CN109187960A - 一种基于免疫层析技术的检测古代丝织品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及文物检测领域，公开了一种基于免疫层析技术的检测古代丝织品的方法。本发明采用甲酸、硝酸钙溶液体系提取丝素蛋白，然后使用硒化镉/硫化锌量子点制备出一种高度发光的量子点珠。在使用免疫层析试纸检测时，量子点珠与丝素蛋白抗体结合，T线喷涂丝素蛋白，C线喷涂山羊抗兔抗体，待测丝织品文物样与量子点珠丝素蛋白抗体结合体在层析作用下移动，通过T、C线的荧光情况，即可判断文物样种属。本发明在对丝织品文物样检测时具有快捷、直观、准确、高灵敏度点。
Description
技术领域
本发明涉及文物检测领域，尤其涉及一种基于免疫层析技术的检测古代丝织品的方法。
背景技术
中国自古以来就是纺织品大国，生产的纺织品种类丰富，工艺精美，舒适透气。其中最负盛名的纺织品就是中国的丝绸，故中国又被称为“丝绸之国”。丝绸的主要成分是桑蚕丝，桑蚕丝主要由丝素蛋白和丝胶两部分组成，丝素蛋白是蚕丝的主要组成部分，约占总重量的70%。并且桑蚕丝作为一种有机高分子材料，易受光、热、酸碱、微生物等的影响发生降解，从而造成结晶度、分子量等结构及性能的变化，所以常规的检测方法灵敏度低，受杂质干扰影响大，不适合对文物进行检测，因此需要开发一种快捷、简单、灵敏度高的检测古代丝织品的方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于免疫层析技术的检测古代丝织品的方法，利用本发明方法对古代丝织品进行检测时，具有快捷、简单、灵敏度高的特点。
本发明的具体技术方案为：一种基于免疫层析技术的检测古代丝织品的方法，以mg、g和µl、ml计，步骤如下：
A)称取18-22mg硒化镉/硫化锌量子点，118-122mg聚甲基丙烯酸甲酯，78-82mg的聚马来酸酐-十八烯共聚物，加入至1.8-2.2ml的氯仿中，与4.5-5.5ml的3mg/ml的十二烷基磺酸钠水溶液混合，超声均化处理，再将氯仿蒸发；然后将所得水溶性量子点珠离心纯化，用去离子水清洗2-4次。
本发明中制备的量子点珠包含很多个硒化镉/硫化锌量子点，发光强度是单个硒化镉/硫化锌量子点的几千倍，在检测过程中起到荧光信号放大的作用。
B)称取4-6g桑蚕丝置于180-220mL含0.018-0.022M的碳酸钠溶液中，水浴55-65min，水浴温度为80℃，取出用去离子水清洗三次以上，干燥。
C)取1.8-2.2g烘干的丝素，2.3-2.7g硝酸钙，加入甲酸48-52mL，搅拌80-100min，过滤加入碳酸氢钠直至溶液呈中性，透析冷冻干燥后，将得到的丝素蛋白研磨成粉，得到丝素蛋白粉。
本发明使用硝酸钙、甲酸体系溶解丝素，既能增加对丝素的溶解度，又能减小对丝素分子链的破坏，而且该体系在常温下即可完成对丝素的溶解，无需加热。
D)取0.9-1.1µg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，0.1-0.14mg的步骤A）中的水溶性量子点珠加入到2.5 -3.1mlPBS 7.4缓冲液中，然后边缓慢搅拌边逐滴加入90-110µl 用稀释到1000倍的丝素蛋白抗体，在室温下放置35-45min，离心，取沉淀物用600µlPBS 7.4缓冲液重悬，然后存放在1-5℃环境下备用。
E)取4-6µl经步骤D）处理后的溶液喷涂在玻璃纤维素膜上，将其置于35-40℃下干燥，将4.8mg/ml的丝素蛋白和稀释至3000倍的山羊抗兔抗体分别划在硝酸纤维素膜的检测线（T）和质控线（C）上，并置于35-40℃下干燥。
F)在PVC底板长1-2 cm端下侧粘贴样品垫，在PVC底板下方距离0.8-1.2cm处粘贴量子点珠结合垫，在PVC底板中间2.3-2.7cm处粘贴硝酸纤维素膜，在PVC底板上方1.8-2.2cm处粘贴吸水垫，将组装好的条板切成宽3.8-4.2mm的条状，装于塑料卡中备用。
G)在样品加入口处加入经处理的待测样品70-80µl，在室温下放置10-20min后，用光学读取器扫描试纸条带，若只有质控线出现荧光，说明所测样品含有桑蚕丝，同时在另一相同装置样品入口处加入70-80µl的用CB 9.6缓冲液配制的100µg/ml的丝素蛋白经过相同处理后形成对照。
本发明采用甲酸、硝酸钙溶液体系提取丝素蛋白，然后使用硒化镉/硫化锌量子点制备出一种高度发光的量子点珠。在使用免疫层析试纸检测时，量子点珠与丝素蛋白抗体结合，T线喷涂丝素蛋白，C线喷涂山羊抗兔抗体，待测丝织品文物样与量子点珠丝素蛋白抗体结合体在层析作用下移动，通过T、C线的荧光情况，即可判断文物样种属。本发明在对丝织品文物样检测时具有快捷、直观、准确、高灵敏度点。
作为优选，步骤A）中，离心速率为8000-12000rpm，离心时间为8-12min。
作为优选，步骤D）中，PBS 7.4缓冲液的配制方法为：称取0.2 g 氯化钾，0.27 g磷酸二氢钾，8 g氯化钠和1.42 g磷酸氢二钠加入到800 mL 去离子水中均匀搅拌直至完全溶解后用容量瓶定容至1000 mL，调节溶液的pH至7.4。
作为优选，步骤D）和E）中，使用1wt%BSA稀释抗体。
作为优选，步骤G）中，待测样品的处理方法为：取0.02-0.2g文物样溶解于100mlCB9.6缓冲液，混合搅拌均匀，静置，取上清液。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
(1)本发明中制备的量子点珠包含很多个硒化镉/硫化锌量子点，发光强度是单个硒化镉/硫化锌量子点的几千倍，在检测过程中起到荧光信号放大的作用。
(2)本发明使用硝酸钙、甲酸体系溶解丝素，既能增加对丝素的溶解度，又能减小对丝素分子链的破坏，而且该体系在常温下即可完成对丝素的溶解，无需加热。
(3)本发明样品用量少，可以快捷、直观、准确、高灵敏性地检测出丝素蛋白，对于检测降解严重的丝织品文物具有重要的意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1：
A)称取20mg硒化镉/硫化锌量子点，118mg聚甲基丙烯酸甲酯，78mg的聚马来酸酐-十八烯共聚物，加入1.8ml的氯仿中，与4.5ml的3mg/ml的十二烷基磺酸钠水溶液混合后用超声波均化器处理，之后再将氯仿蒸发。然后将所得水溶性量子点珠离心纯化，离心速率为8000rpm，离心时间为8min，用去离子水清洗2次。
B)称取5g桑蚕丝置于180mL含0.018M的碳酸钠溶液中，水浴55min，水浴温度为80℃，取出用去离子水清洗三次以上，放入烘箱干燥。
C)取2g烘干的丝素，2.3g硝酸钙，加入甲酸48mL，用磁力搅拌80min，过滤加入碳酸氢钠直至溶液呈中性，透析冷冻干燥后，将得到的丝素蛋白研磨成粉备用。
D)取0.9µg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，0.1mg的步骤A）中的量子点珠加入到2.5mlPBS 7.4缓冲液中，然后一边缓慢搅拌一边逐滴加入90µl 用1wt%BSA稀释到1000倍的丝素蛋白抗体，在室温下放置35min，离心，取沉淀物用600µl PBS 7.4缓冲液重悬，然后存放在4℃冰箱里备用。
其中，PBS 7.4缓冲液的配制：称取0.2 g 氯化钾，0.27 g磷酸二氢钾，8 g氯化钠和1.42 g磷酸氢二钠加入到800 mL 去离子水中均匀搅拌直至完全溶解后用容量瓶定容至1000 mL，调节溶液的pH至7.4。
E)取5µl经步骤D）处理后的溶液喷涂在玻璃纤维素膜上，将其置于37℃下干燥，将4.8mg/ml的丝素蛋白和用1wt%BSA稀释到3000倍的山羊抗兔抗体分别划在硝酸纤维素膜的检测线（T）和质控线（C）上，并置于37℃下干燥。
F)在PVC底板长1.5cm端下侧粘贴样品垫，在PVC底板下方距离1.0cm处粘贴量子点珠结合垫，在PVC底板中间2.5cm处粘贴硝酸纤维素膜，在PVC底板上方2cm处粘贴吸水垫，将组装好的条板切成宽4mm的小条状，装在塑料卡里备用；
G)取0.02g文物样溶解于100mlCB 9.6缓冲液，混合搅拌均匀，静置，得到上清液，在样品加入口处加入70µl上清液，在室温下放置10min后，用光学读取器扫描试纸条带，若只有质控线出现荧光，说明所测样品含有桑蚕丝，同时在另一相同装置样品入口处加入70µl的用CB 9.6缓冲液配制的100µg/ml的丝素蛋白经过相同处理后形成对照。
实施例2：
A)称取20mg硒化镉/硫化锌量子点，120mg聚甲基丙烯酸甲酯，80mg的聚马来酸酐-十八烯共聚物，加入2ml的氯仿中，与5ml的3mg/ml的十二烷基磺酸钠水溶液混合后用超声波均化器处理，之后再将氯仿蒸发。然后将所得水溶性量子点珠离心纯化，离心速率为10000rpm，离心时间为10min，用去离子水清洗3次。
B)称取5g桑蚕丝置于200mL含0.02M的碳酸钠溶液中，水浴60min，水浴温度为80℃，取出用去离子水清洗三次以上，放入烘箱干燥。
C)取2g烘干的丝素，2.5g硝酸钙，加入甲酸50mL，用磁力搅拌90min，过滤加入碳酸氢钠直至溶液呈中性，透析冷冻干燥后，将得到的丝素蛋白研磨成粉备用。
D)取1µg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，0.12mg的步骤A）中的量子点珠加入到2.8mlPBS 7.4缓冲液中，然后一边缓慢搅拌一边逐滴加入100µl 用1wt%BSA稀释到1000倍的丝素蛋白抗体，在室温下放置40min，离心，取沉淀物用600µl PBS 7.4缓冲液重悬，然后存放在4℃冰箱里备用。
其中，PBS 7.4缓冲液的配制：称取0.2 g 氯化钾，0.27 g磷酸二氢钾，8 g氯化钠和1.42 g磷酸氢二钠加入到800 mL 去离子水中均匀搅拌直至完全溶解后用容量瓶定容至1000 mL，调节溶液的pH至7.4。
E)取5µl经步骤D）处理后的溶液喷涂在玻璃纤维素膜上，将其置于37℃下干燥，将4.8mg/ml的丝素蛋白和用1wt%BSA稀释到3000倍的山羊抗兔抗体分别划在硝酸纤维素膜的检测线（T）和质控线（C）上，并置于37℃下干燥。
F)在PVC底板长1.5cm端下侧粘贴样品垫，在PVC底板下方距离1.0cm处粘贴量子点珠结合垫，在PVC底板中间2.5cm处粘贴硝酸纤维素膜，在PVC底板上方2cm处粘贴吸水垫，将组装好的条板切成宽4mm的小条状，装在塑料卡里备用；
G)取0.02-0.2g文物样溶解于100mlCB 9.6缓冲液，混合搅拌均匀，静置，得到上清液，在样品加入口处加入75µl上清液，在室温下放置15min后，用光学读取器扫描试纸条带，若只有质控线出现荧光，说明所测样品含有桑蚕丝，同时在另一相同装置样品入口处加入75µl的用CB 9.6缓冲液配制的100µg/ml的丝素蛋白经过相同处理后形成对照。
实施例3：
A)称取20mg硒化镉/硫化锌量子点，122mg聚甲基丙烯酸甲酯，82mg的聚马来酸酐-十八烯共聚物，加入2.2ml的氯仿中，与5.5ml的3mg/ml的十二烷基磺酸钠水溶液混合后用超声波均化器处理，之后再将氯仿蒸发。然后将所得水溶性量子点珠离心纯化，离心速率为12000rpm，离心时间为12min，用去离子水清洗4次。
B)称取5g桑蚕丝置于220mL含0.022M的碳酸钠溶液中，水浴65min，水浴温度为80℃，取出用去离子水清洗三次以上，放入烘箱干燥。
C)取2g烘干的丝素，2.7g硝酸钙，加入甲酸52mL，用磁力搅拌100min，过滤加入碳酸氢钠直至溶液呈中性，透析冷冻干燥后，将得到的丝素蛋白研磨成粉备用。
D)取1.1µg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，0.14mg的步骤A）中的量子点珠加入到3.1mlPBS 7.4缓冲液中，然后一边缓慢搅拌一边逐滴加入110µl 用1wt%BSA稀释到1000倍的丝素蛋白抗体，在室温下放置45min，离心，取沉淀物用600µl PBS 7.4缓冲液重悬，然后存放在4℃冰箱里备用。
其中，PBS 7.4缓冲液的配制：称取0.2 g 氯化钾，0.27 g磷酸二氢钾，8 g氯化钠和1.42 g磷酸氢二钠加入到800 mL 去离子水中均匀搅拌直至完全溶解后用容量瓶定容至1000 mL，调节溶液的pH至7.4。
E)取5µl经步骤D）处理后的溶液喷涂在玻璃纤维素膜上，将其置于37℃下干燥，将4.8mg/ml的丝素蛋白和用1wt%BSA稀释到3000倍的山羊抗兔抗体分别划在硝酸纤维素膜的检测线（T）和质控线（C）上，并置于37℃下干燥。
F)在PVC底板长1.5cm端下侧粘贴样品垫，在PVC底板下方距离1.0cm处粘贴量子点珠结合垫，在PVC底板中间2.5cm处粘贴硝酸纤维素膜，在PVC底板上方2cm处粘贴吸水垫，将组装好的条板切成宽4mm的小条状，装在塑料卡里备用；
G)取0.2g文物样溶解于100mlCB 9.6缓冲液，混合搅拌均匀，静置，得到上清液，在样品加入口处加入80µl上清液，在室温下放置20min后，用光学读取器扫描试纸条带，若只有质控线出现荧光，说明所测样品含有桑蚕丝，同时在另一相同装置样品入口处加入80µl的用CB 9.6缓冲液配制的100µg/ml的丝素蛋白经过相同处理后形成对照。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (5)
1.一种基于免疫层析技术的检测古代丝织品的方法，其特征在于，以mg、g和µl、ml计，步骤如下：
A)称取18-22mg硒化镉/硫化锌量子点，118-122mg聚甲基丙烯酸甲酯，78-82mg的聚马来酸酐-十八烯共聚物，加入至1.8-2.2ml的氯仿中，与4.5-5.5ml的3mg/ml的十二烷基磺酸钠水溶液混合，超声均化处理，再将氯仿蒸发；然后将所得水溶性量子点珠离心纯化，用去离子水清洗2-4次；
B)称取4-6g桑蚕丝置于180-220mL含0.018-0.022M的碳酸钠溶液中，水浴55-65min，水浴温度为80℃，取出用去离子水清洗三次以上，干燥；
C)取1.8-2.2g烘干的丝素，2.3-2.7g硝酸钙，加入甲酸48-52mL，搅拌80-100min，过滤加入碳酸氢钠直至溶液呈中性，透析冷冻干燥后，将得到的丝素蛋白研磨成粉，得到丝素蛋白粉；
D)取0.9-1.1µg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，0.1-0.14mg的步骤A）中的水溶性量子点珠加入到2.5 -3.1mlPBS 7.4缓冲液中，然后边缓慢搅拌边逐滴加入90-110µl用稀释到1000倍的丝素蛋白抗体，在室温下放置35-45min，离心，取沉淀物用600µl PBS7.4缓冲液重悬，然后存放在1-5℃环境下备用；
E)取4-6µl经步骤D）处理后的溶液喷涂在玻璃纤维素膜上，将其置于35-40℃下干燥，将4.8mg/ml的丝素蛋白和稀释至3000倍的山羊抗兔抗体分别划在硝酸纤维素膜的检测线（T）和质控线（C）上，并置于35-40℃下干燥；
F)在PVC底板长1-2 cm端下侧粘贴样品垫，在PVC底板下方距离0.8-1.2cm处粘贴量子点珠结合垫，在PVC底板中间2.3-2.7cm处粘贴硝酸纤维素膜，在PVC底板上方1.8-2.2cm处粘贴吸水垫，将组装好的条板切成宽3.8-4.2mm的条状，装于塑料卡中备用；
G)在样品加入口处加入经处理的待测样品70-80µl，在室温下放置10-20min后，用光学读取器扫描试纸条带，若只有质控线出现荧光，说明所测样品含有桑蚕丝，同时在另一相同装置样品入口处加入70-80µl的用CB 9.6缓冲液配制的100µg/ml的丝素蛋白经过相同处理后形成对照。
2.如权利要求1所述的一种基于免疫层析技术的检测古代丝织品的方法，其特征在于，步骤A）中，离心速率为8000-12000rpm，离心时间为8-12min。
3.如权利要求1所述的一种基于免疫层析技术的检测古代丝织品的方法，其特征在于，步骤D）中，PBS 7.4缓冲液的配制方法为：称取0.2 g 氯化钾，0.27 g磷酸二氢钾，8 g氯化钠和1.42 g磷酸氢二钠加入到800 mL 去离子水中均匀搅拌直至完全溶解后用容量瓶定容至1000 mL，调节溶液的pH至7.4。
4.如权利要求1所述的一种基于免疫层析技术的检测古代丝织品的方法，其特征在于，步骤D）和E）中，使用1wt%BSA稀释抗体。
5.如权利要求1所述的一种基于免疫层析技术的检测古代丝织品的方法，其特征在于，步骤G）中，待测样品的处理方法为：取0.02-0.2g文物样溶解于100mlCB 9.6缓冲液，混合搅拌均匀，静置，取上清液。
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