JP2019215341A

JP2019215341A - ヒト血液からのマイクロベシクルの分離方法及び分析方法

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Publication number: JP2019215341A
Application number: JP2019107270A
Authority: JP
Inventors: 東天康; Dongchon Kang; 健内海; Takeshi Utsumi; 恒伊神; Hisashi Igami
Original assignee: Kyushu University NUC; LSI Medience Corp
Current assignee: Kyushu University NUC; LSI Medience Corp
Priority date: 2018-06-07
Filing date: 2019-06-07
Publication date: 2019-12-19
Anticipated expiration: 2039-06-07
Also published as: JP7376021B2

Abstract

【課題】ヒト血液中に存在するマイクロベシクルを、効率的に分離及び分析する方法を提供する。【解決手段】前記方法は、以下の工程を含む；（工程Ａ）血液検体又はその処理物に（１）染色試薬と（２）標識したＩｇＧとを、この順に、若しくは逆の順に、又は同時に添加する工程、（工程Ｂ）前記工程Ａで得られた反応物をフローサイトメーターの測定に供する工程、（工程Ｃ）前記工程Ｂで取得したデータを解析し、（１）凝集したマイクロベシクルと、（２）標識したＩｇＧに反応する粒子群とを、この順に、若しくは逆の順に、又は同時に観測像から除外する工程、（工程Ｄ）由来する細胞のマイクロベシクル集団への分別、キャラクタライズを行う工程。【選択図】なし

Description

本発明は、ヒト血液中に存在するマイクロベシクルを効率的に分離及び分析する方法に関する。

細胞から離出分離する微小膜画分として、エクソソーム（直径０．０３〜０．１μｍ）、マイクロベシクル（直径０．１〜１μｍ）等が知られており、これらはそれぞれ異なるメカニズムで分泌され、正常条件下および病的条件下のいずれにおいても数多くの異なる細胞タイプから分泌されることが報告されている（非特許文献１）。

これらの微小膜画分はヒト体液中（血液、尿、髄液、他）に含まれるが、これらの微小膜画分が含有する内容物は、細胞や組織間相互作用におけるシグナル伝達機能において重要な役割を担うと考えられている。そして一方で、これらの微小膜画分は、非侵襲的な診断材料であるリキッドバイオプシとして罹患状態や疾病の有無を判別に用いられ得ることが期待されている（特許文献１、特許文献２、非特許文献２、非特許文献３）。

リキッドバイオプシとして使用される生体材料には、遊離核酸、微小膜画分、血中循環腫瘍細胞（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ：ＣＴＣ）等が挙げられる。微小膜画分は、（Ｉ）エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）：直径３０〜１００ｎｍの膜性小胞、（II）エクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅ）（マイクロベシクル（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ）、シェディング・マイクロベシクル（ＳＭＶｓ：ｓｈｅｄｄｉｎｇｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ）ともいう）：原形質膜（ｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅ）から直接放出される、直径１００〜１，０００ｎｍの大きい膜性小胞、（III）アポトーシス性水疱（ａｐｏｐｔｏｔｉｃｂｌｅｂｓ）：死んで行く細胞から放出される直径５０〜５，０００ｎｍの小胞、を含む。

近年、これら微小膜画分の臨床的価値が注目されている。エクソソームにおいては臨床応用が進められており、小胞内のポリヌクレオチドを利用した乳がん診断方法が開発されている（特許文献３）。しかしながら、従来のエクソソームを使用した診断方法は、１個１個のキャラクタライズが困難でどういった組織や細胞に由来しているのかが簡便には判別しづらいという問題点がある。マイクロベシクルは、ＣＴＣなどと比べてヒト体液中に多量に含まれること、腫瘍の浸潤に極めて重要な役割を担っていること（非特許文献４）や、血液中に存在するマイクロベシクルは生理的な血液凝固の因子であると同時に敗血症などへの疾患への関与が報告されている（非特許文献１）ことから、臨床検査材料としての有効利用が期待されているものの、未だ実現には至っていない。

エクソソームとマイクロベシクルはその生成プロセスが異なり、別々の微小膜画分として定義されているものの、これまでの観測法では大きさやそれらを特徴づける膜に存在する表面抗原が非常に近接、類似しており、これらを厳密に区別して分離し観測することができなかった。例えば、特許文献１や特許文献２ではエクソソーム及びマイクロベシクルを両方含む形での分離方法及び分析方法について記述されており、両者の区別は不明瞭である。

また、一般的に、体液中に存在する微小膜画分は、全身の臓器、組織、またはそれらを構成する各細胞に由来するため、診断や検査応用に価値を見出すには、特定の疾患にマッチングした特定の臓器、組織や細胞にフォーカスした微小膜画分の観測が必要とされている。従って、観測する微小膜画分がどういった臓器、組織や細胞に由来するかを簡便にカテゴライズする分析法が確立できれば、微小膜画分の臨床的有用性は更に高まると考えられる。

このように、マイクロベシクルを臨床検査材料等として有効利用するためには、エクソソームと区別して分離することに加えて、由来する臓器、組織や細胞を区別できる分離法及び分析法が必要である。

特許第5838963号公報特開2015-91251号公報特開2014-117282号公報

Andrea Piccin , William G, Owen P (2007) Circulating microparticles: pathophysiology and clinical implications. Blood Reviews 21, 157-171 Boukouris S, Mathivanan S (2015) Exosomes in bodily fluids are a highly stable resource of disease biomarkers. Proteomics Clin Appl 9(3-4): 358-367 IH Chen, L Xue, CC Hsu, (2017) Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. PNAS vol. 114, no. 12, 3175-3180 James W. Clancy, Alanna Sedgwick, Carine Rosse, (2015) Regulated delivery of molecular cargo to invasive tumour-derived microvesicles. Nature Communications 6, Article number: 6919

上述したように、マイクロベシクルはリキッドバイオプシとして有効な臨床検査材料になりえると考えられるが、エクソソームとマイクロベシクルを明確に区別して分離することは非常に困難である上に、様々な細胞や組織に由来するマイクロベシクルが混在している限り、血液中マイクロベシクル全体をリキッドバイオプシとして使用（例えば核酸などを抽出）しても、疾患部位の特定や診断目的にマッチした結果は獲得しがたいと考えられる。

そこで、特に血液中のマイクロベシクル（直径０．１〜１μｍ）に注目し、これらを簡便にキャラクタライズし１個１個のマイクロベシクルがどういった細胞に由来するかを観測でき、また、これまで不明瞭であったエクソソームとマイクロベシクルとを区別して分離し、また観測するマイクロベシクルが由来する細胞や組織、臓器を明確にする方法を構築することを、本発明の課題とする。

更に、本発明者らは、上記課題に加えて、マイクロベシクルを臨床検査材料として使用するにあたって、特に血液中には補体などイムノグロブリンを補足するタンパク質が存在しており、これらはイムノコンプレックスを形成し分子サイズとしてマイクロベシクルと近接する可能性があり、これらはＩｇＧとも相互作用するので血液由来のマイクロベシクルに免疫化学的なキャラクタライズ方法を実施する際には問題となりうることを見出した。
なお、本明細書において、分離とは、分画、検出などと同義で用いるものとする。

本発明者らは、前記の問題点を解決すべく鋭意検討した結果、血液検体（全血、血漿または血清）からマイクロベシクルを遠心操作により濃縮する前処理工程、前記血液検体または前記前処理工程で得られた濃縮マイクロベシクル画分に、標識したＩｇＧを添加する工程、フローサイトメーターを使用し、直径約０．１〜１μｍの画分に集約させて観測する工程、前記観測データから標識ＩｇＧに反応する粒子集団を除去する工程、そしてマイクロベシクルが由来する細胞に特異的な表面抗原にてマイクロベシクルをキャラクタライズする工程を適宜組み合わせて選択して実施することにより、１個１個のマイクロベシクルがどういった臓器、組織やそれを構成する細胞から放出されて血液中に存在していたのかを精度よく観測できることを見出した。本発明はこの知見に基づいて、血液中のマイクロベシクルを個々にキャラクタライズしうる測定法を完成させたものである。

すなわち、本発明は、以下を提供する：
［１］血液検体中のマイクロベシクルを分離する方法であって、以下の工程を含む方法；
（工程Ａ）血液検体又はその処理物に（１）染色試薬と（２）標識したＩｇＧとを、この順に、若しくは逆の順に、又は同時に添加する工程、
（工程Ｂ）前記工程Ａで得られた反応物をフローサイトメーターの測定に供する工程、
（工程Ｃ）前記工程Ｂで取得したデータを解析し、（１）凝集したマイクロベシクルと、（２）標識したＩｇＧに反応する粒子群とを、この順に、若しくは逆の順に、又は同時に観測像から除外する工程、
（工程Ｄ）由来する細胞のマイクロベシクル集団への分別、キャラクタライズを行う工程、
［２］前記工程Ｂにおける観測域が１μｍ以下、又は２００ｎｍ以上１μｍ以下のいずれかである、［１］の方法、
［３］フローサイトメーターの観測域に所望の直径の粒子群を収束させるためにフローサイトメーターのパラメータを設定する工程を実施する、［１］又は［２］の方法、
［４］粒径が０．２２〜１．３５μｍである、ポリスチレンビーズを使用して観測域における粒子径を推定する、［１］〜［３］のいずれかの方法、
［５］血液検体の処理物が、遠心分離によって分離された試料である、［１］〜［４］のいずれかの方法、
［６］分離されるマイクロベシクルの直径が１μｍ以下である、［１］〜［５］のいずれかの方法、
［７］分離されたマイクロベシクルが、表４に記載の蛋白質を含む、［１］〜［６］のいずれかの方法、
［８］［１］〜［７］のいずれかの方法によって得られた画分を使用して、血液に由来するマイクロベシクルに特異的に含まれる物質を探索する方法、
［９］［１］〜［７］のいずれかの方法によって得られた画分を使用して、対象における疾患、薬剤投与効果または他の医学的状態の検出を助ける方法。

本発明により、血液中に存在するマイクロベシクルを簡便に且つ特異的に分離、観測することができ、さらに膜に存在する表面抗原を用いて個々のマイクロベシクルをキャラクタライズ（どういった細胞や組織、臓器に由来するのか）することができる。その結果、特定の疾患にマッチングした特定の臓器、組織や細胞にフォーカスした診断や検査応用が可能な検査としての価値の向上が期待される。また、本発明により得られた画分を使用して分析することで、対象における疾患、薬剤投与効果または他の医学的状態を推定することが可能となる。

血漿を直接染色したサンプル（上側）と、前処理により濃縮したマイクロベシクル画分を染色したサンプル（下側）のフローサイトメーターでの観測像である。前処理により濃縮したマイクロベシクル画分のフローサイトメーターでの観測像である。前処理により濃縮したマイクロベシクル画分の透過型電子顕微鏡によるネガティブ染色像である。前処理により濃縮したマイクロベシクル画分のナノ粒子解析システムによる粒度分布ヒストグラムである。ショットガンプロテオミクス解析により検出した蛋白質からｍｅｔａｓｃａｐｅを使用した蛋白質のエンリッチメント解析結果である。ショットガンプロテオミクス解析により検出した蛋白質からｍｅｔａｓｃａｐｅを使用した蛋白質のエンリッチメント解析結果をクラスター毎にネットワーク解析した結果である。前処理により濃縮したマイクロベシクル画分のフローサイトメーターによる測定データを側方散乱光におけるパルス幅とパルスエリアで展開した観測像である。図７と同じ測定データを前方散乱光と側方散乱光の面積で展開した観察像である。図７及び図８に示す観測像から大きく外れた集団を除外（ゲートアウト）した測定データを側方散乱光とＡＰＣマウスＩｇＧで展開した観測像である。図９に示す観察像からＡＰＣマウスＩｇＧ陽性集団を除外（ゲートアウト）した測定データから赤血球由来マイクロベシクルを選別する過程を示す説明図と、キャラクタライゼーションに使用した表面抗原との反応性を示す表である。図９に示す観察像からＡＰＣマウスＩｇＧ陽性集団を除外（ゲートアウト）した測定データからマクロファージ／単球／顆粒球由来マイクロベシクルを選別する過程を示す説明図と、キャラクタライゼーションに使用した表面抗原との反応性を示す表である。図９に示す観察像からＡＰＣマウスＩｇＧ陽性集団を除外（ゲートアウト）した測定データからＴ細胞／Ｂ細胞由来マイクロベシクルを選別する過程を示す説明図と、キャラクタライゼーションに使用した表面抗原との反応性を示す表である。図９に示す観察像からＡＰＣマウスＩｇＧ陽性集団を除外（ゲートアウト）した測定データから血小板由来マイクロベシクルを選別する過程を示す説明図と、キャラクタライゼーションに使用した表面抗原との反応性を示す表である。図９に示す観察像からＡＰＣマウスＩｇＧ陽性集団を除外（ゲートアウト）した測定データから血管内皮細胞由来マイクロベシクルを選別する過程を示す説明図と、キャラクタライゼーションに使用した表面抗原との反応性を示す表である。由来する細胞集団へのマイクロベシクルのキャラクタライゼーション後に側方散乱光とＡｎｎｅｘｉｎ５の展開図へ重ね合わせた図である。由来する細胞集団へのマイクロベシクルのキャラクタライゼーション後に側方散乱光とＡｎｎｅｘｉｎ５の展開図へ重ね合わせた図（上側）と、由来する各細胞集団における、Ａｎｎｅｘｉｎ５陽性集団とＡｎｎｅｘｉｎ５陰性集団のフローサイトメーターでの観察像（下側）である。フローサイトメーターによる健常人１０名からの各細胞由来マイクロベシクルのＡｎｎｅｘｉｎ５陽性集団とＡｎｎｅｘｉｎ５陰性集団との割合を比較した結果を示すグラフである。

以下において、本発明の実施形態について詳細に説明するが、利用方法の態様についてはこれに限定されるものではない。

本発明は、血液中のマイクロベシクルに特化した観測条件を設定したフローサイトメーターによる分離方法及び分析方法である。夾雑物を除去しマイクロベシクルを濃縮する前処理工程を組み合わせてもよいが、前処理条件を省いて、直接フローサイトメーターにより分離、測定することもできる。直接フローサイトメーターにより分離、測定する方法は、検査応用や実用的に汎用性のある観測系として好ましい。本明細書において、前処理は濃縮や回収の意味を含むものとし、濃縮と回収はほぼ同義の語として用いられることがある。

本明細書において血液とは、例えば、全血、血漿、血清などが挙げられる。生体試料はそのまま本発明の方法に適用してもよいし、水、酸性溶液、アルカリ性溶液、緩衝液、またはこれらの混合液に溶解または懸濁し、必要に応じてさらに処理を加えたものを本発明の方法に適用してもよい。本発明で利用可能な酸性溶液、アルカリ性溶液、緩衝液は、当業者であれば適宜選択して使用することが可能である。

以下、血液中のマイクロベシクルを、フローサイトメーターを用いて分離、分析する条件の一例について説明をするが、本発明はこれに限定されるものではない。

また、本発明において使用できるフローサイトメーターは、特定の機器に限定されるものではなく、クオーツキュベット方式、ジェットインエアー方式などいずれのフローセルを採用したフローサイトメーターであっても使用することができる。

本発明で利用可能なフローサイトメーターを用いた観測法は、例えば、以下の工程に従って実施することができる。

（１）マイクロベシクルの染色
本工程では、血液検体又はその処理物と染色試薬とを混和させて、マイクロベシクルを染色する。より具体的には、全血、血漿、血清そのもの、あるいは前処理法により濃縮した画分に、染色試薬、例えば、蛍光標識した、表面抗原に特異的な抗体を混和させて、マイクロベシクルを染色する。染色方法は、当業者であれば定法を採用し、場合によっては条件を適宜検討して実施することができる。マイクロベシクル中の複数の抗原ターゲッティングを行うために、マルチカラー分別として、多種類の標識抗体で染色して検出してもよい。例えば、マイクロベシクルの膜構成成分であるホスファチジルセリン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ：ＰＳ）に対して、金属イオン存在下で結合するタンパク質であるＡｎｎｅｘｉｎ５などを使用することができる。

その他、マイクロベシクルに特異的に結合することができる物質としては、例えば、小胞マイクロベシクル表面に存在するタンパク質、脂質または糖に結合することができる物質であればよい。表面に存在する物質としては、例えばタンパク質の場合、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ５９、ＣＤ４４、ＣＤ３３、ＣＤ４５、ＣＤ１４４、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ４１、ＣＤ６１、ＥＰ−ＣＡＭ、ＣＤ３２４、ＣＤ１４、ＣＤ８１、ＣＤ３１、ＣＤ２７４、ＣＤ６３、Ａｌｉｘ、ＣＤ１０５、ＣＤ１３３、ＣＤ２７９、ＣＤ１５、ＴＳＧ１０１、ＣＤ２０、ＣＤ２４９、ＣＤ５、ＣＤ１０、ＣＤ２６、ＣＤ２７３、ＣＤ９、ＭＵＣ−１、ＣＤ１３、ＣＤ１４６、ＣＤ６２Ｅまたはこれらの組み合わせを使用することができる。例えば、赤血球に由来するマイクロベシクルとしてＡｎｎｅｘｉｎ５、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ５９を、血小板に由来するマイクロベシクルとしてＡｎｎｅｘｉｎ５、ＣＤ４１、ＣＤ６１を、マクロファージ・単球・顆粒球に由来するマイクロベシクルとしてＡｎｎｅｘｉｎ５、ＣＤ４５、ＣＤ１５を、Ｔ細胞／Ｂ細胞に由来するマイクロベシクルとしてＡｎｎｅｘｉｎ５、ＣＤ４５、ＣＤ５、血管内皮細胞に由来するマイクロベシクルとしてＡｎｎｅｘｉｎ５、ＣＤ１４６、ＣＤ１０５のように組み合わせて使用することで、より高精度な分離ができるため、好ましい。

上記以外のマイクロベシクルに特異的に結合することができる物質は、例えば、タンパク質に対して結合親和性を有する物質、酵素の基質、補酵素、調節因子、受容体と特異的に結合する物質、レクチン、糖、糖蛋白質、抗原、抗体若しくはその抗原結合断片、ホルモン、神経伝達物質、リン脂質結合タンパク質、プレクストリン相同（ＰＨ：ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎｈｏｍｏｌｏｇｙ、ＰＨ）ドメインを含むタンパク質、コレステロール結合タンパク質、またはこれらの組み合わせであってもよい。抗原結合断片は、抗原結合部位を含むものであり、例えば、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｍａｉｎａｎｔｉｂｏｄｙ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはｓｃＦｖを使用してもよい。

（２）ＩｇＧの添加
先の工程で血液検体又はその処理物と染色試薬とを混和させて得られた混和物に、あるいは、染色試薬と混和させる前の血液検体又はその処理物に、ＩｇＧを蛍光標識したものを混和させて反応させる。前記ＩｇＧの由来は特に限定されるものではなく、例えば、マウスＩｇＧ、ヒトＩｇＧ、ラットＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、ヤギＩｇＧ、ウシＩｇＧなどを用いることができる。マイクロベシクルの染色工程同様、当業者であれば定法に従って実施することができる。例えば、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識マウスＩｇＧ、Ｍｉｘ−ｎ−ＳｔａｉｎＡＰＣＡｎｔｉｂｏｄｙＬａｂｅｌｉｎｇｋｉｔ（Ｂｉｏｔｉｕｍ社）を使用して、定常プロトコールにて、室温で３０分静置することで実施することができる。

血液中には補体などイムノグロブリンを補足するタンパク質が存在し、イムノコンプレックスを形成することがある。このイムノコンプレックスは、マイクロベシクルと分子サイズが近接する場合がある。そのため、イムノコンプレックスはＩｇＧとも相互作用するので血液由来のマイクロベシクルに免疫化学的なキャラクタライズ方法を実施する際には問題となりうる。従って、観測像においてＩｇＧを捕捉する画分を検出し、それらを観測像から除去するためにＩｇＧを蛍光標識したものを混和させてＩｇＧ捕捉画分と反応させる工程を実施することで、目的とするマイクロベシクル以外を除去することができ、夾雑物を含まないより正確な測定を行うことができるため、好ましい。
なお、上記の、表面抗原特異的な抗体によってマイクロベシクルを染色する工程とＩｇＧを添加する工程とは、いずれを先に実施してもよく、両工程を同時に実施してもよく、当業者が実施する環境に合わせて、適宜選択することが可能である。

（３）フローサイトメーターの設定
前方散乱光と側方散乱光の光電子増倍管の電圧（Ｖｏｌｔａｇｅ）と閾値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を調節して観測域に特定の直径を持つ粒子群を収束させる。これらのパラメータ等条件設定に際しては、未染色サンプルおよび染色サンプルの測定を実施し、各標的を検出する上でのその検出感度を満たす電圧設定や及びシース流速度を決定することが好ましい。

フローサイトメーターのパラメータ設定としては、当業者であれば、最適な条件を探索して適宜設定することが可能であるが、例えば、流量（Ｆｌｏｗｒａｔｅ）は１２μＬ／ｍｉｎ、前方散乱光の電圧は３８１、側方散乱光の電圧は３４０に設定し、それぞれの検出感度として、蛍光強度閾値を２００に設定して実施することができる。各蛍光物質に対する励起光（Ｅｘ．）及び蛍光検出フィルター（Ｅｍ．）の波長及び電圧は、使用する各々の蛍光物質に応じて適宜選択して設定することができる。

上記で設定したフローサイトメーターのパラメータを使用して、観測域における粒子径の推定を行う。サイズが均一なポリスチレンビーズ（例えば、ＳＰＨＥＲＯＴＭＮａｎｏＰｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅＳｉｚｅＳｔａｎｄａｒｄＫｉｔ、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ）などを使用して定法に従って測定を実施することができる。観測域の粒子径を推定するためには、例えば、ポリスチレンビーズのサイズの粒径が０．２２μｍ、０．４５μｍ、０．８８μｍ、１．３５μｍであることが好ましい。

観測域として設定する直径としては、マイクロベシクルを含む大きさであれば特に限定されるものではないが、例えば、約１μｍ以下が好ましく、１００ｎｍ〜１μｍがより好ましく、２００ｎｍ〜１μｍが更に好ましい。特にこれら微小粒子を観測する際に、側方散乱光が前方散乱光より分解能が高く粒子のサイズ検証などにも使用することができるため、好ましい。

なお、本工程は、前記染色工程及びＩｇＧ添加工程と、下記測定・分離工程との間に実施する態様に限定されず、例えば、パラメータを設定した後、染色工程、ＩｇＧ添加工程、測定・分離工程を実施することもできるし、あるいは、一度設定できれば、測定毎にパラメータを設定することなく、一連の工程を繰り返し実施することができる。

（４）フローサイトメトリーによる測定・分離
フローサイトメーターでデータを取得する。マルチカラー測定を実施した場合は各蛍光から割り当てた検出器以外の検出器へ漏れこんだ蛍光の漏れこみ補正を実施し、その条件下にて測定結果を得る。

マイクロベシクルが凝集する場合があるが、凝集したマイクロベシクルを観測像から除外するために、１）側方散乱光のパルス幅（Ｗｉｄｔｈ）の値が集団から外れて非常に高いもの、２）前方散乱光と側方散乱光のプロットから両者が集団から外れて高い値となっているものをマーキングしてゲートアウトすることができる。特に、前処理法を加えてマイクロベシクルが凝集した場合などに有効である。また、ＩｇＧ捕捉画分との免疫複合体を除去するために、ＩｇＧを蛍光標識したものに反応する陽性集団をマーキングしてゲートアウトすることができる。
なお、上記の、凝集したマイクロベシクルを除外する工程とＩｇＧにより捕捉された免疫複合体を除去する工程とは、いずれを先に実施してもよく、両工程を同時に実施してもよく、当業者が実施する環境に合わせて、適宜選択することが可能である。

マルチカラーで検出したマイクロベシクルをゲーティング操作により、それぞれが由来する細胞のマイクロベシクル集団への分別、キャラクタライズを行うことができる。この工程により、分離された血液中のマイクロベシクルであることを確認することができる。

本発明により血液中マイクロベシクルの分別、キャラクタライズを行うことができるが、これらのキャラクタライズした画分を、セルソーターを使用して更に分離することもできる。これらの分離した画分からその特異的なコンテンツ（核酸、代謝物、蛋白質、脂質）を分析し臨床応用することも可能である。分離された画分について、更に、各マイクロベシクル集団の頻度解析や標的分子の発現量解析に使用してもよい。

マイクロベシクルを分離し観測しうる測定技術としては上記工程に加えて、例えば、ナノトラッキング粒子径測定装置ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（ナノサイト、ＭａｌｖｅｒｎＰａｎａｌｙｔｉｃａｌ社）は、ＮＴＡ（ＮａｎｏＴｒａｃｋｉｎｇＡｎａｌｙｓｉｓ）技術とＦＦＦ（ＦｉｅｌｄＦｌｏｗＦｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）技術を組み合わせて使用することもできる。ＮＴＡ技術は、液中のナノ粒子のブラウン運動の様子をＰＣ画面上で、リアルタイムに観察することができ、また、ＦＦＦ技術は、薄いフロー・チャンネルの中で分離が行われるが、このチャンネルの特殊な幾何学的形状によって、このフローは放射状の断面をもつ層流をなしえ、この層流と直交することで、分離力が生じさせることにより、マイクロベシクルのような微小粒子をサイズで分離することができるため、より高精度な分離や分析が期待される。このような分離／観測法と個々のマイクロベシクルを特徴付ける表面抗原を組み合わせることでマイクロベシクルをキャラクタライズし、臓器特異性や疾患特異性を高め、臨床応用に利用できる。

本発明で利用可能なマイクロベシクルの分離方法において、夾雑物を除去し、マイクロベシクルを濃縮することが可能な前処理工程を組み合わせた方法を使用することができる。このような前処理工程を組み合わせることで、フローサイトメーターによる分離工程において、条件設定が容易になるだけでなく、分離の速度や感度が向上させることができるため、好ましい。遠心分離法を特徴とする前処理工程は、例えば、以下の工程に従って実施することができる。

採血管に採取された血液検体を、低速遠心分離にて血漿あるいは血清成分に分離する（前処理工程１）。このとき、低速遠心分離条件などは、公知の方法に従って実施することができ、室温で２，０００×ｇで２０分間遠心分離して得られた上清を使用することができる。

次に、上記前処理工程１において得られた血漿や血清をさらに低速遠心する（前処理工程２）。この遠心工程により、血小板やアポトーシス性水疱などを沈殿させることができるため、好ましい。前処理工程１同様に、室温で２，０００×ｇで２０分間遠心分離して得られた上清を回収して使用することができる。

前処理工程２によって得られた上清を、高速遠心してマイクロベシクル画分を沈殿させる（前処理工程３）。当該工程の条件としては、例えば、室温で２０，０００×ｇで３０分遠心分離して得られた沈殿を使用することができる。

前処理工程３によって得られた沈殿画分に例えばＰＢＳ等の緩衝液を加えて懸濁し、更に高速遠心を行う（前処理工程４）。この高速遠心により、マイクロベシクル画分を濃縮することができ、夾雑物を除去することができるため、好ましい。当該工程の条件としては、室温で２０，０００×ｇで３０分遠心分離して得られた沈殿を使用することができる。必要に応じて、前処理工程４を繰り返してもよい。複数回高速で遠心分離をおこなうことにより、夾雑物を取り除いてマイクロベシクル画分の純度を高めることができ、好ましい。

本発明の一態様として利用可能な前処理方法は上記の前処理工程に加えて、他の方法を使用してもよい。例えば、水溶液およびタンパク質を含む溶液のろ過滅菌等に使用する各種孔径を有するメンブレンフィルターを組み合わせて、目的とするマイクロベシクル画分を抽出することができる。この場合孔径は、直径０．１〜１０μｍのものを使用した精密ろ過（Ｍｉｃｒｏ−Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）法に相当する方法が好適である。

また、その他の前処理法として、密度勾配溶質とともに試料を遠心分画する平衡密度勾配遠心法、微小膜画分の表面抗原に特異的な抗体を利用し、微小膜画分を様ざまな担体に結合させて回収する免疫学的捕捉法、サイズ排除クロマトグラフィー（ゲルろ過法）により可溶性蛋白質よりも早く溶出してくる画分を回収する方法、微小膜画分の膜構成成分に対して金属イオン存在下で結合する担体を使用したリン脂質アフィニティー法、また高分子ポリマーと微小膜画分を混合し、目的の微小膜画分を沈殿させるポリマー沈殿法を組み合わせて実施してもよく、当業者であれば、これらの方法を、必要とされる組織や細胞、用途に応じて適宜選択して組み合わせて使用することができる。複数の前処理工程を組み合わせることで、フローサイトメーターによる分離が高感度、高精度に行える可能性がある。

異なる本発明実施の一態様として、対象における疾患進行のモニタリングのための方法、個体における疾患再発のモニタリングのための方法として使用することもできる。これらの方法は、血液検体中からマイクロベシクルを分離する工程に加えて、マイクロベシクル中に含まれる物質を分析するプロファイル工程を含む。ある特定の医学的状態の対象個体において、プロファイルを分析することによって、例えば特定の疾患の存在を推定することに用いることができる。例えば、マイクロベシクルを分離するための試料採取の期間を、目的とする対象疾患の検出などに応じて適宜設定することで、より詳細なプロファイルを得て状態を観察し、診断を補助することが可能となる。また、これは、薬剤投与後の疾患状態をモニタリングする方法としても使用することができる。

本発明により、マイクロベシクルを臨床検査材料としての有効利用できるようになるため、血液中に存在するマイクロベシクルを簡便に且つ特異的に抽出、観測することができ、さらに膜に存在する表面抗原を用いて個々のマイクロベシクルのキャラクタライズ（どういった細胞や組織、臓器に由来するのか）することができる。その結果、特定の疾患にマッチングした特定の臓器、組織や細胞にフォーカスした診断や検査応用が可能な検査としての価値の向上が期待される。また、本発明により得られた画分を使用して分析することで、対象における疾患、薬剤投与効果または他の医学的状態を推定することが可能となる。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

《実施例１：ヒト血液中からのマイクロベシクルの濃縮》
健常人から、５ｍＬ〜７ｍＬの血液をＴＥＲＵＭＯベノジェクトII真空採血管ＥＤＴＡ−Ｎａ（ＶＥＮＯＪｅｃｔII（登録商標）、テルモ）へ採取した。血液試料を、２０℃で２，３３０×ｇで１０分間遠心分離して血漿を得て、その後に約２０℃で約２，０００×ｇで１０分間遠心分離し、血漿内脂質及び細胞残余物、血小板を除去し、上澄み液を下記実験に使用した。なお、本採血からの実験は、九州大学医系地区部局臨床研究倫理審査委員会の承認（許可番号２９−３４０）の下、実施された。

得られた血漿６００μＬを２０℃で１８，９００×ｇで３０分間遠心分離した。遠心分離された結果物から上澄み液を除去し、ペレットにおいてマイクロベシクル画分を濃縮した。このペレットに対してリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）６００μＬを使用して希釈した。希釈されたペレットは、２０℃で１８，９００×ｇで３０分遠心分離した。遠心分離された結果物からペレットにおいてマイクロベシクル画分を濃縮した。

《実施例２：フローサイトメーターを用いた血漿マイクロベシクルの観測》
Ａ．血漿を直接染色した場合におけるフローサイトメーターでのマイクロベシクル観測（前処理濃縮画分との比較データ）
遠心操作（２，０００×ｇ）によって得られた血漿６０μＬに対して、ＦＩＴＣ−Ａｎｎｅｘｉｎ５（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＥａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＣＤ２３５ａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰｅｒＣＰａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＣＤ６１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を各々１μＬ添加し、室温で３０分静置した。この染色溶液に７５０μＬの１０ｍｍｏｌ／ＬＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、０．１４ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、２．５ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ_２に懸濁したものをサンプルとして使用した。フローサイトメーターでの測定パラメータは以下Ｃの項に記載する。測定データを横軸：側方散乱光（ＳＳＣ）の強度、縦軸：ＦＩＴＣ（Ａｎｎｅｘｉｎ５）強度にて展開した観測像を図１に示す。この図において下部のノイズ由来の集団と分離して得られる蛍光強度の大きい領域を抽出し、この領域をＡｎｎｅｘｉｎ５陽性集団として解析対象とした。Ａｎｎｅｘｉｎ５陽性画分においては血漿を直接染色して観測されるものと、前記実施例１で得られた前処理濃縮画分を染色して観測されるものは同様の結果を示した。

Ｂ．血漿から濃縮したマイクロベシクルの免疫蛍光染色
前記実施例１にてマイクロベシクル画分を濃縮したペレットに対してＰＢＳ６０μＬを添加し、ボルテックスにてマイクロベシクル画分を溶液中に分散させた。この溶液に対し、ＦＩＴＣ−Ａｎｎｅｘｉｎ５（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ５１０ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＣＤ５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰｅｒＣＰａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＣＤ１５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ／Ｃｙ７ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＣＤ４１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＰＥ／Ｃｙ７ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＣＤ４５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＣＤ５９（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ４２１ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＣＤ１０５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＣＤ１４６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰＥ／Ｃｙ７ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＣＤ２３５ａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＰｅｒＣＰａｎｔｉ−ｈｕｍａｎＣＤ６１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ標識ｍｏｕｓｅＩｇＧ（購入したＮｏｒｍａｌＭｏｕｓｅＩｇＧ（Ｗａｋｏ社）を、Ｍｉｘ−ｎ−ＳｔａｉｎＡＰＣＡｎｔｉｂｏｄｙＬａｂｅｌｉｎｇｋｉｔ（Ｂｉｏｔｉｕｍ社）に添付の定常プロトコールにて標識したもの）を、各々１μＬ添加し、室温で３０分静置した。

Ｃ．フローサイトメーターでの血漿中マイクロベシクルの観測
測定は、フローサイトメーターとしてＢＤＦＡＣＳＶｅｒｓｅＴＭ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ）を用いて行った。測定手順とパラメータ設定は次のとおりである。サンプルは前記実施例２Ｂで各種蛍光染色した画分を７５０μＬの１０ｍｍｏｌ／ＬＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、０．１４ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、２．５ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ_２に懸濁したものを使用した。流量（Ｆｌｏｗｒａｔｅ）は１２μＬ／ｍｉｎ、前方散乱光の電圧（Ｖｏｌｔａｇｅ）は３８１、側方散乱光の電圧は３４０に設定し、それぞれの閾値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）として２００に設定した。各蛍光物質に対する励起光（Ｅｘ．）及び蛍光検出フィルター（Ｅｍ．）の波長及び電圧は、ＦＩＴＣ：Ｅｘ．４８８ｎｍ、Ｅｍ．５２７／３２ｎｍ、電圧４４２、ＰＥ：Ｅｘ．４８８ｎｍ、Ｅｍ．５８６／４２ｎｍ、電圧４１１、ＰｅｒＣＰ：Ｅｘ．４８８ｎｍ、Ｅｍ．７００／５４ｎｍ、電圧５５６、ＰＥ／Ｃｙ７：Ｅｘ．４８８ｎｍ、Ｅｍ．７８３／５６ｎｍ、電圧５６４．３、ＡＰＣ：Ｅｘ．６４０ｎｍ、Ｅｍ．６６０／１０ｎｍ、電圧５３８．２、ＡＰＣ／Ｃｙ７：Ｅｘ．６４０ｎｍ、Ｅｍ．７８３／５６ｎｍ、電圧５８４．８、ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ４２１：Ｅｘ．４０５ｎｍ、Ｅｍ．４４８／４５ｎｍ、電圧５３８．２、ＢｒｉｌｌｉａｎｔＶｉｏｌｅｔ５１０：Ｅｘ．４０５ｎｍ、Ｅｍ．５２８／４５ｎｍ、電圧５４０とした。

Ｄ．設定した観測域におけるポリスチレンビーズによるサイズ検証測定
前記にて設定したフローサイトメーターのパラメータにおいて、観測域における粒子径を推定するためにサイズが均一なポリスチレンビーズ（ＳＰＨＥＲＯＴＭＮａｎｏＰｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅＳｉｚｅＳｔａｎｄａｒｄＫｉｔ、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ）の測定を行った。ポリスチレンビーズのサイズはその粒子径が０．２２μｍ、０．４５μｍ、０．８８μｍ、１．３５μｍのものを使用した。

Ｅ．フローサイトメーターでのマイクロベシクル測定結果の解釈
測定データを横軸：側方散乱光（ＳＳＣ）の強度、縦軸：ＦＩＴＣ（Ａｎｎｅｘｉｎ５）強度にて展開した観測像を図２に示す。この図において下部のノイズ由来の集団と分離して得られる蛍光強度の大きい領域を抽出し、この領域をＡｎｎｅｘｉｎ５陽性集団として解析対象とした。また側方散乱光の強度と０．２２〜１．３５μｍのポリスチレンビーズのサイズが観測域にて比例関係にあり、特に０．２２μｍと０．４５μｍの直径を有するポリスチレンビーズ間にマイクロベシクル画分の中央値が集積するように観測された。

《実施例３：血液から濃縮したマイクロベシクル画分の電子顕微鏡観測》
Ａ．血漿中マイクロベシクルの固定化
実施例１においてマイクロベシクル画分を濃縮したペレットに対してＰＢＳ１００μＬを添加し、これに対し固定液（４％パラフォルムアルデヒド、４％グルタルアルデヒド含有の０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４））１００μＬを添加し、撹拌後、４℃にて１時間静置した。

Ｂ．ネガティブ染色法
上記固定化したサンプルをグリッドがコートされたフォルムバールフィルム（ｆｏｒｍｖａｒｆｉｌｍ）に吸着させて、２％のリン・タングステン酸（ｐＨ７．０）で３０秒間染色した。

Ｃ．透過型電子顕微鏡での観測
上記のグリッドを透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ−１４００；ＪＥＯＬＬｔｄ．）にて観測した。加速電圧（ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎｖｏｌｔａｇｅ）は１００ｋＶに設定した。デジタルイメージ（３２９６×２４７２ｐｉｘｅｌｓ）はＣＣＤカメラ（ＥＭ−１４８３０ＲＵＢＹ２；ＪＥＯＬＬｔｄ．）にて取得した。観察画像を図３に示す。マイクロベシクルの大きさを有し、膜構造及びその内側に内部構造として含有されるもの（オルガネラ他）を含む微小膜画分が検出された。

《実施例４：ナノ粒子解析システムによる抽出画分の粒子計測》
実施例１においてマイクロベシクル画分を濃縮したペレットに対してＰＢＳ１００μＬを添加し、さらにＰＢＳにて３倍希釈したものをＮａｎｏｓｉｇｈｔ（ＭａｌｖｅｒｎＰａｎａｌｙｔｉｃａｌ社）にて測定した。装置の観測条件を表１に示す。ナノ粒子解析システムによる粒度分布ヒストグラムを図４に示す。本濃縮操作にて直径が１μｍ以上の画分は殆ど含まれず、直径が６００μｍ以下の画分に濃縮され、その粒子径として２００〜３００ｎｍ程度に均一な集団をメインに含有し、それ以下の粒子径（〜１００ｎｍ）を含む画分であることが確認された。

《実施例５：ショットガンプロテオミクス解析による濃縮マイクロベシクル画分において検出された蛋白質》
Ａ．血液の前処理により得られた濃縮マイクロベシクル画分から蛋白質画分の抽出
実施例１においてマイクロベシクル画分を濃縮した画分から、特に膜蛋白質を効率よく抽出するためにＰＴＳ（ＰｈａｓｅＴｒａｎｓｆｅｒＳｕｒｆａｃｔａｎｔ（相間移動可溶化剤））を用いた蛋白質可溶化法を実施した。この原理を用いた試薬キットとしてＭＰＥＸＰＴＳＲｅａｇｅｎｔｓｆｏｒＭＳ（ＧＬＳｃｉｅｎｃｅＩｎｃ．）を使用した。実施例１においてマイクロベシクル画分を濃縮したペレットに対して２５０μＬの当該キット試薬Ｂを添加し、超音波ホモジナイザー（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ：ソニック・バイオ社）にて稼働１分３０秒、インターバル３０秒からなるサイクルを１０回、１０℃の条件でソニケーション（パワー：ＭＡＸ）した。破砕後、遠心式フィルター（Ａｍｉｃｏｎｕｌｔｒａ３Ｋ、メルク）にて１４，０００ｇ×１５ｍｉｎを２回繰り返し、濃縮した。この画分をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ^ＴＭＢＣＡＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｃ．）を使用）にて蛋白質定量した。

Ｂ．蛋白質画分の酵素消化
ＢＣＡアッセイにて定量し、３０μｇ／２０μＬの濃度になるように前記試薬Ｂに溶解したものを膜蛋白質消化のための試料とした。１μＬの１００ｍｍｏｌ／Ｌジチオトレイトール（ＤＴＴ）を加え（ジスルフィド結合の還元開裂のため）、室温で３０分間インキュベートした。これに１μＬの５５０ｍｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミドを加え（Ｃｙｓのカルバミドメチル化のため）、遮光して室温で３０分間インキュベートした。当該キットの試薬Ａを７７μＬ加え、１．５μＬのトリプシン（ＴＰＣＫ−Ｔｒｙｐｓｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｃ．：Ｐｒｏｄ＃２０２３３））を加えた。室温で一晩インキュベートして蛋白消化を実施した。１５０μＬの試薬Ｃと１．５μＬの試薬Ｄを加えた。添加後１分間ボルテックスをして、２５℃、１５，６００×ｇで２分間遠心し二相分離した。不要な可溶化剤は上相にくるので、これをピペットで吸引し除去した。残った試薬Ｃを除去するために、遠心濃縮を行った後に、５０μＬの５％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えてボルテックスした。

Ｃ．ペプチドの脱塩・濃縮
前記にて酵素消化したものを脱塩・濃縮するためにＧＬ−ＴｉｐＳＤＢ（ＧＬＳｃｉｅｎｃｅＩｎｃ）を使用した。当該チップをまず、８０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ水溶液を２０μＬ添加し、室温、３，０００×ｇで２分間遠心することでコンディショニングした。これに５％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ水溶液を２０μＬ添加し、室温、３，０００×ｇで２分間遠心することでカラムを平衡化した。これに対して、前記実施例５Ｂの操作で得られた試料を全量添加し、室温、３，０００×ｇで５分間遠心することでペプチドをカラムに吸着させた。さらに５％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ水溶液を２０μＬ添加し、室温、３，０００×ｇで２分間遠心することでカラムを洗浄後、８０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ水溶液を５０μＬ添加し、室温、３，０００×ｇで２分間遠心することで、ペプチドを溶出させた。

Ｄ．質量分析測定
上記サンプルを、ｎａｎｏ−ＬＣシステム（ＥＡＳＹ−ｎＬＣ１０００：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｃ．）を連結したフーリエ変換型Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ：ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｃ．）で、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析を行った。上記にて調製した質量分析測定用サンプルから２μＬを測定に供した。なお、トラップカラムとしてＡｃｃｌａｉｍ^ＲＴＰｅｐＭａｐ１００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｃ．：Ｃ１８、充填剤径３μｍ、内径７５μｍ、カラム長２ｃｍ）、分析カラムとして、Ａｃｃｌａｉｍ^ＲＴＰｅｐＭａｐＲＳＬＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｃ．：Ｃ１８、充填剤径２μｍ、内径５０μｍ、カラム長１５ｃｍ）を用いた。移動相Ａは０．１％蟻酸水溶液、移動相Ｂは０．１％蟻酸／アセトニトリル、流量は２００ｎＬ／分、グラジエントは、０−４０％移動相Ｂ／２００分間、４０−１００％移動相Ｂ／１０分間、１００％移動相Ｂ／１０分間で測定した。

ＭＳ測定のスキャン条件はＦｕｌｌＭＳ／ｄｄ−ＭＳ２モードを使用しＦｕｌｌＭＳをスキャンした後に、強度が高いシグナルのＭＳ／ＭＳスペクトルを取得した。設定条件を表２に示す。

Ｅ．データ解析
得られたデータはＰｒｏｔｅｏｍｅＤｉｓｃｏｖｅｒｅｒ１．４ソフトウェア（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｃ．）にて、ヒトタンパク質データベースＨｏｍｏ＿ｓａｐｉｅｎｓ＿Ｕｎｉｐｒｏｔ＿２０１２１０．ｆａｓｔに対してＳｅｑｕｅｓｔＨＴアルゴリズムにより検索を行った。ＳｅｑｕｅｓｔＨＴでの検索条件を表３に示す。

検索結果からＳｃｏｒｅ１．０以上のものをピックアップした。抽出したマイクロベシクル画分のショットガンプロテオミクス解析により検出できた蛋白質の一覧を表４に示す。また、ショットガンプロテオミクス解析により検出した蛋白質からｍｅｔａｓｃａｐｅ（Tripathi et al., Cell Host & Microbe (2015), 18: 723-735）を使用した蛋白質のエンリッチメント解析結果を図５に、そのエンリッチメント解析結果をクラスター毎にネットワーク解析した結果を図６に、それぞれ、示す。表４に示す蛋白質は細胞膜や細胞内にカテゴライズされるものが多く、血液凝固や免疫応答、各種シグナル伝達としての機能を有すものが含まれ（図５、図６）、これら検出された蛋白質はマイクロベシクルをキャラクタライズする表面マーカーとして、またその内容物をバイオマーカー利用として、臨床検査や診断に使用できる可能性がある。

《実施例６：フローサイトメーターを用いた血漿マイクロベシクルのキャラクタライゼーション》
Ａ．パルス処理による凝集マイクロベシクルのゲートアウト（観測像からの除外）
実施例１においてマイクロベシクル画分を濃縮した画分を各表面抗原で染色し、実施例２のフローサイトメーターの観測条件にて測定した。このとき、観測像の中にはマイクロベシクルが凝集して複数個合体したような像が観測された（各種染色した表面抗原が全て陽性集団となるような集団）。これを観測像から除去するために、側方散乱光におけるパルス幅（縦軸）とパルスエリア（横軸）で展開した観察像（図７）と前方散乱光（横軸）と側方散乱光（縦軸）の面積で展開した観察像（図８）を用意して、それぞれから大きく外れた集団を観測像から除外した。

Ｂ．ＩｇＧ捕捉画分のゲートアウト（観測像からの除外）
前記実施例６Ａの操作後に、側方散乱光（横軸）とＡＰＣ標識マウスＩｇＧ（縦軸）の展開図（図９）からＡＰＣ陽性集団すなわちＩｇＧを捕捉する集団を抽出し、観測像から除外すると共に、ＡＰＣ陰性となる集団を以下のキャラクタライゼーションの対象とした。マイクロベシクルキャラクタライゼーションに使用した（または使用可能な）表面抗原の各種細胞での発現パターンを表５に示す。

Ｃ．赤血球由来マイクロベシクルのキャラクタライゼーション
前記実施例６Ｂの操作後に、側方散乱光とＡｎｎｅｘｉｎ５の展開図からＡｎｎｅｘｉｎ５陽性集団を抽出し、この集団からＣＤ４５陰性となる集団を抽出し、更にこの集団からＣＤ２３５ａ陽性且つＣＤ５９陽性集団を選別した（図１０）。キャラクタライゼーションに使用した表面抗原とそれが各種細胞に存在する（○）、しない（×）ことを提示させた表も同時に記載している。この集団（図１０の表における「Erythrocyte」の欄）を赤血球由来マイクロベシクルとし、Ａｎｎｅｘｉｎ５陽性集団中の本集団の割合は３２％であった。

Ｄ．マクロファージ／単球／顆粒球由来マイクロベシクルのキャラクタライゼーション
前記実施例６Ｂの操作後に、側方散乱光とＡｎｎｅｘｉｎ５の展開図からＡｎｎｅｘｉｎ５陽性集団を抽出し、この集団からＣＤ２３５ａ陰性となる集団を抽出し、更にこの集団からＣＤ４５陽性且つＣＤ１５陽性集団を選別した（図１１）。キャラクタライゼーションに使用した表面抗原とそれが各種細胞に存在する（○）、しない（×）ことを提示させた表も同時に記載している。この集団（図１１の表における「Macrophage/Monocyte」及び「Granulocyte」の各欄）をマクロファージ／単球／顆粒球由来マイクロベシクルとし、Ａｎｎｅｘｉｎ５陽性集団中の本集団の割合は２．６％であった。

Ｅ．Ｔ細胞／Ｂ細胞由来マイクロベシクルのキャラクタライゼーション
前記実施例６Ｂの操作後に、側方散乱光とＡｎｎｅｘｉｎ５の展開図からＡｎｎｅｘｉｎ５陽性集団を抽出し、この集団からＣＤ２３５ａ陰性となる集団を抽出し、更にこの集団からＣＤ４５陽性且つＣＤ５陽性集団を選別した（図１２）。キャラクタライゼーションに使用した表面抗原とそれが各種細胞に存在する（○）、しない（×）ことを提示させた表も同時に記載している。この集団（図１２の表における「T Cell」及び「B Cell」の各欄）をＴ細胞／Ｂ細胞由来マイクロベシクルとし、Ａｎｎｅｘｉｎ５陽性集団中の本集団の割合は０．４％であった。

Ｆ．血小板由来マイクロベシクルのキャラクタライゼーション
前記実施例６Ｂの操作後に、側方散乱光とＡｎｎｅｘｉｎ５の展開図からＡｎｎｅｘｉｎ５陽性集団を抽出し、この集団からＣＤ４５陰性且つＣＤ５陰性となる集団を抽出し、更にこの集団からＣＤ４１陽性且つＣＤ６１陽性集団を選別した（図１３）。キャラクタライゼーションに使用した表面抗原とそれが各種細胞に存在する（○）、しない（×）ことを提示させた表も同時に記載している。この集団（図１３の表における「Platelet」の欄）を血小板由来マイクロベシクルとし、Ａｎｎｅｘｉｎ５陽性集団中の本集団の割合は６２％であった。

Ｇ．血管内皮細胞由来マイクロベシクルのキャラクタライゼーション
前記実施例６Ｂの操作後に、側方散乱光とＡｎｎｅｘｉｎ５の展開図からＡｎｎｅｘｉｎ５陽性集団を抽出し、この集団からＣＤ１０５陽性且つＣＤ１４６陽性集団を選別した（図１４）。キャラクタライゼーションに使用した表面抗原とそれが各種細胞に存在する（○）、しない（×）ことを提示させた表も同時に記載している。この集団（図１４の表における「Endothelial Cell」の欄）を血管内皮細胞由来マイクロベシクルとし、Ａｎｎｅｘｉｎ５陽性集団中の本集団の割合は０．３％であった。

Ｈ．血漿マイクロベシクルの５分類
上記において、それぞれが由来する細胞集団へのマイクロベシクルのキャラクタライゼーション後に側方散乱光とＡｎｎｅｘｉｎ５の展開図へ重ね合わせた図の一例を図１５に示す。

Ｉ．各細胞由来マイクロベシクルのＡｎｎｅｘｉｎ５陽性と陰性によるキャラクタライゼーション
前記実施例６Ｂの操作後に、側方散乱光とＡｎｎｅｘｉｎ５の展開図からＡｎｎｅｘｉｎ５陽性と陰性集団を抽出し、この集団から前記Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇで示したＣＤ抗原を用いた由来細胞からのマイクロベシクルキャラクタライゼーションも行った（図１６）。由来するベシクルごとにＡｎｎｅｘｉｎ５陽性と陰性の割合を比較したところ赤血球由来及びマクロファージ／単球／顆粒球由来及び血管内皮細胞由来マイクロベシクルはＡｎｎｅｘｉｎ５陽性集団が多く、Ｔ細胞／Ｂ細胞由来マイクロベシクルはＡｎｎｅｘｉｎ５陰性集団が多かった（図１７）。なお、比較検定はウィルコクソンの符号順位検定を用いた（* p< 0.05, ** p < 0.01）。
従来より利用されているマイクロベシクルのマーカー（例えばＡｎｎｅｘｉｎ５）について、上記結果より、Ａｎｎｅｘｉｎ５陰性のマイクロベシクルが多数存在し、その割合も由来する細胞ごとに大きな違いがあることが明らかとなった。すなわち、各細胞に由来するマイクロベシクル中の物質の挙動が従来とは異なる可能性が見いだされた。このことは、従来より利用されている方法を利用したキャラクタライゼーションのみではマイクロベシクルの正確な性質を見落とす可能性がある。本発明を利用することで、疾患部位の特定や診断目的にマッチした結果を得るための臨床検査材料を入手することができる可能性があることが示唆された。

以上の結果より、血液中のマイクロベシクルを血漿から直接的に観測する方法または血漿からマイクロベシクル画分を濃縮したものを観測する方法により、個々のマイクロベシクルが表面に有している蛋白質によりキャラクタライゼーションできることが示された。本発明を用いることで、血液中に存在する個々のマイクロベシクルの由来する細胞や臓器を判別し、その増減や含有率などを測定することが可能になった。

本発明におけるマイクロベシクルを濃縮する前処理法は特に複雑な操作を伴うことなく、効率よくマイクロベシクル抽出することが可能である。当該、前処理法を実施することで、マイクロベシクルに含有されるバイオマーカーとなるべく候補物質（実施例では蛋白質の一覧を例示）を濃縮することができ、血漿や血清を直接測定するよりも高感度な測定を実施できる可能性がある。

また、本発明によれば、簡便にマイクロベシクルの表面抗原によって個々の血液中マイクロベシクルのキャラクタライゼーションを行うことができ、どういった細胞や臓器に由来したマイクロベシクルが存在するのかを測定／定量／解析することができる。マイクロベシクルなどの微小膜画分には細胞や臓器間コミュニケーションに必要な伝達物質が含まれリキッドバイオプシとしての臨床応用が期待されているが、表面抗原そのものにも標的臓器や細胞との接着や相互作用としての臨床的、生理的な意味合いが含有されると思われる。

これらのことは本発明によるマイクロベシクルの観測が特定の疾患や患者の状態を判定する検査法への応用や健康状態→未病（疾病予備軍）状態への個人の遷移などを日々管理しうる予防、予知マーカーとしての臨床応用なども考えられる。より微小な粒子をダイナミックレンジの広い性能にて、表面抗原と合わせて測定できる系があればエクソソーム、マイクロベシクルなどを含めて微小膜画分としての臨床応用価値を高めることができる。

Claims

血液検体中のマイクロベシクルを分離する方法であって、以下の工程を含む方法；
（工程Ａ）血液検体又はその処理物に（１）染色試薬と（２）標識したＩｇＧとを、この順に、若しくは逆の順に、又は同時に添加する工程、
（工程Ｂ）前記工程Ａで得られた反応物をフローサイトメーターの測定に供する工程、
（工程Ｃ）前記工程Ｂで取得したデータを解析し、（１）凝集したマイクロベシクルと、（２）標識したＩｇＧに反応する粒子群とを、この順に、若しくは逆の順に、又は同時に観測像から除外する工程、
（工程Ｄ）由来する細胞のマイクロベシクル集団への分別、キャラクタライズを行う工程。
前記工程Ｂにおける観測域が１μｍ以下、又は２００ｎｍ以上１μｍ以下のいずれかである、請求項１に記載の方法。
フローサイトメーターの観測域に所望の直径の粒子群を収束させるためにフローサイトメーターのパラメータを設定する工程を実施する、請求項１または２に記載の方法。
粒径が０．２２〜１．３５μｍである、ポリスチレンビーズを使用して観測域における粒子径を推定する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
血液検体の処理物が、遠心分離によって分離された試料である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
分離されるマイクロベシクルの直径が１μｍ以下である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
分離されたマイクロベシクルが、表４に記載の蛋白質を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法によって得られた画分を使用して、血液に由来するマイクロベシクルに特異的に含まれる物質を探索する方法。
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法によって得られた画分を使用して、対象における疾患、薬剤投与効果または他の医学的状態の検出を助ける方法。