CN110927391A - 一种用于诊断血管炎性高血压的检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于诊断血管炎性高血压的检测试剂盒及其应用，目前已有的诊断都效果不理想，可重复性差，诊断准确性和诊断速度都不高的技术问题，正是为解决目前的技术问题，本发明提供了一种用于诊断血管炎性高血压的检测试剂盒及其应用，利用血液样本作为诊断材料，可以通过试剂盒检测病人血清中LAMP‑2和LAMP‑2抗体含量，来对血管炎性高血压进行诊断，其检测方法简便、周期短、特异性好、灵敏度高等优点，诊断准确性达到了100%，在血管炎性高血压的诊断及治疗领域具有广泛的适用性。
Description
技术领域
本发明涉及医疗技术领域，具体说，本发明具体涉及一种医疗试剂盒的技术领域。
背景技术
系统性血管炎(Systemic vasculitis，SV)是一组以累及不同类型血管及伴多个器官系统受损为主要特征的自身免疫疾病，常引起肾性高血压，甚至为恶性高血压，不及时治疗，致残率、致死率很高。有研究表明：系统性血管炎是恶性高血压最常见的病因之一。随着近年研究的不断深入，由于SV的临床表现较为多样化且缺乏特异性生物标记物，血管炎性高血压疾病临床的诊断及评估具有极大的挑战性。临床急需寻找血管炎性高血压疾病的血清学指标用于诊断及病情活动评估，以便于早期诊断，早期治疗，改善预后。
人溶酶体相关膜蛋白2(hLAMP-2)是一种糖基化的1型糖蛋白，表达于中性粒细胞、内皮细胞等不同细胞溶酶体膜上，hLAMP-2免疫表位与大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌的黏附蛋白-Ⅰ型菌毛蛋白H(FimH)有高度一致性。1995年，Kain等在AAV(血管炎)患者血清中首先鉴定出抗hLAMP-2抗体的存在，AAV肾损害是较常见的继发性肾脏疾病，预后较差，病情容易反复，发病机制目前并不明确，近年来抗LAMP-2抗体在AAV中发现是研究的重大进展。当前存在AAV患者血清中的抗hLAMP-2抗体绝对阳性率及其与疾病活动性的关系尚存在争议，多因检测方法及入选病例偏差造成的，尽管现有技术对于LAMP-2和LAMP-2抗体应用到系统性血管炎单独都一些的披露，但是，根据公众所知常识，两个单体具有某种属性，不见得两者连用就必然具有这种属性，甚至现有技术常见的两者连用不具有或者更有甚者具有相反的作用，如何探讨将LAMP-2和LAMP-2联合抗体联用应用到系统性血管炎中诊断具有重要的现实意义。
发明内容
针对现有技术中将LAMP-2及LAMP-2单独抗体应用到系统性血管炎的诊断中鲜有报道，且已有的诊断都效果不理想，可重复性差，诊断准确性和诊断速度都不高的技术问题，本发明提供了一种用于诊断血管炎性高血压的检测试剂盒及其应用，利用血液样本作为诊断材料，可以通过试剂盒检测病人血清中LAMP-2和LAMP-2抗体含量，来对血管炎性高血压进行诊断，其检测方法简便、周期短、特异性好、灵敏度高等优点，诊断准确性达到了100％，在血管炎性高血压的诊断及治疗领域具有广泛的适用性。
本发明提供了一种用于诊断血管炎性高血压的检测试剂盒，所述用于诊断血管炎性高血压的蛋白包括LAMP-2和LAMP-2联合抗体，所述的检测试剂盒包含检测血清中LAMP-2和LAMP-2抗体的含量的试剂，具体含有LAMP-2标准品、LAMP-2抗体标准品、标准品稀释液、PBS、检测溶液A、检测溶液B、TMB底物溶液、洗涤液、终止溶液、96孔板。
本发明中，所述的LAMP-2和LAMP-2联合抗体从血清中检测。
同时，本发明提供一种用于诊断血管炎性高血压的检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
(1)加样：分别设标准品稀释孔、待测样品孔、空白孔，标准品稀释孔设7孔，依次加入100μL的稀释后标准品，空白孔加入100μL标准品稀释液，待测样品孔加入100μL稀释血清样本，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时后，弃去液体，甩干，不洗涤；
(2)在步骤(1)制备的酶标板孔中，分别加入100μL检测溶液A工作液，酶标板覆膜，37℃温育1小时后，弃去孔内液体，重复洗板3次；
(3)在步骤(2)制备的酶标板孔中，每孔加100μL检测溶液B工作液，酶标板覆膜，37℃温育30分钟后，弃去孔内液体，甩干，重复洗板5次；
(4)在步骤(3)制备的酶标板孔中，每孔加TMB底物溶液90μL，酶标板覆膜，37℃避光显色；
(5)在步骤(4)制备的酶标板孔中，每孔加终止溶液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色，如出现颜色不匀一，请轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀；
(6)在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度值，通过标准曲线计算样品中LAMP-2和LAMP-2抗体浓度。
本发明，所述标准品为LAMP-2标准品和LAMP-2抗体标准品。
本发明，所述标准品稀释液为含有BSA的PBS溶液，pH＝7.2-7.4。
本发明，所述稀释后标准品，通过添加标准品稀释液依次倍比稀释成4000pg/mL、2000pg/mL、1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL。
本发明，所述血清样本，采用5ml促凝管采集外周静脉血，经4℃离心机3000g/min离心15min后，收集血清，分装冻存，-80℃冰箱备用。
本发明，所述稀释血清样本，向血清样本中加入PBS，配成500倍稀释的血清。
本发明，所述检测溶液A为检测抗体。
本发明，所述检测溶液B为IgG-HRP酶标抗体。
本发明，所述检测溶液A和检测溶液B临用前配制，在使用前短暂离心处理，以使黏附在管壁或瓶盖的液体沉积到管底。
本发明，所述检测溶液A工作液，对检测溶液A稀释200倍，充分混匀。
本发明，所述检测溶液B工作液，对检测溶液B稀释200倍，充分混匀。
本发明，所述洗涤液为含Tween-20的PBS溶液，PH＝7.2-7.4。
本发明，所述稀释后的洗涤液，580mL蒸馏水或去离子水加入20mL洗涤液至600mL，进行30倍稀释。
本发明，所述洗板，每孔用350μL的稀释后的洗涤液浸泡1-2分钟，弃去，洗涤后将酶标板放在吸水纸上轻拍，来移除孔内所有液体，此过程也可采用喷射瓶，多道移液器或自动洗板机来完成。
本发明，所述避光显色，反应时间控制在10-20分钟，不要超过30分钟。当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止。
本发明中，所述的试剂盒通过检测血清中LAMP-2和LAMP-2抗体的含量用于诊断血管炎性高血压中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种用于诊断血管炎性高血压的检测试剂盒，可以通过检测病人血清中LAMP-2和LAMP-2抗体含量，来对血管炎性高血压进行诊断。其检测方法简便、周期短、特异性好、灵敏度高等优点。经检测血清中LAMP-2和LAMP-2抗体含量，LAMP-2的最佳截止值为0.56ug/mL，敏感性和特异性分别为54.3％和87.5％，抗LAMP-2抗体的最佳截止值为109.80ng/mL，敏感性和特异性分别为74.3％和62.5％，而且试验52例患者中无一例误诊或者漏诊，诊断准确性达到了100％，在血管炎性高血压的诊断及治疗领域具有广泛的适用性。
附图说明
图1所示为SV、EH和HC三组间血清中LAMP-2水平比较图。
图2所示为活动期和非活动期组中血清LAMP-2水平比较图。
图3所示为SV肾损伤和非肾损伤组中血清LAMP-2水平比较图。
图4所示为血清中LAMP-2与BVAS、Hs-CRP、Scr和24小时蛋白尿的相关性分析图，其中，A表示血清中LAMP-2与BVAS的相关性分析图，B表示为血清中LAMP-2与Hs-CRP的相关性分析图，C表示为血清中LAMP-2与Scr的相关性分析图，D表示为血清中LAMP-2与24小时蛋白尿的相关性分析图。
图5所示为SV、EH和HC组中血清抗LAMP-2抗体水平变化图。
图6所示为ROC曲线分析评估血清LAMP-2及LAMP-2抗体对SV及活动期的诊断价值图，其中，A表示血清LAMP-2及LAMP-2抗体对SV的联合诊断价值图，B表示为血清LAMP-2及LAMP-2抗体对SV的疾病活动的判断价值图。
具体实施方式
下面实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细描述，但本发明的方法不限于下述实施例。
本发明中用到的ELISA试剂盒(LAMP-2、LAMP-2抗体)、恒温水浴箱、-80℃冰箱、-10℃冰箱、量筒、电动连续分液器Eppendorf、10ul单通道微量移液枪、微量移液枪、离心机、微量振荡器、10ul枪头、100ul枪头、200ul枪头、1000ul枪头、电动连续分液器Eppendorf枪头、10ml样品管、稀释样品的EP管、去离子水、吸水纸、ELX-800型酶标仪、ELX-50型洗板机等都可从市场途径采购获得。
实施例一：本发明用于诊断血管炎性高血压的检测试剂盒
本发明提供了一种用于诊断血管炎性高血压的检测试剂盒，所述用于诊断血管炎性高血压的蛋白包括LAMP-2和LAMP-2抗体。
本发明中，所述的检测试剂盒，包括LAMP-2标准品、LAMP-2抗体标准品、标准品稀释液、检测溶液A、检测溶液B、TMB底物溶液、洗涤液、终止溶液、96孔板。
本发明中，所述LAMP-2和LAMP-2抗体从血清中检测。
本发明中，所述的试剂盒通过检测血清中LAMP-2和LAMP-2抗体的含量诊断血管炎性高血压。
本发明中，所述的检测试剂盒包含检测血清中LAMP-2和LAMP-2抗体的含量的试剂。
实施例二：用于诊断血管炎性高血压的检测试剂盒的检测方法
本发明提供一种用于诊断血管炎性高血压的检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
(1)加样：分别设标准品稀释孔、待测样品孔、空白孔，标准品稀释孔设7孔，依次加入100μL的稀释后标准品，空白孔加入100μL标准品稀释液，待测样品孔加入100μL稀释血清样本，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时后，弃去液体，甩干，不洗涤；
(2)在步骤(1)制备的酶标板孔中，分别加入100μL检测溶液A工作液，酶标板覆膜，37℃温育1小时后，弃去孔内液体，重复洗板3次；
(3)在步骤(2)制备的酶标板孔中，每孔加100μL检测溶液B工作液，酶标板覆膜，37℃温育30分钟后，弃去孔内液体，甩干，重复洗板5次；
(4)在步骤(3)制备的酶标板孔中，每孔加TMB底物溶液90μL，酶标板覆膜，37℃避光显色；
(5)在步骤(4)制备的酶标板孔中，每孔加终止溶液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色，如出现颜色不匀一，请轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀；
(6)在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度值，通过标准曲线计算样品中LAMP-2和LAMP-2抗体浓度。
本发明，所述标准品为LAMP-2标准品和LAMP-2抗体标准品。
本发明，所述标准品稀释液为含有BSA的PBS溶液，pH＝7.2-7.4。
本发明，所述稀释后标准品，通过添加标准品稀释液依次倍比稀释成4000pg/mL、2000pg/mL、1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL。
本发明，所述血清样本，采用5ml促凝管采集外周静脉血，经4℃离心机3000g/min离心15min后，收集血清，分装冻存，-80℃冰箱备用。
本发明，所述稀释血清样本，向血清样本中加入PBS，配成500倍稀释的血清。
本发明，所述检测溶液A为检测抗体。
本发明，所述检测溶液B为IgG-HRP酶标抗体。
本发明，所述检测溶液A和检测溶液B临用前配制，在使用前短暂离心处理，以使黏附在管壁或瓶盖的液体沉积到管底。
本发明，所述检测溶液A工作液，对检测溶液A稀释200倍，充分混匀。
本发明，所述检测溶液B工作液，对检测溶液B稀释200倍，充分混匀。
本发明，所述洗涤液为含Tween-20的PBS溶液，PH＝7.2-7.4。
本发明，所述稀释后的洗涤液，580mL蒸馏水或去离子水加入20mL洗涤液至600mL，进行30倍稀释。
本发明，所述洗板，每孔用350μL的稀释后的洗涤液浸泡1-2分钟，弃去，洗涤后将酶标板放在吸水纸上轻拍，来移除孔内所有液体，此过程也可采用喷射瓶，多道移液器或自动洗板机来完成。
本发明，所述避光显色，反应时间控制在10-20分钟，不要超过30分钟。当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止。
实施例三：试剂盒的检测试验
(一)研究对象
SV组：2013年1月至2018年12月在新疆维吾尔自治区人民医院高血压中心住院并确诊为SV患者43例。所有这些患者均符合1990ACRSV诊断标准或2012年国际CHCC修订的SV命名及定义。排除继发性血管炎(系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、干燥综合征等引起的血管炎)、恶性肿瘤、急慢性感染、怀孕或妊娠需求的。根据伯明翰血管炎活动期评分(Birmingham vasculitis activity score，BVAS)量表对SV的疾病活动程度进行评估。
EH组：同期收集在高血压中心住院明确诊断为原发性高血压患者46例。排除继发性高血压(肾上腺皮质腺瘤，嗜铬细胞瘤，中重度睡眠呼吸暂停综合征，库欣综合征，肾性高血压等)、恶性肿瘤、急慢性感染、怀孕或妊娠需求的。
HC组：同期收集新疆维吾尔自治区人民医院体检中心进行健康体检的正常人群。临床检查排除有急性、慢性感染及高血压、糖尿病、肾病等血管损伤的体检者，最终纳入与病例组年龄和性别相匹配的健康对照(healthy controls，HC)组43例。
所有入选者均了解并签署知情同意书，本研究经新疆维吾尔自治区人民医院伦理委员会同意。
(二)研究方法
1、收集血液样本
应用5ml促凝管收集所有研究对象空腹外周静脉血，经4℃离心机3000g/min离心15min后，收集血清，分装冻存，-80℃冰箱备用。
2、数据收集
所有临床数据的信息都来自患者住院期间的病例资料。试验室参数包括：血液学参数、红细胞沉降率(Erythrocyte sedimentation rate，ESR)、超敏C-反应蛋白(Highsensitivity C-reactive protein，Hs-CRP)和血清肌酐(Serum creatinine，Scr)等生化指标和HBsAg、HCV、HIV、ANA、ENA、ANCA等感染和免疫指标。白细胞(White blood cell，WBC)、血红蛋白(Hemoglobin，HB)和血小板(Platelet，PLT)由全自动血液分析仪Sysmex XN9000进行分析。使用Model Minitor-100测量ESR水平。使用AU-2700测量Hs-CRP和Scr水平。
3、试验操作
按照本申请实施例二的方法操作。
4、试验结果
(1)不同人群血清LAMP-2水平比较
比较SV、EH和HC三组间血清中LAMP-2水平，参见附图1所示。结果显示三组间血清LAMP-2水平差异有显著统计学意义(P<0.001)。进一步比较，结果显示EH组和HC组中血清LAMP-2水平显著低于SV患者，差异有统计学意义[SV vs EH：0.50(0.21-1.85)vs0.16(0.09-0.28)ug/mL，P<0.001；SVvsHC：0.50(0.21-1.85)vs0.19(0.10-0.28)ug/mL，P<0.001]。而EH和HC两组之间血清LAMP-2水平无显著性差异[EHvsHC：0.16(0.09-0.28)vs0.19(0.10-0.28)ug/mL，P＝0.442]。
比较SV活动期、非活动期、EH和HC各组间血清LAMP-2水平，参见附图2所示。结果显示SV活动期、非活动期和HC三组间血清LAMP-2水平差异有显著性统计学意义(P<0.001)。SV活动期患者血清LAMP-2水平显著高于非活动期患者和HC组[活动期vs非活动期：0.59(0.40-2.54)vs0.20(0.10-0.41)ug/mL，P<0.001；活动期vs HC：0.59(0.40-2.54)vs0.19(0.10-0.28)ug/mL，P<0.001]。而SV非活动期患者和HC两组之间血清LAMP-2水平无显著性差异[非活动期vsHC：0.20(0.10-0.41)vs0.19(0.10-0.28)ug/mL，P＝0.568]。
比较SV肾损伤、非肾损伤和HC三组间血清LAMP-2水平，参见附图3所示，结果显示三组间血清LAMP-2水平差异有显著性统计学意义(P<0.001)。SV肾损伤患者血清LAMP-2水平显著高于非肾损伤患者和HC组[肾损伤vs非肾损伤：0.57(0.35-2.33)vs0.27(0.15-1.13)ug/mL，P＝0.010；肾损伤vsHC：0.57(0.35-2.33)vs0.19(0.10-0.28)ug/mL，P<0.001]。此外，SV非肾损伤患者血清LAMP-2水平显著高于HC组[非肾损伤vsHC：0.27(0.15-1.13)vs0.19(0.10-0.28)ug/mL，P＝0.036]。
综合以上试验结果分析可知，SV组即血管炎性高血压患者组，患者血清LAMP-2水平显著高于EH组和HC组。
(2)血清LAMP-2水平与临床和试验室参数的相关性
血清LAMP-2水平与临床和试验室参数的相关性分析结果显示，参见附图4所示，血清LAMP-2水平与BVAS(r＝0.549，P<0.001)、Hs-CRP(r＝0.405，P<0.001)、24小时蛋白尿(r＝0.374，P＝0.003)呈显著正相关。然而，血清LAMP-2水平与Scr之间无相关性(r＝0.206，P＝0.075)。
(3)抗LAMP-2抗体对不同人群血清抗LAMP-2抗体水平比较
比较SV、EH和HC三组间血清抗LAMP-2抗体水平，参见附图5所示，结果显示三组间血清抗LAMP-2抗体差异有显著性统计学意义(P<0.001)。进一步两两比较结果显示，SV患者血清抗LAMP-2抗体水平显著高于EH和HC组，差异有统计学意义[SVvsEH：(127.98±54.98)vs(53.59±35.51)ng/mL，P<0.001；SVvsHC：(127.98±54.98)vs(55.21±25.09)ng/mL，P<0.001]。此外，EH和HC两组之间的抗LAMP-2抗体水平无显著差异[(53.59±35.51)vs(55.21±25.09)ng/mL，P＝0.850]。
综合以上试验结果分析可知，SV组即血管炎性高血压患者组，患者血清抗LAMP-2抗体水平显著高于EH组和HC组。
(4)血清LAMP-2和抗LAMP-2抗体对SV及活动期诊断价值的评估
观察血清LAMP-2和抗LAMP-2对于SV及活动期诊断的最佳切点值，绘制ROC曲线，利用约登指数寻找最佳切点值，参见附图6所示。对于SV的诊断，LAMP-2的最佳截止值为0.42ug/mL，敏感性和特异性分别为64.7％和89.1％。进一步评估血清LAMP-2对SV活动期诊断的价值，结果显示LAMP-2的最佳截止值为0.56ug/mL，敏感性和特异性分别为54.3％和87.5％。
抗LAMP-2抗体对SV诊断的最佳截止值为72.71ng/mL，敏感性和特异性分别为80.4％和76.1％。进一步评估血清LAMP-2自身抗体对SV活动期诊断的价值，结果显示抗LAMP-2抗体的最佳截止值为109.80ng/mL，敏感性和特异性分别为74.3％和62.5％。
实施例四：用于诊断血管炎性高血压的检测试剂盒效果验证试验
利用本发明实施例二的用于诊断用于诊断血管炎性高血压的检测试剂盒对52位血管炎性高血压患者、33位原发性高血压患者和20位健康对照组患者进行测定，采集测定血清中LAMP-2和LAMP-2抗体浓度，试验结果的参见表1所示。
表1：用于诊断血管炎性高血压的检测试剂盒效果验证试验
从上述数据可以看出，单一通过血清LAMP-2浓度或血清LAMP-2抗体浓度判断受测试误差的影响和患者本身机能的影响不能准确判定是否存在血管炎性高血压的情况，但是本申请的测试盒能够同时进行检测，就能准确快速的判断患者是否患有血管炎性高血压，从平行试验对象的检测过程来看，本申请检测时间缩短到一天内，大大缩短了检测时间，加快了治疗进程。通过实验结果可知，血管炎性高血压组的LAMP-2和LAMP-2抗体水平和对照组相比，均有显著差异，可以明确判断52名受试患者均患有血管炎性高血压；原发性高血压组的LAMP-2和LAMP-2抗体水平和对照组相比，差异均不显著；综合以上试验结果说明，本申请的用于诊断血管炎性高血压的检测试剂盒可以准确诊断血管炎性高血压疾病，而且上述52例无一例误诊或者漏诊，诊断准确性达到了100％，且检测方法简便、周期短、特异性好、灵敏度高等优点。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。
Claims (8)
1.一种用于诊断血管炎性高血压的检测试剂盒，其特征在于，所述包括LAMP-2标准品、LAMP-2抗体标准品、标准品稀释液、PBS、检测溶液A、检测溶液B、TMB底物溶液、洗涤液、终止溶液、96孔板，用于诊断血管炎性高血压的蛋白包括LAMP-2和LAMP-2抗体，所述LAMP-2和LAMP-2抗体从血清中检测。
2.如权利要求1所述的用于诊断血管炎性高血压的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒通过检测血清中LAMP-2和LAMP-2抗体的含量诊断血管炎性高血压。
3.如权利要求1所述的用于诊断血管炎性高血压的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含检测血清中LAMP-2和LAMP-2抗体的含量的试剂。
4.如权利要求1至3任意一项所述的用于诊断血管炎性高血压的检测试剂盒的检测方法，其特征在于，具体检测方法包括如下步骤：
（1）加样：分别设标准品稀释孔、待测样品孔、空白孔，标准品稀释孔设7孔，依次加入100μL的稀释后标准品，空白孔加入100μL标准品稀释液，待测样品孔加入100μL稀释血清样本，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时后，弃去液体，甩干，不洗涤；
（2）在步骤（1）制备的酶标板孔中，分别加入100μL检测溶液 A 工作液，酶标板覆膜，37℃温育1小时后，弃去孔内液体，重复洗板3次；
（3）在步骤（2）制备的酶标板孔中，每孔加100μL检测溶液 B 工作液，酶标板覆膜，37℃温育30分钟后，弃去孔内液体，甩干，重复洗板5次；
（4）在步骤（3）制备的酶标板孔中，每孔加TMB底物溶液90μL，酶标板覆膜，37℃避光显色；
（5）在步骤（4）制备的酶标板孔中，每孔加终止溶液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色；
（6）在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在 450nm波长测量各孔的光密度值，通过标准曲线计算样品中LAMP-2和LAMP-2抗体浓度。
5.如权利要求4所述的用于诊断血管炎性高血压的检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述稀释血清样本，向血清样本中加入PBS，配成500倍稀释的血清。
6.如权利要求4所述的用于诊断血管炎性高血压的检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述标准品为LAMP-2标准品和LAMP-2抗体标准品。
7.如权利要求4所述的用于诊断血管炎性高血压的检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述稀释后标准品，通过添加标准品稀释液依次倍比稀释成4000pg/mL、2000pg/mL、1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL。
8.如权利要求4所述的用于诊断血管炎性高血压的检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述血清样本，采用5ml促凝管采集外周静脉血，经4℃离心机3000g/min离心15min后，收集血清，分装冻存，-80℃冰箱备用。
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