CN108445233A - 一种抗病毒蛋白MxA诊断试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗病毒蛋白MxA诊断试剂盒及其制备方法,其特征是运用量子点技术、微球技术、中频超声技术、悬浮技术、封闭技术、标记技术,制备了一种MxA诊断试剂盒,适用范围宽、可用于临床、操作简单、精密度高、检测用时较短、灵敏度高、有效期长、成本低廉、作用安全,取得了满意效果。
Description
技术领域
本发明涉及诊断试剂盒制备领域,具体涉及一种抗病毒蛋白MxA诊断试剂盒及其制备方法。
背景技术
MxA是由干扰素(IFN)诱导产生的一种78kD抗病毒蛋白,是区分机体是否受到病毒感染亦或细菌感染的特异性指标,同时也是评价干扰素治疗效果的重要标准。快速检测机体MxA水平对于疾病诊断、合理用药、评价疗效具有重要意义。现有的MxA诊断试剂盒多为酶联免疫法,存在适用范围窄、不可用于临床、操作复杂、精密度低、耗时较长、灵敏度低、有效期短、成本高、作用不安全等不足。本发明依据多年诊断试剂盒研发经验,综合运用量子点技术、微球技术、中频超声技术、悬浮技术、封闭技术、标记技术,提供了一种MxA诊断试剂盒制备方案,适用范围宽、可用于临床、操作简单、精密度高、用时较短、灵敏度高、有效期长、成本低廉、作用安全,取得了满意效果。
发明内容
本发明提供一种MxA诊断试剂盒及其制备方法。
发明实施方案如下:
量子点荧光微球混悬液的制备:
取4ml浓度为5mg/ml的 CdSe/ZnS量子点甲苯溶液,13000转离心10 分钟,弃去上清液,得沉淀,加入含120mg聚甲基丙烯酸甲酯和80mg聚马来酸酐十八醇酯的三氯甲烷液2ml,加入浓度为3mg/ml的十二烷基磺酸钠水溶液5ml,混合10~20分钟,置超声反应器中,选择频率25kHz超声匀质2分钟,得乳液,室温100转旋蒸4小时,除去三氯甲烷,剩余液体10000转离心10分钟,得沉淀,用5ml注射用水10000转离心10分钟洗涤两次,加0.2%叠氮钠水溶液2ml,置超声反应器中,选择频率45kHz超声1~2分钟,得浓度为10mg/ml的量子点荧光微球混悬液,2℃~8℃ 贮藏;
量子点荧光微球标记探针的制备:
取0.1ml浓度为10mg/ml的量子点荧光微球混悬液,4℃10000转离心10分钟,得沉淀,加入1ml浓度为10mMol、pH值为6.5的磷酸缓冲液使悬浮,加入150μg碳二亚胺,混合10~20分钟,加入100μgN-羟基琥珀酰亚胺,混合10~20分钟,室温反应40分钟,4℃10000转离心10分钟,得沉淀,加入1ml浓度为10mMol、pH值为6.5的磷酸缓冲液使悬浮,加入100μg的抗MxA单克隆标记抗体,混合10~20分钟,室温搅拌反应60分钟,4℃10000转离心10分钟,得沉淀,加入1ml含0.5%牛血清白蛋白,20mMol乙醇胺的浓度为10mMol、pH值为7.5的磷酸缓冲液使悬浮,混合10~20分钟,室温旋蒸反应2小时,4℃10000转离心10分钟,得沉淀,置超声反应器中,加入0.1ml浓度为10mMol、pH值为6.5的磷酸缓冲液,选择频率45kHz超声1分钟,使悬浮,2℃~8℃贮藏,得量子点荧光微球标记探针;
NC膜的喷涂划线:
将浓度为0.5mg/ml的羊抗鼠二抗以1μl/mm的喷量喷涂于NC膜的质控线,将浓度为1mg/ml的鼠抗人MxA单克隆包被抗体以1μl/mm的喷量喷涂于NC膜的检测线,质控线与检测线相距4mm,37℃ 干燥12小时,得喷涂后的NC膜;
量子点荧光微球标记垫的制备:
取量子点荧光微球标记探针,10000转离心10分钟,得沉淀,置超声反应器中,加入0.1ml含5%蔗糖,1%牛血清白蛋白,0.5%吐温-20,1%聚乙二醇2000,浓度为10mMol、pH值为7.4的磷酸缓冲液,选择频率60kHz超声1分钟,使悬浮,以5μl/cm的喷量喷涂于标记垫上,37℃ 干燥12小时,得量子点荧光微球标记垫;
样品垫的处理:
样品垫加入5ml含1%牛血清白蛋白,0.3%吐温-20,浓度为10mMol, pH值为7.4的磷酸缓冲液室温浸泡2小时,37℃ 干燥12小时,得样品垫;
试剂盒组装:
将样品垫、标记垫、NC膜和吸水纸在PVC底板上顺次相互搭接粘贴,然后裁切成4mm宽的试纸条,压入塑料卡克,得MxA诊断试剂盒。
本发明方案中所涉及的术语如无特殊说明,均以国家技术质量监督管理局、中国药典、国家食品药品监督管理局颁布的标准和相关规范解释为准。
上述发明方案中所述的浓度如没有单位说明,均指质量浓度。
上述发明方案中设备的功率选择根据所生产样品量的大小确定,按生产厂家设备说明书规定即可实现本发明。
上述实施方案所提到的物质名称如下:
MxA:人体内由干扰素(IFN)诱导产生的一种78kD抗病毒蛋白;
CdSe/ZnS量子点:油溶性量子点,CdSe 为核心,ZnS为壳层,直径200nm,激发波长380~450nm,发射波长520nm,微球表面羧基化,量子产率QY50%~90%:
本发明量子点购自Ocean Nanotech.公司;
蔗糖:CAS号: 57-50-1;
吐温-20:CAS号:9005-64-5;
甲苯:CAS号:108-88-3;
聚甲基丙烯酸甲酯:CAS号:9010-88-2;
聚马来酸酐十八醇酯:CAS号:108-31-6;
三氯甲烷:CAS号:67-66-3 ;
十二烷基磺酸钠:CAS号:2386-53-0;
叠氮钠:CAS号:26628-22-8;
碳二亚胺:CAS号: 25952-53-8;
1N-羟基琥珀酰亚胺:CAS号:6066-82-6;
牛血清白蛋白:CAS号:9048-46-8;
乙醇胺:CAS号:141-43-5;
PEG2000:CAS号:25322-68-3;
注射用水:中国药典2015年版二部;
NC膜:Sartorius CN95:上海杰一生物技术有限公司;
标记垫:聚酯纤维素膜ZCJ1:上海杰一生物技术有限公司;
样品垫:玻璃纤维素薄膜GF2-II:上海杰一生物技术有限公司;
吸水纸:H5076:上海杰一生物技术有限公司;
底板:荧光专用底板DB-4:上海杰一生物技术有限公司;
鼠抗人MxA单克隆包被抗体:上海将来实业股份有限公司;
鼠抗人MxA单克隆标记抗体:上海将来实业股份有限公司;
羊抗鼠二抗:上海华葵金配生物科技有限公司;
以上MxA诊断试剂盒所用到的物质无特殊要求,市场均有销售,只要满足质量标准均可用来实施本发明。
上述实施方案所提到的关键设备如下:
台式高速冷冻离心机:型号:TGL-16K:湖南湘仪离心机仪器有限公司;
XYZ三维划膜喷金仪: 型号:HM3030:上海金标生物科技有限公司;
量子点荧光微球检测读卡器:型号:JBD-001:安徽金标点生物技术有限公司;
超声反应仪:型号:XO-SM:南京先欧仪器制造有限公司;
以上MxA诊断试剂盒所用到的设备无特殊要求,市场均有销售,只要满足参数范围均可用来实施本发明。
四 具体实施方式
本发明的具体实施例1
取4ml浓度为5mg/ml的 CdSe/ZnS量子点甲苯溶液,13000转离心10 分钟,弃去上清液,得沉淀,加入含120mg聚甲基丙烯酸甲酯和80mg聚马来酸酐十八醇酯的三氯甲烷液2ml,加入浓度为3mg/ml的十二烷基磺酸钠水溶液5ml,混合10分钟,置超声反应器中,选择频率25kHz超声匀质2分钟,得乳液,室温100转旋蒸4小时,除去三氯甲烷,剩余液体10000转离心10分钟,得沉淀,用5ml注射用水10000转离心10分钟洗涤两次,加0.2%叠氮钠水溶液2ml,置超声反应器中,选择频率45kHz超声1分钟,得浓度为10mg/ml的量子点荧光微球混悬液,2℃贮藏;
取0.1ml浓度为10mg/ml的量子点荧光微球混悬液,4℃10000转离心10分钟,得沉淀,加入1ml浓度为10mMol,pH值为6.5的磷酸缓冲液使悬浮,加入150μg碳二亚胺,混合10分钟,加入100μgN-羟基琥珀酰亚胺,混合10分钟,室温反应40分钟,4℃10000转离心10分钟,得沉淀,加入1ml浓度为10mMol,pH值为6.5的磷酸缓冲液使悬浮,加入100μg的抗MxA单克隆标记抗体,混合10分钟,室温搅拌反应60分钟,4℃10000转离心10分钟,得沉淀,加入1ml含0.5%牛血清白蛋白,20mMol乙醇胺的浓度为10mMol、pH值为7.5的磷酸缓冲液使悬浮,混合10分钟,室温旋蒸反应2小时,4℃10000转离心10分钟,得沉淀,置超声反应器中,加入0.1ml浓度为10mMol,pH值为6.5的磷酸缓冲液,选择频率45kHz超声1分钟,使悬浮,2℃贮藏,得量子点荧光微球标记探针;
将浓度为0.5mg/ml的羊抗鼠二抗以1μl/mm的喷量喷涂于NC膜的质控线,将浓度为1mg/ml的鼠抗人MxA单克隆包被抗体以1μl/mm的喷量喷涂于NC膜的检测线,质控线与检测线相距4mm,37℃ 干燥12小时,得喷涂后的NC膜;
取量子点荧光微球标记探针,10000转离心10分钟,得沉淀,置超声反应器中,加入0.1ml含5%蔗糖,1%牛血清白蛋白,0.5%吐温-20,1%聚乙二醇2000,浓度为10mMol、pH值为7.4的磷酸缓冲液,选择频率60kHz超声1分钟,使悬浮,以5μl/cm的喷量喷涂于标记垫上,37℃ 干燥12小时,得量子点荧光微球标记垫;
样品垫加入5ml含1%牛血清白蛋白,0.3%吐温-20,浓度为10mMol, pH值为7.4的磷酸缓冲液室温浸泡2小时,37℃ 干燥12小时,得样品垫;
将样品垫、标记垫、NC膜和吸水纸在PVC底板上顺次相互搭接粘贴,然后裁切成4mm宽的试纸条,压入塑料卡克,得MxA诊断试剂盒。
本发明的具体实施例2
取4ml浓度为5mg/ml的 CdSe/ZnS量子点甲苯溶液,13000转离心10 分钟,弃去上清液,得沉淀,加入含120mg聚甲基丙烯酸甲酯和80mg聚马来酸酐十八醇酯的三氯甲烷液2ml,加入浓度为3mg/ml的十二烷基磺酸钠水溶液5ml,混合20分钟,置超声反应器中,选择频率25kHz超声匀质2分钟,得乳液,室温100转旋蒸4小时,除去三氯甲烷,剩余液体10000转离心10分钟,得沉淀,用5ml注射用水10000转离心10分钟洗涤两次,加0.2%叠氮钠水溶液2ml,置超声反应器中,选择频率45kHz超声2分钟,得浓度为10mg/ml的量子点荧光微球混悬液,8℃贮藏;
取0.1ml浓度为10mg/ml的量子点荧光微球混悬液,4℃10000转离心10分钟,得沉淀,加入1ml浓度为10mMol,pH值为6.5的磷酸缓冲液使悬浮,加入150μg碳二亚胺,混合20分钟,加入100μgN-羟基琥珀酰亚胺,混合20分钟,室温反应40分钟,4℃10000转离心10分钟,得沉淀,加入1ml浓度为10mMol,pH值为6.5的磷酸缓冲液使悬浮,加入100μg的抗MxA单克隆标记抗体,混合20分钟,室温搅拌反应60分钟,4℃10000转离心10分钟,得沉淀,加入1ml含0.5%牛血清白蛋白,20mMol乙醇胺的浓度为10mMol、pH值为7.5的磷酸缓冲液使悬浮,混合20分钟,室温旋蒸反应2小时,4℃10000转离心10分钟,得沉淀,置超声反应器中,加入0.1ml浓度为10mMol,pH值为6.5的磷酸缓冲液,选择频率45kHz超声1分钟,使悬浮,8℃贮藏,得量子点荧光微球标记探针;
将浓度为0.5mg/ml的羊抗鼠二抗以1μl/mm的喷量喷涂于NC膜的质控线,将浓度为1mg/ml的鼠抗人MxA单克隆包被抗体以1μl/mm的喷量喷涂于NC膜的检测线,质控线与检测线相距4mm,37℃ 干燥12小时,得喷涂后的NC膜;
取量子点荧光微球标记探针,10000转离心10分钟,得沉淀,置超声反应器中,加入0.1ml含5%蔗糖,1%牛血清白蛋白,0.5%吐温-20,1%聚乙二醇2000,浓度为10mMol、pH值为7.4的磷酸缓冲液,选择频率60kHz超声1分钟,使悬浮,以5μl/cm的喷量喷涂于标记垫上,37℃ 干燥12小时,得量子点荧光微球标记垫;
样品垫加入5ml含1%牛血清白蛋白,0.3%吐温-20,浓度为10mMol, pH值为7.4的磷酸缓冲液室温浸泡2小时,37℃ 干燥12小时,得样品垫;
将样品垫、标记垫、NC膜和吸水纸在PVC底板上顺次相互搭接粘贴,然后裁切成4mm宽的试纸条,压入塑料卡克,得MxA诊断试剂盒。
以上实施例说明,采用本发明实施方案的极端条件均能制成MxA诊断试剂盒。
下面以实施例1制得的MxA诊断试剂盒来考察本发明的实际效果:
1 本发明方案制备的MxA诊断试剂盒与采用现有技术方法制备的MxA诊断试剂盒检测周期对比。
表1检测周期对比表
上述结果表明, 本发明制备MxA诊断试剂盒比采用现有技术方法制备MxA诊断试剂盒检测周期显著缩短。
2 本发明方案制备MxA诊断试剂盒与采用现有技术方法制备MxA诊断试剂盒生产成本对比。
表2 生产成本对比表
上述结果表明, 本发明制备MxA诊断试剂盒比采用现有技术方法制备MxA诊断试剂盒生产成本显著降低。
3本发明方案制备MxA诊断试剂盒与采用现有技术方法制备MxA诊断试剂盒灵敏度对比。
表3 灵敏度对比表
上述结果表明, 本发明制备MxA诊断试剂盒比采用现有技术方法制备MxA诊断试剂盒灵敏度显著提高。
4 本发明方案制备MxA诊断试剂盒与采用现有技术制备MxA诊断试剂盒有效期对比。
表4 有效期对比表
上述结果表明, 本发明制备MxA诊断试剂盒比采用现有技术制备MxA诊断试剂盒有效期限显著延长,稳定性增加。
5 本发明方案制备MxA诊断试剂盒与采用现有技术制备MxA诊断试剂盒安全性对比。
表5 安全性对比表
上述结果表明, 本发明制备MxA诊断试剂盒比采用现有技术制备MxA诊断试剂盒安全可靠。
6 本发明方案制备MxA诊断试剂盒与采用现有技术制备MxA诊断试剂盒精密度对比。
表6 精密度对比表
上述结果表明, 本发明制备MxA诊断试剂盒比采用现有技术制备MxA诊断试剂盒精密度显著增加。
7 本发明方案制备MxA诊断试剂盒与采用现有技术制备MxA诊断试剂盒适用范围对比。
表7 适用范围对比表
上述结果表明, 本发明制备MxA诊断试剂盒比采用现有技术制备MxA诊断试剂盒适用范围更广泛。
Claims (2)
1.一种抗病毒蛋白MxA诊断试剂盒,其特征是按如下方法制备:
量子点荧光微球混悬液的制备:
取4ml浓度为5mg/ml的 CdSe/ZnS量子点甲苯溶液,13000转离心10 分钟,弃去上清液,得沉淀,加入含120mg聚甲基丙烯酸甲酯和80mg聚马来酸酐十八醇酯的三氯甲烷液2ml,加入浓度为3mg/ml的十二烷基磺酸钠水溶液5ml,混合10~20分钟,置超声反应器中,选择频率25kHz超声匀质2分钟,得乳液,室温100转旋蒸4小时,除去三氯甲烷,剩余液体10000转离心10分钟,得沉淀,用5ml注射用水10000转离心10分钟洗涤两次,加0.2%叠氮钠水溶液2ml,置超声反应器中,选择频率45kHz超声1~2分钟,得浓度为10mg/ml的量子点荧光微球混悬液,2℃~8℃ 贮藏;
量子点荧光微球标记探针的制备:
取0.1ml浓度为10mg/ml的量子点荧光微球混悬液,4℃10000转离心10分钟,得沉淀,加入1ml浓度为10mMol、pH值为6.5的磷酸缓冲液使悬浮,加入150μg碳二亚胺,混合10~20分钟,加入100μgN-羟基琥珀酰亚胺,混合10~20分钟,室温反应40分钟,4℃10000转离心10分钟,得沉淀,加入1ml浓度为10mMol、pH值为6.5的磷酸缓冲液使悬浮,加入100μg的抗MxA单克隆标记抗体,混合10~20分钟,室温搅拌反应60分钟,4℃10000转离心10分钟,得沉淀,加入1ml含0.5%牛血清白蛋白,20mMol乙醇胺的浓度为10mMol、pH值为7.5的磷酸缓冲液使悬浮,混合10~20分钟,室温旋蒸反应2小时,4℃10000转离心10分钟,得沉淀,置超声反应器中,加入0.1ml浓度为10mMol、pH值为6.5的磷酸缓冲液,选择频率45kHz超声1分钟,使悬浮,2℃~8℃贮藏,得量子点荧光微球标记探针;
NC膜的喷涂划线:
将浓度为0.5mg/ml的羊抗鼠二抗以1μl/mm的喷量喷涂于NC膜的质控线,将浓度为1mg/ml的鼠抗人MxA单克隆包被抗体以1μl/mm的喷量喷涂于NC膜的检测线,质控线与检测线相距4mm,37℃ 干燥12小时,得喷涂后的NC膜;
量子点荧光微球标记垫的制备:
取量子点荧光微球标记探针,10000转离心10分钟,得沉淀,置超声反应器中,加入0.1ml含5%蔗糖,1%牛血清白蛋白,0.5%吐温-20,1%聚乙二醇2000,浓度为10mMol、pH值为7.4的磷酸缓冲液,选择频率60kHz超声1分钟,使悬浮,以5μl/cm的喷量喷涂于标记垫上,37℃ 干燥12小时,得量子点荧光微球标记垫;
样品垫的处理:
样品垫加入5ml含1%牛血清白蛋白,0.3%吐温-20,浓度为10mMol, pH值为7.4的磷酸缓冲液室温浸泡2小时,37℃ 干燥12小时,得样品垫;
试剂盒组装:
将样品垫、标记垫、NC膜和吸水纸在PVC底板上顺次相互搭接粘贴,然后裁切成4mm宽的试纸条,压入塑料卡克,得MxA诊断试剂盒。
2.根据权利要求1所述抗病毒蛋白MxA诊断试剂盒的制备方法,其特征是按如下方法制备:
量子点荧光微球混悬液的制备:
取4ml浓度为5mg/ml的 CdSe/ZnS量子点甲苯溶液,13000转离心10 分钟,弃去上清液,得沉淀,加入含120mg聚甲基丙烯酸甲酯和80mg聚马来酸酐十八醇酯的三氯甲烷液2ml,加入浓度为3mg/ml的十二烷基磺酸钠水溶液5ml,混合10~20分钟,置超声反应器中,选择频率25kHz超声匀质2分钟,得乳液,室温100转旋蒸4小时,除去三氯甲烷,剩余液体10000转离心10分钟,得沉淀,用5ml注射用水10000转离心10分钟洗涤两次,加0.2%叠氮钠水溶液2ml,置超声反应器中,选择频率45kHz超声1~2分钟,得浓度为10mg/ml的量子点荧光微球混悬液,2℃~8℃ 贮藏;
量子点荧光微球标记探针的制备:
取0.1ml浓度为10mg/ml的量子点荧光微球混悬液,4℃10000转离心10分钟,得沉淀,加入1ml浓度为10mMol、pH值为6.5的磷酸缓冲液使悬浮,加入150μg碳二亚胺,混合10~20分钟,加入100μgN-羟基琥珀酰亚胺,混合10~20分钟,室温反应40分钟,4℃10000转离心10分钟,得沉淀,加入1ml浓度为10mMol、pH值为6.5的磷酸缓冲液使悬浮,加入100μg的抗MxA单克隆标记抗体,混合10~20分钟,室温搅拌反应60分钟,4℃10000转离心10分钟,得沉淀,加入1ml含0.5%牛血清白蛋白,20mMol乙醇胺的浓度为10mMol、pH值为7.5的磷酸缓冲液使悬浮,混合10~20分钟,室温旋蒸反应2小时,4℃10000转离心10分钟,得沉淀,置超声反应器中,加入0.1ml浓度为10mMol、pH值为6.5的磷酸缓冲液,选择频率45kHz超声1分钟,使悬浮,2℃~8℃贮藏,得量子点荧光微球标记探针;
NC膜的喷涂划线:
将浓度为0.5mg/ml的羊抗鼠二抗以1μl/mm的喷量喷涂于NC膜的质控线,将浓度为1mg/ml的鼠抗人MxA单克隆包被抗体以1μl/mm的喷量喷涂于NC膜的检测线,质控线与检测线相距4mm,37℃ 干燥12小时,得喷涂后的NC膜;
量子点荧光微球标记垫的制备:
取量子点荧光微球标记探针,10000转离心10分钟,得沉淀,置超声反应器中,加入0.1ml含5%蔗糖,1%牛血清白蛋白,0.5%吐温-20,1%聚乙二醇2000,浓度为10mMol、pH值为7.4的磷酸缓冲液,选择频率60kHz超声1分钟,使悬浮,以5μl/cm的喷量喷涂于标记垫上,37℃ 干燥12小时,得量子点荧光微球标记垫;
样品垫的处理:
样品垫加入5ml含1%牛血清白蛋白,0.3%吐温-20,浓度为10mMol, pH值为7.4的磷酸缓冲液室温浸泡2小时,37℃ 干燥12小时,得样品垫;
试剂盒组装:
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