CN108445233A - 一种抗病毒蛋白MxA诊断试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗病毒蛋白MxA诊断试剂盒及其制备方法，其特征是运用量子点技术、微球技术、中频超声技术、悬浮技术、封闭技术、标记技术，制备了一种MxA诊断试剂盒，适用范围宽、可用于临床、操作简单、精密度高、检测用时较短、灵敏度高、有效期长、成本低廉、作用安全，取得了满意效果。
Description
技术领域
本发明涉及诊断试剂盒制备领域，具体涉及一种抗病毒蛋白MxA诊断试剂盒及其制备方法。
背景技术
MxA是由干扰素（IFN）诱导产生的一种78kD抗病毒蛋白，是区分机体是否受到病毒感染亦或细菌感染的特异性指标，同时也是评价干扰素治疗效果的重要标准。快速检测机体MxA水平对于疾病诊断、合理用药、评价疗效具有重要意义。现有的MxA诊断试剂盒多为酶联免疫法，存在适用范围窄、不可用于临床、操作复杂、精密度低、耗时较长、灵敏度低、有效期短、成本高、作用不安全等不足。本发明依据多年诊断试剂盒研发经验，综合运用量子点技术、微球技术、中频超声技术、悬浮技术、封闭技术、标记技术，提供了一种MxA诊断试剂盒制备方案，适用范围宽、可用于临床、操作简单、精密度高、用时较短、灵敏度高、有效期长、成本低廉、作用安全，取得了满意效果。
发明内容
本发明提供一种MxA诊断试剂盒及其制备方法。
发明实施方案如下：
量子点荧光微球混悬液的制备：
取4ml浓度为5mg/ml的 CdSe/ZnS量子点甲苯溶液，13000转离心10 分钟，弃去上清液，得沉淀，加入含120mg聚甲基丙烯酸甲酯和80mg聚马来酸酐十八醇酯的三氯甲烷液2ml，加入浓度为3mg/ml的十二烷基磺酸钠水溶液5ml，混合10～20分钟，置超声反应器中，选择频率25kHz超声匀质2分钟，得乳液，室温100转旋蒸4小时，除去三氯甲烷，剩余液体10000转离心10分钟，得沉淀，用5ml注射用水10000转离心10分钟洗涤两次，加0.2%叠氮钠水溶液2ml，置超声反应器中，选择频率45kHz超声1～2分钟，得浓度为10mg/ml的量子点荧光微球混悬液，2℃～8℃ 贮藏；
量子点荧光微球标记探针的制备：
取0.1ml浓度为10mg/ml的量子点荧光微球混悬液，4℃10000转离心10分钟，得沉淀，加入1ml浓度为10mMol、pH值为6.5的磷酸缓冲液使悬浮，加入150μg碳二亚胺，混合10～20分钟，加入100μgN-羟基琥珀酰亚胺，混合10～20分钟，室温反应40分钟，4℃10000转离心10分钟，得沉淀，加入1ml浓度为10mMol、pH值为6.5的磷酸缓冲液使悬浮，加入100μg的抗MxA单克隆标记抗体，混合10～20分钟，室温搅拌反应60分钟，4℃10000转离心10分钟，得沉淀，加入1ml含0.5%牛血清白蛋白，20mMol乙醇胺的浓度为10mMol、pH值为7.5的磷酸缓冲液使悬浮，混合10～20分钟，室温旋蒸反应2小时，4℃10000转离心10分钟，得沉淀，置超声反应器中，加入0.1ml浓度为10mMol、pH值为6.5的磷酸缓冲液，选择频率45kHz超声1分钟，使悬浮，2℃～8℃贮藏，得量子点荧光微球标记探针；
NC膜的喷涂划线：
将浓度为0.5mg/ml的羊抗鼠二抗以1μl/mm的喷量喷涂于NC膜的质控线，将浓度为1mg/ml的鼠抗人MxA单克隆包被抗体以1μl/mm的喷量喷涂于NC膜的检测线，质控线与检测线相距4mm，37℃ 干燥12小时，得喷涂后的NC膜；
量子点荧光微球标记垫的制备：
取量子点荧光微球标记探针，10000转离心10分钟，得沉淀，置超声反应器中，加入0.1ml含5%蔗糖，1%牛血清白蛋白，0.5%吐温-20，1%聚乙二醇2000,浓度为10mMol、pH值为7.4的磷酸缓冲液，选择频率60kHz超声1分钟，使悬浮，以5μl/cm的喷量喷涂于标记垫上，37℃ 干燥12小时，得量子点荧光微球标记垫；
样品垫的处理：
样品垫加入5ml含1%牛血清白蛋白，0.3%吐温-20，浓度为10mMol， pH值为7.4的磷酸缓冲液室温浸泡2小时，37℃ 干燥12小时，得样品垫；
试剂盒组装：
将样品垫、标记垫、NC膜和吸水纸在PVC底板上顺次相互搭接粘贴，然后裁切成4mm宽的试纸条，压入塑料卡克，得MxA诊断试剂盒。
本发明方案中所涉及的术语如无特殊说明，均以国家技术质量监督管理局、中国药典、国家食品药品监督管理局颁布的标准和相关规范解释为准。
上述发明方案中所述的浓度如没有单位说明，均指质量浓度。
上述发明方案中设备的功率选择根据所生产样品量的大小确定，按生产厂家设备说明书规定即可实现本发明。
上述实施方案所提到的物质名称如下：
MxA：人体内由干扰素（IFN）诱导产生的一种78kD抗病毒蛋白；
CdSe/ZnS量子点：油溶性量子点，CdSe 为核心，ZnS为壳层，直径200nm，激发波长380～450nm，发射波长520nm，微球表面羧基化，量子产率QY50%～90%：
本发明量子点购自Ocean Nanotech.公司；
蔗糖：CAS号: 57-50-1；
吐温-20：CAS号:9005-64-5；
甲苯：CAS号:108-88-3；
聚甲基丙烯酸甲酯：CAS号:9010-88-2；
聚马来酸酐十八醇酯：CAS号:108-31-6；
三氯甲烷：CAS号:67-66-3 ；
十二烷基磺酸钠：CAS号:2386-53-0；
叠氮钠：CAS号:26628-22-8；
碳二亚胺：CAS号： 25952-53-8；
1N-羟基琥珀酰亚胺：CAS号:6066-82-6；
牛血清白蛋白：CAS号:9048-46-8；
乙醇胺：CAS号:141-43-5；
PEG2000：CAS号:25322-68-3；
注射用水：中国药典2015年版二部；
NC膜：Sartorius CN95：上海杰一生物技术有限公司；
标记垫：聚酯纤维素膜ZCJ1：上海杰一生物技术有限公司；
样品垫：玻璃纤维素薄膜GF2-II：上海杰一生物技术有限公司；
吸水纸：H5076：上海杰一生物技术有限公司；
底板：荧光专用底板DB-4：上海杰一生物技术有限公司；
鼠抗人MxA单克隆包被抗体：上海将来实业股份有限公司；
鼠抗人MxA单克隆标记抗体：上海将来实业股份有限公司；
羊抗鼠二抗：上海华葵金配生物科技有限公司；
以上MxA诊断试剂盒所用到的物质无特殊要求，市场均有销售，只要满足质量标准均可用来实施本发明。
上述实施方案所提到的关键设备如下：
台式高速冷冻离心机：型号：TGL-16K：湖南湘仪离心机仪器有限公司；
XYZ三维划膜喷金仪： 型号：HM3030：上海金标生物科技有限公司；
量子点荧光微球检测读卡器：型号：JBD-001：安徽金标点生物技术有限公司；
超声反应仪：型号：XO-SM：南京先欧仪器制造有限公司；
以上MxA诊断试剂盒所用到的设备无特殊要求，市场均有销售，只要满足参数范围均可用来实施本发明。
四 具体实施方式
本发明的具体实施例1
取4ml浓度为5mg/ml的 CdSe/ZnS量子点甲苯溶液，13000转离心10 分钟，弃去上清液，得沉淀，加入含120mg聚甲基丙烯酸甲酯和80mg聚马来酸酐十八醇酯的三氯甲烷液2ml，加入浓度为3mg/ml的十二烷基磺酸钠水溶液5ml，混合10分钟，置超声反应器中，选择频率25kHz超声匀质2分钟，得乳液，室温100转旋蒸4小时，除去三氯甲烷，剩余液体10000转离心10分钟，得沉淀，用5ml注射用水10000转离心10分钟洗涤两次，加0.2%叠氮钠水溶液2ml，置超声反应器中，选择频率45kHz超声1分钟，得浓度为10mg/ml的量子点荧光微球混悬液，2℃贮藏；
取0.1ml浓度为10mg/ml的量子点荧光微球混悬液，4℃10000转离心10分钟，得沉淀，加入1ml浓度为10mMol，pH值为6.5的磷酸缓冲液使悬浮，加入150μg碳二亚胺，混合10分钟，加入100μgN-羟基琥珀酰亚胺，混合10分钟，室温反应40分钟，4℃10000转离心10分钟，得沉淀，加入1ml浓度为10mMol，pH值为6.5的磷酸缓冲液使悬浮，加入100μg的抗MxA单克隆标记抗体，混合10分钟，室温搅拌反应60分钟，4℃10000转离心10分钟，得沉淀，加入1ml含0.5%牛血清白蛋白，20mMol乙醇胺的浓度为10mMol、pH值为7.5的磷酸缓冲液使悬浮，混合10分钟，室温旋蒸反应2小时，4℃10000转离心10分钟，得沉淀，置超声反应器中，加入0.1ml浓度为10mMol，pH值为6.5的磷酸缓冲液，选择频率45kHz超声1分钟，使悬浮，2℃贮藏，得量子点荧光微球标记探针；
将浓度为0.5mg/ml的羊抗鼠二抗以1μl/mm的喷量喷涂于NC膜的质控线，将浓度为1mg/ml的鼠抗人MxA单克隆包被抗体以1μl/mm的喷量喷涂于NC膜的检测线，质控线与检测线相距4mm，37℃ 干燥12小时，得喷涂后的NC膜；
取量子点荧光微球标记探针，10000转离心10分钟，得沉淀，置超声反应器中，加入0.1ml含5%蔗糖，1%牛血清白蛋白，0.5%吐温-20，1%聚乙二醇2000,浓度为10mMol、pH值为7.4的磷酸缓冲液，选择频率60kHz超声1分钟，使悬浮，以5μl/cm的喷量喷涂于标记垫上，37℃ 干燥12小时，得量子点荧光微球标记垫；
样品垫加入5ml含1%牛血清白蛋白，0.3%吐温-20，浓度为10mMol， pH值为7.4的磷酸缓冲液室温浸泡2小时，37℃ 干燥12小时，得样品垫；
将样品垫、标记垫、NC膜和吸水纸在PVC底板上顺次相互搭接粘贴，然后裁切成4mm宽的试纸条，压入塑料卡克，得MxA诊断试剂盒。
本发明的具体实施例2
取4ml浓度为5mg/ml的 CdSe/ZnS量子点甲苯溶液，13000转离心10 分钟，弃去上清液，得沉淀，加入含120mg聚甲基丙烯酸甲酯和80mg聚马来酸酐十八醇酯的三氯甲烷液2ml，加入浓度为3mg/ml的十二烷基磺酸钠水溶液5ml，混合20分钟，置超声反应器中，选择频率25kHz超声匀质2分钟，得乳液，室温100转旋蒸4小时，除去三氯甲烷，剩余液体10000转离心10分钟，得沉淀，用5ml注射用水10000转离心10分钟洗涤两次，加0.2%叠氮钠水溶液2ml，置超声反应器中，选择频率45kHz超声2分钟，得浓度为10mg/ml的量子点荧光微球混悬液，8℃贮藏；
取0.1ml浓度为10mg/ml的量子点荧光微球混悬液，4℃10000转离心10分钟，得沉淀，加入1ml浓度为10mMol，pH值为6.5的磷酸缓冲液使悬浮，加入150μg碳二亚胺，混合20分钟，加入100μgN-羟基琥珀酰亚胺，混合20分钟，室温反应40分钟，4℃10000转离心10分钟，得沉淀，加入1ml浓度为10mMol，pH值为6.5的磷酸缓冲液使悬浮，加入100μg的抗MxA单克隆标记抗体，混合20分钟，室温搅拌反应60分钟，4℃10000转离心10分钟，得沉淀，加入1ml含0.5%牛血清白蛋白，20mMol乙醇胺的浓度为10mMol、pH值为7.5的磷酸缓冲液使悬浮，混合20分钟，室温旋蒸反应2小时，4℃10000转离心10分钟，得沉淀，置超声反应器中，加入0.1ml浓度为10mMol，pH值为6.5的磷酸缓冲液，选择频率45kHz超声1分钟，使悬浮，8℃贮藏，得量子点荧光微球标记探针；
将浓度为0.5mg/ml的羊抗鼠二抗以1μl/mm的喷量喷涂于NC膜的质控线，将浓度为1mg/ml的鼠抗人MxA单克隆包被抗体以1μl/mm的喷量喷涂于NC膜的检测线，质控线与检测线相距4mm，37℃ 干燥12小时，得喷涂后的NC膜；
取量子点荧光微球标记探针，10000转离心10分钟，得沉淀，置超声反应器中，加入0.1ml含5%蔗糖，1%牛血清白蛋白，0.5%吐温-20，1%聚乙二醇2000,浓度为10mMol、pH值为7.4的磷酸缓冲液，选择频率60kHz超声1分钟，使悬浮，以5μl/cm的喷量喷涂于标记垫上，37℃ 干燥12小时，得量子点荧光微球标记垫；
样品垫加入5ml含1%牛血清白蛋白，0.3%吐温-20，浓度为10mMol， pH值为7.4的磷酸缓冲液室温浸泡2小时，37℃ 干燥12小时，得样品垫；
将样品垫、标记垫、NC膜和吸水纸在PVC底板上顺次相互搭接粘贴，然后裁切成4mm宽的试纸条，压入塑料卡克，得MxA诊断试剂盒。
以上实施例说明，采用本发明实施方案的极端条件均能制成MxA诊断试剂盒。
下面以实施例1制得的MxA诊断试剂盒来考察本发明的实际效果：
1 本发明方案制备的MxA诊断试剂盒与采用现有技术方法制备的MxA诊断试剂盒检测周期对比。
表1检测周期对比表
上述结果表明, 本发明制备MxA诊断试剂盒比采用现有技术方法制备MxA诊断试剂盒检测周期显著缩短。
2 本发明方案制备MxA诊断试剂盒与采用现有技术方法制备MxA诊断试剂盒生产成本对比。
表2 生产成本对比表
上述结果表明, 本发明制备MxA诊断试剂盒比采用现有技术方法制备MxA诊断试剂盒生产成本显著降低。
3本发明方案制备MxA诊断试剂盒与采用现有技术方法制备MxA诊断试剂盒灵敏度对比。
表3 灵敏度对比表
上述结果表明, 本发明制备MxA诊断试剂盒比采用现有技术方法制备MxA诊断试剂盒灵敏度显著提高。
4 本发明方案制备MxA诊断试剂盒与采用现有技术制备MxA诊断试剂盒有效期对比。
表4 有效期对比表
上述结果表明, 本发明制备MxA诊断试剂盒比采用现有技术制备MxA诊断试剂盒有效期限显著延长，稳定性增加。
5 本发明方案制备MxA诊断试剂盒与采用现有技术制备MxA诊断试剂盒安全性对比。
表5 安全性对比表
上述结果表明, 本发明制备MxA诊断试剂盒比采用现有技术制备MxA诊断试剂盒安全可靠。
6 本发明方案制备MxA诊断试剂盒与采用现有技术制备MxA诊断试剂盒精密度对比。
表6 精密度对比表
上述结果表明, 本发明制备MxA诊断试剂盒比采用现有技术制备MxA诊断试剂盒精密度显著增加。
7 本发明方案制备MxA诊断试剂盒与采用现有技术制备MxA诊断试剂盒适用范围对比。
表7 适用范围对比表
上述结果表明, 本发明制备MxA诊断试剂盒比采用现有技术制备MxA诊断试剂盒适用范围更广泛。
Claims (2)
1.一种抗病毒蛋白MxA诊断试剂盒，其特征是按如下方法制备：
量子点荧光微球混悬液的制备：
取4ml浓度为5mg/ml的 CdSe/ZnS量子点甲苯溶液，13000转离心10 分钟，弃去上清液，得沉淀，加入含120mg聚甲基丙烯酸甲酯和80mg聚马来酸酐十八醇酯的三氯甲烷液2ml，加入浓度为3mg/ml的十二烷基磺酸钠水溶液5ml，混合10～20分钟，置超声反应器中，选择频率25kHz超声匀质2分钟，得乳液，室温100转旋蒸4小时，除去三氯甲烷，剩余液体10000转离心10分钟，得沉淀，用5ml注射用水10000转离心10分钟洗涤两次，加0.2%叠氮钠水溶液2ml，置超声反应器中，选择频率45kHz超声1～2分钟，得浓度为10mg/ml的量子点荧光微球混悬液，2℃～8℃ 贮藏；
量子点荧光微球标记探针的制备：
取0.1ml浓度为10mg/ml的量子点荧光微球混悬液，4℃10000转离心10分钟，得沉淀，加入1ml浓度为10mMol、pH值为6.5的磷酸缓冲液使悬浮，加入150μg碳二亚胺，混合10～20分钟，加入100μgN-羟基琥珀酰亚胺，混合10～20分钟，室温反应40分钟，4℃10000转离心10分钟，得沉淀，加入1ml浓度为10mMol、pH值为6.5的磷酸缓冲液使悬浮，加入100μg的抗MxA单克隆标记抗体，混合10～20分钟，室温搅拌反应60分钟，4℃10000转离心10分钟，得沉淀，加入1ml含0.5%牛血清白蛋白，20mMol乙醇胺的浓度为10mMol、pH值为7.5的磷酸缓冲液使悬浮，混合10～20分钟，室温旋蒸反应2小时，4℃10000转离心10分钟，得沉淀，置超声反应器中，加入0.1ml浓度为10mMol、pH值为6.5的磷酸缓冲液，选择频率45kHz超声1分钟，使悬浮，2℃～8℃贮藏，得量子点荧光微球标记探针；
NC膜的喷涂划线：
将浓度为0.5mg/ml的羊抗鼠二抗以1μl/mm的喷量喷涂于NC膜的质控线，将浓度为1mg/ml的鼠抗人MxA单克隆包被抗体以1μl/mm的喷量喷涂于NC膜的检测线，质控线与检测线相距4mm，37℃ 干燥12小时，得喷涂后的NC膜；
量子点荧光微球标记垫的制备：
取量子点荧光微球标记探针，10000转离心10分钟，得沉淀，置超声反应器中，加入0.1ml含5%蔗糖，1%牛血清白蛋白，0.5%吐温-20，1%聚乙二醇2000,浓度为10mMol、pH值为7.4的磷酸缓冲液，选择频率60kHz超声1分钟，使悬浮，以5μl/cm的喷量喷涂于标记垫上，37℃ 干燥12小时，得量子点荧光微球标记垫；
样品垫的处理：
样品垫加入5ml含1%牛血清白蛋白，0.3%吐温-20，浓度为10mMol， pH值为7.4的磷酸缓冲液室温浸泡2小时，37℃ 干燥12小时，得样品垫；
试剂盒组装：
将样品垫、标记垫、NC膜和吸水纸在PVC底板上顺次相互搭接粘贴，然后裁切成4mm宽的试纸条，压入塑料卡克，得MxA诊断试剂盒。
2.根据权利要求1所述抗病毒蛋白MxA诊断试剂盒的制备方法，其特征是按如下方法制备：
量子点荧光微球混悬液的制备：
取4ml浓度为5mg/ml的 CdSe/ZnS量子点甲苯溶液，13000转离心10 分钟，弃去上清液，得沉淀，加入含120mg聚甲基丙烯酸甲酯和80mg聚马来酸酐十八醇酯的三氯甲烷液2ml，加入浓度为3mg/ml的十二烷基磺酸钠水溶液5ml，混合10～20分钟，置超声反应器中，选择频率25kHz超声匀质2分钟，得乳液，室温100转旋蒸4小时，除去三氯甲烷，剩余液体10000转离心10分钟，得沉淀，用5ml注射用水10000转离心10分钟洗涤两次，加0.2%叠氮钠水溶液2ml，置超声反应器中，选择频率45kHz超声1～2分钟，得浓度为10mg/ml的量子点荧光微球混悬液，2℃～8℃ 贮藏；
量子点荧光微球标记探针的制备：
取0.1ml浓度为10mg/ml的量子点荧光微球混悬液，4℃10000转离心10分钟，得沉淀，加入1ml浓度为10mMol、pH值为6.5的磷酸缓冲液使悬浮，加入150μg碳二亚胺，混合10～20分钟，加入100μgN-羟基琥珀酰亚胺，混合10～20分钟，室温反应40分钟，4℃10000转离心10分钟，得沉淀，加入1ml浓度为10mMol、pH值为6.5的磷酸缓冲液使悬浮，加入100μg的抗MxA单克隆标记抗体，混合10～20分钟，室温搅拌反应60分钟，4℃10000转离心10分钟，得沉淀，加入1ml含0.5%牛血清白蛋白，20mMol乙醇胺的浓度为10mMol、pH值为7.5的磷酸缓冲液使悬浮，混合10～20分钟，室温旋蒸反应2小时，4℃10000转离心10分钟，得沉淀，置超声反应器中，加入0.1ml浓度为10mMol、pH值为6.5的磷酸缓冲液，选择频率45kHz超声1分钟，使悬浮，2℃～8℃贮藏，得量子点荧光微球标记探针；
NC膜的喷涂划线：
将浓度为0.5mg/ml的羊抗鼠二抗以1μl/mm的喷量喷涂于NC膜的质控线，将浓度为1mg/ml的鼠抗人MxA单克隆包被抗体以1μl/mm的喷量喷涂于NC膜的检测线，质控线与检测线相距4mm，37℃ 干燥12小时，得喷涂后的NC膜；
量子点荧光微球标记垫的制备：
取量子点荧光微球标记探针，10000转离心10分钟，得沉淀，置超声反应器中，加入0.1ml含5%蔗糖，1%牛血清白蛋白，0.5%吐温-20，1%聚乙二醇2000,浓度为10mMol、pH值为7.4的磷酸缓冲液，选择频率60kHz超声1分钟，使悬浮，以5μl/cm的喷量喷涂于标记垫上，37℃ 干燥12小时，得量子点荧光微球标记垫；
样品垫的处理：
样品垫加入5ml含1%牛血清白蛋白，0.3%吐温-20，浓度为10mMol， pH值为7.4的磷酸缓冲液室温浸泡2小时，37℃ 干燥12小时，得样品垫；
试剂盒组装：
将样品垫、标记垫、NC膜和吸水纸在PVC底板上顺次相互搭接粘贴，然后裁切成4mm宽的试纸条，压入塑料卡克，得MxA诊断试剂盒。
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