CN111965344B - 一种冻干磁微粒化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种冻干磁微粒化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫检测领域，具体涉及一种冻干磁微粒化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。所述冻干磁微粒化学发光检测试剂盒，为真空试剂管，管内容物为含10‑100个冻干磁微粒偶联抗体或抗原和冻干吖啶酯或酶标记抗体或抗原的两种冻干小微球。本发明提供的冻干磁微粒化学发光免疫检测试剂盒采用液氮滴珠预冷冻技术，将两种核心原料分别冻干成两种小微球，单独存在于一个真空试剂管中，该冻干磁微粒化学发光免疫检测试剂盒可以室温保存并且可以保证生物活性，便于运输、贮存和即时检测使用。

Description

一种冻干磁微粒化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及免疫检测领域，具体涉及一种冻干磁微粒化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
近年来化学发光免疫检测技术发展迅速，在医学、生命科学等领域的应用得到不断扩展。免疫学检测主要是利用抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种方法，由于其可以利用同位素、酶、化学发光物质等对检测信号进行放大和显示，因此常被用于检测蛋白质、激素等微量物质。
化学发光免疫分析是将化学发光底物与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。化学发光反应的原理是将发光物质或酶标记在抗原(或抗体)上，通过氧化底物激发发光物质发光，然后通过化学发光分析仪进行检测。
目前化学发光产品试剂盒都是液体包装，由于化学发光产品所用的核心原料(抗原或抗体)为生物活性物质，常温易失去生物活性，因此所有的液体试剂盒均需冷链运输和低温保存。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种冻干磁微粒化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。本发明采用液氮滴珠预冷冻技术，将两种核心原料分别冻干成两种小微球，单独存在于一个真空试剂管中，该冻干磁微粒化学发光免疫检测试剂盒可以室温保存并且可以保证生物活性，便于运输、贮存和即时检测使用。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案。
一种冻干磁微粒化学发光检测试剂盒，该试剂盒为真空试剂管，如图1所示，管内容物为含10-100个冻干磁微粒偶联抗体或抗原和冻干吖啶酯或酶标记抗体或抗原的两种冻干小微球。
进一步地，所述真空试剂管的材料为石英、玻璃或PDMS、PMMA、PS、PC、COC、COP高聚物中的一种。
进一步地，所述真空试剂管直径5-10mm，体积0.5-2ml；所述真空试剂管的盖子在冻干机中自动压紧试剂管口后，应完全密闭，保持真空，且能够被加样针、清洗针轻易刺破。
所述真空试剂管的真空是指试剂管内的气压低于1个标准大气压。
所述真空试剂管内的冻干小微球是通过液氮冻干滴球机将2-20ul“微液滴”滴在盛有液氮的试剂管中，形成预冰冻的微小球体(液氮滴球)。将所述的盛有液氮滴球的试剂管转移至真空冷冻冻干机完成冷冻干燥，并真空压盖，形成冻干的小微球制品。
所述小微球体积为2-20ul。
所述小微球分为两种不同组分，即A微球和B微球。
所述A微球组分为超顺磁性微球偶联抗原或抗体及冻干液组成，所述超顺磁性微球直径为2-10um。
所述B微球组分为标记物偶联抗原或抗体及冻干液组成，所述标记物包括吖啶酯及衍生物、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。
所述冻干液为含有冻干赋形剂及0.2-1％的牛血清白蛋白的0.02-0.1M三羟甲基氨基甲烷或磷酸盐或碳酸盐缓冲液。
所述冻干赋形剂为蔗糖、葡萄糖、海藻糖的一种或几种。
所述的冻干赋形剂浓度为5-20％。
所述冻干磁微粒化学发光免疫检测试剂盒的其制备方法，具体包括以下步骤。
步骤1、磁微粒偶联抗体方法和吖啶酯或酶偶联抗体的方法制备磁微粒偶联抗体(捕获抗体)和吖啶酯或酶偶联抗体(标记抗体)。
步骤2、冻干溶液的制备：将制备好的磁微粒联抗体(捕获抗体)和吖啶酯或酶偶联抗体(标记抗体)分别与冻干液按比例混匀制成“磁微粒-捕获抗体”冻干溶液和“标记物-抗体”冻干溶液。
步骤3、微球成型：将制备好的“磁微粒-捕获抗体”冻干溶液和“标记物-抗体”冻干溶液分别通过液氮冻干滴球机将“微液滴”定量滴在盛有液氮的试剂管中，形成预冰冻的微小球体(液氮滴球)，微球体积2-20ul。
步骤4、冷冻干燥：将步骤3制得的盛有液氮滴球的试剂管转移至真空冷冻冻干机完成冷冻干燥，并真空压盖，形成制品。
进一步地，步骤1中所述磁微粒偶联捕获抗体的方法为：取商品化超顺磁性微球悬液，离心，保留磁珠，弃上清液，加入磷酸盐(PBS)或三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液洗涤，离心，保留磁珠，弃上清液，反复此操作1-3次；加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，活化1-2小时后，按照磁珠表面积:抗体重量比值为1mm2：50-100ug的比例加入捕获抗体反应1-2小时；离心，保留磁珠，弃去上清，加入由20mMTris、0.1％吐温、0.5％牛血清白蛋白组成的保存液，重复上述操作1-3次，得磁微粒-抗体溶液(捕获抗体)。
进一步地，步骤1中所述吖啶酯(或酶)偶联抗体的制备方法为：取吖啶酯，用碳酸盐或磷酸盐(PBS)缓冲液配置成1-10mg/ml溶液，按照吖啶酯：抗体摩尔比为5-20:1比例加入抗体，反应1-3小时，加入10％赖氨酸溶液0.5-1小时，终止反应，透析纯化后得吖啶酯偶联抗体。
与现有技术比，本发明的有益效果如下。
本发明提供的冻干磁微粒化学发光免疫检测试剂盒发明采用液氮滴珠预冷冻技术，将两种核心原料分别冻干成两种小微球，单独存在于一个真空试剂管中，室温保存可保证生物活性，便于运输和贮存，方便临床即时检测使用。
附图说明
图1是真空试管的示意图。
图2是冻干磁微粒化学发光试剂与电化学发光结果相关性结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进一步阐述。但本发明并非局限于此，本说明书中未作详细描述之内容为本领域专业技术人员公知现有技术。
实施例一吖啶酯标记直接发光法制备降钙素原(PCT)定量检测试剂盒。
降钙素原(PCT)是诊断和监测细菌炎性疾病感染的一个重要指标。
降钙素原(PCT)定量检测试剂盒制备方法如下。
制备吖啶酯偶联PCT标记抗体：取吖啶酯粉末，用0.1M碳酸盐缓冲液稀释终浓度为1mg/ml，取抗PCT抗体，按照抗体：吖啶酯＝1：10摩尔比的比例加入吖啶酯溶液，室温反应1小时，加入10％赖氨酸溶液0.5小时，终止反应，透析纯化后得吖啶酯-PCT抗体1”溶液(标记抗体)，含抗体浓度为0.2mg/ml。
制备磁微粒偶联PCT捕获抗体：取磁性微球悬液400μL，离心，保留磁珠，弃上清液，加入20mM磷酸盐缓冲液(PBS)，离心，保留磁珠，弃上清液，反复此操作3次。洗涤完成后，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，反应1小时。活化完成后，加入抗PCT抗体400ug，反应2小时。反应完成后，离心，保留磁珠，弃去上清，加入保存液800ul(20mMTris，0.1％吐温，0.5％牛血清白蛋白)，重复上述操作3次，得磁微粒-PCT抗体溶液(捕获抗体)，含抗体浓度为0.5mg/ml。
冻干液制备：0.02M三羟甲基氨基甲烷缓冲液中加入蔗糖，至终浓度15％；向溶液中加入牛血清白蛋白，并使其最终含量达到0.5％。
标记物冻干溶液：取“标记抗体”1ml，加99ml冻干液，混匀，2-8℃保存。
捕获物冻干溶液：取“捕获抗体”1ml，加99ml冻干液，混匀，2-8℃保存。
通过液氮冻干滴球机分别将上述“标记物冻干溶液”和“捕获物冻干溶液”各100ul滴在盛有液氮的试剂管中，形成冰冻的微小球体，每个小球体积10ul，每个试剂管中分别装有10个标记物冻干球和10个捕获物冻干冻干球。
冷冻干燥：将盛装液氮冰冻小微球的试剂管转移至真空冷冻冻干机完成冷冻干燥，并真空压盖，形成冻干制品。
实施例二癌胚抗原定量检测试剂盒制备-辣根过氧化物酶(HRP)标记的酶促化学发光法(间接化学发光)。
癌胚抗原(CEA)为一种广谱肿瘤标志物，临床上用于诊断肿瘤的发生。
制备辣根过氧化物酶标记CEA抗体：取HRP，用0.1M磷酸盐缓冲液配制成10mg/ml溶液，加入等量的抗CEA抗体，反应1小时，透析纯化过夜后，得备“HRP-CEA抗体1”溶液(标记抗体)，含抗体浓度为0.2mg/ml。
制备磁微粒偶联CEA捕获抗体：取磁性微球悬液400μL，离心，保留磁珠，弃上清液，加入20mMPBS，离心，保留磁珠，弃上清液，反复此操作3次。洗涤完成后，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，反应1小时。活化完成后，加入抗CEA抗体，反应2小时。反应完成后，离心，保留磁珠，弃去上清，加入保存液800ul(20mMTris，0.1％吐温，0.5％牛血清白蛋白)，重复上述操作3次，得磁微粒-CEA抗体溶液(捕获抗体)，含抗体浓度为0.5mg/ml。
冻干液制备：0.02M磷酸盐缓冲液中加入海藻糖，至终浓度10％；向溶液中加入牛血清白蛋白，并使其最终含量达到0.5％。
标记物冻干溶液：取“标记抗体”1ml，加99ml冻干液，混匀，2-8℃保存。
捕获物冻干溶液：取“捕获抗体”1ml，加99ml冻干液，混匀，2-8℃保存。
通过液氮冻干滴球机分别将上述“标记物冻干溶液”和“捕获物冻干溶液”各100ul滴在盛有液氮的试剂管中，形成冰冻的微小球体，每个小球体积5ul，每个试剂管中分别装有20个标记物冻干球和20个捕获物冻干球。
冷冻干燥：将盛装液氮冰冻的微小球的试剂管转移至真空冷冻冻干机完成冷冻干燥，并真空压盖，形成冻干制品。
实施例三肌钙蛋白I定量检测试剂盒制备-碱性磷酸酶(AP)标记的酶促化学发光法(间接化学发光)。
肌钙蛋白I(CTNI)是心肌损伤的重要指标。
制备碱性磷酸酶(AP)标记的CTNI抗体：取AP，用NaHCO3缓冲液配制成5mg/ml溶液，加入5倍体积的0.06M的过碘酸钠，室温反应30min，加入5倍体积的0.16M的乙二醇，室温反应1小时终止反应，透析纯化，加入等量的抗cTnI抗体，反应3小时，再次透析纯化,即得“AP-CTNI抗体1”溶液(标记抗体)，含抗体浓度为0.2mg/ml。
制备磁微粒偶联cTnI捕获抗体：取磁珠溶液400μL，磁性分离，保留磁珠，弃上清液，加入洗涤液，反复1-3次后，加入偶联液，进行磁性分离，保留磁珠弃上清，反复1-3次后，加入抗cTnI抗体，加入偶联试剂，反应1-2小时后，加入封闭液进行封闭，1小时后，磁性分离，保留磁珠，弃去上清，加入保存液，重复上述操作一次，得磁微粒-cTnI抗体溶液(捕获抗体)，含抗体浓度为0.2mg/ml。
冻干液制备：0.02M三羟甲基氨基甲烷缓冲液中加入葡萄糖，至终浓度10％；向溶液中加入牛血清白蛋白，并使其最终含量达到0.5％。
标记物冻干溶液：取“标记抗体”2ml，加98ml冻干液，混匀，2-8℃保存。
捕获物冻干溶液：取“捕获抗体”1ml，加99ml冻干液，混匀，2-8℃保存。
通过液氮冻干滴球机分别将上述“标记物冻干溶液”和“捕获物冻干溶液”各100ul滴在盛有液氮的试剂管中，形成冰冻的微小球体，每个小球体积20ul，每个试剂管中分别装有5个标记物冻干球和5个捕获物冻干球。
冷冻干燥：将盛装液氮冰冻的微小球的试剂管转移至真空冷冻冻干机完成冷冻干燥，并真空压盖，形成冻干制品。
实施例四冻干磁微粒化学发光免疫检测试剂盒稳定性考察。
以降钙素原质控品(低值0.1ng/ml，高值5ng/ml)对实施例一中“降钙素原(PCT)定量检测试剂盒(冻干磁微粒吖啶酯直接化学发光)”进行常温(2-30℃放置)稳定性试验测试，结果见表1，结果表明，冻干磁微粒化学发光试剂在常温条件下，放置18个月，产品稳定。
表1.冻干磁微粒化学发光试剂常温放置条件下稳定性试验结果。
浓度(ng/ml) 1月 2月 3月 6月 9月 12月 18月 平均 CV
0.1 0.113 0.123 0.106 0.102 0.109 0.104 0.097 0.107 5.34
5 5.028 4.96 5.187 5.023 4.874 5.221 5.124 5.052 2.17
实施例五冻干磁微粒化学发光免疫检测试剂一致性考察。
对实施例一中“降钙素原(PCT)定量检测试剂盒(冻干磁微粒吖啶酯直接化学发光)”与罗氏“降钙素原检测试剂盒(电化学发光)”，进行一致性比对评价，结果见表2及图2。结果表明冻干磁微粒化学发光试剂与罗氏电化学发光测定结果，相关性良好。
表2.冻干磁微粒化学发光试剂与电化学发光一致性评价结果。

Claims (7)

1.一种冻干磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒为真空试剂管，管内容物为含10-100个冻干磁微粒偶联抗体或抗原和冻干吖啶酯或酶标记抗体或抗原的两种冻干小微球；所述冻干小微球是通过液氮冻干滴球机将2-20ul “微液滴”滴在盛有液氮的试剂管中，形成预冰冻的微小球体；将所述的盛有液氮滴球的试剂管转移至真空冷冻冻干机完成冷冻干燥，并真空压盖，形成冻干的小微球制品；所述真空试剂管直径5-10mm，体积0.5-2ml；所述真空试剂管的盖子在冻干机中自动压紧试剂管口后，应完全密闭，保持真空，且能够被加样针、清洗针轻易刺破；所述真空试剂管的真空是指试剂管内的气压低于1个标准大气压；
具体包括以下步骤：
步骤1、利用磁微粒偶联抗体方法和吖啶酯或酶偶联抗体的方法制备磁微粒偶联抗体和吖啶酯或酶偶联抗体；
步骤2、冻干溶液的制备：将制备好的磁微粒偶联抗体和吖啶酯或酶偶联抗体分别与冻干液按比例混匀制成“磁微粒-捕获抗体”冻干溶液和“标记物-抗体”冻干溶液；
步骤3、微球成型：将制备好的“磁微粒-捕获抗体”冻干溶液和“标记物-抗体”冻干溶液分别通过液氮冻干滴球机将“微液滴”定量滴在盛有液氮的试剂管中，形成预冰冻的微小球体，微球体积2-20ul；
步骤4、冷冻干燥：将步骤3制得的盛有液氮滴球的试剂管转移至真空冷冻冻干机完成冷冻干燥，并真空压盖，形成制品。
2.如权利要求1所述的冻干磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述真空试剂管的材料为石英、玻璃或PDMS、PMMA、PS、PC、COC、COP高聚物中的一种。
3.如权利要求1所述的冻干磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述冻干小微球的体积为2-20ul。
4.如权利要求1所述的冻干磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述小微球分为两种不同组分，即A微球和B微球；所述A微球组分为超顺磁性微球偶联抗原或抗体及冻干液组成，所述超顺磁性微球直径为2-10um；所述B微球组分为标记物偶联抗原或抗体及冻干液组成，所述标记物包括吖啶酯及衍生物、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。
5.如权利要求4所述的冻干磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述冻干液为含有冻干赋形剂及0.2-1%的牛血清白蛋白的0.02-0.1M三羟甲基氨基甲烷或磷酸盐或碳酸盐缓冲液。
6.如权利要求5所述的冻干磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述冻干赋形剂为蔗糖、葡萄糖、海藻糖的一种或几种。
7.如权利要求5所述的冻干磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的冻干赋形剂浓度为5-20%。
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