CN107367620A - 一种检测血液中降钙素原的试剂盒及降钙素原的检测方法 - Google Patents
一种检测血液中降钙素原的试剂盒及降钙素原的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测血液中降钙素原的试剂盒及降钙素原的检测方法，该检测方法包括：1)用链霉亲和素包被磁珠；2)用生物素标记降钙素原单克第一隆抗体；3)将包被有链霉亲和素的磁珠与标记有生物素的降钙素原单克隆第一抗体结合反应，得磁珠‑SA‑生物素‑PCT单抗溶剂；4)用降钙素原单克隆第二抗体标记吖啶酯，制得吖啶酯‑PCT单抗溶剂；5)样本或校准品中的降钙素原与吖啶酯‑PCT单抗溶剂、磁珠‑SA‑生物素‑PCT单抗溶剂发生反应；6)清洗后，计算样本中降钙素原的含量。本发明提供的降钙素原的试剂盒及降钙素原的检测方法，解决了出结果时间较长的问题，可以用于做末梢全血样本，且在不降低灵敏度的情况下拉宽检测范围。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测血液中降钙素原的试剂盒及降钙素原的检测方法。
背景技术
降钙素原(procalcitonin，PCT)是无激素活性的降钙素前肽物质，降钙素仅在甲状腺的C细胞受到激素性刺激时才产生，降钙素原可由很多器官的不同类型细胞在受到促炎症反应刺激特别是受到细菌引起的刺激后分泌。
降钙素原是一种能特异性区分细菌感染和其它原因导致的炎症反应的重要标志物，当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时，其在血浆中的水平升高。临床资料显示，PCT浓度>0.1ng/mL时说明存在临床相关的细菌感染，需要采用抗生素进行治疗；当PCT浓度>0.5ng/mL时，要考虑患者可能有发展成重症败血症或败血症性休克的危险。PCT反映了全身炎症反应的活跃程度。影响PCT水平的因素包括被感染器官的大小和类型、细菌的种类、炎症的程度和免疫反应的状况。检测病例中PCT浓度的变化，有利于判断机体细菌感染情况，评判机体健康状况，对临床和基础性研究都有重要意义。
自上世纪80年代以后，免疫学检测技术随着单克隆抗体、人工合成多肽、基因工程表达抗原及各种标记技术的成熟而迅速发展，免疫比浊法、速率散射比浊法(INA)、胶乳增强透射比浊法(ITA)与化学发光分析技术逐渐取代传统的免疫沉淀、免疫凝集物，使检测更为快捷，近些年快速检测(POCT)的应用使免疫学操作更为简单、方便。
目前，多种免疫学检测技术应用于PCT检测，既可以定性，亦可以定量。
罗氏诊断产品开发了一种定量化学发光免疫检测方法，其具体检测方法如下：
■第一步反应:加样后,样本中的降钙素原(PCT)和生物素标记的降钙素原单克隆抗体(Ab)以及吡啶钌标记的降钙素原单克隆抗体形成夹心复合物；
■第二步反应:加入包被有链霉亲和素(SA)的磁性微粒，夹心复合物固定在磁性微粒上，将磁性微粒提取到读数模块，可以根据吡啶钌的发光值计算相应的降钙素原浓度值；
■出结果时间18分钟，样本类型：血清，血浆，检测范围：0.02-100ng/mL。
但上述的检测方法存在以下问题：1)出结果时间较长；2)不能做末梢全血样本，小孩检测炎症或感染需要的采血量较大；3)测量范围窄，高浓度的样本需要稀释。因此，对已有技术所存在的缺陷进行改进，使其在临床检测时能够发挥更为有效的作用至关重要。
发明内容
本发明为解决现有技术中的上述问题，提出一种检测血液中降钙素原的试剂盒及降钙素原的检测方法，解决了出结果时间较长的问题，可以用于做末梢全血样本检测，且在不降低灵敏度的情况下拉宽检测范围。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一个方面是提供一种检测血液中降钙素原的方法，包括步骤：
1)用链霉亲和素包被磁珠；
2)用生物素标记降钙素原单克第一隆抗体；
3)将步骤1)制得的包被有链霉亲和素的磁珠与步骤2)制得的标记有生物素的降钙素原单克隆第一抗体结合反应，得磁珠-SA-生物素-PCT单抗溶剂；
4)用降钙素原单克隆第二抗体标记吖啶酯，制得吖啶酯-PCT单抗溶剂；
5)样本或校准品中的降钙素原与步骤4)制得的吖啶酯-PCT单抗溶剂、步骤3)制得的磁珠-SA-生物素-PCT单抗溶剂发生反应，形成双抗体夹心复合物；
6)将未反应的溶剂清洗去除后，可根据双抗体夹心复合物的数量，计算样本中降钙素原的含量；
进一步地，在所述的检测血液中降钙素原的方法中，步骤1)中所述磁珠
进一步地，在所述的检测血液中降钙素原的方法中，步骤2)中所述降钙素原单克隆第一抗体与所述生物素的质量比为1:3-1:8。
进一步地，在所述的检测血液中降钙素原的方法中，步骤3)中所述包被有链霉亲和素的磁珠与所述标记有生物素的降钙素原单克隆抗体的质量比为90:1-110:1。
进一步地，在所述的检测血液中降钙素原的方法中，步骤4)中所述降钙素原单克隆第二抗体与所述吖啶酯的质量比为1:3-1:8。
本发明的第二个方面是提供一种用于所述检测方法的试剂盒，包括由若干并排设置的孔位组成的试剂条，所述试剂条包含的试剂有磁珠-SA-生物素-PCT单抗溶剂、吖啶酯-PCT单抗溶剂。
进一步地，在所述的试剂盒中，所述试剂条上的一孔位内设有磁棒套。
进一步地，在所述的试剂盒中，所述试剂盒还包含样本稀释液、校准品、磁珠清洗液以及预激发液。
进一步优选地，在所述的试剂盒中，所述样本稀释液是含有表面活性剂聚山梨酯-80或十二烷基聚乙二醇醚的Tris-HCl缓冲液；所述磁珠清洗液是含有吐温、防腐剂的Tris-HCl缓冲液。
进一步优选地，在所述的试剂盒中，所述预激发液是含有双氧水、硝酸溶液；所述校准品是含有一定量的PCT抗原的BSA蛋白溶液。
进一步地，在所述的试剂盒中，所述所述试剂条上的0号位设有磁棒套；1号位设有磁珠-SA-生物素-PCT单抗溶剂；2号位设有样本稀释液；3、5、6、7号位设有磁珠清洗液；4号孔位设有吖啶酯-PCT单抗溶剂；8号位设有预激发液。
本发明的第三个方面是提供一种所述检测试剂盒的使用方法，检测时，所述试剂条置放于孵育仓内，所述孵育仓设置于输送带上，所述输送带连接水平位移电机，所述输送带的末端设有分析读数模块；并采用可相对磁棒套上下移动的上吸式磁珠转移枪实现所述试剂条上取磁棒套、吸取磁珠、磁珠洗脱、磁珠混匀、磁棒套打脱动作；
所述上吸式磁珠转移枪，包括可与所述磁棒套过盈连接的提取枪枪头、位于所述提取枪枪头轴心线上用于吸附磁珠的磁棒，所述磁棒由提取电机驱动并相对所述提取枪枪头上下移动；
具体包括如下使用步骤：
通过上吸式磁珠转移枪提取0号位孔的磁棒套，整个检测在一个连体的试剂条中由右向左进行，样本加在2号位孔后，磁棒套将第1号位孔的磁珠-SA-生物素-PCT单抗溶剂提到2号位孔，完成第一步反应；反应结束后由磁棒将结合物提取到3号位孔的清洗液中清洗，洗去未结合的样本；清洗结束后由磁棒套将结合物提取到4号位孔开始第二步反应；反应结束后由磁棒套将结合物依次通过5、6、7号位进行三次清洗，最终提取到8号位孔的预激发液中，添加激发液读取信号值。
进一步地，所述提取电机安装于所述提取枪顶端，且所述提取电机通过电机轴与所述磁棒连接。
进一步地，所述提取枪枪头可与所述磁棒套的内壁或其外壁过盈连接。
进一步地，所述提取枪由设置于基板上的纵向位移电机驱动进行上下移动。
进一步优选地，所述纵向位移电机的输出轴上设有螺杆，所述螺杆上设有螺母，所述螺母与所述提取枪固定连接。
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明提供的检测血液中降钙素原的方法，是基于两步法双抗夹心原理，同时利用磁分离原理和吖啶酯化学发光方法制备的试剂盒，将磁珠-SA-生物素-PCT单抗溶剂与吖啶酯-PCT单抗溶剂发生结合反应，形成双抗原夹心复合物，用于检测样本中降钙素原的含量；本发明检测方法及其试剂盒应用链霉亲和素和生物素放大信号值原理提高灵敏度，有效解决了现有现有检测方法反应时间长、检测范围窄等问题，且本发明检测方法出结果时间可以控制在10分钟以内，检测范围可以扩宽到0.02-240ng/mL；此外，本发明通过在样本稀释液中添加了一种表面活性剂，可以降低测试背景，降低红细胞对测试产生的干扰，使试剂可以检测及检测末梢血或全血样本。综上，本发明检测方法及其检测试剂盒解决了出结果时间较长的问题，可以用于做末梢全血样本，且在不降低灵敏度的情况下拉宽检测范围。
附图说明
图1为本发明检测血液中降钙素原的检测方法的反应原理示意图；
图2为本发明一血液中降钙素原的检测试剂条的结构示意图；
图3为本发明上吸式磁珠转移枪的结构示意图；
图4为本发明上吸式磁珠转移枪的截面结构示意图；
图5为本发明上吸式磁珠转移枪在吸取磁珠时磁棒和磁棒套的位置状态图；
图6为本发明上吸式磁珠转移枪在洗脱磁珠时磁棒和磁棒套的位置状态图；
图7为采用本发明检测方法将浓度值为255ng/mL的样本按一定的比例稀释时，理论浓度与实测浓度的线性关系图；
图8为采用本发明检测试剂盒与现有化学发光试剂盒测定227份EDTA血浆的结果相关性图；
图9为采用本发明检测试剂盒测定142份末梢血(全血)和同源血浆的结果相关性图；
其中，各附图标记为：
1-水平位移电机，2-输送带，3-孵育仓，4-试剂条，5-磁棒套，6-纵向位移电机，7-基板，8-螺杆，9-螺母，10-提取电机，11-转移枪，12-提取枪枪头，13-分析读数模块，14-电机轴，15-磁棒，16-磁珠。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例1
本实施例提供了一种检测血液中降钙素原的方法，包括如下步骤：
1)用链霉亲和素包被磁珠：磁珠用0.1M的PBS缓冲液稀释到10mg/mL；按质量比磁珠：链霉亲和素＝1:8-1:12的比例添加链霉亲和素，37℃反应16-24小时；磁分离清洗后，稀释到Tris-Hcl体系的封闭液中，封闭液含有1％BSA、0.1％酪蛋白、3％蔗糖，37℃封闭16-24小时，磁分离清洗后，用上述封闭液稀释到10mg/mL保存，制得包被有链霉亲和素的磁珠；
2)用生物素标记降钙素原单克第一隆抗体：将降钙素原单克第一隆抗体透析后用0.1M的PBS缓冲液稀释到1mg/mL，按质量比抗体：生物素＝1:3-1:8的比例添加生物素，25℃反应4小时进行标记，标记结束后用0.1M的PBS缓冲液透析16-24小时，换液3次，制得物素标记抗体；
3)将步骤1)制得的包被有链霉亲和素的磁珠与步骤2)制得的标记有生物素的降钙素原单克隆第一抗体按质量比90:1-110:1的比例混合，于37℃包被16-24小时，完成第一步反应，包被结束后磁分离清洗4次，用步骤1)中的封闭液按磁珠浓度稀释到10mg/mL保存，得磁珠-SA-生物素-PCT单抗溶剂；
4)将降钙素原单克隆第二抗体透析后用0.1M的PBS缓冲液稀释到1mg/mL，按质量比抗体：吖啶酯＝1:3-1:8的比例添加生物素，25℃反应4小时，标记结束后用G-50凝胶分离纯化，0.01M的Tris-Hcl做洗脱液，收集的吖啶酯标记抗体采用步骤1)中的封闭液稀释到0.1mg/mL保存，制得吖啶酯-PCT单抗溶剂；
5)样本或校准品中的降钙素原与步骤4)制得的吖啶酯-PCT单抗溶剂、步骤3)制得的磁珠-SA-生物素-PCT单抗溶剂发生反应，形成双抗体夹心复合物；
6)将未反应的溶剂清洗去除后，通过形成复合物的数量，可以计算样本中降钙素原的含量；
作为本实施例检测血液中降钙素原的方法的一个优选技术方案，步骤1)中所述磁珠与所述链霉亲和素的质量比为1:10；步骤2)中所述降钙素原单克隆第一抗体与所述生物素的质量比为1:3-1:8；步骤3)中所述包被有链霉亲和素的磁珠与所述标记有生物素的降钙素原单克隆抗体的质量比为90:1-110:1；步骤4)中所述降钙素原单克隆第二抗体与所述吖啶酯的质量比为1:3-1:8。
实施例2
本实施例提供了一种用于所述检测方法的试剂盒，包括由若干并排设置的孔位组成的试剂条，所述试剂条包含的试剂有磁珠-SA-生物素-PCT单抗溶剂、吖啶酯-PCT单抗溶剂。所述试剂盒还包含样本稀释液、校准品、磁珠清洗液以及预激发液。相应的试剂采用热封膜技术分别密封储存于试剂条上相应的孔位内，有效防止了试剂串孔，解决了运输问题。
在本实施例的降钙素原的检测方法的检测试剂盒中，所述试剂条上的一孔位内设有用于与专用上吸式磁珠转移枪配套使用的磁棒套，在于采用该试剂盒进行降钙素原检测时，用上吸式磁珠转移枪转移磁珠技术，将磁棒深入到液体内部快速提取磁珠；该试剂盒上的磁棒套采用一次性磁棒套，防止磁珠污染磁棒，同时使得磁珠洗脱变得容易。
以及在本实施例的降钙素原的检测方法的检测试剂盒中，所述样本稀释液是含有表面活性剂聚山梨酯-80或十二烷基聚乙二醇醚的Tris-HCl缓冲液，在样本稀释液中添加了一种表面活性剂，可以降低测试背景，降低红细胞对测试产生的干扰，使试剂可以检测可以检测末梢血或全血样本；所述磁珠清洗液是含有吐温、防腐剂的Tris-HCl缓冲液。所述预激发液是含有双氧水、硝酸溶液；所述校准品是含有一定量的PCT抗原的BSA蛋白溶液。
此外，如图2所示为本实施例的试剂条结构图，所述试剂条上的0号位设有磁棒套；1号位设有磁珠-SA-生物素-PCT单抗溶剂；2号位设有样本稀释液；3、5、6、7号位设有磁珠清洗液；4号孔位设有吖啶酯-PCT单抗溶剂；8号位设有预激发液。具体地，如图2所示，从右到左依次为磁棒套、磁珠-SA-生物素-PCT单抗溶剂、样本稀释液、磁珠清洗液、吖啶酯-PCT单抗溶剂、磁珠清洗液、磁珠清洗液、磁珠清洗液以及预激发液。
实施例3
本实施例提供了一种所述检测试剂盒的使用方法，检测时，所述试剂条4置放于孵育仓3内，所述孵育仓3设置于输送带2上，所述输送带2连接水平位移电机1，所述输送带2的末端设有分析读数模块13；并采用可相对磁棒套5上下移动的上吸式磁珠转移枪实现所述试剂条上取磁棒套、吸取磁珠、磁珠洗脱、磁珠混匀、磁棒套打脱动作。
请继续参阅如图2所示，通过上吸式磁珠转移枪提取0号位孔的磁棒套5，整个检测在一个连体的试剂条中由右向左进行，样本加在2号位孔后，磁棒套5将第1号位孔的磁珠-SA-生物素-PCT单抗溶剂提到2号位孔，完成第一步反应，反应结束后由磁棒15将结合物提取到3号位孔的清洗液中清洗，洗去未结合的样本；清洗结束后由磁棒套5将结合物提取到4号位孔开始第二步反应，反应结束后由磁棒套5将结合物依次通过5、6、7号位进行三次清洗，最终提取到8号位孔的预激发液中，添加激发液读取信号值。
如图3所示为上吸式磁珠转移枪的结构示意图，该上吸式磁珠转移枪与试剂条上的磁棒套配套使用。具体地，该上吸式磁珠转移枪包括可与所述磁棒套5过盈连接的提取枪枪头12、位于所述提取枪枪头12轴心线上用于吸附磁珠16的磁棒15，采用本实施例的上吸式磁珠转移枪进行磁珠转移时，通过提取枪枪头12提取磁棒套5，然后通过磁棒15的相对位移使得磁棒套5带磁性或失去磁性，继而通过磁棒套5吸附磁珠16进行转移。
采用实施例2所试剂盒进行血液中氨基末端脑利钠肽前体检测时，将所述试剂条4置放于孵育仓3内，所述孵育仓3设置于输送带2上，所述输送带2连接水平位移电机1，所述输送带2的末端设有分析读数模块13。
如图4所示，提取电机10安装于转移枪11顶端，且提取电机10通过电机轴14与磁棒15连接，磁棒15装设在电机轴14的下端，通过提取电机10控制电机轴14的上下移动，继而带动其下端的磁棒15上下移动，远离或靠近磁棒套5的底部，使得磁棒套5的底部带磁性或失去磁性，用于磁珠16的转移。
在本实施例的上吸式磁珠转移枪上，提取枪枪头12可与磁棒套5的内壁或其外壁过盈连接。具体地，提取枪枪头12随转移枪11整体向下移动，提取枪枪头12呈筒状，可设计提取枪枪头12的内径略小于磁棒套5的外径，使提取枪枪头12过盈包紧在磁棒套5的外壁上，在包紧过程中，由于受提取枪枪头12向下的力作用，磁棒套5发生一定的形变；或设计提取枪枪头12的外径略大于磁棒套5的内径，使提取枪枪头12过盈紧贴在磁棒套5的内壁上，在贴合的过程中，由于受提取枪枪头12向下的力作用，磁棒套5在挤压过程中发生一定的形变。
如图3所示，孵育仓3设置于输送带2上，输送带2连接水平位移电机1，由水平位移电机1驱动输送带2运行，继而带动其上的孵育仓3移动至相应位置，输送带2的末端还设有用于对磁珠混均后的试剂进行检测分析的分析读数模块13。
请继续参阅如图3所示的上吸式磁珠转移枪，转移枪11由设置于基板7上的纵向位移电机6驱动进行上下移动，基板7固定在输送带2上方位置，纵向位移电机6固定安装在基板7，并与转移枪11连接，用于驱动转移枪11整体进行上下移动。优选地，纵向位移电机6的输出轴上设有螺杆8，螺杆8上设有螺母9，螺母9与转移枪11固定连接，即纵向位移电机6通过螺杆8带动螺杆8上的转移枪11进行上下移动。
实施例4
本实施例提供了一种采用上吸式磁珠转移枪对试剂盒内的磁珠进行转移的方法，具体包括如下步骤：
步骤1：取磁棒套
将磁棒套5移动到转移枪11的正下方，使转移枪11向下运动，12提取枪枪头探入5磁棒套内；在转移枪11的挤压下，磁棒套5与提取枪枪头12过盈连接在一起；再使11提取枪向上移动，同时提取枪枪头12带着磁棒套5向上移动，取出磁棒套5；
步骤2：吸取磁珠
取好磁棒套5后，将试剂条4上的将要吸取磁珠的小孔移动到转移枪11的正下方，由提取电机10带动磁棒15向下移动到磁棒套5的底部，使磁棒套5的底部带有磁性；然后使转移枪11向下移动，将磁棒套5的底部探入到含有磁珠16的液体中，再使转移枪11上下缓慢移动，磁棒15会将磁珠吸到磁棒套5的底部；最后，使转移枪11向上移动，同时提取枪枪头12带着磁棒套5向上移动，磁珠16也随磁棒套5移出至液体外；吸取磁珠时，磁棒15和磁棒套5的位置状态如图5所示：
步骤4：洗脱磁珠
吸取磁珠16后，将试剂条4上的将要接受磁珠16的小孔移动到转移枪11的正下方，使转移枪11向下移动，将吸附有磁珠16的磁棒套5探入到要接受磁珠16的液体中，由提取电机10驱动磁棒15向上移动，使磁棒套5的底部失去磁性；然后使转移枪11上下小幅度较快速运动，将磁珠16洗脱到液体中；洗脱磁珠时，磁棒15和磁棒套5的位置状态如图6所示：
步骤4：磁珠混匀
洗脱磁珠16后，将试剂条4上的将要混匀磁珠16的小孔运行到转移枪11的正下方，该将要混匀磁珠16的小孔是指孵育过程中的小孔，在磁棒套5底部无磁性的状态下，使转移枪11向下运动，将磁棒套5的底部探入到将要混匀磁珠16的液体中，使转移枪11上下小幅度较快速运动，将液体中的磁珠16混匀保持悬浮状态；
步骤5：磁棒套打脱
当不再需要磁棒套5时，将试剂条4上的磁棒套放置孔移动到转移枪11的正下方，由提取电机10驱动磁棒15向下运动，直到将磁棒套5从提取枪枪头12上顶脱，使得磁棒套5掉落到试剂条4上的磁棒套放置孔内。
在本实施例试剂盒的磁珠转移方法中，步骤4磁珠混匀时，磁棒15和磁棒套5的位置状态为磁棒15的下端远离磁棒套5的底部，使磁棒套5底部失去磁性，即同步骤3洗脱磁珠时磁棒15和磁棒套5的位置状态相同。
实施例5
本发明检测试剂盒的试剂性能测试：
(1)按照上述实施例2中所提到的反应过程，将实施例1步骤3)制备的磁珠-SA-生物素-抗体溶剂按磁珠浓度稀释到0.3mg/mL，使用体积400微升，加入1号位孔中；
将实施例1步骤4)制备的吖啶酯-PCT单抗溶剂稀释到500ng/mL，使用体积100微升，加入4号位孔中；
样本稀释液：0.01M的Tris-Hcl缓冲液，1％BSA，0.1％十二烷基聚乙二醇醚，使用体积200微升；
在第3、5、6、7号位孔中分别加入400微升清洗液，清洗液用0.01M的Tris-Hcl缓冲液，0.05％吐温20；
第8号位孔中加入100微升预激发液：1.2％体积的双氧水，0.055％体积的浓硝酸，0.02％曲拉通X-100；
激发液200微升：1.4％氢氧化钠，0.15％曲拉通X-100；
第2号位孔第一次反应时间：4分钟；
第4号位孔第二次反应时间：4分钟；
第2号位孔加样量：血清、血浆20微升，全血、末梢血33微升；
磁珠提取、清洗、加样过程需要4分钟。
(2)线性：将浓度值为255ng/mL的样本按一定的比例稀释：
| 稀释比例 | 理论浓度 | 实测浓度 |
| 0.00％ | 0 | 0.01 |
| 0.03％ | 0.079 | 0.08 |
| 0.06％ | 0.159 | 0.17 |
| 0.13％ | 0.318 | 0.35 |
| 1.25％ | 3.187 | 2.98 |
| 2.50％ | 6.375 | 6.14 |
| 5.00％ | 12.75 | 12.09 |
| 10.00％ | 25.5 | 25.56 |
| 20.00％ | 51 | 52.9 |
| 30.00％ | 76.5 | 75.79 |
| 40.00％ | 102 | 106.3 |
| 50.00％ | 127.5 | 129.61 |
| 60.00％ | 153 | 166.18 |
| 70.00％ | 178.5 | 196.25 |
| 80.00％ | 204 | 213.18 |
| 100.00％ | 255 | 255.86 |
理论浓度与实测浓度的线性关系图如图7所示。
(3)灵敏度：将校准品零点和低浓度样本在5天连续累积测试60次：
| 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| 0.00 | 0.01 | 0.00 | 0.00 | 0.01 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
| 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.01 | 0.00 |
| 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 |
LOB＝MEAN+1.645SD＝0.004ng/mL
| 0.01 | 0.01 | 0.02 | 0.02 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
| 0.02 | 0.02 | 0.01 | 0.02 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
| 0.01 | 0.01 | 0.03 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
| 0.01 | 0.01 | 0.02 | 0.02 | 0.01 | 0.02 | 0.01 | 0.02 | 0.01 | 0.01 |
| 0.01 | 0.02 | 0.02 | 0.01 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.01 | 0.02 | 0.01 |
| 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.01 | 0.02 | 0.01 | 0.03 | 0.01 | 0.01 | 0.02 |
均值＝0.014，精密性＝39.89％
| 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 |
| 0.02 | 0.03 | 0.03 | 0.02 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.01 |
| 0.03 | 0.04 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.02 | 0.03 | 0.03 | 0.03 |
| 0.03 | 0.02 | 0.02 | 0.03 | 0.03 | 0.02 | 0.03 | 0.02 | 0.03 | 0.03 |
| 0.04 | 0.02 | 0.02 | 0.03 | 0.03 | 0.02 | 0.03 | 0.03 | 0.02 | 0.03 |
| 0.02 | 0.02 | 0.03 | 0.05 | 0.02 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 |
均值＝0.028，精密性＝21.61％
| 0.05 | 0.04 | 0.05 | 0.04 | 0.04 | 0.05 | 0.04 | 0.05 | 0.05 | 0.05 |
| 0.05 | 0.04 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.04 | 0.05 | 0.05 | 0.04 | 0.04 |
| 0.06 | 0.04 | 0.05 | 0.05 | 0.03 | 0.04 | 0.04 | 0.05 | 0.06 | 0.06 |
| 0.04 | 0.04 | 0.05 | 0.04 | 0.05 | 0.05 | 0.04 | 0.04 | 0.05 | 0.05 |
| 0.05 | 0.04 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.04 | 0.03 | 0.05 | 0.06 | 0.05 |
| 0.05 | 0.05 | 0.04 | 0.05 | 0.04 | 0.04 | 0.05 | 0.05 | 0.05 | 0.04 |
均值＝0.0463，精密性＝14.31％
| 0.08 | 0.07 | 0.07 | 0.07 | 0.08 | 0.08 | 0.08 | 0.07 | 0.08 | 0.08 |
| 0.09 | 0.07 | 0.07 | 0.07 | 0.08 | 0.08 | 0.08 | 0.08 | 0.08 | 0.08 |
| 0.09 | 0.07 | 0.09 | 0.09 | 0.09 | 0.08 | 0.08 | 0.07 | 0.06 | 0.07 |
| 0.08 | 0.08 | 0.08 | 0.08 | 0.08 | 0.07 | 0.07 | 0.07 | 0.08 | 0.07 |
| 0.07 | 0.07 | 0.08 | 0.07 | 0.08 | 0.07 | 0.09 | 0.08 | 0.09 | 0.09 |
| 0.07 | 0.07 | 0.08 | 0.09 | 0.07 | 0.08 | 0.08 | 0.08 | 0.08 | 0.07 |
均值＝0.0775，精密性＝9.39％；
当浓度在0.014ng/mL时，95％结果大于本底值，LOD＝MEAN+1.645SD＝0.025ng/mL；
浓度在0.046ng/mL时，精密性小于20％，LOQ＝0.046ng/mL。
(5)方法学比对：本发明和罗氏电化学发光试剂盒比对：
和罗氏试剂盒同时测定227份EDTA血浆：如图8所示为本发明用于血液中降钙素原的检测试剂盒与现有罗氏电化学发光试剂盒的相关性图；由如图8所示的相关性可知，相关系数R2＝0.9936，斜率1.0936，本发明试剂盒与电化学发光结果相关性好。
本发明同时测定142份末梢血(全血)和同源血浆结果，如图9所示，结果表明，末梢血结果和血浆结果相关系数R2＝0.9945，斜率1.0628，相关性良好。
综上，本发明提供的一种检测血液中降钙素原的试剂盒及降钙素原的检测方法，有效解决了现有罗氏试剂盒所存在的1)出结果时间较长，2)不能做末梢全血样本，小孩检测炎症或感染需要的采血量较大，3)测量范围窄，高浓度的样本需要稀释的问题，在不降低灵敏度的情况下拉宽检测范围，具有较高的临床应用价值。此外，本发明试剂盒与化学发光结果相关性好采用专用的上吸式磁珠转移枪进行磁棒的提取，将磁棒深入到液体内部快速提取磁珠，并采用一次性磁棒套，防止磁珠污染磁棒，同时使得磁珠洗脱变得容易；以及本发明试剂条采用热封膜技术，有效防止了试剂串孔，解决了运输问题。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (16)
1.一种检测血液中降钙素原的方法，其特征在于，包括步骤：
1)用链霉亲和素包被磁珠；
2)用生物素标记降钙素原单克第一隆抗体；
3)将步骤1)制得的包被有链霉亲和素的磁珠与步骤2)制得的标记有生物素的降钙素原单克隆第一抗体结合反应，得磁珠-SA-生物素-PCT单抗溶剂；
4)用降钙素原单克隆第二抗体标记吖啶酯，制得吖啶酯-PCT单抗溶剂；
5)样本或校准品中的降钙素原与步骤4)制得的吖啶酯-PCT单抗溶剂、步骤3)制得的磁珠-SA-生物素-PCT单抗溶剂发生反应，形成双抗体夹心复合物；
6)将未反应的溶剂清洗后，可根据双抗体夹心复合物的数量，计算样本中降钙素原的含量。
2.根据权利要求1所述的检测血液中降钙素原的方法，其特征在于，步骤1)中所述磁珠与所述链霉亲和素的质量比为1:8-1:12。
3.根据权利要求1所述的检测血液中降钙素原的方法，其特征在于，步骤2)中所述降钙素原单克隆第一抗体与所述生物素的质量比为1:3-1:8。
4.根据权利要求1所述的检测血液中降钙素原的方法，其特征在于，步骤3)中所述包被有链霉亲和素的磁珠与所述标记有生物素的降钙素原单克隆抗体的质量比为90:1-110:1。
5.根据权利要求1所述的检测血液中降钙素原的方法，其特征在于，步骤4)中所述降钙素原单克隆第二抗体与所述吖啶酯的质量比为1:3-1:8。
6.一种用于权利要求1-5任一项所述检测方法的试剂盒，其特征在于，包括由若干并排设置的孔位组成的试剂条，所述试剂条包含的试剂有磁珠-SA-生物素-PCT单抗溶剂、吖啶酯-PCT单抗溶剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂条上的一孔位内设有磁棒套。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含样本稀释液、校准品、磁珠清洗液以及预激发液。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液是含有表面活性剂聚山梨酯-80或十二烷基聚乙二醇醚的Tris-HCl缓冲液；所述磁珠清洗液是含有吐温、防腐剂的Tris-HCl缓冲液。
10.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述预激发液是含有双氧水、硝酸溶液；所述校准品是含有一定量的PCT抗原的BSA蛋白溶液。
11.根据权利要求8所述的检测血液中降钙素原的方法，其特征在于，所述所述试剂条上的0号位设有磁棒套；1号位设有磁珠-SA-生物素-PCT单抗溶剂；2号位设有样本稀释液；3、5、6、7号位设有磁珠清洗液；4号孔位设有吖啶酯-PCT单抗溶剂；8号位设有预激发液。
12.一种如权利要求6-11任一项所述检测试剂盒的使用方法，其特征在于，检测时，所述试剂条(4)置放于孵育仓(3)内，所述孵育仓(3)设置于输送带(2)上，所述输送带(2)连接水平位移电机(1)，所述输送带(2)的末端设有分析读数模块(13)；并采用可相对磁棒套(5)上下移动的上吸式磁珠转移枪实现所述试剂条上取磁棒套、吸取磁珠、磁珠洗脱、磁珠混匀、磁棒套打脱动作；
所述上吸式磁珠转移枪，包括可与所述磁棒套(5)过盈连接的提取枪枪头(12)、位于所述提取枪枪头(12)轴心线上用于吸附磁珠(16)的磁棒(15)，所述磁棒(15)由提取电机(10)驱动并相对所述提取枪枪头(12)上下移动；
具体包括如下使用步骤：
通过上吸式磁珠转移枪提取0号位孔的磁棒套，整个检测在一个连体的试剂条中由右向左进行，样本加在2号位孔后，磁棒套(5)将第1号位孔的磁珠-SA-生物素-PCT单抗溶剂提到2号位孔，完成第一步反应；反应结束后由磁棒(15)将结合物提取到3号位孔的清洗液中清洗，洗去未结合的样本；清洗结束后由磁棒套(5)将结合物提取到4号位孔开始第二步反应；反应结束后由磁棒套(5)将结合物依次通过5、6、7号位进行三次清洗，最终提取到8号位孔的预激发液中，添加激发液读取信号值。
13.根据权利要求12所述检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述提取电机(10)安装于所述转移枪(11)顶端，且所述提取电机(10)通过电机轴(14)与所述磁棒(15)连接。
14.根据权利要求12所述检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述提取枪枪头(12)可与所述磁棒套(5)的内壁或其外壁过盈连接。
15.根据权利要求12所述检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述转移枪(11)由设置于基板(7)上的纵向位移电机(6)驱动进行上下移动。
16.根据权利要求15所述检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述纵向位移电机(6)的输出轴上设有螺杆(8)，所述螺杆(8)上设有螺母(9)，所述螺母(9)与所述转移枪(11)固定连接。
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