CN112305221A - 犬细小病毒检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

犬细小病毒检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种犬细小病毒检测试剂盒，包括试纸条以及标记管，所述试纸条包括样品垫、反应膜、吸水垫，所述反应膜上设有相互间隔的检测线及质控线，所述检测线较所述质控线更靠近所述样品垫，所述标记管的内表面上负载有分别用荧光微球标记的第一犬细小病毒单克隆抗体和质控抗体，所述检测线包被有第二犬细小病毒单克隆抗体，所述第一犬细小病毒单克隆抗体和所述第二犬细小病毒单克隆抗体分别识别犬细小病毒的不同抗原表位，所述质控线包被有能够与所述质控抗体特异性结合的抗原。

Description

犬细小病毒检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，特别是涉及犬细小病毒检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
犬细小病毒最早是从患肠炎的病犬粪便中分离获得的病毒，该病毒属于细小病毒科，细小病毒属。病毒进入健康犬的消化道进行感染后，主要攻击肠上皮细胞和心肌细胞，出现呕吐、腹泻、精神不振、脱水、发热等临床症状，其感染性极强，致死率较高。犬是主要的宿主，随着病毒抗原的漂移，狐狸、水貂、猫和郊狼等也会被感染。近年来宠物市场不断扩大和发展，犬成为最受人类喜爱的家庭宠物之一，其健康状况往往与人类自身的健康状况息息相关，关注宠物犬的健康对于动物福利和人类健康具有重要的公共卫生意义。犬细小病毒是我国养犬业最为严重的传染病之一，该病既影响着家养宠物的生命健康，又危害着我国养犬业、毛皮动物养殖业及野生动物保护业的发展。目前细小病毒检测方法主要有血凝抑制试验(HI)、核酸检测、酶联免疫(ELISA)和胶体金法。
血凝抑制试验(HI)样本要求较高需要新鲜的红细胞，且人为操作对实验结果影响较大，目前只适用于个别实验室，还无法工业化批量生产，将其推广到宠物医院临床一线检测需要很长一段时间。核酸检测需要配备一整套精密的检测设备，这对于小宠物医院价格是较为昂贵的。酶联免疫(ELISA)检测过程繁琐，耗时较长，所需仪器设备体积较大且需要配备专业技术人员，这对于小型宠物医院和野外考察即时检测不适用。胶体金法灵敏度低、重复性差，只能区分阴阳，无法进行定量检测。
中国专利201820862282.X公开了一种犬细小病毒免疫荧光检测试剂，所诉检测试剂包括一检测卡(侧流片)和一卡盒，该检测卡包括背衬以及位于背衬上的样品垫，荧光乳胶垫，检测区，质控区，硝酸纤维素膜，吸收垫，荧光乳胶垫包被有荧光乳胶标记的犬细小病毒抗体-1；并且检测区包被有犬细小病毒抗体-2，质控区包被有能结合犬细小病毒抗体-1的羊抗鼠IgG二抗。其缺点为：当待测样本中所含犬细小病毒抗原浓度较高时，将在检测线处聚集大量的荧光胶乳微球，从而影响质控线的检测，当待测样本中所含犬细小病毒抗原浓度较低时，将在质控线处聚集大量的荧光胶乳微球，从而影响整体的T/C值，即检测线与质控线使用同一检测系统，可能会影响检测的特异性、灵敏度和检测上限。
发明内容
基于此，有必要针对传统检测犬细小病毒的检测特异性差、灵敏度差的问题，提供一种能够实现快速、精准检测的犬细小病毒检测试剂盒及其制备方法。
一种犬细小病毒检测试剂盒，包括试纸条以及标记管，所述试纸条包括样品垫、反应膜、吸水垫，所述反应膜上设有相互间隔的检测线及质控线，所述检测线较所述质控线更靠近所述样品垫，所述标记管的内表面上负载有分别用荧光微球标记的第一犬细小病毒单克隆抗体和质控抗体，所述检测线包被有第二犬细小病毒单克隆抗体，所述第一犬细小病毒单克隆抗体和所述第二犬细小病毒单克隆抗体分别识别犬细小病毒的不同抗原表位，所述质控线包被有能够与所述质控抗体特异性结合的抗原。
在其中一个实施例中，所述第一犬细小病毒单克隆抗体和所述质控抗体均匀分布在所述标记管的内表面。
在其中一个实施例中，以所述标记管的内表面面积计算，所述标记管的内表面包被的所述第一犬细小病毒单克隆抗体的浓度为20ng/cm2～200ng/cm2，所述质控抗体的浓度为2ng/cm2～20ng/cm2。
在其中一个实施例中，所述标记管的内表面上负载有海藻糖、吐温80和甘氨酸。
在其中一个实施例中，以所述反应膜的表面面积计算，所述反应膜的检测线上包被的所述第二犬细小病毒单克隆抗体的浓度为50ng/cm2～500ng/cm2，所述能够与所述质控抗体特异性结合的抗原的浓度为5ng/cm2～50ng/cm2。
在其中一个实施例中，所述试剂盒包括样本稀释液，所述样本稀释液为含有质量分数为0.05％～0.15％SDS、1％～2％NaCl、0.3％～0.7％PVP、0.3％～0.7％Tween、0.5％～1.5％TX-100和0.015％～0.025％proclin300的0.005M～0.015M PB缓冲液。
在其中一个实施例中，所述荧光微球的直径为0.1μm～1μm。
在其中一个实施例中，以搭接后的结构计算，所述试纸条中所述样品垫、所述反应膜、所述吸水垫的长度比为(1.6～3.0)：(2.0～3.0)：(2.0～2.5)。
一种所述的犬细小病毒检测试剂盒的制备方法，所述标记管的制备包括以下步骤：
将分别用荧光微球标记的第一犬细小病毒单克隆抗体和质控抗体混合在标记混合液中；
将所述标记混合液施加在空白管内，烘干。
在其中一个实施例中，所述试纸条的制备包括以下步骤：
将第二犬细小病毒单克隆抗体包被在反应膜上形成检测线；
将与所述质控抗体特异性结合的抗原包被在所述反应膜上形成与所述检测线相间隔的质控线；
将样品垫、具有所述检测线和所述质控线的所述反应膜及吸水垫搭接。
本发明的试剂盒单独设置标记管，通过将待检测样品混合在标记管中实现对样品的标记，然后将标记后的样品施加在试纸条的样品垫上进行层析实现检测，相较于常规的仅利用试纸条的检测方法，通过本发明的试剂盒能够实现对犬细小病毒的快速、精确诊断。
附图说明
图1为本发明一实施例的犬细小病毒检测试剂盒的结构示意图；
图2为本发明另一实施例的犬细小病毒检测试剂盒的结构示意图；
图3为本发明另一实施例的犬细小病毒检测试剂盒的结构示意图；
图4为本发明实施例的剂量-反应曲线图；
图5为本发明实施例1的线性关系曲线图；
图6为本发明对比例1的线性关系曲线图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明实施例提供一种犬细小病毒检测试剂盒，包括试纸条以及标记管，所述试纸条包括样品垫、反应膜、吸水垫，所述反应膜上设有相互间隔的检测线及质控线，所述检测线较所述质控线更靠近所述样品垫，所述标记管的内表面上负载有分别用荧光微球标记的第一犬细小病毒单克隆抗体和质控抗体，所述检测线包被有第二犬细小病毒单克隆抗体，所述第一犬细小病毒单克隆抗体和所述第二犬细小病毒单克隆抗体分别识别犬细小病毒的不同抗原表位，所述质控线包被有能够与所述质控抗体特异性结合的抗原。
本发明的试剂盒单独设置标记管，通过将待检测样品混合在标记管中实现对样品的标记，然后将标记后的样品施加在试纸条的样品垫上进行层析实现检测，相较于常规的仅利用试纸条的检测方法，通过本发明的试剂盒能够实现对犬细小病毒的快速、精确诊断。
在一些实施例中，该试纸条还包括底板，所述样品垫、所述反应膜及所述吸水垫设于所述底板上，所述反应膜搭接在所述样品垫与所述吸水垫之间。
上述犬细小病毒免疫层析试纸条工作时，待测样品先混合在标记管中实现对样品的标记，标记后的样品与样品垫接触，通过层析作用，层析至反应膜，通过检测线的结果表征样品中是否含有犬细小病毒，通过质控线的结果表征该标记管是否能够正常工作。
若待检测样品中含有犬细小病毒，则样品中的犬细小病毒先与标记管中的用荧光微球标记的第一犬细小病毒单克隆抗结合形成反应复合物，然后标记后的样品加至试纸条，在层析作用下，反应复合物沿着反应膜向前移动，反应复合物被反应膜中的检测线上包被的第二犬细小病毒单克隆抗体所捕获。待检测样品中的犬细小病毒越多，检测线上积聚的结合后的复合物越多，显色就更加明显。例如标记微球选自荧光微球时，荧光信号的强度则反应了被捕获的犬细小病毒的数量。反应复合物和用荧光微球标记的质控抗体继续层析至质控线，如果该标记管和试纸条没有质量问题，则荧光微球标记的质控抗体与质控线上的与所述质控抗体特异性结合的抗原结合显色。
若待检测样品中不含有犬细小病毒，则标记管中用荧光微球标记的第一犬细小病毒单克隆抗体和检测线包被的第二犬细小病毒单克隆抗体均未与犬细小病毒结合，因此检测线不显色，用荧光微球标记的质控抗体继续层析至质控线，质控抗体与质控线上的与所述质控抗体特异性结合的抗原结合显色。
若质控线不显色，则说明犬细小病毒免疫层析试纸条失效，或者标记管失效。
在一些实施方式中，所述第一犬细小病毒单克隆抗体和所述质控抗体均匀分布在所述标记管的内表面。在进行工作时，将待检测样品加入到该标记管中，待检测样品与标记管内表面上的荧光微球标记的第一犬细小病毒单克隆抗体以及质控抗体混合形成标记混合液用于检测，第一犬细小病毒单克隆抗体和所述质控抗体均匀分布在所述标记管的内表面能够降低样品与标记管内表面抗体的混合难度，并且降低对于样品量的要求，使得即使样本量很少也能够将标记管内表面上的抗体混合到样品中。
在一些实施方式中，以所述标记管的内表面面积计算，所述标记管的内表面包被的所述第一犬细小病毒单克隆抗体的浓度为20ng/cm2～200ng/cm2，所述质控抗体的浓度为2ng/cm2～20ng/cm2。
在一些实施方式中，所述标记管的内表面上负载有海藻糖、吐温80和甘氨酸。在标记管上负载此组分一方面有利于标记管上抗体的保存，另一方面有利于使得标记管上负载的抗体更容易与标记管剥离而混合到样品中。
在一些实施方式中，以所述反应膜的表面面积计算，所述反应膜上包被的所述第二犬细小病毒单克隆抗体的浓度为50ng/cm2～500ng/cm2，所述能够与所述质控抗体特异性结合的抗原的浓度为5ng/cm2～50ng/cm2。
在一些实施方式中，所述试剂盒包括样本稀释液，该样本稀释液用于稀释待检测样品，该样本稀释液需要在待检测样品加入标记管之前对待检测样品进行稀释，通过样本稀释液扩大待检测样品的溶液体积，更有利于标记管上抗体的混合。在待检测样品所述样本稀释液为含有质量分数为0.05％～0.15％SDS、1％～2％NaCl、0.3％～0.7％PVP、0.3％～0.7％Tween、0.5％～1.5％TX-100和0.015％～0.025％proclin300的0.005M～0.015MPB缓冲液。
在一些实施方式中，样品垫上包被有非检测样品种属的抗体和凝集素。
待检测样品中含有内源性异嗜性抗体，可结合其他种属的免疫球蛋白，包括作为免疫分析试剂的异源抗体，这些抗体会干扰免疫检验体系，造成与实际分析物浓度无关的虚高检测值，可能导致误诊，发明人发现，在样品垫上包被合适的浓度的非检测样品种属的抗体起到被动阻断作用，以确保优先于分析物结合异嗜性抗体，能排除异嗜性干扰的一部分。
在一具体实施例中，所述非检测样品种属的抗体选自鼠源IgG，所述质控抗体选自羊抗兔IgG，所述与所述质控抗体特异性结合的抗原选自兔IgG。具体的，兔IgG可选自兔抗鼠IgG。
在一些实施方式中，所述荧光微球的直径为0.1μm～1μm，受激发后发射的波长为180～800nm。具体直径可以为100nm、200nm、500nm、700nm、1μm等。
在一些实施方式中，反应膜的材料可以为硝酸纤维素膜。
在一具体实施例中，底板可选自PVC板。
在一些实施方式中，以搭接后的结构计算，所述试纸条中所述样品垫、所述反应膜、所述吸水垫的长度比为(1.6～3.0)：(2.0～3.0)：(2.0～2.5)。
该试剂盒可包括卡壳，用于盛置该犬细小病毒检测试纸条。
本发明实施例还提供了上述任一实施例的犬细小病毒检测试剂盒的制备方法。
在一些实施方式中，所述标记管的制备包括以下步骤：
将分别用荧光微球标记的第一犬细小病毒单克隆抗体和质控抗体混合在标记混合液中；
将所述标记混合液施加在空白管内，烘干。
其中，标记混合液的制备方法为：将含有用荧光微球标记的第一犬细小病毒单克隆抗体的第一标记溶液、含有用荧光微球标记的标记抗体的第二标记溶液、标记处理液混合后得到标记混合液。
其中，第一标记溶液的制备步骤可以为：
a1、活化荧光微球，向微球悬浮液中加入活化剂EDC溶液和NHS溶液，制备成活化荧光微球的溶液；
a2、向所述活化荧光微球的溶液中加入第一犬细小病毒单克隆抗体，室温混合；
a3、所得混合物离心，溶解所得沉淀，获得第一标记溶液。
其中，第二标记溶液的制备步骤可以为：
b1、活化荧光微球，向微球悬浮液中加入活化剂EDC溶液和NHS溶液，制备成活化荧光微球的溶液；
b2、向所述活化荧光微球的溶液中加入质控抗体，室温混合；
b3、所得混合物离心，溶解所得沉淀，获得第二标记溶液。
进一步的，所述第一标记溶液和第二标记溶液的喷用量为0.012～0.024μL/cm。
步骤a1和b1中，所述活化荧光微球的溶液的浓度为800～1200μg/100μL。
步骤a1和b1中，所述EDC溶液浓度为10mg/mL～100mg/mL。
步骤a1和b1中，所述NHS溶液浓度为10mg/mL～100mg/mL。
步骤a2中，所述第一犬细小病毒单克隆抗体的加入量为：每100μL所述活化荧光微球的溶液中加入5～100μg，加入后室温混合的时间为1小时～3小时。
步骤a3中，所得沉淀用PBS-TBN溶解，溶解后所得溶液的体积与活化荧光微球的溶液体积相等，获得第一标记溶液。
步骤b2中，所述加入质控抗体的加入量为：每100μL所述活化荧光微球的溶液中加入5～100μg，加入后室温混合的时间为1小时～3小时。
步骤b3中，所得沉淀用PBS-TBN溶解，溶解后所得溶液的体积与活化荧光微球的溶液体积相等，获得第二标记溶液。
在一些实施方式中，所述标记处理液含有质量分数为1％～5％海藻糖、1％～10％吐温80、1％～10％甘氨酸、0.2‰proclin300的0.01M PB(pH＝7.4)缓冲液。
在一些实施方式中，所述试纸条的制备包括以下步骤：
将第二犬细小病毒单克隆抗体包被在反应膜上形成检测线；
将与所述质控抗体特异性结合的抗原包被在所述反应膜上形成与所述检测线相间隔的质控线；
将样品垫、具有所述检测线和所述质控线的所述反应膜及吸水垫搭接。
在一些实施方式中，样品垫可采用如下方法制备：配制样品垫处理液：制备含0.5mg/mL～2mg/mL非检测样品种属的抗体和0.1mg/mL～2mg/mL凝集素的样品垫处理液。将样品垫处理液喷涂于玻璃纤维上，制得。进一步，样品垫处理液中包括体积分数为0.5％～1％的伊文斯兰。进一步，所述样品垫处理液含有体积分数为0.5％～3％的吐温-20,2％～5％的BSA，0.015M～0.025M PB。
其中，具有检测线和质控线的反应膜可采用如下方法制得：将第二犬细小病毒单克隆抗体包被在反应膜上形成检测线；将与所述质控抗体特异性结合的抗原包被在反应膜上形成与检测相间隔的质控线。
以下为具体实施例。
实施例1
本实发明提供的一种检测犬细小病毒抗原的免疫层析荧光试纸条，参阅图1至图2，包括壳体7，所述的壳体7内设有用于检测犬细小病毒抗原的免疫荧光层析检测试纸条，所述用于检测犬细小病毒抗原的免疫荧光层析检测试纸条包括底板1，在底板1上依次衔接有样品垫2、反应膜3和吸水垫4，所述的反应膜3设有检测线5包被有第二犬细小病毒单克隆抗体，质控线6包被有羊抗兔IgG抗体。所述的壳体7上设有与样品垫2相适配的加样孔9，与反应膜3相适配的观察窗口10，所述的壳体7上表面还设有防滑条8，方便试剂卡的取出与放入。
实施例2
本实发明提供的一种检测犬细小病毒抗原的免疫层析荧光试纸条，参阅图1至图3，包括盒体11，所述的盒体11内设有样本稀释液管17、枪头16、棉签15、铝箔袋14、干燥剂13、标记管12以及检测卡，所述检测卡包括壳体7，壳体7内设有用于检测犬细小病毒抗原的免疫荧光层析检测试纸条，所述用于检测犬细小病毒抗原的免疫荧光层析检测试纸条包括底板1，在底板1上依次衔接有样品垫2、反应膜3和吸水垫4，所述的反应膜3设有检测线5包被有第二犬细小病毒单克隆抗体，质控线6包被有羊抗兔IgG抗体。所述的壳体7上设有与样品垫2相适配的加样孔9，与反应膜3相适配的观察窗口10，所述的壳体7上表面还设有防滑条8，方便试剂卡的取出与放入。所诉标记管内含有荧光微球标记的第一犬细小病毒单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗兔IgG单克隆抗体。
实施例3
实施例1和实施例2提供的一种检测犬细小病毒抗原的免疫层析荧光试纸条的制备及方法，在温度(18～26)℃、湿度≤30％的环境下进行装配，在底板1上依次衔接有样品垫2、反应膜3、吸水垫4；将粘贴好的大板切成4.0mm宽的试纸条，装入塑料卡壳壳体7内，即CPV检测卡；将每一检测卡置于铝膜袋14中，加入一粒干燥剂13和一个标记管12，热合封口备用。上述试剂条的储存温度在4℃～30℃，无需冷藏，运输方便，使用者操作快捷。
上述样品垫、标记垫和包被膜的制备过程可不限先后，同理第一犬细小病毒单克隆抗体与羊抗兔IgG抗体与活化荧光微球溶液的制备步骤也不限先后，可根据需要具体制作，如可以同时制备。
实施例的试剂盒具体制备方法如下：
1.标记溶液的制备
(1)荧光微球的活化
清洗：用移液枪吸取1mL荧光微球液(含10mg荧光微球)于离心管中，在14000rpm离心15min，弃上清液，加入1mL 0.01M Tris缓冲液，超声混匀，得到清洗后的荧光微球溶液。
活化：向上述清洗后的荧光微球溶液中加入1mL含5mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺和5mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的0.01M Tris缓冲液，在旋转混匀仪上混匀20min，得到活化的荧光微球溶液。
活化终止：将上述活化的荧光微球在14000rpm离心15min，弃上清液，加入1mL含0.1％甲醇的0.1M MES缓冲液，超声混匀，得到活化后的荧光微球溶液。
(2)第一标记溶液的制备
向(1)活化后的荧光微球溶液中加入10μg第一犬细小病毒单克隆抗体，在旋转混匀仪上混匀120min，然后加入1mL含5％BSA的0.01M Tris缓冲液，超声混匀，然后在旋转混匀仪上混匀60min。然后在14000rpm离心15min，弃上清液，保留沉淀；
向上述沉淀中加入1mL含有0.5％吐温-20、2％BSA和3％蔗糖的0.02M PB缓冲液，复溶，超声混匀，得到第一犬细小病毒单克隆抗体标记溶液即第一标记溶液。
(3)第二标记溶液的制备
向(1)活化后的荧光微球溶液中加入10μg羊抗兔IgG抗体，在旋转混匀仪上混匀120min，然后加入1mL含5％BSA的0.01M Tris缓冲液，超声混匀，然后在旋转混匀仪上混匀60min。然后在14000rpm离心15min，弃上清液，保留沉淀；
向上述沉淀中加入1mL含有0.5％吐温-20、2％BSA和3％蔗糖的0.02M PB缓冲液，复溶，超声混匀，得到羊抗兔IgG标记溶液即第二标记溶液。
2.标记管的制备
将第一标记溶液、第二标记溶液、标记处理液按照体积比按照10:1:89混合后得到标记混合液，将标记混合液均匀喷在空白管内，置于50℃烘箱内，烘干72h，得到标记管。其中标记处理液是含3％海藻糖、5％吐温80、5％甘氨酸、0.2‰proclin300的0.01M PB(pH＝7.4)缓冲液。
3.包被膜的制备
用含3％蔗糖的0.01M PB(pH＝7.4)缓冲液将第二犬细小病毒单克隆抗体(检测抗体)稀释到0.5mg/ml，为检测线(T线)的工作液。
用含3％蔗糖的0.01M PB(pH＝7.4)将兔IgG稀释到0.5mg/ml，为质控线(C线)的工作液。
将反应膜贴在PVC板上，在膜上划检测线和质控线，划膜的速度为1.0μL/cm，放置50℃，烘干72h得包被膜。
4.样品垫的制备
将样品垫处理液以2μL/cm的速度喷在玻璃纤维上，50℃烘干过夜；样品垫处理液为含0.5mg/mL鼠IgG、0.5％伊文斯兰和0.1mg/mL凝集素的样品垫稀释液，样品垫稀释液为含有0.5％吐温-20和2％BSA的0.02M PB缓冲液。
5.免疫层析试纸条的制备
在PVC板依次相互搭接地粘贴样品垫、包被膜和吸水垫，并使样品垫、反应膜及吸水垫从PVC板的一端至另一端依次连接，然后切割成适当宽度，获得犬细小病毒抗原免疫层析试纸条。
对比例1
对比例1采用的犬细小病毒抗原免疫层析试纸条与实施例1类似，区别在于试纸条由样品垫、反应垫、反应膜及吸水垫形成，将标记混合液均匀喷制在空白玻璃纤维上形成反应垫，50℃烘干过夜(传统标记垫处理方式)。
将实施例1制备的犬细小病毒抗原免疫层析试纸条进行性能评估。
仪器：广州蓝勃生物科技有限公司生产的干式荧光免疫分析仪(型号：AFS-1000)。
CPV Ag样本稀释液：含0.1％的SDS、1.5％NaCl、0.5％PVP、0.5％Tween、1％TX-100和0.02％proclin300的0.01M PB缓冲液。
1.样本检测步骤如下：
1.1使用棉签采集病犬粪便；
1.2取10μL加入含有1.0mL样品稀释液的样品管中，充分混匀；
1.3取出检测卡，打开干式免疫荧光检测仪；
1.4吸取稀释后的样本混合液100μL，加入到标记管中，上下颠倒持续约1min；
1.5吸取样本标记混合液100μL，加入到检测卡的加样孔中；
1.6将检测卡放入到仪器的卡槽中，开始计时；
1.7三分钟后，点击仪器上的“测试”按键，仪器将开始测试；
1.8荧光强度与样品中的CPV浓度成正比，通过内置标准曲线进行曲线拟合和浓度的计算，剂量反应曲线：
Figure BDA0002750579870000121
其中(a＝0.052,b＝0.775,c＝65086.452,d＝248.777)，R＝0.9999。
免疫荧光检测仪检测结果如下：
2.线性范围研究
2.1将CPV校准品用阴性血清分别稀释到0ng/mL、4ng/mL、16ng/mL、32ng/mL、64ng/mL、128ng/mL、256ng/mL、512ng/mL、1024ng/mL、1300ng/mL、16000ng/mL、19000ng/mL、21000ng/mL和25000ng/mL；
2.2将以上各浓度样本分别取100μL，加入至制备好的猫CPV检测试剂中，每浓度重复测试3次；
2.3反应3min后，将试纸放入干式免疫荧光分析仪中，读取T/C值，通过内置标准曲线进行曲线拟合和浓度的计算。
2.4测试结果显示：试剂在检测4～16000ng/mL的CPV线性拟合关系较好，r＞0.9900，当CPV浓度增加到19000ng/mL时，线性拟合r值小于0.9900，T/C增长减缓，CPV在19000～21000ng/mL时T/C值平缓，CPV达到25000ng/mL时，T/C值反而降低。因此本检测的最大检测范围可以达到16000ng/mL。剂量-反应曲线原始数值如表1和曲线为图4。
表1
Figure BDA0002750579870000131
3、最低检出限
将阴性血清，重复测试20次，计算T/C均值，将其代入剂量-反应曲线中，得出本方法的最低检出限为1.0ng/mL，见表2。
表2
校准品浓度 T/C 拟合浓度
0 0.0981 1.00
0 0.099 1.03
0 0.0986 1.01
0 0.0982 1.00
0 0.0995 1.04
0 0.0964 0.95
0 0.0974 0.98
0 0.0964 0.95
0 0.0984 1.01
0 0.0983 1.01
0 0.0965 0.96
0 0.0953 0.92
0 0.0987 1.02
0 0.1002 1.06
0 0.1027 1.13
0 0.0966 0.96
0 0.1028 1.13
0 0.0997 1.05
0 0.0966 0.96
0 0.0992 1.03
平均值 0.0984 1.01
SD 0.002 0.056
精密度 2.00％ 5.50％
4、准确度
对浓度为32ng/mL、512ng/mL的CPV Ag校准品进行测定，每个浓度各检测3次得出拟合浓度，并计算均值和相对偏差，结果如表3所示。
表3
校准品浓度 32(ng/mL) 512(ng/mL)
项目 拟合浓度％ 拟合浓度％
1 5.10 16.91
2 5.05 16.92
3 5.02 17.47
均值 5.06 17.10
Bias％ 1.1％ 1.30％
由表3的结果显示：本发明制备的试纸条检测的准确度较高，检测两个浓度的参考品的准确度Bias％在±5％内。
6.实验对比
将实施例1和对比例1的试纸条对浓度为512ng/mL的CPV Ag校准品进行测定(分别做三个平行样)，并在加样后2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min及10min进行检测试纸条的信号值。其中，实施例1的犬细小病毒抗原免疫层析试纸条上的检测线信号值和质控线信号值分别用T1和C1表示，对比例1提供的犬细小病毒抗原免疫层析试纸条上的检测线信号值和质控线信号值分别用T2和C2表示；以检测线信号值与质控线的信号值的比值为纵坐标，反应时间为横坐标，建立方程并拟合线性回归曲线，线性回归曲线原始数据如下表4，实施例1和对比例1的线性回归曲线分别见图5(a曲线)和图6(b曲线)所示。
表4
组别 实施例1 对比例1
时间(min) T1/C1均值 T2/C2均值
2 4.825 3.527
3 5.689 4.719
4 5.685 5.114
5 5.692 5.688
6 5.698 5.691
7 5.093 5.691
8 5.001 5.708
9 4.725 5.002
10 4.117 4.723
由表4的结果显示：实施例1的犬细小病毒抗原免疫层析试纸条信号值在2～3min处于上升阶段，3～6min时处于稳定期，6min后处于衰减期，故本试纸条在3min出即可进行检查，极大提高了检测效率，节约检测用时。对比例1的犬细小病毒抗原免疫层析试纸条信号值在2～5min处于上升阶段，5～8min时处于稳定期，8min后处于衰减期，对比例试纸条需在5min出才能进行检测。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种犬细小病毒检测试剂盒，其特征在于，包括试纸条以及标记管，所述试纸条包括样品垫、反应膜、吸水垫，所述反应膜上设有相互间隔的检测线及质控线，所述检测线较所述质控线更靠近所述样品垫，所述标记管的内表面上负载有分别用荧光微球标记的第一犬细小病毒单克隆抗体和质控抗体，所述检测线包被有第二犬细小病毒单克隆抗体，所述第一犬细小病毒单克隆抗体和所述第二犬细小病毒单克隆抗体分别识别犬细小病毒的不同抗原表位，所述质控线包被有能够与所述质控抗体特异性结合的抗原。
2.根据权利要求1所述的犬细小病毒检测试剂盒，其特征在于，所述第一犬细小病毒单克隆抗体和所述质控抗体均匀分布在所述标记管的内表面。
3.根据权利要求2所述的犬细小病毒检测试剂盒，其特征在于，以所述标记管的内表面面积计算，所述标记管的内表面包被的所述第一犬细小病毒单克隆抗体的浓度为20ng/cm2～200ng/cm2，所述质控抗体的浓度为2ng/cm2～20ng/cm2。
4.根据权利要求2所述的犬细小病毒检测试剂盒，其特征在于，所述标记管的内表面上负载有海藻糖、吐温80和甘氨酸。
5.根据权利要求1～4任一项所述的犬细小病毒检测试剂盒，其特征在于，以所述反应膜的表面面积计算，所述反应膜上包被的所述第二犬细小病毒单克隆抗体的浓度为50ng/cm2～500ng/cm2，所述能够与所述质控抗体特异性结合的抗原的浓度为5ng/cm2～50ng/cm2。
6.根据权利要求1～4任一项所述的犬细小病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括样本稀释液，所述样本稀释液为含有质量分数为0.05％～0.15％SDS、1％～2％NaCl、0.3％～0.7％PVP、0.3％～0.7％Tween、0.5％～1.5％TX-100和0.015％～0.025％proclin300的0.005M～0.015M PB缓冲液。
7.根据权利要求1～4任一项所述的犬细小病毒检测试剂盒，其特征在于，所述荧光微球的直径为0.1μm～1μm。
8.根据权利要求1～4任一项所述的犬细小病毒检测试剂盒，其特征在于，以搭接后的结构计算，所述试纸条中所述样品垫、所述反应膜、所述吸水垫的长度比为(1.6～3.0)：(2.0～3.0)：(2.0～2.5)。
9.一种如权利要求1～8任一项所述的犬细小病毒检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述标记管的制备包括以下步骤：
将分别用荧光微球标记的第一犬细小病毒单克隆抗体和质控抗体混合在标记混合液中；
将所述标记混合液施加在空白管内，烘干。
10.根据权利要求9所述的犬细小病毒检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述试纸条的制备包括以下步骤：
将第二犬细小病毒单克隆抗体包被在反应膜上形成检测线；
将与所述质控抗体特异性结合的抗原包被在所述反应膜上形成与所述检测线相间隔的质控线；
将样品垫、具有所述检测线和所述质控线的所述反应膜及吸水垫搭接。
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