CN114280290A - 一种用于评估系统性红斑狼疮凝血功能的试剂盒及其应用 - Google Patents
一种用于评估系统性红斑狼疮凝血功能的试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及抗体检测技术领域，尤其涉及一种用于评估系统性红斑狼疮凝血功能的试剂盒及其应用。本发明的试剂盒中含有检测aPT IgA抗体水平的试剂。本发明首次发现aPT IgA水平亦与狼疮患者凝血功能相关，而aPS IgA、IgM、IgG与狼疮患者凝血功能无相关性。因此，本方案发现了尚未应用于临床检测的aPT IgA水平与狼疮患者凝血功能的相关性，推测其在狼疮患者血栓形成、肾损伤中亦发挥作用，未来有可能将aPT抗体检测应用于临床，作为现有抗磷脂检测的补充手段。
Description
技术领域
本发明涉及抗体检测技术领域，尤其涉及一种用于评估系统性红斑狼疮凝血功能的试剂盒及其应用。
背景技术
抗磷脂抗体综合征(antiphospholipid syndrome，APS)是一种以反复发生的血栓形成、血小板减少、流产为主要临床特征，并伴有血清中抗磷脂抗体(antiphospholipidantibodies，aPL)存在的临床综合征。系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种多发于育龄期女性的累及全身多脏器的自身免疫性炎症性结缔组织病，可引起继发性APS。SLE患者体内B细胞过度活化，血浆中可检测到大量自身抗体，包括抗双链DNA(double strand DNA，dsDNA)抗体、抗核抗体(anti-nuclear antibody，ANA)、抗肾小球基底膜抗体、抗SSA抗体、抗SSB抗体、抗磷脂抗体等。
抗磷脂抗体谱是一组针对各种带负电荷磷脂、磷脂结合蛋白、磷脂-蛋白复合物的自身抗体的总称。现有研究认为，抗磷脂抗体通过干扰各种依赖磷脂的凝血因子和抗凝因子而影响机体的凝血功能。实验研究发现抗磷脂抗体在系统性红斑狼疮发病和疾病进展过程中起着重要作用，与狼疮性肾炎、凝血功能、血栓、疾病活动度密切相关。APS的临床实验诊断标准包括：抗β2糖蛋白1(anti-β2-glycoprotein 1，aβ2GPI)IgG、IgM、抗心磷脂(anticardiolipin，aCL)IgG、IgM和狼疮抗凝物(lupus anticoagulant，LA)。研究显示：除以上临床诊断标准抗体外，尚有数十种非诊断标准抗体(non-criteria aPLs)，包括抗磷脂酰丝氨酸抗体(anti-phosphatidylserine antibodies，aPS)、抗凝血酶原抗体(antiprothrombin antibody，aPT)、抗磷脂酰丝氨酸/凝血酶原复合物抗体(anti-phosphatidylserine/prothrombin complex antibodies，aPS/PT)，在自身免疫病的发生和发展中亦发挥重要的作用。凝血酶原通常与带负电荷的磷脂酰丝氨酸形成磷脂-磷脂结合蛋白复合物。aPS/PT作为临床检测指标，与血栓及产科并发症等相关性较强，主要用于诊断标准抗体阴性时的补充检测项目，或与多个抗磷脂抗体同时检测，提高检测的准确性。
凝血酶原是一种由肝脏合成的维生素K依赖性凝血因子，被激活后产生凝血酶，使血液中纤维蛋白原转变为纤维蛋白，激发凝血过程。抗凝血酶原抗体aPT为非中和性抗体，促进凝血酶原与磷脂或内皮细胞表面结合，导致凝血酶原局部浓度升高。而与抗体结合的凝血酶原仍可正常活化成凝血酶，激发凝血过程，产生局部血栓。
在哺乳动物细胞内，磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)占全部磷脂含量的5％～15％，并位于健康细胞质膜的胞质侧。当细胞受特定刺激激活后，PS迅速翻转至细胞外表面。PS在细胞外表面的表达被广泛认为在细胞凋亡及凝血级联反应启动过程中起关键作用。在凝血过程中，当血小板活化后，带负电荷的磷脂翻转到外表面，为凝血酶原复合物(FXa-FVa-Ca2+-磷脂复合物)的装配提供了适宜的平面，进一步激活凝血酶原，产生凝血酶，促进纤维蛋白原转变为纤维蛋白，引起血液凝固。凝血因子Ⅷ同样可与血小板表面表达的PS结合，这也是血管内凝血的关键步骤。
但是现有的狼疮抗凝物检测方法复杂，不易标准化，容易受到华法林、肝素等抗凝药物的影响，部分患者尽管临床表现符合APS，诊断标准抗磷脂抗体检测却呈阴性，称为血清学阴性的抗磷脂抗体综合征(Serologically negative antiphospholipid antibodysyndrome，SNAPS)。因此，迫切需要与临床指标相关性更好的检测指标辅助进行APS诊断，预测患者血栓、肾损伤等危险结局事件。aPS/PT目前已经应用于临床，作为现有抗磷脂抗体检测的补充手段，其导致患者血栓的机制尚不清楚，一般认为aPS/PT影响患者凝血功能，造成机体高凝状态，形成病理性血管微血栓，甚至进一步影响患者的肾功能、神经系统功能、心血管功能。然而，与aPS/PT相比，aPT，aPS和aPS/PT三种抗体之间虽然有相关性，但并不属于同一种抗体，其作用表位不同。自身抗体aPS和aPT尚未应用于临床，与患者凝血功能、血栓、肾功能、心血管系统功能、神经系统功能等的相关性尚未可知。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于评估系统性红斑狼疮凝血功能的试剂盒及其应用。
研究表明，多个抗磷脂抗体检测联合应用，可提高APS诊断的准确性。因此，本发明通过检测狼疮患者体内aPT、aPS、aPS/PT三种抗体及其亚型(IgA、IgG、IgM)的表达水平，旨在分析aPT、aPS、aPS/PT与凝血功能、肾功能等临床指标的相关性，为现有抗磷脂抗体检测提供新的补充手段。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种用于评估系统性红斑狼疮凝血功能的试剂盒，所述试剂盒中含有检测aPT IgA抗体水平的试剂。
本发明首次发现aPT IgA水平亦与狼疮患者凝血功能相关，而aPS IgA IgM IgG与狼疮患者凝血功能无相关性。因此，本方案发现了尚未应用于临床检测的aPT IgA水平与狼疮患者凝血功能的相关性，推测其在狼疮患者血栓形成、肾损伤中亦发挥作用，未来有可能将aPT抗体检测应用于临床，作为现有抗磷脂检测的补充手段。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒中还包括检测aPS/PT IgM和aPS/PT IgG抗体水平的试剂。
本发明结果表明，已经应用于临床的aPS/PT IgM和aPS/PT IgG抗体与狼疮患者凝血功能相关，高aPS/PT水平的患者血液呈高凝状态，推测其容易出现血栓、肾损伤，与既往研究及临床报道相符。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述评估系统性红斑狼疮凝血功能是为了预测患者血栓或肾损伤。
作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒为Elisa检测试剂盒。
本发明同时提供检测aPT IgA水平的试剂在制备评估系统性红斑狼疮凝血功能的试剂盒中的应用。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述试剂盒中还包括检测aPS/PT IgM和aPS/PT IgG抗体水平的试剂。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述评估系统性红斑狼疮凝血功能是为了预测患者血栓或肾损伤。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒。
本发明的有益效果：
本发明结果表明，已经应用于临床的aPS/PT IgM和aPS/PT IgG抗体与狼疮患者凝血功能相关，高aPS/PT水平的患者血液呈高凝状态，推测其容易出现血栓、肾损伤，与既往研究及临床报道相符。除此之外，本发明发现：aPT IgA水平亦与狼疮患者凝血功能相关，而aPS IgA、IgM、gG与狼疮患者凝血功能无相关性。因此，本方案发现了尚未应用于临床检测的aPT IgA水平与狼疮患者凝血功能的相关性，推测其在狼疮患者血栓形成、肾损伤中亦发挥作用，未来有可能将aPT抗体检测应用于临床，作为现有抗磷脂检测的补充手段。
附图说明
图1：狼疮患者血浆aPS/PT抗体水平与临床指标的相关性(N＝30)。
图2：狼疮患者血浆aPT抗体水平与临床指标的相关性(N＝30)。
图3：狼疮患者血浆aPS抗体水平与临床指标的相关性(N＝30)。
具体实施方式
为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
实施例1
本发明检测30例狼疮患者aPS/PT、aPT、aPS三种抗体及其亚型IgA、IgG、IgM的浓度，并进行自身抗体水平与临床指标相关性分析。aPS/PT IgA、IgG、IgM和aPT IgA、IgG、IgM测定按照ELISA试剂盒(J&L Biological Company,Shanghai,China)说明书的要求进行。aPS检测按照以下实验步骤进行：
(1)包被抗原：向牛血清白蛋白-磷脂酰丝氨酸偶联物(Cloud-Clone Corp,Texas,USA)100ug加入PBS，稀释至终浓度为5ng/ml。每孔加入60ul抗原至ELISA板内。密封96孔板，放入4℃冰箱孵育过夜。将96孔板从冰箱内取出，恢复至室温，弃去孔内液体，每孔加入含0.05％Tween20(Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd.)的PBST洗涤液200ul，洗涤3次。
(2)封闭非特异性结合位点：配置含0.5％明胶(Beijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.)和0.5％牛血清白蛋白(Beijing Solarbio Science&TechnologyCo.,Ltd.)的PBST封闭液，每孔加入封闭液100ul，密封板，室温放置1h。弃去孔内液体，每孔加入含0.05％Tween20的PBST洗涤液200ul，洗涤3次。
(3)添加待测样本：设置样本孔和空白孔。样本孔中加待测样本50μL，空白孔加PBS50ul。室温孵育2小时，每孔加入含0.05％Tween20的PBST洗涤液200ul，洗涤3次。
(4)添加抗体：将HRP-IgA抗体(BioLegend,California,USA)进行1：2000稀释，每孔加入60ul稀释后抗体，室温孵育1.5小时后直接显色。将Biotin-IgM(BioLegend,California,USA)和Biotin-IgG抗体(BioLegend,California,USA)进行1：2000稀释，每孔加入60ul稀释后抗体，室温孵育1小时。弃去孔内液体，每孔加入含0.05％Tween20的PBST洗涤液200ul，洗涤3次。将链酶亲和素-辣根过氧化物酶(BioLegend,California,USA)进行1：2000稀释，每孔加60ul，室温孵育30分钟。弃去孔内液体，每孔加入含0.05％Tween20的PBST洗涤液200ul，洗涤5次。
(5)TMB显色：每孔加入TMB显色液(Beijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.)100ul，37度孵育15分钟。每孔加入50ul TMB终止液(J&L Biological Company,Shanghai,China)，终止显色反应。
(6)读数：用酶标仪读取每个孔的光密度值(OD)，波长设置为450nm。
(7)计算：计算血浆样品对应的OD值。
本发明的实验结果如表1-3和图1-3所示。
表1：狼疮患者血浆aPS/PT抗体水平与临床指标的相关性(N＝30)
注：r：相关性系数；P<0.05定义为差异具有统计学意义；*：P<0.05；**：P<0.01。
凝血酶原的激活在凝血过程中起着关键作用，而临床检测凝血功能的指标中，凝血酶原时间、凝血酶原活动度、国际标准化比值反映了受试者体内凝血酶原的功能，反映患者凝血功能变化，能早期预测患者潜在的血栓风险。我们检测了30例狼疮患者血浆aPS/PTIgA、IgG、IgM 3个指标，结果如表1和图1所示：aPS/PT IgM与凝血酶原活动度成正相关，推测其通过影响凝血功能，导致血栓，进而引起肾损伤，与既往研究报道及临床现象相符。
表2：狼疮患者血浆aPT抗体水平与临床指标的相关性(N＝30)
注：r：相关性系数；P<0.05定义为差异具有统计学意义；*：P<0.05；**：P<0.01。
我们检测了30例狼疮患者血浆aPT IgA、IgG、IgM 3个指标，最新研究结果如表2和图2所示：尚未应用于临床的aPT IgA与狼疮患者凝血酶原时间成正相关，与凝血酶原活动度成负相关，与国际标准化比值成正相关。表明aPT IgA可以反映患者凝血酶原功能，与患者凝血功能相关，进而预测患者发生血栓的风险。
表3：狼疮患者血浆aPS抗体水平与临床指标的相关性(N＝30)
注：r：相关性系数；P<0.05定义为差异具有统计学意义；*：P<0.05；**：P<0.01。
如表3和图3所示，我们后续研究发现：现有临床指标aPS/PT IgA、IgG、IgM预测血栓等临床事件的不敏感性，部分原因可能在于其针对的PS/PT复合物抗原成分复杂，含有与早期凝血酶原功能不完全相关的指标PS抗原，细胞凋亡等其他病理过程也会影响PS在细胞膜的表达，进而影响aPS/PT指标的水平，体现在现有病人队列研究发现：aPS水平与凝血功能并无显著的关联性。
综上，本发明首次发现：已经应用于临床的aPS/PT IgG、IgM可以预测患者发生血栓的风险，但是其针对的抗原成分复杂，含有与早期凝血酶原功能不完全相关的指标PS抗原，导致其反应凝血酶原功能的特异性不高。与aPS/PT IgG、IgM相比，aPT IgA抗原成分单一，反映凝血酶原功能的敏感性和特异性更高，更能预测狼疮患者发生血栓的风险。
实施例2 aPT抗体试剂盒
本实施例选取6例狼疮患者血浆标本进行梯度稀释(1:10-1:800)，检测自己制备aPT抗体试剂盒的检测范围。实验步骤如下：
(1)收取血浆标本
采用含有EDTA的采血管收集6例狼疮患者新鲜全血，室温静置30min，吸取上清液，4000rpm离心5分钟，取上清检测。
(2)PT纯品稀释
取人凝血酶原纯品，加入PBS溶解稀释至终浓度为50ug/ml。
(3)包被抗原
向96孔板中每孔加入60ul抗原，保鲜膜密封，放入4℃冰箱孵育过夜。将96孔板取出，恢复至室温，弃去孔内液体，每孔加入含0.05％Tween20的PBST洗涤液200ul，洗涤3次。
(4)封闭液封闭非特异性结合位点
称取0.15g明胶和0.15g牛血清白蛋白，加入30ml PBST，充分溶解，配置成含0.5％明胶和牛血清白蛋白的封闭液，置于冰上，每孔加入封闭液200ul，保鲜膜封好，室温放置1h。弃去孔内液体，每孔加入含0.05％Tween20的PBST洗涤液200ul，洗涤3次。
(5)添加样本
取血浆样本(编号为1-6)，采用PBS稀释至1:10、1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600浓度梯度。向样本孔中加入稀释血浆50ul，空白孔中加入PBS 50ul。保鲜膜密封，室温下孵育2h。弃去孔内液体，每孔加入含0.05％Tween20的PBST洗涤液200ul，洗涤3次。
(6)添加抗体
将HRP-IgA抗体按照抗体：PBS＝1：2000稀释，每孔加入60ul稀释后抗体，室温孵育1.5小时后直接显色。将Biotin-IgM和Biotin-IgG抗体按照抗体：PBS＝1：2000稀释，每孔加入60ul稀释后抗体，室温孵育1小时。弃去孔内液体，每孔加入含0.05％Tween20的PBST洗涤液200ul，洗涤3次。将链酶亲和素-辣根过氧化物酶进行1：2000稀释，每孔加60ul，室温孵育30min。弃去孔内液体，每孔加入含0.05％Tween20的PBST洗涤液200ul，洗涤5次。
(7)显色
每孔加100ul TMB显色液，37度孵育15min。加入50ul TMB终止液，立即置于酶标仪上，进行读数，波长设置为450nm。
(8)计算结果
复孔取平均值，计算每个样本的OD值。结果如下：
表4：梯度稀释狼疮血浆后的aPT IgA OD450nm水平(N＝6)
表5：梯度稀释狼疮血浆后的aPT IgG OD450nm水平(N＝6)
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| 1:10 | 0.1875 | 1.085 | 1.2565 | 2.4755 | 1.254 | 0.421 |
| 1:50 | 0.0505 | 0.4425 | 0.629 | 1.358 | 0.433 | 0.122 |
| 1:100 | 0.0255 | 0.2685 | 0.399 | 0.8695 | 0.2475 | 0.08 |
| 1:200 | 0.0225 | 0.1055 | 0.278 | 0.6275 | 0.156 | 0.0365 |
| 1:400 | 0.0465 | 0.1045 | 0.166 | 0.3305 | 0.1265 | 0.05 |
| 1:800 | 0.0305 | 0.0875 | 0.143 | 0.2205 | 0.046 | 0.024 |
表6：梯度稀释狼疮血浆后的aPT IgM OD450nm水平(N＝6)
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| 1:10 | 1.8185 | 1.1695 | 1.506 | 0.701 | 1.3665 | 1.791 |
| 1:50 | 0.743 | 0.423 | 0.7555 | 0.293 | 0.619 | 0.777 |
| 1:100 | 0.527 | 0.2625 | 0.515 | 0.2115 | 0.3685 | 0.462 |
| 1:200 | 0.393 | 0.14 | 0.391 | 0.1725 | 0.26 | 0.306 |
| 1:400 | 0.194 | 0.1455 | 0.2545 | 0.1285 | 0.203 | 0.2495 |
| 1:800 | 0.1515 | 0.149 | 0.194 | 0.061 | 0.093 | 0.2005 |
结果表明：血浆在稀释10-800倍后，本发明检测方法依然有较好的检测能力，敏感性高。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (8)
1.一种用于评估系统性红斑狼疮凝血功能的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有检测aPT IgA抗体水平的试剂。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括检测aPS/PT IgM和aPS/PT IgG抗体水平的试剂。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述评估系统性红斑狼疮凝血功能是为了预测患者血栓或肾损伤。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒。
5.检测aPT IgA水平的试剂在制备评估系统性红斑狼疮凝血功能的试剂盒中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中还包括检测aPS/PT IgM和aPS/PT IgG抗体水平的试剂。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述评估系统性红斑狼疮凝血功能是为了预测患者血栓或肾损伤。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为ELISA检测试剂盒。
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| IVAN PALOMO ET AL: "Antiphospholipid antibodies in Chilean patients with systemic lupus erythematosus", 《J LAB CLIN MED》, vol. 140, no. 5, pages 337 - 338 * |
| 张蜀澜等: "抗磷脂综合征病态妊娠患者中抗磷脂抗体谱的临床意义", 《中华临床实验室管理电子杂志》, vol. 5, no. 4, pages 226 - 231 * |
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