CN203587414U - 一种流式细胞术用红细胞裂解试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本实用新型涉及一种流式细胞术用红细胞裂解试剂盒。该流式细胞术用红细胞裂解试剂盒包括一盒体，该盒体内至少设有一个裂解试剂放置区和一个洗涤试剂放置区。本实用新型提供的流式细胞术用红细胞裂解试剂盒为实验室检测及临床诊断中“生物样本前处理-红细胞裂解”这一关键技术环节提供普遍适用、效果稳定的系统化解决方案，这不仅提高了执行这一步骤的便捷程度，更有助于提高分析检验实验室内部质量控制的可实施性和室间质量评价（External Quality Assessment,EQA）中的表现，以保证检验结果可以最佳地符合受检对象的实际情况，为进一步实验操作和医疗行为提供更为准确的依据。
Description
技术领域
本实用新型涉及一种流式细胞术用红细胞裂解试剂盒，属于生物材料技术领域。
背景技术
流式细胞术（Flow Cytometry Method,FCM）在免疫功能评价、血液肿瘤的诊断与分型、治疗方案选择与预后判断、药物敏感性筛选和发病机理研究等方面都发挥着重要作用；特别是干细胞研究及临床应用中，FCM检测与监测CD34+细胞群比例是最为常规和必需的技术手段。FCM技术在为实验室和临床提供重要参数的同时，其自身作为检测方法的准确性，特别是其在诊断应用中的质量控制成为了关键环节。卫生部临床检验中心专家在《分子诊断质量控制面临的问题》（胡丽涛等,临床检验杂志,2012,30(6):466-467.）一文中详细阐释了这一问题。此外，美国病理学家学会（College of American Pathologists,CAP）作为诊断检验的权威机构，制定了一整套较为完整的检测技术质量控制程序指南和实验室质量监控条例，该指南和条例从取材送材，到样本前处理、上机等，对检测所涉及技术的各个环节都作了详细规定。
FCM检测结果的准确性依赖于对实验操作的过程实施全面质量控制，而分析样本的制备则是其中非常重要的环节，也是最困难的环节之一。分析样本制备的主要内容是样本前处理。所谓样本前处理，是指在实施FCM检测之前，必须对生物样本在体外进行适宜的前处理操作，这一操作是保证这些技术实施效果的关键性步骤，将对检测结果的准确性产生较大影响。样本前处理包含的概念十分广泛，其中应用最为普遍的一项前处理方案是红细胞去除。目前去除红细胞的主要途径是红细胞裂解法、密度梯度离心法等。根据已发表文献表明，使用后者执行这一步骤不仅费时费力，而且可能会丢失部分细胞，造成实验误差。而红细胞裂解法由于其操作简便，并能够最大程度保持原始白细胞各项生物学参数和形态，目前应用最为广泛。
红细胞裂解需要使用红细胞裂解试剂，而红细胞裂解试剂的选择，以及红细胞裂解的实验操作对检测结果存在较大影响。选择红细胞裂解试剂品种的研究实例例如，巩文玉等在研究骨髓移植前动员外周血CD34+细胞相对计数时发现，使用BectonDikinson公司的产品FACS Lysing Solution裂解处理后的粒细胞和淋巴细胞的FSC、SSC信号强度均弱于Beckman Coulter公司的产品IOTest，且前者处理的标本CD45+细胞在所有收集的信号中的百分比要高于后者，这提示IOTest的裂解作用较为温和，但其会导致红细胞污染，IOTest的配方为氯化铵、碳酸氢钾和乙二胺四乙酸；此外，该研究还发现裂解后所得总白细胞数与CD34+细胞数并不存在相关关系，这些现象均提示裂解试剂的配方对于预测输注给受者的CD34+细胞量存在重大影响，主要原因在于CD34+细胞含量很低，其检测结果可能对任何可能造成微小变异的因素均很敏感，特别是红细胞裂解这一操作（巩玉文等,红细胞裂解液对CD34+细胞相对计数的影响,中国实验血液学杂志,2010,18(3):762-765.）。
红细胞裂解实验操作对检测结果影响的实例例如，ALDAGEN公司的干细胞检测产品ALDEFLUOR说明书中明确提示使用氯化铵配方的红细胞裂解试剂对外周血进行红细胞裂解时需要执行两次，以确保红细胞被完全去除，不影响后续试验；然而，本领域技术人员所熟知的是，执行两次裂解及相应的洗涤，将会造成部分细胞丢失，进而造成实验误差，例如刘艳荣等（刘艳荣等，流式细胞术计数CD34阳性细胞标准化与质量控制，中国实验血液杂志，2000，8(4):302-306）明确指出了这一问题，并提出样本制备过程的这些差异将会影响CD34阳性细胞标准化检测与质量控制。
此外，现有的红细胞裂解试剂在有效性和样本兼容性上也存在一定问题，不同类型的血液样本对红细胞裂解试剂的表现相差迥异，例如ALDAGEN公司的干细胞检测产品ALDEFLUOR说明书中明确指出，为保证红细胞的有效去除，使用氯化铵配方的红细胞裂解试剂对骨髓和脐带血样本进行处理时，条件是不同的，应严格按产品配套的不同实验方案进行操作。再例如瑞士Lonza公司的著名产品ACK lysing buffer的产品说明书中明确指出，这一产品是针对人或小鼠的淋巴细胞制备液设计，而不是针对全血设计的；Lonza公司的产品ACK lysing buffer的配方是氯化铵-碳酸氢钾-乙二胺四乙酸二钠，Lonza对其产品做出明确的适用性限制是有其原因的，这一配方的红细胞裂解试剂很难同时满足有效性和样本兼容性。又例如Bautista ML等在研究红细胞渗透脆性的研究中，发现丙三醇诱发的溶血试验中，脐带血比成年人外周血发生50%溶解的时间要显著更长，P<0.0001（Bautista ML等，Cord blood red cell osmoticfragility:a comparison between preterm and full-term newborn infants,Early Hum Dev,2003,72(1):37-46）；这提示对于不同生物样本，红细胞裂解的难易程度存在较大差异，脐带血中的红细胞比外周血可能更难于发生裂解，这不仅在红细胞裂解试剂的品种选择上引入了困难，也为实验操作的标准化带来了障碍。
试剂盒是实现实验操作标准化的一个良好解决方案。专利申请201110097316.3中记载了一种体外分离有核细胞且能除去红细胞的方法和试剂盒，其中起到裂解红细胞作用的是7.47g/L的氯化铵+2.6g/L的三羟甲氨基甲烷，如上文所述，这种配方对于样本的兼容性不够好。
综上，目前技术的问题在于：
（a）进口在售产品价格昂贵，货期长，不利于广泛使用，且各品牌试剂配方不同、作用机制和标准各异，导致红细胞裂解的标准化操作很难实现；
（b）裂解试剂配方对红细胞裂解不完全，或裂解时间很难控制（操作可控制性差），对于后续实验产生不利影响；
（c）裂解试剂配方对红细胞以外的细胞造成较大影响，特别对于丰度较低的细胞研究而言是非常不利的，例如CD34+造血干细胞；
（d）裂解试剂的兼容性差，对于脐带血等难于裂解的样本表现不佳，缺乏普遍通用的配方可供选择。
实用新型内容
为解决上述技术问题，本实用新型的目的在于提供一种流式细胞术用红细胞裂解试剂盒，该试剂盒是一种包含红细胞裂解试剂的配套试剂盒。
为达到上述目的，本实用新型提供了一种流式细胞术用红细胞裂解试剂盒，其中，该流式细胞术用红细胞裂解试剂盒包括一盒体，该盒体内至少设有一个裂解试剂放置区和一个洗涤试剂放置区。
在上述流式细胞术用红细胞裂解试剂盒中，优选地，所述盒体中还设有一个固定试剂放置区。
在上述流式细胞术用红细胞裂解试剂盒中，优选地，所述裂解试剂放置区设有一裂解试剂管。
在上述流式细胞术用红细胞裂解试剂盒中，优选地，所述裂解试剂管的容积为50mL或100mL。
在上述流式细胞术用红细胞裂解试剂盒中，优选地，所述洗涤试剂放置区设有至少两个洗涤试剂管。
在上述流式细胞术用红细胞裂解试剂盒中，优选地，所述洗涤试剂管的容积为100mL或200mL。
在上述流式细胞术用红细胞裂解试剂盒中，优选地，所述固定试剂放置区设有至少两个固定试剂管。
在上述流式细胞术用红细胞裂解试剂盒中，优选地，所述固定试剂管的容积为100mL或200mL。
在上述试剂盒中，裂解试剂管用于盛装十倍浓度（10×）的红细胞裂解试剂。该红细胞裂解试剂可以具有以下成分组成：以重量百分比计，该红细胞裂解试剂含有8.0-8.2%的氯化铵、0.8-1.0%的碳酸氢盐、0.003-0.03%的乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸盐、0.02-0.1%的裂解辅助剂，余量为水。其中，碳酸氢盐的实例包括碳酸氢钠、碳酸氢钾等；乙二胺四乙酸盐的实例包括乙二胺四乙酸二钠等；裂解辅助剂的实例包括十二烷基硫酸钠、十二烷基三甲基氯化铵、聚山梨酯-80等。裂解辅助剂可以有效通过增加红细胞膜渗透性而达到提升样本兼容性的目的，这不仅提高了红细胞的裂解效率，对不同类型的生物样本也提供了普遍通用的配方可供选择，有助于提高分析检验实验室内部质量控制的可实施性。洗涤试剂管用于盛装十倍浓度（10×）的洗涤试剂，上述洗涤试剂可以是平衡盐溶液（PBS溶液、Hanks溶液等）或生理盐水。该洗涤试剂同样可以用作样本稀释试剂。上述固定试剂可以是浓度为0-4%(w/v)的多聚甲醛或甲醛的水溶液。高兼容性红细胞裂解试剂与统一标准的洗涤试剂和固定试剂的组合形式为红细胞裂解操作提供了系统化解决方案，这为能够获得跨越时间和空间可比性的检测数据奠定了坚实基础。
本实用新型提供的流式细胞术用红细胞裂解试剂盒为实验室检测及临床诊断中“生物样本前处理-红细胞裂解”这一关键技术环节提供普遍适用、效果稳定的系统化解决方案，这不仅提高了执行这一步骤的便捷程度，更有助于提高分析检验实验室内部质量控制的可实施性，和室间质量评价（External Quality Assessment,EQA）中的表现，以保证检验结果可以最佳地符合受检对象的实际情况，为进一步实验操作和医疗行为提供更为准确的依据。
附图说明
以下附图仅旨在于对本实用新型做示意性说明和解释，并不限定本实用新型的范围。其中：
图1为实施例1提供的流式细胞术用红细胞裂解试剂盒的结构示意图；
图2为实施例2提供的流式细胞术用红细胞裂解试剂盒的结构示意图。
附图标号说明：
盒体1 裂解试剂放置区2 洗涤试剂放置区3 固定试剂放置区4 裂解试剂管5 洗涤试剂管6 固定试剂管7
具体实施方式
为了对本实用新型的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现参照说明书附图对本实用新型的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本实用新型的可实施范围的限定。
实施例1
本实施例提供了一种流式细胞术用红细胞裂解试剂盒，其结构如图1所示。
该试剂盒包括一盒体1，该盒体1内设有裂解试剂放置区2和洗涤试剂放置区3，
其中，裂解试剂放置区2内设有一容积为50mL的裂解试剂管5，该裂解试剂管5中盛装有10×的红细胞裂解试剂，以重量百分比计，该10×红细胞裂解试剂含有8.0%的氯化铵、1.0%的碳酸氢钾、0.003%的乙二胺四乙酸二钠、0.02%的裂解辅助剂，余量为水；其是通过以下步骤制备的：准确称取EDTA·Na2·2H2O0.0500g，添加纯水到10.0000g，混匀溶解，得到0.5%的乙二胺四乙酸盐母液；准确称取裂解辅助剂0.0500g，添加纯水到10.0000g，混匀溶解，得到0.5%的裂解辅助剂母液；准确称取一定质量氯化铵、碳酸氢钾，溶解于80.0000g纯水中；使用移液器添加一定量的0.5%的EDTA·Na2·2H2O母液以及0.5%的裂解辅助剂母液到配制的裂解试剂中，混匀，添加纯水到100.0000g，得到10×的红细胞裂解试剂；在局部百级层流净化条件的无菌环境中，将所得到的溶液再经过0.22μm直径的滤膜过滤到无菌离心管中，留存备用。
洗涤试剂放置区3内设有两个容积分别为100mL的洗涤试剂管6，该洗涤试剂管6内盛装有10×的洗涤试剂--PBS磷酸盐缓冲液，其是通过以下步骤制备的：准确称取一定质量磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钾、氯化钠溶解于80mL纯水中，加入氢氧化钠或者盐酸调节pH值于7.2，调节pH后，使用纯水将溶液定容到1L，得到10×的洗涤试剂，在局部百级层流净化条件的无菌环境中，将所得到的溶液再经过0.22μm直径的滤膜过滤到无菌离心管中，留存备用。
实施例2
本实施例提供了一种流式细胞术用红细胞裂解试剂盒，其结构如图2所示。
该试剂盒包括一盒体1，该盒体1内设有裂解试剂放置区2、洗涤试剂放置区3和固定试剂放置区4；
其中，裂解试剂放置区2内设有一容积为50mL的裂解试剂管5，该裂解试剂管5中盛装有10×的红细胞裂解试剂，以重量百分比计，该红细胞裂解试剂含有8.0%的氯化铵、1.0%的碳酸氢钾、0.003%的乙二胺四乙酸二钠、0.02%的裂解辅助剂，余量为水；其是通过以下步骤制备的：准确称取EDTA·Na2·2H2O0.0500g，添加纯水到10.0000g，混匀溶解，得到0.5%的乙二胺四乙酸盐母液；准确称取裂解辅助剂0.0500g，添加纯水到10.0000g，混匀溶解，得到0.5%的裂解辅助剂母液；准确称取一定质量氯化铵，碳酸氢钾，溶解于80.0000g纯水中；使用移液器添加一定量的0.5%的EDTA·Na2·2H2O母液以及0.5%的裂解辅助剂母液到配制的裂解试剂中，混匀，添加纯水到100.0000g，得到10×的红细胞裂解试剂；在局部百级层流净化条件的无菌环境中，将所得到的溶液再经过0.22μm直径的滤膜过滤到无菌离心管中，留存备用。
洗涤试剂放置区3内设有两个容积分别为100mL的洗涤试剂管6，该洗涤试剂管6内盛装有10×的洗涤试剂--PBS磷酸盐缓冲液，其是通过以下步骤制备的：准确称取一定质量磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钾、氯化钠溶解于80mL纯水中，加入氢氧化钠或者盐酸调节pH值于7.2，调节pH后，使用纯水将溶液定容到1L，得到10×的洗涤试剂；在局部百级层流净化条件的无菌环境中，将所得到的溶液再经过0.22μm直径的滤膜过滤到无菌离心管中，留存备用。
固定试剂放置区4内设有两个容积分别为100mL的固定试剂管7，该固定试剂管7中盛装有固定试剂，其是通过以下步骤制备的：准确称取一定质量多聚甲醛粉末，置于100mL烧杯中；用量筒量取50mL PBS溶液，置于烧杯中，将烧杯置于约60℃水中水浴，并搅拌；加入1M的氢氧化钠溶液15μL，搅拌至溶液澄清，用1M的HCl调节pH值至中性，得到固定试剂；在局部百级层流净化条件的无菌环境中，将所得到的溶液再经过0.22μm直径的滤膜过滤到无菌离心管中，留存备用。
实施例3
本实施例提供了一种利用实施例1提供的试剂盒进行外周血血液样本前处理的方法，其包括以下步骤：
1、使用EDTA·K2抗凝剂的采血管采集身体健康志愿者外周血，与抗凝剂充分混匀，静置，使其恢复至室温。
2、将裂解试剂管5中的10×红细胞裂解试剂根据质量比使用纯水进行十倍稀释，得到1×红细胞裂解试剂，将洗涤试剂管6中的10×洗涤试剂根据质量比使用纯水进行十倍稀释，得到1×洗涤试剂，备用。
3、将采血管中的样本混匀后取100μL抗凝外周血，加入流式管中，使用1mL移液器加入2mL的1×红细胞裂解试剂，混匀，室温静置10min，在离心力为600g，离心时间为5min的条件下进行离心。
4、离心结束后，平稳取出流式管，弃去流式管中红色上清，用100μL移液器取100μL洗涤试剂加入流式管中重悬细胞，加入相应抗体染色，室温避光孵育20min后，加入2mL洗涤试剂洗涤流式管中的剩余抗体，洗涤操作重复一次，最后使用500μL洗涤试剂重悬细胞，将得到的细胞样本于1h内进行流式细胞检测。
实施例4
本实施例提供了一种利用实施例2提供的试剂盒进行外周血血液样本前处理的方法，其包括以下步骤：
1、使用EDTA·K2抗凝剂的采血管采集身体健康志愿者外周血，与抗凝剂充分混匀，静置，使其恢复至室温。
2、将裂解试剂管5中的10×红细胞裂解试剂根据质量比使用纯水进行十倍稀释，得到1×红细胞裂解试剂，将洗涤试剂管6中的10×洗涤试剂根据质量比使用纯水进行十倍稀释，得到1×洗涤试剂，备用。
3、将采血管中的样本混匀后取100μL抗凝外周血，加入流式管中，使用1mL移液器加入2mL的1×红细胞裂解试剂，混匀，室温静置10min，在离心力为600g，离心时间为5min的条件下进行离心。
4、离心结束后，平稳取出流式管，弃去流式管中红色上清，用100μL移液器取100μL洗涤试剂加入流式管中重悬细胞，加入相应抗体染色，室温避光孵育20min后，加入2mL洗涤试剂离心洗涤流式管中的剩余抗体。
5、洗去流式管中的剩余抗体后，弃去上清液，向流式管中加入500μL固定试剂重悬细胞，4℃避光固定1h后，离心洗去固定试剂，洗涤操作重复一次，最后使用500μL洗涤试剂重悬细胞，所得细胞样本可以于24h内进行流式细胞检测。
实施例5
本实施例提供了一种利用实施例2提供的试剂盒进行脐血血液样本前处理的方法，其包括以下步骤：
1、使用枸橼酸钠抗凝剂的血袋采集脐血，与抗凝剂充分混匀，静置，使其恢复至室温。
2、将裂解试剂管5中的10×红细胞裂解试剂根据质量比使用纯水进行十倍稀释，得到1×红细胞裂解试剂，将洗涤试剂管6中的10×洗涤试剂根据质量比使用纯水进行十倍稀释，得到1×洗涤试剂，备用。
3、将血袋中的样本混匀后取100μL抗凝脐血加入流式管中，向流式管中加入相应抗体染色，室温避光孵育20min，染色结束后，使用1mL移液器加入2mL1×红细胞裂解试剂，混匀，室温静置10min，在离心力为600g，离心时间为5min的条件下进行离心。
4、离心结束后，平稳取出流式管，弃去流式管中红色上清，随后加入2mL洗涤试剂离心洗涤流式管中的剩余抗体，洗涤操作重复一次。
5、洗去流式管中的剩余抗体后，弃去上清液，最后使用500μL洗涤试剂重悬细胞，将得到的细胞样本于1h内进行流式细胞检测。
实施例6
本实施例提供了一种利用实施例2提供的试剂盒进行脐血血液样本前处理的方法，其包括以下步骤：
1、使用枸橼酸钠抗凝剂的血袋采集脐血，与抗凝剂充分混匀，静置，使其恢复至室温。
2、将裂解试剂管5中的10×红细胞裂解试剂根据质量比使用纯水进行十倍稀释，得到1×红细胞裂解试剂，将洗涤试剂管6中的10×洗涤试剂根据质量比使用纯水进行十倍稀释，得到1×洗涤试剂，备用。
3、将血袋中的样本混匀后取100μL抗凝脐血加入流式管中，向流式管中加入相应抗体染色，室温避光孵育20min，染色结束后，使用1mL移液器加入2mL1×红细胞裂解试剂，混匀，室温静置10min，在离心力为600g，离心时间为5min的条件下进行离心。
4、离心结束后，平稳取出流式管，弃去流式管中红色上清，随后加入2mL洗涤试剂离心洗涤流式管中的剩余抗体。
5、洗去流式管中的剩余抗体后，弃去上清液，向流式管中加入500μL固定试剂重悬细胞，4℃避光固定1h后，离心洗去固定试剂，洗涤操作重复一次，最后使用500μL洗涤试剂重悬细胞，得到细胞样本可以于24h内进行流式细胞检测。
Claims (8)
1.一种流式细胞术用红细胞裂解试剂盒，其特征在于，该流式细胞术用红细胞裂解试剂盒包括一盒体，该盒体内至少设有一个裂解试剂放置区和一个洗涤试剂放置区。
2.根据权利要求1所述的流式细胞术用红细胞裂解试剂盒，其特征在于，所述盒体中还设有一个固定试剂放置区。
3.根据权利要求1所述的流式细胞术用红细胞裂解试剂盒，其特征在于，所述裂解试剂放置区设有一裂解试剂管。
4.根据权利要求3所述的流式细胞术用红细胞裂解试剂盒，其特征在于，所述裂解试剂管的容积为50mL或100mL。
5.根据权利要求1所述的流式细胞术用红细胞裂解试剂盒，其特征在于，所述洗涤试剂放置区设有至少两个洗涤试剂管。
6.根据权利要求5所述的流式细胞术用红细胞裂解试剂盒，其特征在于，所述洗涤试剂管的容积为100mL或200mL。
7.根据权利要求2所述的流式细胞术用红细胞裂解试剂盒，其特征在于，所述固定试剂放置区设有至少两个固定试剂管。
8.根据权利要求7所述的流式细胞术用红细胞裂解试剂盒，其特征在于，所述固定试剂管的容积为100mL或200mL。
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| CN201320733936.6U CN203587414U (zh) | 2013-05-10 | 2013-11-19 | 一种流式细胞术用红细胞裂解试剂盒 |
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| CN105769217A (zh) * | 2016-05-03 | 2016-07-20 | 胡松 | 采血装置 |
| CN107367620A (zh) * | 2017-09-21 | 2017-11-21 | 苏州新波生物技术有限公司 | 一种检测血液中降钙素原的试剂盒及降钙素原的检测方法 |
-
2013
- 2013-11-19 CN CN201320733936.6U patent/CN203587414U/zh not_active Expired - Lifetime
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