐缓冲液中加入牛血清白蛋白和Proclin950，充分混匀即可。
作为改进，所述标准品的制备方法为：
S1：利用流式荧光发光法，通过NIBSC标准品对IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、 IL-10、IL-12p70、IL-17、TNF-α、IFN-γ、IFN-α细胞因子重组蛋白溶液分别校准；
S2：校准后的细胞因子重组蛋白溶液，用蛋白保存液稀释；
S3：利用冻干机冻干细胞因子重组蛋白混合液制成冻干粉，即为标准品。
作为改进，所述链霉亲和素-PE的制备方法为：
S1：链霉亲和素活化：利用脱盐柱对链霉亲和素脱盐处理，将交联剂SANH溶解于DMSO中配制SANH母液，将链霉亲和素与SANH按比例加入SANH母液，轻轻混匀，室温避光反应，反应结束后用脱盐柱脱盐除去未结合的SANH；
S2：藻红蛋白活化：取藻红蛋白溶液于离心管中，离心，弃上清，加入磷酸盐缓冲液重悬沉淀，利用脱盐柱对藻红蛋白脱盐处理，将交联剂SFB溶解于DMSO中配制SFB母液，将藻红蛋白与SFB按比例加入SFB母液，轻轻混匀，室温避光反应，反应结束后用脱盐柱脱盐除去未结合的SFB；
S3：链霉亲和素-SANH与藻红蛋白-SFB共价偶联：将链霉亲和素-SANH与藻红蛋白-SFB按比例混合，振荡混匀后加入苯胺，振荡混匀后室温避光孵育；
S4：链霉亲和素-PE偶联产物纯化：采用AKTA进行纯化，洗脱，收集洗脱的链霉亲和素-PE，利用紫外分光光度计测定收集的链霉亲和素-PE的浓度；
S5：利用蛋白稀释液将纯化得到的链霉亲和素-PE稀释，即为链霉亲和素-PE试剂。
一种同时定量检测十二种细胞因子的方法，所述方法包括以下操作步骤：
S1：标准曲线准备：①取出标准品管，瞬时离心，加入样品稀释液，轻柔震荡后静置5～10分钟，作为标准曲线最高浓度，标记为S1；②取7个新的离心管，标记为S2～S7，每管加入样品稀释液，从S1管中取一定量加入S2管中混匀，从S2管中取一定量加入S3管中混匀，从S3管中取一定量加入S4管中混匀，从S4管中取一定量加入S5管中混匀，从 S5管中取一定量加入S6管中混匀，从S6管中取一定量加入S7管中混匀，进行倍比稀释；
S2：检测试剂准备：根据制备标准曲线的管数和待测样本的管数计算所需1×洗液的量，将洗液用超纯水按比例稀释即得；
S3：样本制备：样本如为冷冻保存，应提前取出，缓慢融化，恢复至室温；样本如为血液，离心后轻轻取上清；
S3：根据标准品管和待测样本数量，准备适量流式管，每管加入捕获微球混合液和样品稀释液；
S4：取8个流式管，分别标记S1～S8，其中S1～S7管加入对应梯度稀释的标准品，S8管加入样品稀释液，作为空白管，待测样本管加入样本；
S5：每管加入生物素标记的检测试剂，涡旋震荡混匀，室温避光震荡孵育，；
S6：孵育结束后，每管加入链霉亲和素-PE，室温避光震荡孵育；
S7：孵育结束后，每管加入检测试剂，涡旋震荡混匀，离心，弃上清；
S8：每管加入检测试剂，涡旋振荡，重悬微球；
S9：设置实验方案：取捕获微球混合液，加入检测试剂混匀，上机建立模板，具体步骤如下：
①建立X轴为FSC、Y轴为SSC的线性散点图，根据FSC，圈中微球；
②建立PE即X轴和APC即Y轴的对数散点图，显示圈中的微球；
③低速采集微球，调节PE通道电压，使微球位于左侧，不要压线；
④保存模板和条件；
S10：采集数据：依次检测标准品和样本。
作为改进，所述S3中，捕获微球混合液在加入前先进行涡旋处理。
本发明与现有技术相比的优点在于：本发明能同时检测出样本中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、 IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17、TNF-α、IFN-γ、IFN-α十二种细胞因子的浓度，解决检测一个样本中十二种细胞因子需要单独用十二种检测试剂检测的问题，实现单样本多重定量检测、节约时间和成本、检测浓度范围广、需要样本量少、步骤简单易操作、效率更高。
附图说明
图1是本发明十二种包被微球混合液的不同大小微球FSC-SSC散点图。
图2是本发明4um微球的7种细胞因子对应的荧光编码微球与荧光信号强度的散点图。
图3是本发明5um微球的5种细胞因子对应的荧光编码微球与荧光信号强度的散点图。
图4是本发明对血清样本同时检测十二种细胞因子流式细胞仪分析结果图。
图5是本发明对血清样本检测4um微球的7种细胞因子流式细胞仪分析结果图。
图6是本发明对血清样本检测5um微球的5种细胞因子流式细胞仪分析结果图。
具体实施方式
1.捕获微球混合液制备
1.1分别取4μm和5μm两种尺寸且不同荧光强度的12种聚苯乙烯羧基化微球分别加入离心管中，5000g离心5min，弃上清；
1.2加入500μl去离子水，涡旋振荡混匀后，5000g离心5min，弃上清，重复洗涤2次；
1.3加入100μl0.1M磷酸盐缓液液重悬微球，涡旋振荡混匀；
1.4加入50μlEDC(50mg/ml)和NHS(50mg/ml)溶液，涡旋振荡混匀，室温避光振荡孵育20min；
1.5孵育结束后，5000g离心5min，弃上清；
1.6加入200μl0.05MMES，涡旋振荡混匀，5000g离心5min，弃上清。重复洗涤2次；
1.7加入500μl0.05MMES，涡旋振荡混匀，按照每106个微球加入10μg细胞因子捕获抗体，室温避光振荡孵育2h；
1.8孵育结束后，5000g离心5min，弃上清；
1.9加入200μl0.01M磷酸盐缓冲液(含1％BSA和1％甘氨酸)，涡旋振荡混匀，室温避光振荡孵育30min；
1.10孵育结束后，5000g离心5min，弃上清；
1.11加入200ul0.01M磷酸盐缓冲液(含1％BSA)，涡旋振荡混匀，5000g离心5min，弃上清，重复洗涤2次；
1.12加入适当0.01M磷酸盐缓冲液(含1％BSA)，涡旋振荡混匀，流式细胞仪计数，调整微球浓度为5000个/ul，4℃避光保存，得到的即为12种包被不同细胞因子捕获抗体的微球；
1.13按照每人份每种微球2000个制备十二种细胞因子捕获微球混合液如图1所示，使用4μm微球制备IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12p70、TNF-α、IFN-γ捕获微球如图2所示，使用5μm微球制备IL-4、IL-5、IL-8、IL-17、IFN-α捕获微球如图3所示。
2.检测抗体混合液制备
2.1将生物素预先溶解在DMSO中至终浓度10mg/ml；
2.2分别将细胞因子检测抗体加入各个脱盐柱，1000g离心2min，收集离心管中的细胞因子抗体；
2.3按照抗体与生物素摩尔比1:20加入生物素/DMSO溶液，与待标记的抗体混匀；
2.4室温避光孵育2h；
2.5孵育结束后，加入与生物素同体积的Tris-HCl，室温避光孵育1h；
2.6孵育结束后，用脱盐柱除去未反应的生物素；
2.7利用紫外分光光度计测定脱盐后的抗体浓度，分别得到12种细胞因子生物素标记抗体；
2.8利用抗体稀释液将12种细胞因子生物素标记抗体稀释至终浓度为0.5ug/ml，即为检测抗体混合液。
3.链霉亲和素-PE制备
3.1链霉亲和素活化：利用脱盐柱对链霉亲和素脱盐处理，脱盐后调整浓度为5mg/ml，将交联剂SANH溶解于DMSO中配制10mg/mlSANH母液；按照链霉亲和素与SANH摩尔比1:20加入SANH母液，轻轻混匀，室温避光反应2小时，反应结束后用脱盐柱脱盐除去未结合的SANH；
3.2藻红蛋白(PE)活化：取5mg藻红蛋白(PE)溶液于1.5ml离心管中，12000rpm 离心10min，弃上清，加入磷酸盐缓冲液重悬沉淀，利用脱盐柱对藻红蛋白PE脱盐处理，脱盐后调整浓度为5mg/ml，将交联剂SFB溶解于DMSO中配制10mg/mlSFB母液，按照藻红蛋白(PE)与SFB摩尔比1:10加入SFB母液，轻轻混匀，室温避光反应2小时，反应结束后用脱盐柱脱盐除去未结合的SFB；
3.3链霉亲和素-SANH与藻红蛋白(PE)-SFB共价偶联：按照链霉亲和素-SANH与藻红蛋白(PE)-SFB摩尔比1:1.5混合，振荡混匀后加入苯胺至终浓度10mM，振荡混匀后室温避光孵育2h；
3.4链霉亲和素-PE偶联产物纯化：采用AKTA进行纯化，纯化柱型号HiLoad16/600Superdex200pg，流动相1×PBS，pH7.4，检测波长280nm，洗脱顺序依次为链霉亲和素-PE、游离的PE、游离的链霉亲和素，收集洗脱的链霉亲和素-PE，利用紫外分光光度计测定收集的链霉亲和素-PE的浓度；
3.5利用蛋白稀释液将纯化得到的链霉亲和素-PE稀释至终浓度1ug/ml，即为链霉亲和素-PE试剂。
4.标准品制备
4.1利用流式荧光发光法，通过NIBSC标准品对IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、 IL-10、IL-12p70、IL-17、TNF-α、IFN-γ、IFN-α细胞因子重组蛋白溶液分别校准；
4.2校准后的细胞因子重组蛋白溶液，用蛋白保存液稀释至终浓度10000pg/ml；
4.3利用冻干机冻干细胞因子重组蛋白混合液制成冻干粉，即为标准品。
5.样品稀释液制备
向0.01MpH7.2磷酸盐缓冲液中加入1％牛血清白蛋白和0.2％Proclin950，充分混匀。
6.洗液制备
向0.1MpH7.2磷酸缓冲液中加入0.5％Tween-20和0.2％Proclin950，充分混匀。
7.标准曲线准备
7.1取出标准品管，2000×g瞬时离心，加入125μl样品稀释液，轻柔震荡后静置5-10 分钟，作为标准曲线最高浓度10，000pg/ml，标记为S1；
7.2取7个新的离心管，标记为S2～S7，每管加入150μl样品稀释液，从S1管中取50μl，加入到S2管中，混匀，再取S2中50μl至S3管混匀，从S3管中取50μl加入S4管中混匀，从S4管中取50μl加入S5管中混匀，从S5管中取50μl加入S6管中混匀，从S6 管中取50μl加入S7管中混匀，依次进行倍比稀释。
8.试剂准备
1×洗液：根据制备标准曲线的管数和待测样本的管数计算所需1×洗液的量，按每管需 1ml洗液进行计算，配制适量1×洗液，将10×洗液用超纯水按1:9稀释为1×检测试剂。
9.样本准备
9.1样本如为冷冻保存，应提前取出，缓慢融化，恢复至室温；
9.2样本如为血液，3000rpm离心15min，轻轻取上清。
10.操作步骤 10.1根据标准品管和待测样本数量，准备适量流式管，每管加入25μl捕获微球混合液和25μl样品稀释液，捕获微球混合液加入前涡旋45秒；
10.2取8个流式管，分别标记S1～S8，其中S1～S7管加入25μl对应梯度稀释的标准品， S8管加入25μl样品稀释液，作为空白管，待测样本管加入25μl样本；
10.3每管加入25μl生物素标记的检测试剂，涡旋震荡混匀，室温避光震荡孵育2h；
10.4孵育结束后，每管加入25μl链霉亲和素-PE，室温避光震荡孵育30min；
10.5孵育结束后，每管加入500μl1×洗液，涡旋震荡混匀，500×g离心5分钟，弃上清；
10.6每管加入100ul1×洗液，涡旋振荡，重悬微球；
10.7设置实验方案：取10μl捕获微球，加入100μl1×洗液混匀，上机建立模板，
具体步骤如下：
(1)建立X轴为FSC、Y轴为SSC的线性散点图，根据FSC，圈中微球；
(2)建立PE(X轴)和APC(Y轴)的对数散点图，显示圈中的微球；
(3)低速采集微球，调节PE通道电压，使微球位于左侧，不要压线；
(4)保存模板和条件；
10.8采集数据
依次检测标准品和样本，上机前涡旋10秒，每个样本收集2400个微球，每种微球大约200个，如图4～图6所示。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种同时定量检测十二种细胞因子的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括捕获微球混合液、检测抗体混合液、样品稀释液、标准品、检测试剂、链霉亲和素-PE及洗液。
2.根据权利要求1所述的一种同时定量检测十二种细胞因子的试剂盒，其特征在于：所述捕获微球混合液的制备方法如下：
S1：分别取12种不同尺寸大小和荧光强度的聚苯乙烯羧基化微球分别加入离心管中，离心,弃上清；
S2：加入去离子水，涡旋振荡混匀后，离心,弃上清，重复洗涤至少1次；
S3：加入磷酸盐缓液液重悬微球，涡旋振荡混匀；
S4：加入EDC和NHS溶液，涡旋振荡混匀，室温避光振荡孵育；
S5：孵育结束后，离心,弃上清；
S6：加入MES，涡旋振荡混匀，离心,弃上清，重复洗涤至少1次；
S7：加入MES，涡旋振荡混匀，加入细胞因子捕获抗体，室温避光振荡孵育；
S8：孵育结束后，离心，弃上清；
S9：加入磷酸盐缓冲液，涡旋振荡混匀，室温避光振荡孵育；
S10：孵育结束后，离心，弃上清；
S11：加入磷酸盐缓冲液，涡旋振荡混匀，离心，弃上清，重复洗涤至少1次；
S12：加入磷酸盐缓冲液，涡旋振荡混匀，流式细胞仪计数，调整微球浓度，避光保存，得到的即为12种包被不同细胞因子捕获抗体的微球；
S13：按比例制备十二种细胞因子捕获微球混合液。
3.根据权利要求1所述的一种同时定量检测十二种细胞因子的试剂盒，其特征在于：所述检测抗体混合液的制备方法为：
S1：将生物素预先溶解在DMSO中；
S2：分别将细胞因子检测抗体加入各个脱盐柱，离心，收集离心管中的细胞因子抗体；
S3：将抗体与生物素按比例加入生物素/DMSO溶液，与待标记的抗体混匀；
S4：室温避光孵育；
S5：孵育结束后，加入与生物素同体积的Tris-HCl，室温避光孵育；
S6：孵育结束后，用脱盐柱除去未反应的生物素；
S7：利用紫外分光光度计测定脱盐后的抗体浓度，分别得到12种细胞因子生物素标记抗体；
S8：利用抗体稀释液将12种细胞因子生物素标记抗体稀释，即为检测抗体混合液。
4.根据权利要求1所述的一种同时定量检测十二种细胞因子的试剂盒，其特征在于：所述样品稀释液的制备方法为向磷酸盐缓冲液中加入牛血清白蛋白和Proclin 950，充分混匀即可。
5.根据权利要求1所述的一种同时定量检测十二种细胞因子的试剂盒，其特征在于：所述标准品的制备方法为：
S1：利用流式荧光发光法，通过NIBSC标准品对IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17、TNF-α、IFN-γ、IFN-α细胞因子重组蛋白溶液分别校准；
S2：校准后的细胞因子重组蛋白溶液，用蛋白保存液稀释；
S3：利用冻干机冻干细胞因子重组蛋白混合液制成冻干粉，即为标准品。
6.根据权利要求1所述的一种同时定量检测十二种细胞因子的试剂盒，其特征在于：所述链霉亲和素-PE的制备方法为：
S1：链霉亲和素活化：利用脱盐柱对链霉亲和素脱盐处理，将交联剂SANH溶解于DMSO中配制SANH母液，将链霉亲和素与SANH按比例加入SANH母液，轻轻混匀，室温避光反应，反应结束后用脱盐柱脱盐除去未结合的SANH；
S2：藻红蛋白活化：取藻红蛋白溶液于离心管中，离心，弃上清，加入磷酸盐缓冲液重悬沉淀，利用脱盐柱对藻红蛋白脱盐处理，将交联剂SFB溶解于DMSO中配制SFB母液，将藻红蛋白与SFB按比例加入SFB母液，轻轻混匀，室温避光反应，反应结束后用脱盐柱脱盐除去未结合的SFB；
S3：链霉亲和素-SANH与藻红蛋白-SFB共价偶联：将链霉亲和素-SANH与藻红蛋白-SFB按比例混合，振荡混匀后加入苯胺，振荡混匀后室温避光孵育；
S4：链霉亲和素-PE偶联产物纯化：采用AKTA进行纯化，洗脱，收集洗脱的链霉亲和素-PE，利用紫外分光光度计测定收集的链霉亲和素-PE的浓度；
S5：利用蛋白稀释液将纯化得到的链霉亲和素-PE稀释，即为链霉亲和素-PE试剂。
7.根据权利要求1所述的一种同时定量检测十二种细胞因子的试剂盒，其特征在于：所述洗液的制备方法为向磷酸缓冲液中加入Tween-20和Proclin 950,充分混匀即可。
8.一种同时定量检测十二种细胞因子的方法，其特征在于：所述方法包括以下操作步骤：
S1：标准曲线准备：①取出标准品管，瞬时离心，加入样品稀释液，轻柔震荡后静置5～10分钟，作为标准曲线最高浓度，标记为S1；②取7个新的离心管，标记为S2～S7，每管加入样品稀释液，从S1管中取一定量加入S2管中混匀，从S2管中取一定量加入S3管中混匀，从S3管中取一定量加入S4管中混匀，从S4管中取一定量加入S5管中混匀，从S5管中取一定量加入S6管中混匀，从S6管中取一定量加入S7管中混匀，进行倍比稀释；
S2：检测试剂准备：根据制备标准曲线的管数和待测样本的管数计算所需1×洗液的量，将洗液用超纯水按比例稀释即得；
S3：样本制备：样本如为冷冻保存，应提前取出，缓慢融化，恢复至室温；样本如为血液，离心后轻轻取上清；
S3：根据标准品管和待测样本数量，准备适量流式管，每管加入捕获微球混合液和样品稀释液；
S4：取8个流式管，分别标记S1～S8，其中S1～S7管加入对应梯度稀释的标准品，S8管加入样品稀释液，作为空白管，待测样本管加入样本；
S5：每管加入生物素标记的检测试剂，涡旋震荡混匀，室温避光震荡孵育，；
S6：孵育结束后，每管加入链霉亲和素-PE，室温避光震荡孵育；
S7：孵育结束后，每管加入检测试剂，涡旋震荡混匀，离心，弃上清；
S8：每管加入检测试剂，涡旋振荡，重悬微球；
S9：设置实验方案：取捕获微球混合液，加入检测试剂混匀，上机建立模板，具体步骤如下：
①建立X轴为FSC、Y轴为SSC的线性散点图，根据FSC，圈中微球；
②建立PE即X轴和APC即Y轴的对数散点图，显示圈中的微球；
③低速采集微球，调节PE通道电压，使微球位于左侧，不要压线；
④保存模板和条件；
S10：采集数据：依次检测标准品和样本。
9.根据权利要求8所述的一种同时定量检测十二种细胞因子的方法，其特征在于：所述S3中，捕获微球混合液在加入前先进行涡旋处理。
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