CN112378835B - 一种标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品及其制备方法、应用 - Google Patents
一种标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品及其制备方法、应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于细胞检测分析技术领域，具体涉及一种标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品及其制备方法、应用。其中，标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品的制备方法，包括以下步骤：（1）将荧光聚苯乙烯微球分散于冻干保护剂中，得到聚苯乙烯微球混液；（2）取精确定量的聚苯乙烯微球混液置于液氮中，得到球形制剂；（3）将球形制剂置于流式管中，放入冻干机进行冷冻干燥。利用冻干保护剂冻干荧光聚苯乙烯微球，冻干后微球可长期保存，并稳定用于流式淋巴亚群标准绝对计数；经液氮速冻凝结成球形制剂，冻干后球形制剂可便携运输和实验操作；微球冻干效率和回收率高，冻干后微球能够直接用于流式淋巴细胞亚群的绝对计数。
Description
技术领域
本发明属于细胞检测分析技术领域，具体涉及一种标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品及其制备方法、应用。
背景技术
淋巴细胞的水平是机体细胞免疫和体液免疫功能的重要指标。当不同的淋巴细胞亚群的量及功能发生异常改变时，机体就会产生一系列的病理变化及免疫功能失调，因此检测人类淋巴细胞亚群的变化，对一些疾病的早期发现和控制、临床治疗及评估机体免疫状态有着非常重要的意义。
流式细胞术，是临床上检测淋巴亚群的标准，能够同时检测集中淋巴细胞的表面抗原，能够得到亚群细胞的相对比例，通过参照物，可以由相对比例计算出亚群细胞的绝对数量。
目前，亚群细胞的绝对计数比较常用方法是用计数微球。市面上的标准聚苯乙烯绝对计数微球是溶液或粉末，其在实际应用过程中存在以下不足之处：
（1）储存和运输条件苛刻，需要低温（2-8℃）；
（2）储存周期短，保存期限为1年左右；
（3）不能直接用于流式淋巴亚群的绝对计数，需要先验证微球溶液或粉末是否影响抗体试剂反应体系，使用过程繁琐，费时费力，有可能影响抗体试剂的反应体系；
（4）实验操作时有环境污染风险。
因此，本领域亟需提供一种便于实验操作、可便携运输、性能稳定，用于流式淋巴亚群标准绝对计数。
发明内容
基于现有技术中存在的上述不足之处，本发明的目的之一是至少解决现有技术中存在的上述问题之一或多个，换言之，本发明的目的之一是提供满足前述需求之一或多个的一种标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品及其制备方法、应用。
为了达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品的制备方法，包括以下步骤：
（1）将荧光聚苯乙烯微球分散于冻干保护剂中，得到聚苯乙烯微球混液；
（2）取精确定量的聚苯乙烯微球混液置于液氮中，得到球形制剂；
（3）将球形制剂置于流式管中，放入冻干机进行冷冻干燥。
利用冻干保护剂冻干荧光聚苯乙烯微球，冻干后微球可长期保存，并稳定用于流式淋巴亚群标准绝对计数；经液氮速冻凝结成球形制剂，冻干后球形制剂可便携运输和实验操作；微球冻干效率和回收率高，冻干后微球能够直接用于流式淋巴细胞亚群的绝对计数。
作为优选方案，所述冻干保护剂包括磷酸盐缓冲液、海藻糖、甘露醇、牛血清白蛋白和Decon90溶液，冻干保护剂的pH为7.0～7.4。本发明的冻干保护剂的Decon90溶液作为表面活性剂，在冻干微球复溶后，能有效降低复溶悬液表面张力，增强微球亲水性，有助增强微球悬液分散作用。
作为优选方案，所述海藻糖占磷酸盐缓冲液的质量/体积百分比浓度为2～3%。
作为优选方案，所述甘露醇占磷酸盐缓冲液的质量/体积百分比浓度为2～10%。
作为优选方案，所述牛血清白蛋白占磷酸盐缓冲液的质量/体积百分比浓度为1～5%。
作为优选方案，所述Decon90溶液占磷酸盐缓冲液的体积百分比浓度为0.05～0.1%。
作为优选方案，所述冷冻干燥的工艺过程，包括：
装料：冻干机隔板2～30℃保存5～10min；
冷冻：斜坡时间为20～40min，冻干机隔板温度降至-60～-50℃后，将具有油球形制剂的流式管置于冷冻机隔板上，冷冻持续2～5h；
制冷后箱：-60℃持续15～30min；
抽真空：真空度50Pa；
干燥阶段：-45℃持续7h，真空度10～20Pa；-40℃持续20h，真空度5～10Pa；-30℃持续1h，真空度10～20Pa；-20℃持续1h，真空度10～20Pa；-10℃持续19h，真空度10～20Pa；+20℃持续1h，真空度10～20Pa。
作为优选方案，所述流式管具有锁扣帽。带有锁扣帽的流式管能有效避免管中微球在冷冻干燥过程中相互污染。
本发明还提供一种如上任一方案所述制备方法制得的标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品。
本发明还提供如上方案所述的标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品的应用，每一流式管内的标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品，用于淋巴细胞亚群的绝对计数。
本发明与现有技术相比，有益效果是：
（1）本发明的标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品能够直接用于流式淋巴细胞亚群的绝对计数，可以广泛应用于临床试验；
（2）本发明的标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品的淋巴计数准确度高，通过淋巴细胞亚群6色抗体标记，精准对淋巴细胞绝对计数，准确输出不同淋巴细胞亚群的绝对计数；
（3）本发明的标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品、抗体等试剂和样品可以直接加入流式管中进行样品处理和上机绝对计数检测，操作方便，性能稳定，同时不影响抗体反应体系；
（4）本发明采用含锁扣帽的流式管，能有效避免管中微球在冷冻干燥过程中相互污染，冻干后含锁扣帽的流式管也能降低实验的生物危害；
（5）本发明冻干前后标准聚苯乙烯绝对计数微球回收率高，性能稳定，冻干工艺可靠。
（6）本发明的标准聚苯乙烯绝对计数微球的品质稳定性强，保存时间长，可以节省不同批次产品的对照验证次数，满足广大终端用户的需求。
附图说明
图1为本发明实施例1及对照组1的去细胞碎片后的FSC通道和SSC通道上的细胞信号图；其中，A对应实施例1，B对应对照组1；
图2是本发明实施例1及对照组1的去细胞碎片后的CD45 PerCP通道和SSC通道上的细胞信号图；其中，A对应实施例1，B对应对照组1；
图3是本发明实施例1及对照组1的去细胞碎片后的CD4 PE-Cy7通道和CD16+56通道上的细胞信号图；其中，A对应实施例1，B对应对照组1；
图4为本发明实施例2及对照组2的去细胞碎片后的FSC通道和SSC通道上的细胞信号图；其中，A对应实施例2，B对应对照组2；
图5是本发明实施例2及对照组2的去细胞碎片后的CD45 PerCP通道和SSC通道上的细胞信号图；其中，A对应实施例2，B对应对照组2；
图6是本发明实施例2及对照组2的去细胞碎片后的CD4 PE-Cy7通道和CD16+56通道上的细胞信号图；其中，A对应实施例2，B对应对照组2；
图7为本发明实施例3及对照组3的去细胞碎片后的FSC通道和SSC通道上的细胞信号图；其中，A对应实施例3，B对应对照组3；
图8是本发明实施例3及对照组3的去细胞碎片后的CD45 PerCP通道和SSC通道上的细胞信号图；其中，A对应实施例3，B对应对照组3；
图9是本发明实施例3及对照组3的去细胞碎片后的CD4 PE-Cy7通道和CD16+56通道上的细胞信号图；其中，A对应实施例3，B对应对照组3；
图10为本发明实施例4及对照组4的去细胞碎片后的FSC通道和SSC通道上的细胞信号图；其中，A对应实施例4，B对应对照组4；
图11是本发明实施例4及对照组4的去细胞碎片后的CD45 PerCP通道和SSC通道上的细胞信号图；其中，A对应实施例4，B对应对照组4；
图12是本发明实施例4及对照组4的去细胞碎片后的CD4 PE-Cy7通道和CD16+56通道上的细胞信号图；其中，A对应实施例4，B对应对照组4。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步解释说明。
实施例1：
本实施例的标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品，由冻干保护剂和荧光聚苯乙烯微球混合，制得聚苯乙烯微球混液；然后经液氮速冻制成球形制剂，经冻干后呈白色球状。
具体地，本实施例的标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品的制备方法，包括：
（1）将荧光聚苯乙烯微球分散于冻干保护剂中，涡旋混液，制得聚苯乙烯微球混液；
其中，本实施例的冻干保护剂包括溶剂和溶质，溶剂为0.01M的磷酸盐缓冲液，溶质配比为：2%(w/v)海藻糖，2%(w/v)甘露醇，3%(w/v)BSA，0.06%(v/v)Decon90溶液；其中，w/v是指溶质占溶剂的质量/体积百分比浓度，单位为g/mL；v/v是指溶质占溶剂的体积百分比浓度。另外，冻干保护剂的pH为7.2；
（2）精确定量吸取10μL制得的聚苯乙烯微球混液于液氮中，速冻凝结成球形制剂；
（3）将每个球形制剂分别转移至各自对应的含锁扣帽的流式管中，置于流式管恒温金属架中，一并放入冻干机隔板冻干。
其中，标准聚苯乙烯绝对计数微球按照下述步骤进行冻干：
装料：隔板4℃保存10分钟；
冷冻：斜坡时间为32min，隔板温度降至-55℃后，将流式管恒温金属架置于隔板上，-55℃冷冻持续3h；
制冷后箱：-60℃持续15min；
抽真空：真空度50Pa；
干燥阶段：-45℃持续7h，真空度15Pa；-40℃持续20h，真空度10Pa；-30℃持续1h，真空度15Pa；-20℃持续1h，真空度15Pa；-10℃持续19h，真空度15Pa；+20℃持续1h，真空度15Pa。
冻干结束，密封保存，得到含有标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品的流式管，采用1管/1测试的包装规格使实验人员便携用于流式淋巴细胞亚群的绝对计数。
具体地，利用本实施例的标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品进行流式淋巴细胞亚群的绝对计数的检测，检测方法：取相同批次冻干品，分别加入淋巴细胞亚群6色抗体试剂（CD3/CD16+CD56/CD4/CD8/CD19/CD45）和50 μL健康人血液，室温避光孵育30分钟，加入450μL溶血素，室温避光孵育30分钟，上机检测，流式结果如图1-3所示。其中，以未加冻干保护剂作为对照组1，对照组1的其他条件同本实施例。
图1中，A代表实施例1的去细胞碎片后的FSC通道和SSC通道上的细胞信号图，左侧的框代表绝对计数微球群，下侧的框代表淋巴细胞群，可知绝对计数微球群可以和其它细胞群分离，并且聚集程度高；B代表对照组1的去细胞碎片后的FSC通道和SSC通道上的细胞信号图，显示出绝对计数微球群虽然可以和其它细胞群分离，但是聚集程度低。
图2中，A代表实施例1的去细胞碎片后的CD45 PerCP通道和SSC通道上的细胞信号图，A下侧的框代表CD45-PerCP抗体标记的淋巴细胞群，右侧的框代表绝对计数微球群，可知绝对计数微球群可以和其它细胞群分离，并且聚集程度高；B代表对照组1的去细胞碎片后的CD45 PerCP通道和SSC通道上的细胞信号图显示出绝对计数微球群虽然可以和其它细胞群分离，但是聚集程度低。
图3中，A代表实施例1的去细胞碎片后的CD4 PE-Cy7通道和CD16+56通道上的细胞信号图，右上角的框代表绝对计数微球群，中间的框代表NK细胞群，右下角的框代表辅助T细胞，可知绝对计数微球群可以和其它细胞群分离，并且聚集程度高；B代表对照组1的去细胞碎片后的CD4 PE-Cy7通道和CD16+56通道上的细胞信号图，显示出绝对计数微球群虽然可以和其它细胞群分离，但是聚集程度低。
另外，还对冻干前后的计数微球回收率进行检测，如表1所示。
表1冻干前后的计数微球的浓度对比
| 组别 | 冻干前计数微球浓度（个/μL） | 冻干后计数微球浓度（个/μL） | 回收率 |
| 实施例1 | 193 | 185 | 95.85% |
| 对照组1 | 193 | 14 | 7.25% |
由表1可知，未加冻干保护剂的对照组1，其冻干后的回收率仅为7.25%，而本实施例1的添加冻干保护剂冻干后的回收率可以达到95.85%，回收率明显提高。
实施例2：
本实施例的标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品，由冻干保护剂和荧光聚苯乙烯微球混合，制得聚苯乙烯微球混液；然后经液氮速冻制成球形制剂，经冻干后呈白色球状。
具体地，本实施例的标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品的制备方法，包括：
（1）将荧光聚苯乙烯微球分散于冻干保护剂中，涡旋混液，制得聚苯乙烯微球混液；
其中，本实施例的冻干保护剂包括溶剂和溶质，溶剂为0.01M的磷酸盐缓冲液，溶质配比为：2.5%(w/v)海藻糖，4%(w/v)甘露醇，5%(w/v)BSA，0.06%(v/v)Decon90溶液；其中，w/v是指溶质占溶剂的质量/体积百分比浓度，单位为g/mL；v/v是指溶质占溶剂的体积百分比浓度。另外，冻干保护剂的pH为7.2；
（2）精确定量吸取10μL制得的聚苯乙烯微球混液于液氮中，速冻凝结成球形制剂；
（3）将每个球形制剂分别转移至各自对应的含锁扣帽的流式管中，置于流式管恒温金属架中，一并放入冻干机隔板冻干。
其中，标准聚苯乙烯绝对计数微球按照下述步骤进行冻干：
装料：隔板2℃保存5分钟；
冷冻：斜坡时间为20min，隔板温度降至-55℃后，将流式管恒温金属架置于隔板上，-55℃冷冻持续3h；
制冷后箱：-60℃持续20min；
抽真空：真空度50 Pa；
干燥阶段：-45℃持续7h，真空度10Pa；-40℃持续20h，真空度8Pa；-30℃持续1h，真空度10Pa；-20℃持续1h，真空度10Pa；-10℃持续19h，真空度10Pa；+20℃持续1h，真空度10Pa。
冻干结束，密封保存，得到含有标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品的流式管，采用1管/1测试的包装规格使实验人员便携用于流式淋巴细胞亚群的绝对计数。
具体地，利用本实施例的标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品进行流式淋巴细胞亚群的绝对计数的检测，检测方法：取相同批次冻干品，分别加入淋巴细胞亚群6色抗体试剂（CD3/CD16+CD56/CD4/CD8/CD19/CD45）和50 μL健康人血液，室温避光孵育30分钟，加入450μL溶血素，室温避光孵育30分钟，上机检测，流式结果如图4-6所示。其中，以未加冻干保护剂作为对照组2，对照组2的其他条件同本实施例。
图4中，A代表实施例2的去细胞碎片后的FSC通道和SSC通道上的细胞信号图，左侧的框代表绝对计数微球群，下侧的框代表淋巴细胞群，可知绝对计数微球群可以和其它细胞群分离，并且聚集程度高；B代表对照组2的去细胞碎片后的FSC通道和SSC通道上的细胞信号图，显示出绝对计数微球群虽然可以和其它细胞群分离，但是聚集程度低。
图5中，A代表实施例2的去细胞碎片后的CD45 PerCP通道和SSC通道上的细胞信号图，下侧的框代表CD45-PerCP抗体标记的淋巴细胞群，右侧的框代表绝对计数微球群，可知绝对计数微球群可以和其它细胞群分离，并且聚集程度高；B代表对照组2的去细胞碎片后的CD45 PerCP通道和SSC通道上的细胞信号图，显示出绝对计数微球群虽然可以和其它细胞群分离，但是聚集程度低。
图6中，A代表实施例2的去细胞碎片后的CD4 PE-Cy7通道和CD16+56通道上的细胞信号图，右上角的框代表绝对计数微球群，中间的框代表NK细胞群，右下角的框代表辅助T细胞，可知绝对计数微球群可以和其它细胞群分离，并且聚集程度高；B代表对照组2的去细胞碎片后的CD4 PE-Cy7通道和CD16+56通道上的细胞信号图，显示出绝对计数微球群虽然可以和其它细胞群分离，但是聚集程度低。
另外，还对冻干前后的计数微球回收率进行检测，如表2所示。
表2冻干前后的计数微球的浓度对比
| 组别 | 冻干前计数微球浓度（个/μL） | 冻干后计数微球浓度（个/μL） | 回收率 |
| 实施例2 | 193 | 178 | 92.22% |
| 对照组2 | 193 | 14 | 7.25% |
由表2可知，未加冻干保护剂的对照组2，其冻干后的回收率仅为7.25%，而本实施例2的添加冻干保护剂冻干后的回收率可以达到92.22%，回收率明显提高。
实施例3：
本实施例的标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品，由冻干保护剂和荧光聚苯乙烯微球混合，制得聚苯乙烯微球混液；然后经液氮速冻制成球形制剂，经冻干后呈白色球状。
具体地，本实施例的标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品的制备方法，包括：
（1）将荧光聚苯乙烯微球分散于冻干保护剂中，涡旋混液，制得聚苯乙烯微球混液；
其中，本实施例的冻干保护剂包括溶剂和溶质，溶剂为0.01M的磷酸盐缓冲液，溶质配比为：3%(w/v)海藻糖，10%(w/v)甘露醇，5%(w/v)BSA，0.1%(v/v)Decon90溶液；其中，w/v是指溶质占溶剂的质量/体积百分比浓度，单位为g/mL；v/v是指溶质占溶剂的体积百分比浓度。另外，冻干保护剂的pH为7.0；
（2）精确定量吸取10μL制得的聚苯乙烯微球混液于液氮中，速冻凝结成球形制剂；
（3）将每个球形制剂分别转移至各自对应的含锁扣帽的流式管中，置于流式管恒温金属架中，一并放入冻干机隔板冻干。
其中，标准聚苯乙烯绝对计数微球按照下述步骤进行冻干：
装料：隔板30℃保存8分钟；
冷冻：斜坡时间为40min，隔板温度降至-55℃后，将流式管恒温金属架置于隔板上，-55℃冷冻持续5h；
制冷后箱：-60℃持续30min；
抽真空：真空度50Pa；
干燥阶段：-45℃持续7h，真空度20 Pa；-40℃持续20h，真空度5Pa；-30℃持续1h，真空度20 Pa；-20℃持续1h，真空度20 Pa；-10℃持续19h，真空度20Pa；+20℃持续1h，真空度20Pa。
冻干结束，密封保存，得到含有标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品的流式管，采用1管/1测试的包装规格使实验人员便携用于流式淋巴细胞亚群的绝对计数。
具体地，利用本实施例的标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品进行流式淋巴细胞亚群的绝对计数的检测，检测方法：取相同批次冻干品，分别加入淋巴细胞亚群6色抗体试剂（CD3/CD16+CD56/CD4/CD8/CD19/CD45）和50 μL健康人血液，室温避光孵育30分钟，加入450μL溶血素，室温避光孵育30分钟，上机检测，流式结果如图7-9所示。其中，以未加冻干保护剂作为对照组3，对照组3的其他条件同本实施例。
图7中，A代表实施例3的去细胞碎片后的FSC通道和SSC通道上的细胞信号图，左侧的框代表绝对计数微球群，下侧的框代表淋巴细胞群，可知绝对计数微球群可以和其它细胞群分离，并且聚集程度高；B代表对照组3的去细胞碎片后的FSC通道和SSC通道上的细胞信号图，显示出绝对计数微球群虽然可以和其它细胞群分离，但是聚集程度低。
图8中，A代表实施例3的去细胞碎片后的CD45 PerCP通道和SSC通道上的细胞信号图，下侧的框代表CD45-PerCP抗体标记的淋巴细胞群，右侧的框代表绝对计数微球群，可知绝对计数微球群可以和其它细胞群分离，并且聚集程度高；B代表对照组3的去细胞碎片后的CD45 PerCP通道和SSC通道上的细胞信号图，显示出绝对计数微球群虽然可以和其它细胞群分离，但是聚集程度低。
图9中，A代表实施例3的去细胞碎片后的CD4 PE-Cy7通道和CD16+56通道上的细胞信号图，右上角的框代表绝对计数微球群，中间的框代表NK细胞群，右下角的框代表辅助T细胞，可知绝对计数微球群可以和其它细胞群分离，并且聚集程度高；B代表对照组3的去细胞碎片后的CD4 PE-Cy7通道和CD16+56通道上的细胞信号图，显示出绝对计数微球群虽然可以和其它细胞群分离，但是聚集程度低。
另外，还对冻干前后的计数微球回收率进行检测，如表3所示。
表3冻干前后的计数微球的浓度对比
| 组别 | 冻干前计数微球浓度（个/μL） | 冻干后计数微球浓度（个/μL） | 回收率 |
| 实施例3 | 193 | 179 | 92.74% |
| 对照组3 | 193 | 14 | 7.25% |
由表3可知，未加冻干保护剂的对照组3，其冻干后的回收率仅为7.25%，而本实施例3的添加冻干保护剂冻干后的回收率可以达到92.74%，回收率明显提高。
实施例4：
本实施例的标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品，由冻干保护剂和荧光聚苯乙烯微球混合，制得聚苯乙烯微球混液；然后经液氮速冻制成球形制剂，经冻干后呈白色球状。
具体地，本实施例的标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品的制备方法，包括：
（1）将荧光聚苯乙烯微球分散于冻干保护剂中，涡旋混液，制得聚苯乙烯微球混液；
其中，本实施例的冻干保护剂包括溶剂和溶质，溶剂为0.01M的磷酸盐缓冲液，溶质配比为：3%(w/v)海藻糖，10%(w/v)甘露醇，1%(w/v)BSA，0.05%(v/v)Decon90溶液；其中，w/v是指溶质占溶剂的质量/体积百分比浓度，单位为g/mL；v/v是指溶质占溶剂的体积百分比浓度。另外，冻干保护剂的pH为7.4；
（2）精确定量吸取10μL制得的聚苯乙烯微球混液于液氮中，速冻凝结成球形制剂；
（3）将每个球形制剂分别转移至各自对应的含锁扣帽的流式管中，置于流式管恒温金属架中，一并放入冻干机隔板冻干。
其中，标准聚苯乙烯绝对计数微球按照下述步骤进行冻干：
装料：隔板4℃保存10分钟；
冷冻：斜坡时间为32min，隔板温度降至-55℃后，将流式管恒温金属架置于隔板上，-55℃冷冻持续3h；
制冷后箱：-60℃持续15min；
抽真空：真空度50Pa；
干燥阶段：-45℃持续7h，真空度12Pa；-40℃持续20h，真空度6Pa；-30℃持续1h，真空度18Pa；-20℃持续1h，真空度16Pa；-10℃持续19h，真空度15Pa；+20℃持续1h，真空度12Pa。
冻干结束，密封保存，得到含有标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品的流式管，采用1管/1测试的包装规格使实验人员便携用于流式淋巴细胞亚群的绝对计数。
具体地，利用本实施例的标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品进行流式淋巴细胞亚群的绝对计数的检测，检测方法：取相同批次冻干品，分别加入淋巴细胞亚群6色抗体试剂（CD3/CD16+CD56/CD4/CD8/CD19/CD45）和50 μL健康人血液，室温避光孵育30分钟，加入450μL溶血素，室温避光孵育30分钟，上机检测，流式结果如图10-12所示。其中，以未加冻干保护剂作为对照组4，对照组4的其他条件同本实施例。
图10中，A代表实施例4的去细胞碎片后的FSC通道和SSC通道上的细胞信号图，左侧的框代表绝对计数微球群，下侧的框代表淋巴细胞群，可知绝对计数微球群可以和其它细胞群分离，并且聚集程度高；B代表对照组4的去细胞碎片后的FSC通道和SSC通道上的细胞信号图，显示出绝对计数微球群虽然可以和其它细胞群分离，但是聚集程度低。
图11中，A代表实施例4的去细胞碎片后的CD45 PerCP通道和SSC通道上的细胞信号图，下侧的框代表CD45-PerCP抗体标记的淋巴细胞群，右侧的框代表绝对计数微球群，可知绝对计数微球群可以和其它细胞群分离，并且聚集程度高；B代表对照组4的去细胞碎片后的CD45 PerCP通道和SSC通道上的细胞信号图，显示出绝对计数微球群虽然可以和其它细胞群分离，但是聚集程度低。
图12中，A代表实施例4的去细胞碎片后的CD4 PE-Cy7通道和CD16+56通道上的细胞信号图，右上角的框代表绝对计数微球群，中间的框代表NK细胞群，右下角的框代表辅助T细胞，可知绝对计数微球群可以和其它细胞群分离，并且聚集程度高；B代表对照组4的去细胞碎片后的CD4 PE-Cy7通道和CD16+56通道上的细胞信号图，显示出绝对计数微球群虽然可以和其它细胞群分离，但是聚集程度低。
另外，还对冻干前后的计数微球回收率进行检测，如表4所示。
表4冻干前后的计数微球的浓度对比
| 组别 | 冻干前计数微球浓度（个/μL） | 冻干后计数微球浓度（个/μL） | 回收率 |
| 实施例4 | 193 | 172 | 89.11% |
| 对照组4 | 193 | 14 | 7.25% |
由表4可知，未加冻干保护剂的对照组4，其冻干后的回收率仅为7.25%，而本实施例4的添加冻干保护剂冻干后的回收率可以达到89.11%，回收率明显提高。
以上所述仅是对本发明的优选实施例及原理进行了详细说明，对本领域的普通技术人员而言，依据本发明提供的思想，在具体实施方式上会有改变之处，而这些改变也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将荧光聚苯乙烯微球分散于冻干保护剂中，得到聚苯乙烯微球混液；
(2)取精确定量的聚苯乙烯微球混液置于液氮中，得到球形制剂；
(3)将球形制剂置于流式管中，放入冻干机进行冷冻干燥；
所述冻干保护剂包括磷酸盐缓冲液、海藻糖、甘露醇、牛血清白蛋白和Decon90溶液，冻干保护剂的pH为7.0～7.4；
所述海藻糖占磷酸盐缓冲液的质量/体积百分比浓度为2～3％；
所述甘露醇占磷酸盐缓冲液的质量/体积百分比浓度为2～10％；
所述牛血清白蛋白占磷酸盐缓冲液的质量/体积百分比浓度为1～5％；
所述Decon90溶液占磷酸盐缓冲液的体积百分比浓度为0.05～0.1％；
所述冷冻干燥的工艺过程，包括：
装料：冻干机隔板2～30℃保存5～10min；
冷冻：斜坡时间为20～40min，冻干机隔板温度降至-55℃后，将具有油球形制剂的流式管置于冷冻机隔板上，冷冻持续2～5h；
制冷后箱：-60℃持续15～30min；
抽真空：真空度50Pa；
干燥阶段：-45℃持续7h，真空度10～20Pa；-40℃持续20h，真空度5～10Pa；-30℃持续1h，真空度10～20Pa；-20℃持续1h，真空度10～20Pa；-10℃持续19h，真空度10～20Pa；+20℃持续1h，真空度10～20Pa；
所述流式管具有锁扣帽。
2.一种如权利要求1所述制备方法制得的标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品。
3.如权利要求2所述的标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品的应用，其特征在于，每一流式管内的标准聚苯乙烯绝对计数微球冻干品，用于淋巴细胞亚群的绝对计数。
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