JPWO2003081240A1 - ウイルス感染症の判定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ウイルス感染症の判定方法および該判定のためのキットに関する。
背景技術
1928年にペニシリンが発見されて以来、次々に開発・改良された抗生物質により、かなりの細菌感染症の治療は可能となった。しかしながら、このことは細菌感染症に限らず全ての感染症が治療できるようになったわけではない。多くの感染症患者が治療を必要としており、治療法選択の為の診断方法が求められている。しかしながら、日常診療において細菌感染症とウイルス感染症を明確にかつ迅速に鑑別する方法は現段階では存在しない。
これまで、細菌感染症とそれ以外の感染症の判別には、患者の症状、末梢血白血球数やC反応性蛋白質(C−reactive protein)値が用いられている。C反応性蛋白質は、急性相反応物質のひとつであり、各種の感染症の診断や経過観察のマーカーとして知られている。健常成人の血中C反応性蛋白質の値は0.06mg/dLである。血中C反応性蛋白質の値が、1〜10mg/dLの場合には中程度増加の異常と判断され、10mg/dL以上の場合には高度増加の異常と判断される。中程度増加の異常と判断された場合には、細菌感染症以外にも、慢性関節リウマチ、血管炎、リウマチ熱、悪性腫瘍、心筋梗塞、外傷が疑われる。また、高度増加の異常と判断された場合には、重症細菌感染症や活動性リウマチが疑われる[臨床検査法提要、金原出版,500(1998)]。
このように、従来細菌感染症の判別に使用されている血中C反応性蛋白質の値の診断では、細菌感染症を完全に判別することは困難である。
近年、ウイルス感染症の特異的指標としてMxA蛋白質が注目されている。MxA蛋白質は、ウイルス感染時に上昇するI型インターフェロン(IFN−αおよびIFN−β)により、リンパ球内で誘導されるが、細菌感染症や慢性炎症性疾患などで産生亢進が認められるIL−1、IL−6、TNF−αなど他の炎症性サイトカインの影響を全く受けない[Eur J Immunol,20,2015(1990)]。そのため、リンパ球内のMxA蛋白質の発現はウイルス感染症全般を検出できるものと考えられ、臨床応用への可能性が報告されている(Pediatr Res,41,647(1997)]。
医療現場には、細菌感染症の疑いがあれば、患者に抗生物質を使用するという傾向がある[JAMA,273,213(1995)]。このような抗生物質の使用により、各種抗生物質に抵抗を示すメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)などの多剤耐性菌の出現が重大な問題となってきた。
抗生物質の適正使用は、多剤耐性菌の出現を防止することができるだけでなく、現在問題になっている医療費の高騰を抑えることにも貢献できるものと期待される[Pedicatrics,108,1(2001)]。従って、ウイルス感染症と細菌感染症を明確に判別することが重要であるが、これまでのところ判別方法は知られていない。
発明の開示
本発明の目的は、細菌感染を伴わないウイルス感染症の判定方法およびそれに用いる判定試薬を提供することである。
本発明は、生体試料中のC反応性蛋白質およびMxA蛋白質を測定することを特徴とする細菌感染を伴わないウイルス感染症の判定方法に関する。
また、本発明は、C反応性蛋白質測定試薬およびMxA蛋白質測定試薬からなる細菌感染を伴わないウイルス感染症を判定するためのキットに関する。
細菌感染を伴わないウイルス感染症を判定するためには、C反応性蛋白質の測定、およびMxA蛋白質の測定を行う。
C反応性蛋白質測定方法としては、C反応性蛋白質を測定する方法であれば特に制限はなく、例えばC反応性蛋白質に対する抗体を用いて測定する免疫学的測定方法があげられる。免疫学的測定方法としては、イムノアッセイ法、イムノブロッティング法、凝集反応、補体結合反応、溶血反応、沈降反応、金コロイド法、クロマトグラフィー法、免疫染色法等の抗原抗体反応を利用した方法であればいかなるものも包含されるが、好ましくはイムノアッセイ法があげられる。
イムノアッセイ法は、各種標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体または抗原を検出或いは定量する方法であり、抗原または抗体の標識方法に応じて、放射免疫検出法(RIA)、酵素免疫検出法(EIAまたはELISA)、蛍光免疫検出法(FIA)、発光免疫検出法(luminescent immunoassay)、物理化学的検出法(TIA,LAPIA,PCIA)、フローサイトメトリーなどがあげられる。C反応性蛋白質測定方法としては、好ましくは物理化学的検出法があげられる。
具体的には、C反応性蛋白質と特異的に結合する抗体もしくは抗血清を用いて、抗原であるC反応性蛋白質と抗体、もしくは抗血清とを結合させることにより凝集体を形成させて、この凝集体を検出することにより行う。この他に物理化学的検出法としては、毛細管法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法あるいはラテックス免疫比濁法等で測定する方法があげられる[臨床検査法提要、金原出版,499(1998)]。
例えば、ラテックス免疫比濁法では、抗体または抗原を感作させた粒径0.1〜1μm程度のポリスチレンラテックス等の担体を用い、対応する抗原あるいは抗体により抗原抗体反応を起こさせると、反応液中の散乱光は増加し、透過光は減少する。この変化を吸光度あるいは積分球濁度として検出することによりC反応性蛋白質を測定することができる。具体的なC反応性蛋白質の測定試薬としては、協和メデックス社のデタミナーT CRPやエクステルCRP、日東紡社のN−アッセイTIA−CRP−Hキット等をあげることができる。
MxA蛋白質測定方法としては、MxA蛋白質を測定する方法であれば特に制限はなく、例えばMxA蛋白質に対する抗体を用いて測定する免疫学的測定方法があげられる。免疫学的測定方法としては、イムノアッセイ法、イムノブロッティング法、凝集反応、補体結合反応、溶血反応、沈降反応、金コロイド法、クロマトグラフィー法、免疫染色法等の抗原抗体反応を利用した方法であればいかなるものも包含される。MxA蛋白質測定方法としては、好ましくはイムノアッセイ法があげられる。
イムノアッセイ法は、各種標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体または抗原を検出或いは定量する方法であり、抗原または抗体の標識方法に応じて、放射免疫検出法(RIA)、酵素免疫検出法(EIAまたはELISA)、蛍光免疫検出法(FIA)、発光免疫検出法(luminescent immunoassay)、物理化学的検出法(TIA,LAPIA,PCIA)、フローサイトメトリーなどがあげられるが、好ましくはフローサイトメトリーがあげられる。
フローサイトメトリーで用いる蛍光標識体としては、任意の公知(川生明著、蛍光抗体法、ソフトサイエンス社製)の蛍光標識体を用いることができる。例えば、FITC、RITC等を用いることができる。
具体的には、MxA蛋白質と特異的に結合する抗体もしくは抗血清と、パラフィン固定を施した末梢血リンパ球とを反応させて、リンパ球に発現しているMxA蛋白質に特異的に結合した抗体を蛍光標識化された適当な二次抗体と反応させ、蛍光強度の違いをフローサイトメトリーにより検出する[WO96/05230、Allergy,56,895(2001)]。
本発明の細菌感染を伴わないウイルス感染症を判定するためのキットは、C反応性蛋白質測定試薬およびMxA蛋白質測定試薬からなる。本発明のキットとしては、C反応性蛋白質測定試薬とMxA蛋白質測定試薬が各々独立したキットを組み合わせてもよいし、C反応性蛋白質測定試薬とMxA蛋白質測定試薬を同一のキットに含めたものでもよい。また、C反応性蛋白質測定試薬とMxA蛋白質測定試薬を同一のキットに含めたものにおいて、各々の測定試薬のうち共通する試薬は共用することができる。共通する試薬としては、例えば、生体試料の希釈液、抗体固定化固相、反応緩衝液、洗浄液、標識された二次抗体またはその抗体断片、標識体の検出用試薬等があげられる。また本発明のキットに、測定に適した機器を組み合わせて、キットとしてもよい。
以下に述べるC反応性蛋白質測定試薬またはMxA蛋白質測定試薬の各構成要素と本質的に同一、またはその一部と本質的に同一な物質が含まれていれば、構成または形態が異なっていても、本発明のキットに包含される。
C反応性蛋白質測定試薬としては、C反応性蛋白質に反応する抗体を含み、また必要に応じ、生体試料の希釈液、抗体固定化固相、反応緩衝液、洗浄液、標識された二次抗体またはその抗体断片、標識体の検出用試薬、C反応性蛋白質の標準物質なども含まれる。
C反応性蛋白質に反応する抗体としては、C反応性蛋白質に反応する抗体であれば特に制限がなく、例えば市販のヤギ、ウサギ、ラット等の抗ヒトC反応性蛋白質ポリクローナル抗体やマウス抗ヒトC反応性蛋白質モノクローナル抗体(SIGMA社)があげられる。
生体試料の希釈液としては、界面活性剤、緩衝剤などにBSAやカゼインなどのタンパク質を含む水溶液などがあげられる。
抗体固定化固相としては、各種高分子素材を用途に合うように整形した素材に、C反応性蛋白質の反応する抗体または抗体断片を固相化したものが用いられる。形状としてはチューブ、ビーズ、プレート、ラテックスなどの微粒子、スティック等が、素材としてはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、ポリエチレンテレフタレート等の高分子素材、ガラス、セラミックスや金属等があげられる。抗体の固相化の方法としては物理的方法と化学的方法またはこれらの併用等、公知の方法が用いられる。例えば、ポリスチレン製96ウェルの免疫測定用マイクロタープレートに抗体等を疎水固相化したものがあげられる。
反応緩衝液としては、抗体固定化固相の抗体と生体試料中の抗原とが結合反応をすることができればいかなる緩衝液であってもよく、例えば、リン酸緩衝液やグッドの緩衝液等があげられる。また、必要に応じて、界面活性剤、BSAやカゼインなどの蛋白質、防腐剤、安定化剤、反応促進剤等を添加してもよい。
洗浄液としては、例えば、0.05%のTween20を含むリン酸緩衝液生理食塩水(以下PBSと表す)等があげられる。また、必要に応じて、緩衝剤、界面活性剤、BSAやカゼインなどの蛋白質、防腐剤、安定化剤等を添加してもよい。
標識された二次抗体またはその抗体断片としては、抗体または抗体断片に西洋ワサビペルオキシダーゼ、ウシ小腸アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなどの標識用酵素を結合した抗体または抗体断片があげられる。該二次抗体またはその抗体断片には、必要に応じて、緩衝剤、BSAやカゼインなどのタンパク質、防腐剤などを添加してもよい。
標識体の検出用試薬としては前記の標識用酵素に応じて、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼであれば、テトラメチルベンジジンやオルトフェニレンジアミンなどの吸光測定用基質、ヒドロキシフェニルヒドロキシフェニルプロピオン酸やヒドロキシフェニル酢酸などの蛍光基質、ルミノールなどの発光基質が、アルカリホスファターゼであれば、4−ニトロフェニルフォスフェートなどの吸光度測定用基質、4−メチルウンベリフェリルフォスフェートなどの蛍光基質等があげられる。
標準物質としては、遺伝子組換え技術により取得された、あるいは生体試料から取得されたC反応性蛋白質や、C反応性蛋白質が発現している細胞等があげられる。
MxA蛋白質測定試薬としては、MxA蛋白質に反応する抗体を含み、必要に応じて、生体試料の希釈液、抗体固定化固相、反応緩衝液、洗浄液、標識された二次抗体またはその抗体断片、標識体の検出用試薬、MxA蛋白質の標準物質なども含まれる。
MxA蛋白質に反応する抗体としては、MxA蛋白質に反応する抗体であれば特に制限がなく、例えばハイブリドーマ細胞FERM BP−4731により生産される抗MxA蛋白質抗体KM1135(WO96/05230)があげられる。
生体試料の希釈液としては、界面活性剤、緩衝剤などにBSAやカゼインなどのタンパク質を含む水溶液などがあげられる。
抗体固定化固相としては、各種高分子素材を用途に合うように整形した素材に、MxA蛋白質の反応する抗体または抗体断片を固相化したものが用いられる。形状としてはチューブ、ビーズ、プレート、ラテックスなどの微粒子、スティック等が、素材としてはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、ポリエチレンテレフタレート等の高分子素材、ガラス、セラミックスや金属等があげられる。抗体の固相化の方法としては物理的方法と化学的方法またはこれらの併用等、公知の方法が用いられる。例えば、ポリスチレン製96ウェルの免疫測定用マイクロタープレートに抗体等を疎水固相化したものがあげられる。
MxA蛋白質測定試薬に含まれる反応緩衝液は、抗体固定化固相の抗体と生体試料中の抗原とが結合反応をすることができればいかなる緩衝液であってもよく、例えば、リン酸緩衝液やグッドの緩衝液等があげられる。また、必要に応じて、界面活性剤、BSAやカゼインなどの蛋白質、防腐剤、安定化剤、反応促進剤等を添加してもよい。
洗浄液としては、MxA蛋白質測定のための抗原抗体反応に関与していないものを洗浄することができればいかなる洗浄液であってもよく、例えば1%の牛胎児血清並びに、0.1%のアザイドを含むPBS等があげられる。また、必要に応じて、緩衝剤、界面活性剤、BSAやカゼインなどの蛋白質、防腐剤、安定化剤等を添加してもよい。
MxA蛋白質測定試薬に含まれる標識された二次抗体またはその抗体断片としては、抗体または抗体断片に西洋ワサビペルオキシダーゼ、ウシ小腸アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなどの標識用酵素を結合した抗体または抗体断片があげられる。該二次抗体またはその抗体断片には、必要に応じて、緩衝剤、BSAやカゼインなどのタンパク質、防腐剤などを添加してもよい。
標識体の検出用試薬としては前記の標識用酵素に応じて、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼであれば、テトラメチルベンジジンやオルトフェニレンジアミンなどの吸光測定用基質、ヒドロキシフェニルヒドロキシフェニルプロピオン酸やヒドロキシフェニル酢酸などの蛍光基質、ルミノールなどの発光基質が、アルカリホスファターゼであれば、4−ニトロフェニルフォスフェートなどの吸光度測定用基質、4−メチルウンベリフェリルフォスフェートなどの蛍光基質等があげられる。
標準物質としては、遺伝子組換え技術により取得された、あるいは生体試料から取得されたMxA蛋白質や、MxA蛋白質が発現している細胞等があげられる。
本発明に用いる生体試料としては、例えば血液が用いられる。
本発明においては、C反応性蛋白質とMxA蛋白質を測定し、その測定された各値から、C反応性蛋白質とMxA蛋白質の発現の有無を判断して、細菌感染を伴わないウイルス感染症を判定する。
この場合、C反応性蛋白質陰性かつMxA蛋白質陽性の場合には細菌感染を伴わないウイルス感染症と判定される。また、C反応性蛋白質陽性かつMxA蛋白質陰性の場合にはウイルス感染を伴わない細菌感染症と判定される。C反応性蛋白質陽性かつMxA蛋白質陽性の場合ウイルス感染症および細菌感染症と判定される。C反応性蛋白質陰性かつMxA蛋白質陰性の場合は不明と判定される。
本発明において、C反応性蛋白質とMxA蛋白質の測定された各値の陽性または陰性の基準は、測定方法により適宜決定することができる。例えば、血中C反応性蛋白質をイムノアッセイ法で測定した場合には、1.0mg/dl未満を陰性、1.0mg/dl以上を陽性として判定に使用することができる。また、MxA蛋白質をイムノアッセイ法で測定した場合は、ウイルス感染が認められない健常者の測定値と標準偏差を求め、平均値+3SD値以上を陽性としてそれ未満を陰性として判定に使用することができる。
以下に具体的な実施例をあげる。
発明を実施するための最良の形態
実施例1
何らかの感染症を疑われて各種検査のために採血された者74名(0カ月〜15歳)の末梢血を用いて、以下の測定を行った。
採血された末梢血を血中C反応性蛋白質値、その他の一般検査用には血清提出用スピッツ管に、またリンパ球内のMxA蛋白質測定用にはヘパリンNa入りスピッツ管に直ちに注入し、当日中に処理を行なった。
血中C反応性蛋白質値の測定には、日東紡社のN−アッセイTIA−CRP−Hキットを使用し、添付のプロトコールに従った。血中C反応性蛋白質の測定値は、1.0mg/dlを基準値とし、1.0mg/dl未満であった患者を陰性、1.0mg/dl以上であった患者を陽性として判定した。
リンパ球内のMxA蛋白質の発現の解析は、以下のように行った。
ヘパリン加採血した末梢血200μlを4%パラホルムアルデヒドにて固定し、その後、0.1%トリトンX−100を含むリシス緩衝液にて赤血球を溶血させると共にリンパ球細胞膜を浸透化した。次に、ハイブリドーマ細胞FERM BP−4731により生産される抗MxA蛋白質抗体KM1135、あるいはコントロール抗体として抗マウスIgG1抗体の1次抗体で染色し、洗浄後に2次抗体を用いて発色させ、フローサイトメーターにて解析を行ない、コントロール抗体との蛍光強度の差をMxA蛋白質値とした。なお、基準値を得るために正常分娩の臍帯血を用い、便宜上その平均値+3SD以上の蛍光強度を基準値とし、平均値+3SD以下を示した患者をリンパ球内のMxA蛋白質発現が陰性、平均値+3SD以上を示した患者をリンパ球内のMxA蛋白質発現が陽性として判定した。
発熱の有無は、採血日の最高体温が37.5℃以上であった患者を発熱有り、37.5℃未満であった患者を発熱無しとした。
これらの患者74名を、発熱の有無による判定、血中C反応性蛋白質値での判定、並びにリンパ球内MxA蛋白質の発現での判定により分類した結果を第1表に示した。
血中C反応性蛋白質値での判定で陽性となった患者は、発熱がある場合には64.6%で、発熱がない場合には23.1%となった。一方、リンパ球内MxA蛋白質の発現での判定で陽性となった患者は、発熱がある場合には68.8%で、発熱がない場合には61.5%となった。従って、血中C反応性蛋白質値の陽性判定とリンパ球内MxA蛋白質の発現での陽性判定は独立した判定基準に起因する判定であり、両者を組み合わせることでより多くの情報が得られる可能性が示された。
実際、血中C反応性蛋白質値での判定とリンパ球内MxA蛋白質の発現での判定を組み合わせて74名の患者を解析した場合、これまでは単なる細菌感染症や、あるいは病因不明であると診断されていた患者の病因を特定できる場合があった。
発熱があり、血中C反応性蛋白質値での判定で陽性となった患者は、31名おり、これまでは単に細菌感染症と判定されていた。この31名の患者に対して、リンパ球内MxA蛋白質の発現での判定を組み合わせたところ、リンパ球内MxA蛋白質の発現が陽性となった患者は19名であった。これら19名の患者の中には喘息発作5例とウイルス性咽頭炎と考えられる5例が含まれており、ウイルス感染症とも考えられる患者の存在が明らかとなった。このことは、単に発熱があって血中C反応性蛋白質値での判定が陽性であれば細菌性感染症であるという従来の判定方法よりも、本発明の判定方法が優れた方法であることを示している。
また、発熱があっても血中C反応性蛋白質値での判定で陰性と判定された17名の患者は、これまでは原因不明と判定されていた。これら17名の患者に、リンパ球内MxA蛋白質の発現での判定を組み合わせたところ、リンパ球内MxA蛋白質の発現での判定で陽性となる患者は14名であった。実際、この14名のなかには、喘息発作4例、ウイルス性胃腸炎(疑い)2例、ウイルス性脳炎(疑い)2例の症例が含まれていた。
発熱が無く、血中C反応性蛋白質値での判定では陰性となり細菌感染症とは判定されない患者は20名であった。これら20名の患者に対して、リンパ球内MxA蛋白質の発現による判定を組み合わせた場合、14名の患者がリンパ球内MxA蛋白質の発現での判定で陽性となった。
実際、これら14名のうち、5名の患者にウイルス感染が確認され、その内訳は、4名がRSウイルス感染症、1名が先天性サイトメガロウイルス感染症であることが確認された。
従って、血中C反応性蛋白質値での判定が陰性となり、これまでは病因は不明が不明となる場合でも、リンパ球内MxA蛋白質の発現による判定を組み合わせることで、容易にウイルス感染症の判定を行うことができ、治療方針を迅速に判断することができることが明らかとなった。
産業上の利用可能性
本発明によれば、細菌感染を伴わないウイルス感染症を判定する方法、およびそれに使用されるキットが提供される。
本発明の細菌感染を伴わないウイルス感染症を判定する方法、およびそれに使用されるキットを用いて、C反応性蛋白質とMxA蛋白質を同時に解析することによって、細菌感染症を伴わないウイルス感染症の判定を行うことができる。
Claims (2)
- 生体試料中のMxA蛋白質およびC反応性蛋白質を測定することを特徴とする細菌感染を伴わないウイルス感染症の判定方法。
- MxA蛋白質測定試薬およびC反応性蛋白質測定試薬からなる、細菌感染を伴わないウイルス感染症を判定するためのキット。
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