CN105158482A - C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒 - Google Patents

C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开的C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒，其中含荧光标记的鼠抗人CRP单克隆抗体和含荧光标记的兔IgG为鼠抗人CRP单克隆抗体和兔IgG经荧光素标记后得到；荧光素对鼠抗人CRP单克隆抗体和兔IgG的标记为将鼠抗人CRP单克隆抗体和兔IgG加入经过活化的荧光素存储液中得到，荧光素储存液中荧光素的浓度为5～10mg/mL。本发明试剂盒具有灵敏度高，检测稳定性好，降低了非特异性结合，并且具有较宽的线性范围，检测时间仅为3分钟，大大提高了诊断效率。

Description

C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种C反应蛋白检测试剂盒，特别是C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒。
背景技术
血清CRP水平是指示细菌感染的一项敏感而客观的指标。细菌感染时，血清CRP的水平可以中度或明显升高，阳性率可达90％以上；而病毒等感染时CRP水平多正常或轻度升高，因此可以帮助细菌感染与非细菌感染的鉴别诊断。此外，定量测定脑脊液、胸腔积液中的CRP水平亦可以对脑膜炎、胸膜炎的鉴别诊断有一定意义；不仅如此，CRP水平还与感染范围和感染严重程度有一定关系。另外，血清CRP水平还可以用来预测感染性疾病的严重程度、住院时间的长短、预后及复发。CRP还可以反映动脉粥样硬化斑块的成分并预测斑块破裂的可能性，是心血管疾病的独立预测因子。冠心病、急性冠脉综合征患者CRP往往明显升高，如心肌梗死患者中血清CRP可以急剧上升，其升高水平与冠状动脉梗阻程度、冠心病终末事件的发生及预后、充血性心力衰竭的程度等均有显著相关性。目前，CRP已经成为健康人及冠脉疾病患者心血管疾病风险的预测因子之一，也是监测疾病治疗效果的指标之一。
在国内，C反应蛋白(CRP)检测临床上主要以国外进口试剂和免疫组化试剂应用为主，国外进口试剂价格非常昂贵，给患者带来很大的经济负担，不利于在基层普及。具有自主知识产权的国产C反应蛋白(CRP)免疫化学发光检测试剂盒目前还较少，也仅停留在96孔微孔板式技术水平上。该技术灵敏度较低、线性窄、特异性较差，也不利于高通量的全自动检测。
因此，有待开发对C反应蛋白(CRP)检测灵敏度高与可靠性并能降低检测成本的检测技术。试剂盒采用荧光免疫层析法则有希望提高特异性强，灵敏度高，在CN201310151166中就公开了一种超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒及其检测方法，其具有良好的灵敏度的技术方案。
发明内容
为解决上述问题，本发明公开了C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒，具有灵敏度高，检测稳定性好，降低了非特异性结合，并且具有较宽的线性范围，检测时间仅为3分钟，大大提高了诊断效率。
本发明公开的C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒，包括CRP反应板，CRP检测缓冲液，CRPID芯片；所述的CRP检测缓冲液中有含荧光标记的鼠抗人CRP单克隆抗体Ⅰ(T1抗体，简称T1和鼠抗人CRP单抗Ⅰ)和含荧光标记的兔IgG(C1抗体，简称C1)；所述的CRP反应板包括吸水纸、硝酸纤维素膜、样品垫、PVC底板、鼠抗人CRP单克隆抗体Ⅱ(简称T2和鼠抗人CRP单抗Ⅱ)、羊抗兔IgG、鼠IgG，
所述含荧光标记的鼠抗人CRP单克隆抗体Ⅰ和含荧光标记的兔IgG为鼠抗人CRP单克隆抗体Ⅰ(T1)和兔IgG(C1)经荧光素标记后得到；
所述荧光素对鼠抗人CRP单克隆抗体Ⅰ和兔IgG的标记为将鼠抗人CRP单克隆抗体Ⅰ和兔IgG与经过活化的荧光素混合交联得到。
本发明公开的C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒的一种改进，荧光素存储液的活化为将荧光素存储液与化学交联剂(荧光素与化学交联剂的摩尔比为1：(0.1～1))混合后，以MES缓冲液作(pH为6.0-7.0)为反应介质，36-38℃培育10～120分钟，得到含有活化后的荧光素，所述荧光素储存液中荧光素的浓度为5～10mg/mL。
本发明公开的C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒的一种改进，化学交联剂为1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、琥珀酸酐及戊二醛中的一种或者几种。
本发明公开的C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒的一种改进，荧光素对鼠抗人CRP单克隆抗体Ⅰ和兔IgG的标记中，荧光素与鼠抗人CRP单克隆抗体Ⅰ的质量比和荧光素与兔IgG的质量比均为1：(5-50)，其中荧光素以活化前的质量计。
本发明公开的C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒的一种改进，鼠抗人CRP单克隆抗体Ⅰ和兔IgG与经过活化的荧光素混合交联后还经过稀释液稀释定容，稀释液含有Tris-HCl5～200mM/L、BSA0.1wt％～3wt％、曲拉通X-1000.1wt％～2wt、NaCl0.9wt％、NaN30.01wt％～1wt％,并且稀释液的pH值为6.0～9.0。这里指以Tris-HCl缓冲液为母液，配置含有BSA0.1wt％～3wt％、曲拉通X-1000.1wt％～2wt、NaCl0.9wt％、NaN30.01wt％～1wt％的稀释液，本发明方案中类似表述方式之处与本处解释的含义相同。
本发明公开的C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒的一种改进，硝酸纤维素膜上由样品垫一侧向吸水纸一侧顺次形成有前质控线C3线、后质控线C2线和检测线T2线，其中T2线为以含有包被用鼠抗人CRP单克隆抗体Ⅱ的划线液Ⅰ得到的划线，C2线为为含有包被用羊抗兔IgG的划线液Ⅱ得到的划线，C3线为以含有包被用鼠IgG的划线液Ⅲ得到的划线。
本发明公开的C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒的一种改进，划线液Ⅰ、划线液Ⅱ以及划线液Ⅲ为分别将包被用鼠抗人CRP单克隆抗体Ⅱ、包被用羊抗兔IgG以及包被用鼠IgG溶解于10-50mM磷酸缓冲液中得到。
本发明公开的C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒的一种改进，磷酸缓冲液中含有0.9wt％～3wt％NaCl、0.1～5wt％海藻糖及0.05-1v/v％表面活性剂，磷酸缓冲液的ph值为6～9。
本发明公开的C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒的一种改进，表面活性剂为吐温20、吐温80、曲拉通X-100、tetronic1307、十二烷基聚乙二醇醚、聚乙二醇及聚乙烯基吡咯烷酮中一种。
以下方案为本发明的优选方案的陈述：
抗体的标记采用荧光素标记。
其中荧光素包括但不限于Lifetechnologies公司产品AlexaFluor系列，使用DMSO(二甲基亚砜)或DMF(N,N-二甲基甲酰胺)将荧光素溶解后定容至浓度5～10mg/ml，作为荧光素存储液。荧光素需进行活化，其活化工艺为：当荧光素表面存在活性基团时，可与特异性抗体直接反应，不需用化学交联剂；反之，则需采用化学交联剂将抗体与荧光素相偶联。其中，化学交联剂包括1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、琥珀酸酐、及戊二醛等。抗体和荧光素的交联技术可保证抗体的高特异性和高亲和力。作为优选，选用的交联剂及方法为零键桥交联剂EDC。该试剂是生物耦合中最小的可利用试剂体系，它通过形成一个不含其它原子的键合介导两个分子之间的生物耦合，这其中一个分子中的一个原子共价的附着于另一个分子的一个原子，它们中间没有介入任何交联剂或间隔基。在本发明的一个优选技术方案中，采用EDC/NHS交联法对荧光素进行活化。荧光素的活化其一般步骤为(以下述方案为例)：将上述的荧光素存储液与EDC和NHS混合，以MES缓冲液作为反应介质，37℃培育10～120分钟，得到活化后的荧光素。活化的荧光素表面含有稳定的活性酯，之后加入需要交联的抗体，活性酯可以与抗体上的氨基缩合成为稳定地酰胺键，得到荧光素标记的抗体。由于抗体上存在多个氨基位点，所以可偶联上多个荧光素分子，以放大反应信号。并且由于抗体的空间折叠方式和Fc端疏水性强，因此偶联反应的绝大多数发生在Fc端，对抗体与抗原的结合的影响不大。荧光素与抗体交联时的质量比可以为1：5～1：50。之后使用透析或者超滤的方式将游离的荧光素去除，使用稀释液定容至适合的浓度。
交联得到的荧光素抗体使用的稀释液为：Tris-HCl5～200mM/L、0.1wt％～3wt％BSA、0.1wt％～2wt％曲拉通X-100、0.9wt％NaCl、0.01wt％～1wt％NaN3pH值为6.0～9.0。
本发明中使用高特异性的鼠抗人CRP单克隆抗体Ⅰ(T1)作为检测标记抗体，并且选用兔IgG(C1)作为质控标记抗体,分别进行荧光素标记，并使用稀释液稀释作为检测缓冲液。检测液中各组分的浓度为：T10.02～0.1mg/ml；C10.005～0.05mg/ml。
(2)、包被抗体
免疫层析技术是建立在层析技术和抗原-抗体特异性免疫反应基础上的一项新型免疫检测技术，以固定有检测线和控制线的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，通过毛细作用使待测物在层析条上移动。本发明使用另一株高特异性的鼠抗人CRP单抗(T2)作为检测包被抗体，包被浓度为1mg/ml～10mg/ml，待测物与T2发生特异性免疫反应。本发明使用经过亲和层析的羊抗兔IgG二抗(C2)作为质控抗体，包被浓度为1mg/ml～10mg/ml，标记有荧光素的兔IgG(C1)在C2线处发生免疫反应。检测线及控制线的包被技术关键为：使用10～50mM磷酸缓冲液溶解待包被抗体，其中含有0.9wt％～3wt％NaCl、0.1～5wt％海藻糖及适量表面活性剂0.05-1v/v％，ph值为6～9。其中，表面活性剂可包括吐温20、吐温80、曲拉通X-100、聚乙二醇、tetronic1307、十二烷基聚乙二醇醚及聚乙烯基吡咯烷酮等。为了降低干扰以适应含有异嗜性抗体及HAMA抗体的血液样本的检测，本发明采用在层析条起始端添加鼠IgG(C3)线作为前质控线的方式截留检测液组分中由人抗鼠抗体及异嗜性抗体相结合的荧光素抗体，当该条线在检测时产生微量荧光信号时，表明检测结果受到的干扰较小或无干扰，当该前端质控线产生的荧光亮度超过阈值时(阈值的确定需要使用该批次样本进行干扰实验确定)，表明结果不可信，该样本需要使用配送的干扰阻断剂进行预处理，需要重新检测。
(3)其他组分
该试剂盒为液体试剂、配套SD校准曲线卡和层析试纸。试剂中含有采用荧光素抗体，使试剂测定的灵敏度高，抗干扰能力强，对脂血有一定的抗干扰性。SD校准曲线卡中含有该批次层析试纸对应的校准曲线，减少了医生所需进行的定标操作步骤。层析试纸采取滤血膜、硝酸纤维素膜以及吸水纸等部件，上面包被了检测抗体，通过双抗夹心法对血液样本中的C反应蛋白进行定量分析。
取硝酸纤维素膜(NC膜)的处理方法为，将其裁剪为宽为2.5cm的长条，长条的一端设定为A端，另一端设定为B端，将按照步骤(2)制得的C3液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，在距A端1.0cm处划线作为前质控线；将按照步骤(2)制得的质控线C2液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，在距A端1.4cm处划线即为后质控线；将按照步骤(2)制得的检测线T2液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，在距A端1.8cm处划线即为检测线；将划好线的硝酸纤维素膜(NC膜)在55度下干燥至少2小时，干燥环境湿度恒定在20％以下；
样品垫选择为致密的玻璃纤维膜，可有效的滤除红细胞，使产品可用于检测全血、血浆、血清多种样本，样品垫无需进行预处理，以减少人为操产生的误差。
将NC膜的非点样面粘帖在PVC底板上，将样品垫裁剪为2cm宽的长条，粘帖于A端的PVC底板上，覆盖NC膜A端2mm，将吸收垫裁剪为1.8cm宽的长条，粘帖于B端的PVC底板上，覆盖NC膜B端约3mm，用滚刷轻压已粘帖好的检测板；用剪切机将粘贴好的检测板切为4mm宽的检测条，装壳，并将壳与干燥剂一同放入铝箔袋，抽真空并封口，即得CRP反应板；所述的CRPID芯片采用以下步骤制成：将CRP标准曲线，质控及批号信息用读写器通过读写软件写入外购的ID芯片，即得CRPID芯片。CRPID芯片中所存储的标准曲线中各标准点的浓度分别为0、1.0、3.0、10.0、80.0、160.0μg/ml。
鼠抗人CRP单克隆抗体(T1)和兔IgG(C1)与荧光素存储液反应时的反应温度为20-24℃。
本发明C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒进行检测时的检测方法为：
(1)、将10μL的样本加入500μl的所述检测缓冲液中，充分混匀；
(2)、取70μL混合液，加入到CRP反应板的测试区，反应3分钟；
(3)、将CRP反应板放入荧光检测仪中，插入ID卡，仪器自动测量并出结果报告。
本发明方案与现有的检测CRP的几种方法相比较：在胶乳凝集实验法的灵敏度为1.0mg/L，是半定量的方法，现在已经较少使用；免疫比浊法的灵敏度为5.0mg/L，检测范围为5～230mg/L，但是需要自动生化分析仪和自动化免疫测定仪等大型仪器，存在操作复杂耗时长，所需要标本量大等问题。化学发光法检测存在时间检测时间长，一般需要耗时90mins左右，需要在实验室专业操作。放射免疫测定法的灵敏度在3μg/L，但是存在同位素污染等问题。荧光胶乳免疫层析法干扰较大，容易发生聚沉导致测量结果不准确。使用荧光素免疫层析方法全程定量检测C反应蛋白比传统方法更敏感，测定范围更宽广。临床常规测定C反应蛋白的方法为免疫比浊法，测定范围一般为3～200mg/L，但其灵敏度相对较低，无法准确测定3mg/L以下水平的C反应蛋白含量，不能作为心、脑血管疾病的危险指标，预测心、脑血管疾病发生的危险性。临床高敏C反应蛋白的测定范围又相对较窄，无法准确测定高浓度水平下CRP的含量，不能用于感染性疾病的诊断或者疗效的观察。而本发明提供的方法提高了检测灵敏度和检测稳定性，降低了非特异性结合，并且具有较宽的线性范围，检测时间仅为3分钟，大大提高了诊断效率。
1、本发明使用荧光素偶联到抗体表面的氨基基团，单个抗体可结合多个荧光素分子，可放大产生的荧光信号，具有高灵敏度。
2、本发明采用前后双C线方法进行质控，前置C线可降低血液样本中异嗜性抗体及HAMA抗体带来的干扰，后置C线可对荧光信号进行校正，可提高检测的准确度。
3、本发明选用的包被抗体缓冲液增强了抗体蛋白与NC膜的结合效率，并且与检测液中的抗体处于最适配比范围，所以达到较宽的线性范围。
附图说明
图1、本发明实施例1的校准曲线图；
图2、本发明实施例1与贝克曼试剂检测血浆样本的相关性分析图；
图3、本发明的结构示意图。
1、PVC底板；2、硝酸纤维素膜(NC膜)；3、样品垫；
4、后质控线(C2线)；5、检测线(T2线)；6、吸水纸；
7、前质控线(C3线)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。需要说明的是，下面描述中使用的词语“前”、“后”、“左”、“右”、“上”和“下”指的是附图中的方向，词语“内”和“外”分别指的是朝向或远离特定部件几何中心的方向。
实施例1
荧光素使用Lifetechnologies公司的AlexaFluor660，使用DMSO溶解后定容至浓度10mg/ml，作为荧光素存储液。采用EDC/NHS交联法对荧光素进行活化(荧光素与化学交联剂总量的摩尔比为1：0.14)。将荧光素存储液与EDC和NHS混合，以50mMpH6.0MES缓冲液作为反应介质，37℃培育60分钟，得到活化后的荧光素。
取1mg活化后的荧光素加入20mg鼠抗人CRP单抗Ⅰ(T1)37℃培育60分钟。之后使用50mMTris-HCl缓冲液ph7.4透析出去游离的荧光素，每6小时更换透析液一次，共三次。收集透析袋中液体，超滤浓缩后使用Tris-HCl50mM/L、1％BSA、0.6％曲拉通X-100、0.9％NaCl、0.05％NaN3pH值为7.4的荧光素抗体稀释液稀释到10mg/ml储存。
取1mg活化后的荧光素加入20mg兔IgG(C1)37℃培育60分钟。之后使用50mMTris-HClph7.4透析出去游离的荧光素，每6小时更换透析液一次，共三次。收集透析袋中液体，超滤浓缩后使用Tris-HCl50mM/L、1％BSA、0.6％曲拉通X-100、0.9％NaCl、0.05％NaN3pH值为7.4的稀释液稀释到10mg/ml储存。
配置检测液，使用Tris-HCl50mM/L、1％BSA、0.6％曲拉通X-100、0.9％NaCl、0.05％NaN3pH值为7.4的稀释液将检测液中各组分的浓度稀释为：T10.08mg/ml；C10.02mg/ml。
(2)、包被抗体
使用含有0.9％NaCl、0.5％海藻糖及0.5％曲拉通X-100，ph值为7.2的10Mm/L磷酸缓冲液溶解鼠IgG(C3)，浓度为1mg/ml。
使用含有0.9％NaCl、0.5％海藻糖及0.5％曲拉通X-100，ph值为7.2的10Mm/L磷酸缓冲液溶解羊抗兔IgG二抗(C2)，浓度为1mg/ml。
使用含有0.9％NaCl、0.5％海藻糖及0.5％曲拉通X-100，ph值为7.2的10Mm/L磷酸缓冲液溶解鼠抗人CRP单抗Ⅱ(T2)，浓度为2mg/ml。
如图1和图2所示，图1表明：该试剂盒在实施例一的情况，线性范围为1-160ug/ml(或mg/L，两者均可，单位需要统一)在此区间具有非常好的线性。
图2表明：该试剂盒在实施例一的情况，检测血浆样本，与贝克曼检测试剂的相关性R2>0.99，表明试剂盒具有非常好的的准确性。
实施例2
荧光素使用Lifetechnologies公司的AlexaFluor660，使用DMSO溶解后定容至浓度5mg/ml，作为荧光素存储液。采用EDC/NHS交联法对荧光素进行活化(荧光素与化学交联剂总量的摩尔比为1：0.14)。将荧光素存储液与EDC和NHS混合，以50mMpH6.2MES缓冲液作为反应介质，36℃培育10分钟，得到活化后的荧光素。
取1mg活化后的荧光素加入5mg鼠抗人CRP单抗Ⅰ(T1)36℃培育10分钟。之后使用50mMTris-HCl缓冲液ph7.4透析出去游离的荧光素，每6小时更换透析液一次，共三次。收集透析袋中液体，超滤浓缩后使用Tris-HCl5mM/L、2.3％BSA、0.1％曲拉通X-100、0.9％NaCl、0.43％NaN3pH值为6的荧光素抗体稀释液稀释到10mg/ml储存。
取1mg活化后的荧光素加入5mg兔IgG(C1)36℃培育10分钟。之后使用50mMTris-HClph7.4透析出去游离的荧光素，每6小时更换透析液一次，共三次。收集透析袋中液体，超滤浓缩后使用Tris-HCl5mM/L、2.3％BSA、0.1％曲拉通X-100、0.9％NaCl、0.43％NaN3pH值为6的稀释液稀释到10mg/ml储存。
配置检测液，使用Tris-HCl5mM/L、2.3％BSA、0.1％曲拉通X-100、0.9％NaCl、0.43％NaN3pH值为6的稀释液将检测液中各组分的浓度稀释为：T10.02mg/ml；C10.01mg/ml。
(2)、包被抗体
使用含有3％NaCl、4.2％海藻糖及0.3％曲拉通X-100，ph值为6.3的10Mm/L磷酸缓冲液溶解，鼠IgG(C3)浓度为1mg/ml。
使用含有3％NaCl、4.2％海藻糖及0.3％曲拉通X-100，ph值为6.3的10Mm/L磷酸缓冲液溶解，羊抗兔IgG二抗(C2)浓度为1mg/ml。
使用含有3％NaCl、4.2％海藻糖及0.3％曲拉通X-100，ph值为6.3的10Mm/L磷酸缓冲液溶解，鼠抗人CRP单抗Ⅱ(T2)浓度为2mg/ml。
实施例3
荧光素使用Lifetechnologies公司的AlexaFluor660，使用DMSO溶解后定容至浓度7mg/ml，作为荧光素存储液。采用EDC/NHS交联法对荧光素进行活化(荧光素与化学交联剂总量的摩尔比为1：0.14)。将荧光素存储液与EDC和NHS混合，以50mMpH6.4MES缓冲液作为反应介质，38℃培育120分钟，得到活化后的荧光素。
取1mg活化后的荧光素加入50mg鼠抗人CRP单抗Ⅰ(T1)38℃培育120分钟。之后使用50mMTris-HCl缓冲液ph7.4透析出去游离的荧光素，每6小时更换透析液一次，共三次。收集透析袋中液体，超滤浓缩后使用Tris-HCl200mM/L、1.7％BSA、2％曲拉通X-100、0.9％NaCl、0.85％NaN3pH值为9的荧光素抗体稀释液稀释到10mg/ml储存。
取1mg活化后的荧光素加入50mg兔IgG(C1)38℃培育120分钟。之后使用50mMTris-HClph7.4透析出去游离的荧光素，每6小时更换透析液一次，共三次。收集透析袋中液体，超滤浓缩后使用Tris-HCl200mM/L、1.7％BSA、2％曲拉通X-100、0.9％NaCl、0.85％NaN3pH值为9的稀释液稀释到10mg/ml储存。
配置检测液，使用Tris-HCl200mM/L、1.7％BSA、2％曲拉通X-100、0.9％NaCl、0.85％NaN3pH值为9的稀释液将检测液中各组分的浓度稀释为：T10.1mg/ml；C10.008mg/ml。
(2)、包被抗体
使用含有1.9％NaCl、2.3％海藻糖及1％曲拉通X-100，ph值为8.2的10Mm/L磷酸缓冲液溶解，鼠IgG(C3)浓度为1mg/ml。
使用含有1.9％NaCl、2.3％海藻糖及1％曲拉通X-100，ph值为8.2的10Mm/L磷酸缓冲液溶解，羊抗兔IgG二抗(C2)浓度为1mg/ml。
使用含有1.9％NaCl、2.3％海藻糖及1％曲拉通X-100，ph值为8.2的10Mm/L磷酸缓冲液溶解，鼠抗人CRP单抗Ⅱ(T2)浓度为2mg/ml。
实施例4
荧光素使用Lifetechnologies公司的AlexaFluor660，使用DMSO溶解后定容至浓度9mg/ml，作为荧光素存储液。采用EDC/NHS交联法对荧光素进行活化(荧光素与化学交联剂总量的摩尔比为1：0.14)。将荧光素存储液与EDC和NHS混合，以50mMpH7.0MES缓冲液作为反应介质，36.5℃培育40分钟，得到活化后的荧光素。
取1mg活化后的荧光素加入30mg鼠抗人CRP单抗Ⅰ(T1)36.5℃培育40分钟。之后使用50mMTris-HCl缓冲液ph7.4透析出去游离的荧光素，每6小时更换透析液一次，共三次。收集透析袋中液体，超滤浓缩后使用Tris-HCl150mM/L、3％BSA、1.6％曲拉通X-100、0.9％NaCl、0.01％NaN3pH值为8.4的荧光素抗体稀释液稀释到10mg/ml储存。
取1mg活化后的荧光素加入30mg兔IgG(C1)36.5℃培育40分钟。之后使用50mMTris-HClph7.4透析出去游离的荧光素，每6小时更换透析液一次，共三次。收集透析袋中液体，超滤浓缩后使用Tris-HCl150mM/L、3％BSA、1.6％曲拉通X-100、0.9％NaCl、0.01％NaN3pH值为8.4的稀释液稀释到10mg/ml储存。
配置检测液，使用Tris-HCl150mM/L、3％BSA、1.6％曲拉通X-100、0.9％NaCl、0.01％NaN3pH值为8.4的稀释液将检测液中各组分的浓度稀释为：T10.05mg/ml；C10.005mg/ml。
(2)、包被抗体
使用含有2.3％NaCl、0.1％海藻糖及0.4％曲拉通X-100，ph值为9的10Mm/L磷酸缓冲液溶解，鼠IgG(C3)浓度为1mg/ml。
使用含有2.3％NaCl、0.1％海藻糖及0.4％曲拉通X-100，ph值为9的10Mm/L磷酸缓冲液溶解，羊抗兔IgG二抗(C2)浓度为1mg/ml。
使用含有2.3％NaCl、0.1％海藻糖及0.4％曲拉通X-100，ph值为9的10Mm/L磷酸缓冲液溶解，鼠抗人CRP单抗Ⅱ(T2)浓度为2mg/ml。
实施例5
荧光素使用Lifetechnologies公司的AlexaFluor660，使用DMSO溶解后定容至浓度8mg/ml，作为荧光素存储液。采用EDC/NHS交联法对荧光素进行活化(荧光素与化学交联剂总量的摩尔比为1：0.14)。将荧光素存储液与EDC和NHS混合，以50mMpH6.8MES缓冲液作为反应介质，37.5℃培育90分钟，得到活化后的荧光素。
取1mg活化后的荧光素加入40mg鼠抗人CRP单抗Ⅰ(T1)37.5℃培育90分钟。之后使用50mMTris-HCl缓冲液ph7.4透析出去游离的荧光素，每6小时更换透析液一次，共三次。收集透析袋中液体，超滤浓缩后使用Tris-HCl170mM/L、0.1％BSA、0.9％曲拉通X-100、0.9％NaCl、1％NaN3pH值为7的荧光素抗体稀释液稀释到10mg/ml储存。
取1mg活化后的荧光素加入40mg兔IgG(C1)37.5℃培育90分钟。之后使用50mMTris-HClph7.4透析出去游离的荧光素，每6小时更换透析液一次，共三次。收集透析袋中液体，超滤浓缩后使用Tris-HCl170mM/L、0.1％BSA、0.9％曲拉通X-100、0.9％NaCl、1％NaN3pH值为7的稀释液稀释到10mg/ml储存。
配置检测液，使用Tris-HCl170mM/L、0.1％BSA、0.9％曲拉通X-100、0.9％NaCl、1％NaN3pH值为7的稀释液将检测液中各组分的浓度稀释为：T10.06mg/ml；C10.05mg/ml。
(2)、包被抗体
使用含有2.7％NaCl、0.1％海藻糖及0.05％曲拉通X-100，ph值为6的10Mm/L磷酸缓冲液溶解，鼠IgG(C3)浓度为1mg/ml。
使用含有2.7％NaCl、0.1％海藻糖及0.05％曲拉通X-100，ph值为6的10Mm/L磷酸缓冲液溶解，羊抗兔IgG二抗(C2)浓度为1mg/ml。
使用含有2.7％NaCl、0.1％海藻糖及0.05％曲拉通X-100，ph值为6的10Mm/L磷酸缓冲液溶解，鼠抗人CRP单抗Ⅱ(T2)浓度为2mg/ml。
以上实施例中(以下替代方案都可以对上述实施例中技术方案进行同等替换，而不影响本发明技术方案的实施，同时也不超出本发明要求的范围内)，荧光素在荧光素存储液中的浓度还可以为5.3、6.6、7.8、8.4、9.5以及5-10mg/mL范围内的其它任意值；荧光素存储液的溶剂还可以为DMF以及DMSO和DMF的任意体积比混合液(如DMSO占溶剂总体积的20-80％，具体如20、22、30、31、46、58、63、75、80以及20-80％范围内的其它任意值)；采用交联剂对荧光素进行活化时，交联剂还可以为1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺单组份交联剂，N-羟基琥珀酰亚胺单组份交联剂，琥珀酸酐单组份交联剂，戊二醛单组份交联剂，1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺与琥珀酸酐双组份交联剂，1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺与戊二醛双组份交联剂，N-羟基琥珀酰亚胺与琥珀酸酐双组份交联剂，N-羟基琥珀酰亚胺与戊二醛双组份交联剂，琥珀酸酐与戊二醛双组份交联剂，N-羟基琥珀酰亚胺、琥珀酸酐及戊二醛三组分交联剂，1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺、琥珀酸酐及戊二醛三组分交联剂，1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺及戊二醛三组分交联剂，1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺及琥珀酸酐三组分交联剂，1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、琥珀酸酐及戊二醛四组分交联剂；荧光素活化时，荧光素与化学交联剂的摩尔比还可以为1:0.1、1:0.15、1:0.18、1:0.2、1:0.22、1:0.27、1:0.3、1:0.33、1:0.39、1:0.4、1:0.42、1:0.48、1:0.5、1:0.53、1:0.55、1:0.6、1:0.64、1:0.66、1:0.7、1:0.74、1:0.78、1:0.8、1:0.82、1:0.89、1:0.9、1:0.93、1:0.96、1:1以及1：(0.1～1)范围内的其它任意值；荧光素活化时的反应温度还可以为36.2、36.7、36.8、36.9、37.2、37.7、37.8、37.9以及36-38℃范围内的其它任意值；荧光素活化时的培育时间还可以为13、17、20、22、26、30、35、38、41、43、47、49、50、52、55、59、63、66、68、70、73、76、78、80、81、85、88、91、96、99、100、101、106、108、110、113、116、118以及10-120min范围内的其它任意值；活化后的荧光素对鼠抗人CRP单克隆抗体Ⅰ和兔IgG的标记时，反应温度均还可以为36.2、36.7、36.8、36.9、37.2、37.7、37.8、37.9以及36-38℃范围内的其它任意值；活化后的荧光素对鼠抗人CRP单克隆抗体Ⅰ和兔IgG的标记时，培育时间还可以为13、17、20、22、26、30、35、38、41、43、47、49、50、52、55、59、63、66、68、70、73、76、78、80、81、85、88、91、96、99、100、101、106、108、110、113、116、118以及10-120min范围内的其它任意值；活化后的荧光素对鼠抗人CRP单克隆抗体Ⅰ和兔IgG的标记时，其中荧光素以活化前的质量计，荧光素与鼠抗人CRP单克隆抗体Ⅰ的质量比和荧光素与兔IgG的质量比均还可以为1:7、1:10、1:13、1:16、1:22、1:26、1:33、1：38、1:42、1:48以及1：(5-50)范围内的其它任意值；磷酸缓冲液中表面活性剂还可以为吐温20、吐温80、聚乙二醇、tetronic1307、十二烷基聚乙二醇醚、聚乙烯基吡咯烷酮任一。
以上实施例中试剂的制备均适用于本以下技术方案的实施：
如图3所示，取硝酸纤维素膜2(NC膜)的处理方法为，将其裁剪为宽为2.5cm的长条，长条的一端设定为A端，另一端设定为B端，将按照步骤(2)制得的C3液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，在距A端1.0cm处划线作为前质控线7；将按照步骤(2)制得的质控线C2液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，在距A端1.4cm处划线即为后质控线4；将按照步骤(2)制得的检测线T2液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，在距A端1.8cm处划线即为检测线5；将划好线的硝酸纤维素膜2(NC膜)在55度下干燥4小时，干燥环境湿度恒定在20％以下；
样品垫3选择为致密的玻璃纤维膜，可有效的滤除红细胞，使产品可用于检测全血、血浆、血清多种样本，样品垫无需进行预处理，以减少人为操产生的误差。
将NC膜2的非点样面粘帖在PVC底板1上，将样品垫裁3剪为2cm宽的长条，粘帖于A端的PVC底板上，覆盖NC膜A端2mm，将吸水纸6裁剪为1.8cm宽的长条，粘帖于B端的PVC底板上，并覆盖NC膜B端约3mm，用滚刷轻压已粘帖好的检测版；用剪切机将粘贴好的检测板切为4mm宽的检测条，装壳，并将壳与干燥剂一同放入铝箔袋，抽真空并封口，即得CRP反应板；所述的CRPID芯片采用以下步骤制成：将CRP标准曲线，质控及批号信息用读写器通过读写软件写入外购的ID芯片，即得CRPID芯片。制得CRPID芯片中所存储的标准曲线中各标准点的浓度分别为0、1.0、3.0、10.0、80.0、160.0mg/L。
鉴于本发明方案实施例众多，各实施例实验数据庞大众多，不适合于此处逐一列举说明，但是各实施例所需要验证的内容和得到的最终结论均接近，故而此处不对各个实施例的验证内容进行逐一说明，仅以上述部分实施例作为代表说明本发明申请优异之处。
本处实施例对本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换所形成的新的技术方案，同样都在本发明要求保护的范围内；同时本发明方案所有列举或者未列举的实施例中，在同一实施例中的各个参数仅仅表示其技术方案的一个实例(即一种可行性方案)，而各个参数之间并不存在严格的配合与限定关系，其中各参数在不违背公理以及本发明述求时可以相互替换，特别声明的除外。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述技术手段所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。以上所述是本发明的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒，包括CRP反应板，CRP检测缓冲液，CRPID芯片；所述的CRP检测缓冲液中有含荧光标记的鼠抗人CRP单克隆抗体Ⅰ和含荧光标记的兔IgG；所述的CRP反应板包括吸水纸、硝酸纤维素膜、样品垫、PVC底板、鼠抗人CRP单克隆抗体Ⅱ、羊抗兔IgG、鼠IgG，其特征在于：
所述含荧光标记的鼠抗人CRP单克隆抗体Ⅰ和含荧光标记的兔IgG为鼠抗人CRP单克隆抗体和兔IgG经荧光素标记后得到；
所述荧光素对鼠抗人CRP单克隆抗体Ⅰ和兔IgG的标记为将鼠抗人CRP单克隆抗体Ⅰ和兔IgG与经过活化的荧光素混合交联得到。
2.根据权利要求1所述的C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒，其特征在于：所述荧光素存储液的活化为将荧光素存储液与化学交联剂混合后，以MES缓冲液作为反应介质，36-38℃培育10～120分钟，得到含有活化后的荧光素，所述荧光素储存液中荧光素的浓度为5～10mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒，其特征在于：所述化学交联剂为1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、琥珀酸酐及戊二醛中的一种或者几种。
4.根据权利要求1所述的C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒，其特征在于：所述荧光素对鼠抗人CRP单克隆抗体Ⅰ和兔IgG的标记中，荧光素与鼠抗人CRP单克隆抗体Ⅰ的质量比和荧光素与兔IgG的质量比均为1：(5-50)，其中荧光素以活化前的质量计。
5.根据权利要求1所述的C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒，其特征在于：所述鼠抗人CRP单克隆抗体Ⅰ和兔IgG与经过活化的荧光素混合交联后还经过稀释液稀释定容，所述稀释液含有Tris-HCl5～200mM/L、BSA0.1wt％～3wt％、曲拉通X-1000.1wt％～2wt％、NaCl0.9wt％、NaN30.01wt％～1wt％,并且稀释液的pH值为6.0～9.0。
6.根据权利要求1所述的C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒，其特征在于：所述硝酸纤维素膜上由样品垫一侧向吸水纸一侧顺次形成有前质控线C3线、后质控线C2线和检测线T2线，其中T2线为以含有包被用鼠抗人CRP单克隆抗体Ⅱ的划线液Ⅰ得到的划线，C2线为为含有包被用羊抗兔IgG的划线液Ⅱ得到的划线，C3线为以含有包被用鼠IgG的划线液Ⅲ得到的划线。
7.根据权利要求6所述的C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒，其特征在于：所述划线液Ⅰ、划线液Ⅱ以及划线液Ⅲ为分别将包被用鼠抗人CRP单克隆抗体Ⅱ、包被用羊抗兔IgG以及包被用鼠IgG溶解于10-50mM磷酸缓冲液中得到。
8.根据权利要求7所述的C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒，其特征在于：所述磷酸缓冲液中含有0.9wt％～3wt％NaCl、0.1～5wt％海藻糖及0.05-1v/v％表面活性剂，磷酸缓冲液的ph值为6～9。
9.根据权利要求8所述的C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒，其特征在于：所述表面活性剂为吐温20、吐温80、曲拉通X-100、tetronic1307、十二烷基聚乙二醇醚、聚乙二醇及聚乙烯基吡咯烷酮中一种。
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