WO2003081240A1 - Procede de recherche d'infection virale - Google Patents

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Toshio Miyawaki
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Definitions

  • the present invention relates to a method for determining a viral infection and a kit for the determination.
  • C-reactive protein is one of the acute phase reactants and is known as a marker for diagnosis and follow-up of various infectious diseases.
  • the value of blood C-reactive protein in healthy adults is 0.06 mg ZdL. If the level of C-reactive protein in the blood is between 1 and 10 mg / dL, it is judged to be a moderate increase in abnormalities, and if it is 1 O mg ZdL or more, it is judged to be an abnormal increase in altitude .
  • M x A protein has attracted attention as a specific indicator of viral infection. ing. MxA protein is induced in lymphocytes by type I influenza ferron (IFN-H and IFN-; 5), which is elevated during viral infection, but is associated with bacterial infections and chronic inflammatory diseases. It is not affected by other inflammatory site-inducing factors such as IL-1, IL-16, and TNF-hi, whose production is enhanced [Eur J Immunol, 20, 2015 (1990)]. Therefore, expression of MxA protein in lymphocytes is considered to be able to detect viral infections in general, and its potential for clinical application has been reported (Pediatr Hes, ⁇ , 647 (1997)].
  • An object of the present invention is to provide a method for judging a viral infection without bacterial infection and a judgment reagent used therefor.
  • the present invention relates to a method for determining a viral infection without bacterial infection, which comprises measuring a C-reactive protein and a MXA protein in a biological sample.
  • the present invention also relates to a kit for determining a viral infection without bacterial infection, comprising a reagent for measuring C-reactive protein and a reagent for measuring MxA protein.
  • the method for measuring the C-reactive protein is not particularly limited as long as it is a method for measuring the C-reactive protein, and examples thereof include an immunological measurement method using an antibody against the C-reactive protein.
  • Immunological assays include antigen-antibody reactions such as the immunoassay method, immunoblotting method, agglutination reaction, complement fixation reaction, hemolysis reaction, sedimentation reaction, gold colloid method, chromatographic method, and immunostaining method. Any method may be included as long as the method is performed, but preferably the Imnoassy method is used.
  • the immunoassay method is a method of detecting or quantifying an antibody or antigen using various labeled antigens or antibodies. Depending on the method of labeling the antigen or antibody, radioimmunoassay (MA), enzyme immunoassay (EIA or ELISA), fluorescent immunoassay (FIA), luminescent immunoassay (luminescent immunoassay), physicochemical detection (TIA, LAPIA, PCIA), flow cytometry, and the like. As a method for measuring the C-reactive protein, a physicochemical detection method is preferable.
  • an antibody or antiserum that specifically binds to C-reactive protein is used to bind the C-reactive protein as an antigen to the antibody or antiserum to form an aggregate, The detection is performed by detecting this aggregate.
  • Other examples of physicochemical detection methods include a capillary method, a one-dimensional immunodiffusion method, an immunoturbidimetric method, and a latex immunoturbidimetric method. [Procedure of Clinical Laboratory Methods, Kinbara Shuppan, 499 ( 1998)].
  • a carrier such as polystyrene latex having a particle diameter of about 0.1 to 1 m to which an antibody or an antigen is sensitized is used to cause an antigen-antibody reaction with the corresponding antigen or antibody.
  • C-reactive protein can be measured by detecting this change as absorbance or sphere turbidity.
  • Specific examples of reagents for measuring the C-reactive protein include Kyowa Medix Corporation's Minaichi TCR Pexel CRP, Nitto Boseki N-Asia TIA-CRP P-H kit, and the like.
  • the M x A protein measurement method is a method for measuring the M x A protein.
  • Immunological assays include antigen-antibody reactions such as the immunoassay method, the immunoblotting method, the agglutination reaction, the complement fixation reaction, the hemolysis reaction, the sedimentation reaction, the gold colloid method, the chromatographic method, and the immunostaining method. Any method used is included.
  • the method for measuring the MxA protein preferably, the Imnoassay method is used.
  • the immunoassay method is a method of detecting or quantifying an antibody or antigen using various labeled antigens or antibodies.
  • radioimmunoassay RIA
  • enzyme immunoassay EIA or ELISA
  • fluorescent immunoassay FIA
  • luminescent immunoassay luminescent immunoassay
  • TIA TIA, LAPIA, PCIA
  • flow cytometry is provided.
  • any known fluorescent label can be used.
  • FITC fluorescent antibody method, manufactured by Soft Science
  • RITC RITC, etc.
  • an antibody or antiserum that specifically binds to the MxA protein reacts with paraffin-fixed peripheral blood lymphocytes to specifically react with the MXA protein expressed on the lymphocytes.
  • the bound antibody is reacted with an appropriate fluorescent-labeled secondary antibody, and the difference in fluorescence intensity is detected by a single-site method [WO966 / 052330, Allergy,, 895 (2001)].
  • the kit for determining a viral infection without bacterial infection comprises a reagent for measuring C-reactive protein and a reagent for measuring MXA protein.
  • the C-reactive protein measurement reagent and the MxA protein measurement reagent may be combined with independent kits, or the C-reactivity protein measurement reagent and the MxA protein measurement reagent may be used in combination. It may be included in the same kit.
  • the C-reactive protein measurement reagent and the M x A protein measurement reagent are the same.
  • the common reagent among the measurement reagents can be shared.
  • kits examples include a diluent of a biological sample, an antibody-immobilized solid phase, a reaction buffer, a washing solution, a labeled secondary antibody or its antibody fragment, and a reagent for detecting a labeled substance.
  • the kit according to the present invention may be combined with a device suitable for measurement to form a kit.
  • the configuration or form differs. However, they are also included in the kit of the present invention.
  • the C-reactive protein measurement reagent includes an antibody that reacts with the C-reactive protein, and if necessary, a diluent of a biological sample, an antibody-immobilized solid phase, a reaction buffer, a washing solution, a labeled secondary antibody or Also included are antibody fragments, reagents for detecting the label, and standard substances for C-reactive protein.
  • the antibody that reacts with the C-reactive protein is not particularly limited as long as it is an antibody that reacts with the C-reactive protein.
  • Examples thereof include commercially available anti-human C-reactive protein polyclonal antibodies such as goats, magpies, and rats.
  • Mouse anti-human C-reactive protein monoclonal antibody (SIGMA) is an example.
  • diluting liquid for the biological sample examples include an aqueous solution containing a surfactant, a buffer, and the like, and a protein such as BSA and force protein.
  • the antibody-immobilized solid phase a material obtained by immobilizing an antibody or antibody fragment that reacts with a C-reactive protein on a material obtained by shaping various polymer materials to suit the intended use is used.
  • the shape is fine particles such as tubes, beads, plates, latex, and sticks.
  • the materials are polystyrene, polycarbonate, polyvinyl toluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, nylon, polymethacrylate, gelatin, Examples include polymer materials such as agarose, cellulose, and polyethylene terephthalate, glass, ceramics, and metals.
  • Known methods for immobilizing antibodies include physical and chemical methods or a combination of these methods. Is used.
  • the reaction buffer may be an antibody immobilized on an antibody-immobilized solid phase and an antigen in a biological sample.
  • Any buffer may be used as long as it can perform a binding reaction, and examples thereof include a phosphate buffer and a good buffer.
  • a surfactant, a protein such as BSA or casein, a preservative, a stabilizer, a reaction accelerator and the like may be added.
  • washing solution examples include a phosphate buffered saline solution containing 0.05% Tween 20 (hereinafter, referred to as PBS). If necessary, buffers, surfactants, proteins such as BSA and casein, preservatives, stabilizers and the like may be added.
  • PBS phosphate buffered saline solution containing 0.05% Tween 20
  • an antibody or antibody fragment is conjugated to a labeling enzyme such as horseradish peroxidase, sea urchin small intestine alkaline phosphatase, or -galactosidase.
  • a labeling enzyme such as horseradish peroxidase, sea urchin small intestine alkaline phosphatase, or -galactosidase.
  • Antibodies or antibody fragments If necessary, a buffer, a protein such as BSA or casein, a preservative, or the like may be added to the secondary antibody or an antibody fragment thereof.
  • a substrate for absorption measurement such as tetramethylbenzidine-orthophenylenediamine, hydroxy, etc.
  • a fluorescent substrate such as phenylhydroxyphenylpropionate and hydroxyphenylacetic acid, or a luminescent substrate such as luminol is alkaline phosphatase
  • an absorbance measuring substrate such as 4-nitrophenyl phosphate or 4-methyl Fluorescent substrates such as amperiferyl phosphate are exemplified.
  • Examples of the standard substance include a C-reactive protein obtained by a genetic recombination technique or a biological sample, and a cell in which the C-reactive protein is expressed.
  • Protein assay reagents include antibodies that react with MxA protein. If necessary, diluent of biological sample, antibody-immobilized solid phase, reaction buffer, washing solution, labeled secondary antibody or its fragment, reagent for detection of labeled product, MxA protein standard Also included.
  • the antibody that reacts with the MxA protein is not particularly limited as long as it is an antibody that reacts with the MxA protein.
  • diluting solution for the biological sample examples include an aqueous solution containing a protein such as BSA or force zein in a surfactant, a buffer or the like.
  • the antibody-immobilized solid phase one obtained by immobilizing an antibody or antibody fragment that reacts with the MxA protein on a material obtained by shaping various polymer materials to suit the intended use is used.
  • Shapes include fine particles such as tubes, beads, plates, and latex, and sticks.
  • Materials include polystyrene, polycarbonate, polyvinyl toluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, nylon, polymethacrylate, gelatin, Examples include polymer materials such as agarose, cellulose, and polyethylene terephthalate, glass, ceramics, and metals.
  • a method for immobilizing the antibody a known method such as a physical method and a chemical method or a combination thereof is used. For example, a polystyrene 96-well plate for immunoassay with a hydrophobic solid phase of an antibody or the like may be mentioned.
  • the reaction buffer contained in the MxA protein measurement reagent may be any buffer as long as the antibody in the solid phase immobilized on the antibody can react with the antigen in the biological sample, such as a phosphate buffer. And good buffer solutions. If necessary, surfactants, proteins such as BSA and casein, preservatives, stabilizers, reaction accelerators and the like may be added.
  • the washing solution may be any washing solution as long as it can wash those that are not involved in the antigen-antibody reaction for MxA protein measurement, such as 1% fetal bovine serum and 0.1% ⁇ S etc. are included. Also, if necessary, buffer, surfactant, BS Proteins such as A and casein, preservatives, stabilizers and the like may be added.
  • Labeled secondary antibodies or antibody fragments thereof contained in the MXA protein assay reagent include antibodies or antibody fragments such as horseradish peroxidase, sea urchin small intestine alkaline phosphatase, and galactosidase.
  • An antibody or an antibody fragment to which a labeling enzyme is bound can be mentioned.
  • a buffer, a protein such as BSA or casein, a preservative, and the like may be added to the secondary antibody or its antibody fragment.
  • horseradish peroxidase may be used as a reagent for detecting a labeled substance, for example, an absorbance measurement substrate such as tetramethylbenzidine or orthophenylenediamine, or a hydroxyfiber.
  • an absorbance measurement substrate such as tetramethylbenzidine or orthophenylenediamine
  • the fluorescent substrate such as phenylhydroxyphenylpropionate and hydroxyphenylacetic acid
  • the luminescent substrate such as luminol
  • a substrate for measuring absorbance such as 4-nitrophenyl phosphate
  • Fluorescent substrates such as methyl-methyl umbelliferyl phosphate.
  • Examples of the standard substance include an MxA protein obtained by a genetic recombination technique or a biological sample, and a cell expressing the MxA protein.
  • biological sample used in the present invention for example, blood is used.
  • the C-reactive protein and the MxA protein are measured, and the presence or absence of the expression of the C-reactive protein and the MxA protein is determined based on the measured values to determine whether the virus is free from bacterial infection. Determine the infection.
  • the C-reactive protein is negative and the MXA protein is positive, it is determined to be a viral infection without bacterial infection.
  • the C-reactive protein is positive and the MxA protein is negative, it is determined to be a bacterial infection without virus infection. If the protein is C-reactive protein positive and MxA protein positive, it is determined to be a viral or bacterial infection. If C-reactive protein negative and M x A protein negative, it is determined to be unknown.
  • each measured value of C-reactive protein and MxA protein The criteria for positive or negative can be determined appropriately according to the measurement method. For example, when blood C-reactive protein is measured by the immunoassay method, a value of less than 1. Omg / dl can be determined as negative, and a value of 1. Omg / dl or more can be determined as positive.
  • the MxA protein is measured by the Immunoassay method, the measurement value and standard deviation of healthy subjects without viral infection are determined, and the mean + 3 SD value or more is used as positive and the value less than that is used as negative. be able to.
  • Nitto Boss N-Assy TIA-CRP-H kit was used according to the attached protocol.
  • the measured value of blood C-reactive protein was 1.0 mg / d1 as a reference value. 1.Negative for patients with less than OmgZd1 and 1. It was determined as positive.
  • MxA protein expression in lymphocytes was performed as follows. Heparin-supplemented peripheral blood 200/1 was fixed with 4% paraformaldehyde, and then red blood cells were lysed with a lysis buffer containing 0.1% Triton X-100 and lymphocyte cell membranes were lysed. Was infiltrated. Next, stain with the anti-MXA protein antibody KM1135 produced by F ERM BP-4731 or the primary antibody of the anti-mouse IgG1 antibody as a control antibody. Color is developed using the secondary antibody and analyzed using a flow cytometer. The difference between the fluorescence intensities was determined as the MxA protein value.
  • the cord blood of normal delivery was used to obtain the reference value, and for convenience, the fluorescence intensity of the mean + 3 SD or more was used as the reference value, and patients showing an average value of 3 SD or less were used for MXA protein in lymphocytes for convenience. Patients with negative expression and a mean value of +3 SD or more were judged as positive for MxA protein expression in lymphocytes.
  • Table 1 shows the results of classification of 74 patients with fever, judgment based on blood C-reactive protein level, and judgment on expression of MxA protein in lymphocyte. .
  • the combination of determination based on blood C-reactive protein level and determination based on expression of MxA protein in lymphocytes could identify the pathogenesis of a mere bacterial infection or of a patient who had been diagnosed with unknown etiology.
  • a method for determining a viral infection without bacterial infection there is provided a method for determining a viral infection without bacterial infection, and a kit used for the method.
  • the method for determining the viral infection can be carried out. No viral infection can be determined.

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Description

明 細 書
ウィルス感染症の判定方法
技術分野
本発明は、 ウィルス感染症の判定方法および該判定のためのキッ ト に関する。
背景技術
1 9 2 8年にぺニシリ ンが発見されて以来、 次々に開発 ·改良され た抗生物質により、 かなりの細菌感染症の治療は可能となった。 しか しながら、 このことは細菌感染症に限らず全ての感染症が治療できる ようになつたわけではない。 多くの感染症患者が治療を必要としてお り、 治療法選択の為の診断方法が求められている。 しかしながら、 日 常診療において細菌感染症とウィルス感染症を明確にかつ迅速に鑑別 する方法は現段階では存在しない。
これまで、細菌感染症とそれ以外の感染症の判別には、患者の症状、 末梢血白血球数や C反応性蛋白質 （C-reactive protein) 値が用いら れている。 C反応性蛋白質は、 急性相反応物質のひとつであり、 各種 の感染症の診断や経過観察のマーカーとして知られている。 健常成人 の血中 C反応性蛋白質の値は 0 . 0 6 m g Z d Lである。 血中 C反応 性蛋白質の値が、 1〜 1 0 m g / d Lの場合には中程度増加の異常と 判断され、 1 O m g Z d L以上の場合には高度増加の異常と判断され る。 中程度増加の異常と判断された場合には、 細菌感染症以外にも、 慢性関節リウマチ、 血管炎、 リウマチ熱、 悪性腫瘍、 心筋梗塞、 外傷 が疑われる。 また、 高度増加の異常と判断された場合には、 重症細菌 感染症や活動性リウマチが疑われる [臨床検査法提要、 金原出版， 500 ( 1998) ] 。
このように、 従来細菌感染症の判別に使用されている血中 C反応性 蛋白質の値の診断では、 細菌感染症を完全に判別することは困難であ る
近年、 ウィルス感染症の特異的指標として M x A蛋白質が注目され ている。 MxA蛋白質は、 ウィルス感染時に上昇する I型イン夕一フ エロン （ I FN—ひおよび I FN—；5) により、 リ ンパ球内で誘導さ れるが、 細菌感染症や慢性炎症性疾患などで産生亢進が認められる I L— 1、 I L一 6、 T N F—ひなど他の炎症性サイ ト力インの影響を 全く受けない [Eur J Immunol, 20, 2015 ( 1990) ] 。 そのため、 リン パ球内の Mx A蛋白質の発現はウィルス感染症全般を検出できるもの と考えられ、 臨床応用への可能性が報告されている （Pediatr Hes, ϋ ， 647 (1997) ] 。
医療現場には、 細菌感染症の疑いがあれば、 患者に抗生物質を使用 するという傾向がある [JAMA， 273, 213 (1995) ] 。 このような抗生 物質の使用により、 各種抗生物質に抵抗を示すメチシリ ン耐性黄色ブ ドウ球菌（MRSA)などの多剤耐性菌の出現が重大な問題となってきた。 抗生物質の適正使用は、 多剤耐性菌の出現を防止することができる だけでなく、 現在問題になっている医療費の高騰を抑えることにも貢 献できるものと期待される [Pedicatrics, 108, 1 (2001) ] 。 従つ て、 ウィルス感染症と細菌感染症を明確に判別することが重要である が、 これまでのところ判別方法は知られていない。 発明の開示
本発明の目的は、 細菌感染を伴わないウィルス感染症の判定方法お よびそれに用いる判定試薬を提供することである。
本発明は、 生体試料中の C反応性蛋白質および M X A蛋白質を測定 することを特徴とする細菌感染を伴わないウィルス感染症の判定方法 に関する。
また、 本発明は、 C反応性蛋白質測定試薬および MxA蛋白質測定 試薬からなる細菌感染を伴わないウィルス感染症を判定するためのキ ッ 卜に関する。
細菌感染を伴わないウイルス感染症を判定するためには、 C反応性 蛋白質の測定、 および MxA蛋白質の測定を行う。 C反応性蛋白質測定方法としては、 C反応性蛋白質を測定する方法 であれば特に制限はなく、 例えば C反応性蛋白質に対する抗体を用い て測定する免疫学的測定方法があげられる。 免疫学的測定方法として は、 ィムノアヅセィ法、 ィムノブロッテイ ング法、 凝集反応、 補体結 合反応、 溶血反応、 沈降反応、 金コロイ ド法、 クロマ トグラフィ一法、 免疫染色法等の抗原抗体反応を利用した方法であればいかなるものも 包含されるが、 好ましくはィムノアッセィ法があげられる。
ィムノアツセィ法は、 各種標識を施した抗原または抗体を用いて、 抗体または抗原を検出或いは定量する方法であり、 抗原または抗体の 標識方法に応じて、 放射免疫検出法 （MA)、 酵素免疫検出法 （EIAまた は EL ISA)、 蛍光免疫検出法 （F IA)、 発光免疫検出法 （luminescent immunoassay), 物理化学的検出法 （TIA， LAPIA, PCIA)、 フローサイ ト メ ト リーなどがあげられる。 C反応性蛋白質測定方法としては、 好ま しくは物理化学的検出法があげられる。
具体的には、 C反応性蛋白質と特異的に結合する抗体もしくは抗血 清を用いて、 抗原である C反応性蛋白質と抗体、 もしくは抗血清とを 結合させることにより凝集体を形成させて、 この凝集体を検出するこ とにより行う。 この他に物理化学的検出法としては、 毛細管法、 一次 元免疫拡散法、 免疫比濁法あるいはラテツクス免疫比濁法等で測定す る方法があげられる [臨床検査法提要、 金原出版， 499 ( 1998) ] 。 例えば、 ラテックス免疫比濁法では、 抗体または抗原を感作させた 粒径 0 . 1〜 1 m程度のポリスチレンラテツクス等の担体を用い、 対 応する抗原あるいは抗体により抗原抗体反応を起こさせると、 反応液 中の散乱光は増加し、 透過光は減少する。 この変化を吸光度あるいは 積分球濁度として検出することにより C反応性蛋白質を測定すること ができる。 具体的な C反応性蛋白質の測定試薬としては、 協和メデッ クス社のデ夕ミナ一 T C R Pゃェクステル C R P、 日東紡社の N— ァヅセィ T I A— C R P— Hキヅ ト等をあげることができる。
M x A蛋白質測定方法としては、 M x A蛋白質を測定する方法であ れば特に制限はなく、 例えば M x A蛋白質に対する抗体を用いて測定 する免疫学的測定方法があげられる。 免疫学的測定方法としては、 ィ ムノアッセィ法、 ィムノブロッティ ング法、 凝集反応、補体結合反応、 溶血反応、 沈降反応、 金コロイ ド法、 クロマ トグラフィ一法、 免疫染 色法等の抗原抗体反応を利用した方法であればいかなるものも包含さ れる。 M x A蛋白質測定方法としては、 好ましくはィムノアツセィ法 があげられる。
ィムノアツセィ法は、 各種標識を施した抗原または抗体を用いて、 抗体または抗原を検出或いは定量する方法であり、 抗原または抗体の 標識方法に応じて、 放射免疫検出法 （RIA)、 酵素免疫検出法 （EIAまた は ELI SA)、 蛍光免疫検出法 （F IA)、 発光免疫検出法 （luminescent immunoassay), 物理化学的検出法 （TIA, LAPIA, PC IA)、 フローサイ ト メ ト リーなどがあげられるが、 好ましくはフローサイ トメ ト リーがあ げられる。
フローサイ トメ ト リーで用いる蛍光標識体としては、任意の公知（川 生明著、 蛍光抗体法、 ソフ トサイエンス社製） の蛍光標識体を用いる ことができる。 例えば、. F ITC、 RITC等を用いることができる。
具体的には、 M x A蛋白質と特異的に結合する抗体もしくは抗血清 と、 パラフィ ン固定を施した末梢血リンパ球とを反応させて、 リンパ 球に発現している M X A蛋白質に特異的に結合した抗体を蛍光標識化 された適当な二次抗体と反応させ、 蛍光強度の違いをフ口一サイ トメ ト リ一により検出する [ W O 9 6 / 0 5 2 3 0、 Al lergy, ， 895 ( 2001 ) ] 。
本発明の細菌感染を伴わないウィルス感染症を判定するためのキッ トは、 C反応性蛋白質測定試薬および M X A蛋白質測定試薬からなる。 本発明のキッ トとしては、 C反応性蛋白質測定試薬と M x A蛋白質測 定試薬が各々独立したキッ トを組み合わせてもよいし、 C反応性蛋白 質測定試薬と M x A蛋白質測定試薬を同一のキッ トに含めたものでも よい。 また、 C反応性蛋白質測定試薬と M x A蛋白質測定試薬を同一 のキッ トに含めたものにおいて、 各々の測定試薬のうち共通する試薬 は共用することができる。 共通する試薬としては、 例えば、 生体試料 の希釈液、 抗体固定化固相、 反応緩衝液、 洗浄液、 標識された二次抗 体またはその抗体断片、 標識体の検出用試薬等があげられる。 また本 発明のキヅ トに、 測定に適した機器を組み合わせて、 キヅ トとしても よい。
以下に述べる C反応性蛋白質測定試薬または M x A蛋白質測定試薬 の各構成要素と本質的に同一、 またはその一部と本質的に同一な物質 が含まれていれば、 構成または形態が異なっていても、 本発明のキッ トに包含される。
C反応性蛋白質測定試薬としては、 C反応性蛋白質に反応する抗体 を含み、 また必要に応じ、 生体試料の希釈液、 抗体固定化固相、 反応 緩衝液、 洗浄液、 標識された二次抗体またはその抗体断片、 標識体の 検出用試薬、 C反応性蛋白質の標準物質なども含まれる。
C反応性蛋白質に反応する抗体としては、 C反応性蛋白質に反応す る抗体であれば特に制限がなく、 例えば市販のャギ、 ゥサギ、 ラッ ト 等の抗ヒ ト C反応性蛋白質ポリクローナル抗体やマウス抗ヒ ト C反応 性蛋白質モノクロ一ナル抗体 （ S I G M A社） があげられる。
生体試料の希釈液としては、 界面活性剤、 緩衝剤などに B S Aや力 ゼィンなどの夕ンパク質を含む水溶液などがあげられる。
抗体固定化固相としては、 各種高分子素材を用途に合うように整形 した素材に、 C反応性蛋白質の反応する抗体または抗体断片を固相化 したものが用いられる。 形状としてはチューブ、 ビーズ、 プレート、 ラテツクスなどの微粒子、 ステイ ツク等が、 素材としてはポリスチレ ン、 ポリカーボネート、 ポリ ビニルトルエン、 ポリプロピレン、 ポリ エチレン、 ポリ塩化ビニル、 ナイ ロン、 ポリメタク リ レート、 ゼラチ ン、 ァガロース、 セルロース、 ポリエチレンテレフ夕レート等の高分 子素材、 ガラス、 セラミ ックスや金属等があげられる。 抗体の固相化 の方法としては物理的方法と化学的方法またはこれらの併用等、 公知 の方法が用いられる。 例えば、 ポリスチレン製 9 6ゥエルの免疫測定 用マイクロ夕一プレー トに抗体等を疎水固相化したものがあげられる, 反応緩衝液としては、 抗体固定化固相の抗体と生体試料中の抗原と が結合反応をすることができればいかなる緩衝液であつてもよく、 例 えば、 リ ン酸緩衝液やグッ ドの緩衝液等があげられる。 また、 必要に 応じて、 界面活性剤、 B S Aやカゼイ ンなどの蛋白質、 防腐剤、 安定 化剤、 反応促進剤等を添加してもよい。
洗浄液としては、 例えば、 0 . 0 5 %の T w e e n 2 0を含むリン 酸緩衝液生理食塩水 （以下: P B Sと表す） 等があげられる。 また、 必 要に応じて、 緩衝剤、 界面活性剤、 B S Aやカゼインなどの蛋白質、 防腐剤、 安定化剤等を添加してもよい。
標識された二次抗体またはその抗体断片としては、 抗体または抗体 断片に西洋ヮサビペルォキシダ一ゼ、 ゥシ小腸アル力リホスファ夕ー ゼ、 ?—ガラク トシダ一ゼなどの標識用酵素を結合した抗体または抗 体断片があげられる。 該二次抗体またはその抗体断片には、 必要に応 じて、 緩衝剤、 B S Aやカゼインなど 0タンパク質、 防腐剤などを添 加してもよい。
標識体の検出用試薬としては前記の標識用酵素に応じて、 例えば西 洋ヮサビペルォキシダ一ゼであれば、 テ トラメチルベンジジンゃオル トフェニレンジアミンなどの吸光測定用基質、 ヒ ドロキシフェニルヒ ドロキシフヱニルプロピオン酸ゃヒ ドロキシフエニル酢酸などの蛍光 基質、 ルミノールなどの発光基質が、 アルカリホスファタ一ゼであれ ば、 4—ニトロフエニルフォスフェートなどの吸光度測定用基質、 4 —メチルゥンペリフェリルフォスフェートなどの蛍光基質等があげら れる。
標準物質としては、 遺伝子組換え技術により取得された、 あるいは 生体試料から取得された C反応性蛋 ή質や、 C反応性蛋白質が発現し ている細胞等があげられる。
Μ χ Α蛋白質測定試薬としては、 M x A蛋白質に反応する抗体を含 み、 必要に応じて、 生体試料の希釈液、 抗体固定化固相、 反応緩衝液、 洗浄液、 標識された二次抗体またはその抗体断片、 標識体の検出用試 薬、 Mx A蛋白質の標準物質なども含まれる。
Mx A蛋白質に反応する抗体としては、 Mx A蛋白質に反応する抗 体であれば特に制限がなく、 例えばハイプリ ドーマ細胞 F ERM B P— 47 3 1により生産される抗 Mx A蛋白質抗体 KM 1 1 3 5 (W 09 6ノ 0523 0) があげられる。
生体試料の希釈液としては、 界面活性剤、 緩衝剤などに B S Aや力 ゼインなどのタンパク質を含む水溶液などがあげられる。
抗体固定化固相としては、 各種高分子素材を用途に合うように整形 した素材に、 Mx A蛋白質の反応する抗体または抗体断片を固相化し たものが用いられる。 形状としてはチューブ、 ビーズ、 プレート、 ラ テックスなどの微粒子、スティ ック等が、素材としてはポリスチレン、 ポリカーボネート、 ポリ ビニル トルエン、 ポリプロピレン、 ポリェチ レン、 ポリ塩化ビニル、 ナイロン、 ポリメタク リ レー ト、 ゼラチン、 ァガロース、 セルロース、 ポリエチレンテレフ夕レート等の高分子素 材、 ガラス、 セラミ ツクスゃ金属等があげられる。 抗体の固相化の方 法としては物理的方法と化学的方法またはこれらの併用等、 公知の方 法が用いられる。 例えば、 ポリスチレン製 9 6ゥエルの免疫測定用マ イク口夕一プレートに抗体等を疎水固相化したものがあげられる。
Mx A蛋白質測定試薬に含まれる反応緩衝液は、 抗体固定化固相の 抗体と生体試料中の抗原とが結合反応をすることができればいかなる 緩衝液であってもよく、 例えば、 リン酸緩衝液やグッ ドの緩衝液等が あげられる。 また、 必要に応じて、 界面活性剤、 B S Aやカゼイ ンな どの蛋白質、 防腐剤、 安定化剤、 反応促進剤等を添加してもよい。 洗浄液としては、 Mx A蛋百質測定のための抗原抗体反応に関与し ていないものを洗浄することができればいかなる洗浄液であってもよ く、 例えば 1 %の牛胎児血清並びに、 0. 1 %のァザイ ドを含む ΡΒ S等があげられる。 また、 必要に応じて、 緩衝剤、 界面活性剤、 B S Aやカゼインなどの蛋白質、 防腐剤、 安定化剤等を添加してもよい。
M X A蛋白質測定試薬に含まれる標識された二次抗体またはその抗 体断片としては、抗体または抗体断片に西洋ヮサビペルォキシダ一ゼ、 ゥシ小腸アル力リホスファ夕ーゼ、 —ガラク トシダーゼなどの標識 用酵素を結合した抗体または抗体断片があげられる。 該二次抗体また はその抗体断片には、 必要に応じて、 緩衝剤、 B S Aやカゼインなど のタンパク質、 防腐剤などを添加してもよい。
標識体の検出用試薬としては前記の標識用酵素に応じて、 例えば西 洋ヮサビペルォキシダ一ゼであれば、 テトラメチルベンジジンやオル トフヱ二レンジァミ ンなどの吸光測定用基質、 ヒ ドロキシフヱニルヒ ドロキシフェニルプロピオン酸ゃヒ ドロキシフェニル酢酸などの蛍光 基質、 ルミノールなどの発光基質が、 アルカリホスファタ一ゼであれ ば、 4—ニトロフエニルフォスフェートなどの吸光度測定用基質、 4 ーメチルゥンベリフェリルフォスフェートなどの蛍光基質等があげら れる。
標準物質としては、 遺伝子組換え技術により取得された、 あるいは 生体試料から取得された M x A蛋白質や、 M x A蛋白質が発現してい る細胞等があげられる。
本発明に用いる生体試料としては、 例えば血液が用いられる。
本発明においては、 C反応性蛋白質と M x A蛋白質を測定し、 その 測定された各値から、 C反応性蛋白質と M x A蛋白質の発現の有無を 判断して、 細菌感染を伴わないウィルス感染症を判定する。
この場合、 C反応性蛋白質陰性かつ M X A蛋白質陽性の場合には細 菌感染を伴わないウィルス感染症と判定される。 また、 C反応性蛋白 質陽性かつ M x A蛋白質陰性の場合にはウィルス感染を伴わない細菌 感染症と判定される。 C反応性蛋白質陽性かつ M x A蛋白質陽性の場 合ウィルス感染症および細菌感染症と判定される。 C反応性蛋白質陰 性かつ M x A蛋白質陰性の場合は不明と判定される。
本発明において、 C反応性蛋白質と M x A蛋白質の測定された各値 の陽性または陰性の基準は、 測定方法により適宜決定することができ る。 例えば、 血中 C反応性蛋白質をィムノアッセィ法で測定した場合 には、 1. O mg/d l未満を陰性、 1. Omg/d l以上を陽性と して判定に使用することができる。 また、 MxA蛋白質をィムノアツ セィ法で測定した場合は、 ゥィルス感染が認められない健常者の測定 値と標準偏差を求め、 平均値 + 3 S D値以上を陽性としてそれ未満を 陰性として判定に使用することができる。
以下に具体的な実施例をあげる。
発明を実施するための最良の形態
実施例 1
何らかの感染症を疑われて各種検査のために採血された者 74名 （ 0力月〜 1 5歳） の末梢血を用いて、 以下の測定を行った。
採血された末梢血を血中 C反応性蛋白質値、 その他の一般検査用に は血清提出用スピッヅ管に、 またリンパ球内の Mx A蛋白質測定用に はへパリン N a入りスピッヅ管に直ちに注入し、 当日中に処理を行な つた。
血中 C反応性蛋白質値の測定には、 日東紡社の N—アツセィ T I A — CRP— Hキヅ トを使用し、 添付のプロ トコ一ルに従つた。 血中 C 反応性蛋白質の測定値は、 1. 0 mg/d 1を基準値とし、 1. O m gZd 1未満であった患者を陰性、 1. Omg/d 1以上であった患 者を陽性として判定した。
リンパ球内の Mx A蛋白質の発現の解析は、 以下のように行った。 へパリン加採血した末梢血 2 00 / 1を 4 %パラホルムアルデヒ ド にて固定し、 その後、 0. 1 %ト リ トン X— 1 00を含むリシス緩衝 液にて赤血球を溶血させると共にリンパ球細胞膜を浸透化した。次に、 ハイプリ ドーマ細胞; F ERM B P— 473 1により生産される抗 M X A蛋白質抗体 KM 1 1 3 5、 あるいはコントロール抗体として抗マ ウス I g G 1抗体の 1次抗体で染色し、 洗浄後に 2次抗体を用いて発 色させ、 フローサイ 卜メーターにて解析を行ない、 コン ト ロール抗体 との蛍光強度の差を Mx A蛋白質値とした。 なお、 基準値を得るため に正常分娩の臍帯血を用い、 便宜上その平均値 + 3 S D以上の蛍光強 度を基準値とし、 平均値 + 3 S D以下を示した患者をリンパ球内の M X A蛋白質発現が陰性、 平均値 + 3 S D以上を示した患者をリンパ球 内の Mx A蛋白質発現が陽性として判定した。
発熱の有無は、 採血日の最高体温が 3 7. 5 °C以上であった患者を 発熱有り、 3 7. 5 °C未満であった患者を発熱無しとした。
これらの患者 7 4名を、 発熱の有無による判定、 血中 C反応性蛋白 質値での判定、 並びにリ ンパ球内 Mx A蛋白質の発現での判定により 分類した結果を第 1表に示した。 第 1表
発熱あり 発熱なし 患者数合計 48 2 6
3 1 6 血中 c反応性蛋白質値 （陽性）
( 64. 6 %) ( 2 3. 1 %)
33 1 6 , リ ンパ球内 Mx A蛋白質の発現 （陽性）
( 6 8. 8 ) ( 6 1 . 5 %) 血中 C反応性蛋白質値での判定で陽性となった患者は、 発熱がある 場合には 6 4. 6 %で、 発熱がない場合には 2 3. 1 %となった。 一 方、 リンパ球内 Mx A蛋白質の発現での判定で陽性となった患者は、 発熱がある場合には 6 8. 8 %で、 発熱がない場合には 6 1. 5 %と なった。 従って、 血中 C反応性蛋白質値の陽性判定とリンパ球内 Mx A蛋白質の発現での陽性判定は独立した判定基準に起因する判定であ り、 両者を組み合わせることでより多くの情報が得られる可能性が示 された。
実際、 血中 C反応性蛋白質値での判定とリンパ球内 Mx A蛋白質の 発現での判定を組み合わせて Ί 4名の患者を解析した場合、 これまで は単なる細菌感染症や、 あるいは病因不明であると診断されていた患 者の病因を特定できる場合があつた。
発熱があり、 血中 C反応性蛋白質値での判定で陽性となつた患者は、 3 1名おり、 これまでは単に細菌感染症と判定されていた。 この 3 1 名の患者に対して、 リンパ球内 M x A蛋白質の発現での判定を組み合 わせたところ、 リンパ球内 M x A蛋白質の発現が陽性となった患者は 1 9名であった。 これら 1 9名の患者の中には喘息発作 5例とウィル ス性咽頭炎と考えられる 5例が含まれており、 ウィルス感染症とも考 えられる患者の存在が明らかとなった。 このことは、 単に発熱があつ て血中 C反応性蛋白質値での判定が陽性であれば細菌性感染症である という従来の判定方法よりも、 本発明の判定方法が優れた方法である ことを示している。
また、 発熱があっても血中 C反応性蛋白質値での判定で陰性と判定 された 1 7名の患者は、 これまでは原因不明と判定されていた。 これ ら 1 7名の患者に、 リンパ球内 M x A蛋白質の発現での判定を組み合 わせたところ、 リンパ球内 M x A蛋白質の発現での判定で陽性となる 患者は 1 4名であった。実際、 この 1 4名のなかには、 喘息発作 4例、 ウィルス性胃腸炎 （疑い） 2例、 ウィルス性脳炎 （疑い） 2例の症例 が含まれていた。
発熱が無く、 血中 C反応性蛋白質値での判定では陰性となり細菌感 染症とは判定されない患者は 2 0名であった。 これら 2 0名の患者に 対して、 リンパ球内 M x A蛋白質の発現による判定を組み合わせた場 合、 1 4名の患者がリンパ球内 M x A蛋白質の発現での判定で陽性と なった。
実際、これら 1 4名のうち、 5名の患者にウィルス感染が確認され、 その内訳は、 4名が: R Sウィルス感染症、 1名が先天性サイ トメガロ ウイルス感染症であることが確認された。
従って、 血中 C反応性蛋白質値での判定が陰性となり、 これまでは 病因は不明が不明となる場合でも、 リ ンパ球内 M x A蛋白質の発現に よる判定を組み合わせることで、 容易にウィルス感染症の判定を行う ことができ、 治療方針を迅速に判断することができることが明らかと なった。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 細菌感染を伴わないウィルス感染症を判定する方 法、 およびそれに使用されるキッ トが提供される。
本発明の細菌感染を伴わないゥィルス感染症を判定する方法、 およ びそれに使用されるキッ トを用いて、 C反応性蛋白質と M x A蛋白質 を同時に解析することによって、 細菌感染症を伴わないウィルス感染 症の判定を行うことができる。

Claims

請求の範囲
1 . 生体試料中の M x A蛋白質および C反応性蛋白質を測定する ことを特徴とする細菌感染を伴わないウィルス感染症の判定方法。
2. M x A蛋白質測定試薬および C反応性蛋白質測定試薬からな る、 細菌感染を伴わないウィルス感染症を判定するためのキッ ト。
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