CN105738621A - 用荧光免疫层析技术检测细小病毒的试纸条和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用荧光免疫层析技术检测细小病毒的试纸条和方法，具体地，公开了一种用荧光免疫层析技术检测细小病毒的试纸条，包括：含荧光微球标记的细小病毒抗体的标记物垫、含另一细小病毒抗体的捕获膜。本发明还公开了一种用荧光免疫层析技术检测细小病毒的方法，包括：将含细小病毒的溶液滴加到前述试纸条的样品垫上，反应一段时间后用读卡器检测信号。

Description

用荧光免疫层析技术检测细小病毒的试纸条和方法

技术领域

本发明涉及纳米材料技术、免疫学技术、侧流层析技术等领域。更具体的，本发明涉及一种用荧光免疫层析技术检测细小病毒的试纸条；此外，本发明还涉及一种用荧光免疫层析技术来检测细小病毒的方法。

背景技术

感染细小病毒可使犬/猫精神沉郁，厌食，发热，软便或轻微呕吐，随后发展成为频繁呕吐和剧烈腹泻，传染率和死亡率很高。

如果犬/猫感染了细小病毒，需要尽早检测并及早治疗。检测细小病毒的传统方法是胶体金免疫层析法，但是胶体金免疫层析灵敏度较低，稳定性也不够好，容易出现假阴假阳。我公司开发的荧光免疫层析法检测细小病毒的试剂盒灵敏度很高，可检测到10ng/ml的细小病毒抗原，对细小病毒感染的犬/猫能早检出早隔离早治疗，提高幼犬/猫的成活率，同时因为灵敏度提高，极大地减少了假阴假阳的出现，提高了产品的稳定性，因此具有重要的应用前景。

发明内容

本发明旨在解决本领域中的上述各种问题和实现以下目标。具体地，本发明的目的就是要提供一种方便、快速而且高灵敏度的地检测细小病毒的试纸条和方法。

具体的，本发明提供了一种用荧光免疫层析技术检测细小病毒的试纸条。

在一种实施方式中，本发明提供了一种用荧光免疫层析技术检测细小病毒的试纸条，包括标记物垫和捕获膜，其特征在于，所述标记物垫含有荧光微球标记的细小病毒检测抗体，所述捕获膜含有捕获探针。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述细小病毒是犬细小病毒。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述细小病毒是猫细小病毒。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述荧光微球是时间分辨荧光微球。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述时间分辨荧光微球是含铕复合物的荧光微球。

在另一种实施方式中，本发明提供了一种用荧光免疫层析技术检测细小病毒的方法，其特征在于，在权利要求1所述的试纸条样品垫上滴加含细小病毒的样品，反应后检测荧光信号。

在另一种实施方式中，本发明提供了一种用荧光免疫层析技术检测细小病毒的试剂盒，包含试剂瓶和试纸条，其中试纸条又包含标记物垫和捕获膜，其特征在于，所述试剂瓶含有荧光微球标记的细小病毒检测抗体，所述捕获膜含有捕获探针。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述荧光微球是时间分辨荧光微球。

在另一种实施方式中，本发明提供了一种用荧光免疫层析技术检测细小病毒的方法，其特征在于，在权利要求7所述的试剂瓶中加入含细小病毒的样品，混合后滴加到试纸条样品垫上，反应后检测荧光信号。

详细说明

用荧光免疫层析技术检测细小病毒的试纸条如图1示，包括样品垫1，标记物垫2，NC膜3，吸水纸4，PVC底板5。NC膜3上含有C线6和T线7。

其中样品垫一般为玻璃纤维、滤纸或滤血膜。标记物垫可为玻璃纤维、滤纸或聚酯膜。当样品垫和标记物垫材质相同时可整合在一起，用一条玻璃纤维、滤纸或聚酯膜来完成样品垫和标记物垫的功能。

所述标记物垫上或者含有荧光微球标记的细小病毒检测抗体，或者同时含有荧光微球标记的细小病毒检测抗体和生物素标记的细小病毒捕获抗体，还可以含有其他用作阳性对照的荧光微球标记的细小病毒或抗体，如链亲和素或兔抗体。如果试剂盒中有试剂瓶，则标记物垫可以仅仅是玻璃纤维、滤纸或聚酯膜而不含荧光微球或抗体。

捕获膜可以是硝酸纤维素膜（NC膜）、尼龙膜等，所述捕获膜的T线或者含有细小病毒捕获抗体（双抗体夹心法），或者含链亲和素（标记物垫同时含荧光微球标记的细小病毒检测抗体和生物素标记的细小病毒捕获抗体），C线或者含有能结合细小病毒检测抗体的二抗，或者含生物素标记的牛血清白细小病毒或卵清细小病毒（标记物垫含链亲和素），或者含羊抗兔抗体（标记物垫含兔抗体）。

用免疫层析技术检测细小病毒的方法，如图1示，当样品溶液滴加到试纸条的样品垫1上后，液体将沿水平箭头方向移动，先到达标记物垫2，样品中的细小病毒与标记物垫2中荧光微球标记的细小病毒检测抗体结合形成‘细小病毒-细小病毒检测抗体-荧光微球’复合物，当溶液继续移动到达捕获膜的T线时，溶液中的‘细小病毒-细小病毒检测抗体～荧光微球’将与此处的细小病毒捕获抗体形成‘细小病毒捕获抗体-细小病毒-细小病毒检测抗体～荧光微球’复合物并被固定在T线上，随后用检测仪来检测T线上的荧光信号，根据信号强度可以判断细小病毒浓度的高低，荧光信号强则细小病毒浓度高。

由于T线处细小病毒捕获抗体捕获的荧光微球包含有很多荧光分子，所以T线处可以检测到很强的荧光信号，从而使这种免疫层析技术检测细小病毒的方法有很高的灵敏度。当荧光分子是时间分辨荧光复合物时，由于发射光有数百微秒到数毫秒的荧光寿命，可以在激发光撤掉后数十微秒到数百微秒检测发射光信号，此时激发光和背景荧光都已经消失，只有荧光分子特异的荧光信号，所以检测的特异性和灵敏度都大大提高。

本发明中的‘微球’可以是二氧化硅微球、聚苯乙烯微球或其他高分子微球，微球直径在10nm到10μm之间，其表面可带有羧基、氨基或酮基等官能团。

本发明中的‘荧光微球’指球体中包埋了荧光分子的微球。所述‘荧光分子’包括荧光素、罗丹明等荧光分子或其衍生物、铕复合物、钐复合物、铽复合物等镧系元素复合物荧光分子以及铂复合物、钯复合物等磷光分子，其中铕复合物为铕与配体螯合后再与其他有机分子形成的复合物，铂复合物为铂与配体（包括卟啉、卟吩、吡啶及其衍生物）螯合形成的复合物，其中铕复合物又为时间分辨荧光复合物，铂复合物又为磷光复合物。

本发明中的‘荧光微球标记的细小病毒检测抗体’指跟荧光微球耦联的细小病毒检测抗体。更具体的，细小病毒检测抗体为用细小病毒的蛋白免疫动物后动物血液中出现的能跟细小病毒特异性结合的抗体。

本发明中的‘捕获探针’指结合在试纸条捕获膜上的细小病毒捕获抗体（双抗体夹心法）、链亲和素（标记物垫同时含荧光微球标记的细小病毒检测抗体和生物素标记的细小病毒捕获抗体）。更具体的，细小病毒捕获抗体为用细小病毒蛋白免疫动物后动物血液中出现的能跟细小病毒特异性结合的抗体，但是细小病毒捕获抗体与细小病毒检测抗体识别细小病毒蛋白的不同部位，两个抗体分别识别并结合细小病毒蛋白后靠双抗体夹心法识别细小病毒。

本发明中试纸条捕获膜上的‘T线’指捕获探针所在的区域，也就是荧光微球标记的细小病毒检测抗体与细小病毒结合后再被固定的细小病毒捕获抗体捕获（双抗体夹心法）的区域，或者是链亲和素与生物素标记的细小病毒捕获抗体结合的区域（荧光微球标记的细小病毒检测抗体和生物素标记的细小病毒捕获抗体夹心识别细小病毒）。

本发明中试纸条捕获膜上的‘C线’指荧光微球标记的细小病毒检测抗体与其二抗结合的区域，或者是指含有其他抗原或抗体（羊抗兔抗体）与荧光微球标记的阳性对照结合的区域。

因为犬/猫感染细小病毒后病情严重的甚至会引起死亡，所以需要在感染初期尽早快速的检测，早作诊断，早知结果，以便及时采取补救措施或治疗手段。而本发明可以通过荧光免疫层析法方便、简单、快速并且高灵敏度地检测动物的细小病毒而早做治疗，避免其进一步发展对动物身体产生严重伤害。

附图说明

根据一个或多个不同的实施方式，参考下列附图对本发明进行了详细描述。附图仅为示例目的而提供，并且仅描述本发明典型或示例性的实施方式。这些附图被提供以促进读者对本发明的理解，将不被认为限制本发明的宽度、范围或应用性。

图1是本发明中用荧光免疫层析技术检测细小病毒的试纸条示意图。图1中，附图标记1-7说明：1-样品垫；2-标记物垫；3-捕获膜；4-吸水垫；5-支撑底板；6-C线；7-T线。

图2是分别用荧光免疫层析和胶体金免疫层析检测犬细小病毒结果的比较

具体实施方式

实施例1，用荧光免疫层析技术检测犬细小病毒抗原的试纸条的制备

图1所示的用荧光免疫层析技术检测细小病毒的试纸条准备方法如下：

1，羧基修饰的含铕复合物的SiO₂微球由长春志昂生物科技有限公司提供，犬细小病毒抗体以及抗原购自抗体在线公司（antibodies-online）公司。

2，荧光微球与犬细小病毒抗体的耦联

将200μl20mMPBS,pH7.4，固含量1%的荧光微球与6毫克碳化二亚胺混合，室温振荡30分钟，12,000rpm离心10分钟，用0.1M硼酸盐缓冲液清洗2次，将活化的荧光微球重悬于300μl硼酸盐缓冲液中。在微球悬液中加入200μl1mg/ml的犬细小病毒抗体，在室温下振荡反应过夜。将反应后的溶液于12,000rpm离心10分钟，加入400μl0.25M乙醇胺在室温再振荡30分钟。将反应后的溶液离心后再用PBS缓冲液洗2次。离心沉淀后加入300μl2mg/ml的BSA重悬，常温振荡30分钟后用PBS洗3次，再用200μl50mMPBS,pH7.4,0.1%Tween20,5%蔗糖重悬荧光微球标记的犬细小病毒抗体。

3，荧光微球标记的犬细小病毒检测抗体处理标记物垫，犬细小病毒捕获抗体以及羊抗鼠抗体（美国Sigma公司）处理捕获膜（此处为NC膜）

将荧光微球标记的犬细小病毒检测抗体溶液用BioDot喷膜仪喷到标记物垫（Millipore公司）上，喷速为10μl/cm。将1mg/ml犬细小病毒捕获抗体以及1mg/ml羊抗鼠抗体用BioDot公司喷膜仪划线NC膜（Millipore公司），划线速度为3μl/cm。然后将喷好的标记物垫和NC膜置于37度恒温箱中干燥1小时，再将标记物垫上含有荧光微球标记的犬细小病毒抗体的部分切割下来，得到5mm宽，30cm长的条带。

4，试纸条大卡的组装与切割

按照图1中试纸条的结构所示，将NC膜首先粘贴在支撑底板（Millipore公司）上，在靠T线一侧先后粘贴标记物垫以及样品垫（Millipore公司），在靠C线一侧粘贴吸水垫（Millipore公司），然后用BioDot公司切割机切割成5mm宽的试纸条，于铝箔袋中封闭保存备用。

实施例2，用荧光免疫层析试纸条检测犬细小病毒抗原

将100μl含0ng/ml,10ng/ml,100ng/ml,1000ng/ml,10000ng/ml犬细小病毒抗原的溶液分别滴加到实施例1中制备的荧光免疫层析试纸条样品垫上，反应15分钟后用发射395nm激发光的荧光检测仪（上海海跃塑模有限公司）检测荧光信号，同时将100μl含0ng/ml,10ng/ml,100ng/ml,1000ng/ml,10000ng/ml犬细小病毒抗原的溶液滴加到胶体金免疫层析试纸条上，反应5分钟后观察结果。两种方法的检测结果比较如图2

由图2可看出，在细小病毒抗原浓度为0ng/ml时，两种检测方法T线（下面那条线位置）都没有信号，说明两种方法都没有假阳性。而在加10ng/ml、100ng/ml、10³ng/ml细小病毒抗原时，只有荧光免疫层析方法T线能检测出信号，而且随着抗原浓度升高荧光信号逐渐增强。当加10⁴ng/ml细小病毒抗原时，两种方法都能检测出，但是荧光免疫层析的检测信号要强很多。可见，荧光免疫层析要比胶体金免疫层析灵敏近1000倍，而且不会出现假阳性。

实施例3，用荧光免疫层析试纸条检测猫细小病毒抗原

将100μl含0ng/ml,10ng/ml,100ng/ml,1000ng/ml,10000ng/ml猫细小病毒抗原的溶液分别滴加到实施例1中制备的荧光免疫层析试纸条样品垫上，反应15分钟后用发射395nm激发光的荧光检测仪（上海海跃塑模有限公司）检测荧光信号，同时将100μl含0ng/ml,10ng/ml,100ng/ml,1000ng/ml,10000ng/ml猫细小病毒抗原的溶液滴加到胶体金免疫层析试纸条上，反应5分钟后观察结果。两种方法的检测结果对比同图2，与实施例2相似。

实施例4，用荧光免疫层析试剂盒检测犬细小病毒抗原

荧光免疫层析试剂盒包括试剂瓶和试纸条。试纸条的制备方法同实施例1，只是该试纸条的标记物垫上不用喷荧光微球标记的细小病毒检测抗体。但是，试剂盒的试剂瓶中含有荧光标记的细小病毒抗体。

检测时，先把含细小病毒的样品溶液加入试剂瓶中，混合后滴加到上述试纸条上，反应5分钟后检测荧光信号。与胶体金免疫层析比较的结果同图2，与实施例2区别不大。

虽然本申请详细描述了具体的实施例，但本申请不限于这些实施例，相反，其意图涵盖包括在实施例的精神和范围内的各种修改和等同方案，在一些具体情况下，可以缺少和增加某个或某些技术特征而不脱离本发明的精神和范围，本申请的范围仅由权利要求书限定。

Claims (9)

1.一种用荧光免疫层析技术检测细小病毒的试纸条，包括标记物垫和捕获膜，其特征在于，所述标记物垫含有荧光微球标记的细小病毒检测抗体，所述捕获膜含有捕获探针。

2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述细小病毒是犬细小病毒。

3.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述细小病毒是猫细小病毒。

4.如权利要求1-3任一项所述的试纸条，其特征在于，所述荧光微球是时间分辨荧光微球。

5.如权利要求4所述的试纸条，其特征在于，所述时间分辨荧光微球是含铕复合物的荧光微球。

6.一种用荧光免疫层析技术检测细小病毒的方法，其特征在于，在权利要求1所述的试纸条样品垫上滴加含细小病毒的样品，反应后检测荧光信号。

7.一种用荧光免疫层析技术检测细小病毒的试剂盒，包含试剂瓶和试纸条，其中试纸条又包含标记物垫和捕获膜，其特征在于，所述试剂瓶含有荧光微球标记的细小病毒检测抗体，所述捕获膜含有捕获探针。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光微球是时间分辨荧光微球。

9.一种用荧光免疫层析技术检测细小病毒的方法，其特征在于，在权利要求7所述的试剂瓶中加入含细小病毒的样品，混合后滴加到试纸条样品垫上，反应后检测荧光信号。