CN104345148A

CN104345148A - 用免疫层析技术检测蛋白的试纸条和方法

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Publication number: CN104345148A
Application number: CN201310319220.6A
Authority: CN
Inventors: 杨挥
Original assignee: JIAXING CHAOYUNFAN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: JIAXING CHAOYUNFAN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-07-28
Filing date: 2013-07-28
Publication date: 2015-02-11

Abstract

本发明涉及用免疫层析技术检测蛋白的试纸条和方法，具体地，公开了一种用免疫层析技术检测蛋白的试纸条，包括：含光致发光微球标记的蛋白检测抗体的标记物垫、含蛋白捕获抗体的捕获膜。本发明还公开了一种用免疫层析技术检测蛋白的方法，包括：将含待测蛋白的溶液滴加到前述试纸条的样品垫上，反应一段时间后用检测仪检测信号。

Description

用免疫层析技术检测蛋白的试纸条和方法

技术领域

本发明涉及纳米材料技术、免疫学技术、侧流层析技术等领域。更具体的，本发明涉及一种用免疫层析技术检测蛋白的试纸条；此外，本发明还涉及一种用免疫层析技术来检测蛋白的方法。

背景技术

研究发现很多疾病都有其蛋白标志物，疾病的有无、疾病的发展阶段或者疾病的疗效都可以通过监测其对应的蛋白标志物来了解，例如：心肌梗塞相关的蛋白标志物心肌脂肪酸结合蛋白（FABP）、心肌肌钙蛋白（cTnI）等，肾脏损伤相关的蛋白标志物尿白蛋白，糖尿病相关的蛋白糖化血红蛋白。另外，引起食物中毒的金黄色葡萄球菌也可以通过其肠毒素蛋白检测。不少对人类身体很重要的激素也是蛋白，如生长激素、绒毛膜促性腺激素（HCG）等。食物如肉类或奶中的生长激素过高被人体摄入后会导致青少年发育不正常，也需要加以检测，而尿液或血液中的绒毛膜促性腺激素监测是检测生育期妇女是否怀孕的常用简单方法。

目前检测这些蛋白标志物的的方法主要有酶联免疫分析法（ELISA）、化学发光免疫分析、时间分辨荧光免疫分析以及胶体金免疫层析法。其中ELISA、化学发光免疫分析、时间分辨荧光免疫分析都要用到昂贵的设备，需要专业技术人员在实验室中操作，而且操作步骤多，耗时长。胶体金免疫层析法则操作简单、方便、快速且便宜，但是其灵敏度较低，而且不能定量检测。因此有必要提供一种快速、方便、简单且高灵敏度的目标蛋白定量检测方法。

发明内容

本发明旨在解决本领域中的上述各种问题和实现以下目标。具体地，本发明的目的就是要提供一种方便、快速而且高灵敏度的地检测样品中的目标蛋白的试纸条和方法。

具体的，本发明提供了一种用免疫层析技术检测样品中的蛋白的试纸条。

在一种实施方式中，本发明提供了一种用免疫层析技术检测蛋白的试纸条，包括标记物垫和捕获膜，其特征在于，所述标记物垫含有光致发光微球标记的蛋白检测抗体，所述捕获膜含有蛋白捕获抗体。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述蛋白是绒毛膜促性腺激素。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述蛋白是尿白蛋白。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述蛋白是糖化血红蛋白。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述蛋白是生长激素。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述蛋白是金黄色葡萄球菌肠毒素。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述光致发光微球是荧光微球。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述荧光微球是时间分辨荧光微球。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述时间分辨荧光微球是含铕复合物的荧光微球。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述光致发光微球是磷光微球。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述磷光微球是含铂复合物的磷光微球。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述光致发光微球是二氧化硅微球。

在进一步的实施方式中，其特征在于，所述光致发光微球是聚苯乙烯微球。

在另一种实施方式中，本发明提供了一种用免疫层析技术检测蛋白的方法，其特征在于，在权利要求1所述的试纸条样品垫上滴加含待测蛋白的样品，反应后检测光信号。

详细说明

用免疫层析技术检测样品中目标蛋白的试纸条如图1示，包括样品垫1，标记物垫2，NC膜3，吸水纸4，塑料底板5。NC膜3上含有C线6和T线7。

其中样品垫一般为玻璃纤维、滤纸或滤血膜。标记物垫可为玻璃纤维、滤纸或聚酯膜。当样品垫和标记物垫材质相同时可整合在一起，用一条玻璃纤维、滤纸或聚酯膜来完成样品垫和标记物垫的功能。

所述标记物垫上或者含有光致发光微球标记的蛋白检测抗体，或者同时含有光致发光微球标记的蛋白检测抗体和生物素标记的目标蛋白捕获抗体，还可以含有其他用作阳性对照的光致发光微球标记的蛋白或抗体，如链亲和素或兔抗体。

捕获膜可以是硝酸纤维素膜（NC膜）、尼龙膜等，所述捕获膜的T线或者含有蛋白捕获抗体（双抗体夹心法），或者含链亲和素（标记物垫同时含光致发光微球标记的蛋白检测抗体和生物素标记的目标蛋白捕获抗体），或者含有目标蛋白（双抗原竞争法），C线或者含有能识别蛋白检测抗体的二抗，或者含生物素标记的牛血清白蛋白或卵清蛋白（标记物垫含链亲和素），或者含羊抗兔抗体（标记物垫含兔抗体）。

用免疫层析技术检测样品中蛋白的方法，如图1示，当样品溶液滴加到试纸条的样品垫1上后，液体将沿水平箭头方向移动，先到达标记物垫2，样品中的目标蛋白与标记物垫2中光致发光微球标记的蛋白检测抗体结合形成‘蛋白-蛋白检测抗体-光致发光微球’复合物，当溶液继续移动到达捕获膜的T线时，溶液中的‘蛋白-蛋白检测抗体～光致发光微球’将与此处的蛋白捕获抗体形成‘蛋白捕获抗体-蛋白-蛋白检测抗体～光致发光微球’复合物并被固定在T线上，随后用检测仪来检测T线上的荧光/磷光信号，并与信号强度-蛋白浓度标准曲线比较计算出待测样品中蛋白的浓度。

由于T线处蛋白捕获抗体捕获的光致发光微球包含有很多光致发光分子（荧光分子或磷光分子），所以T线处可以检测到很强的光信号，从而使这种免疫层析技术检测蛋白的方法有很高的灵敏度。当光致发光分子是时间分辨荧光复合物或磷光复合物时，由于发射光有数百微秒到数毫秒的荧光寿命，可以在激发光撤掉后数十微秒到数百微秒检测发射光信号，此时激发光和背景荧光都已经消失，只有光致发光分子特异的荧光或磷光信号，所以检测的特异性和灵敏度都大大提高。

本发明中的‘蛋白’指蛋白标志物，包括但不限于：心肌脂肪酸结合蛋白、心肌肌钙蛋白、绒毛膜促性腺激素、尿白蛋白、糖化血红蛋白、生长激素、金黄色葡萄球菌肠毒素蛋白、流感病毒蛋白、艾滋病毒蛋白、乙肝病毒蛋白、丙肝病毒蛋白、以及梅毒螺旋体蛋白等。

本发明中的‘微球’可以是二氧化硅微球、聚苯乙烯微球或其他高分子微球，微球直径在10nm到10μm之间，其表面可带有羧基、氨基或酮基等官能团。

本发明中的‘光致发光微球’指球体中包埋了光致发光分子的微球。所述‘光致发光分子’包括荧光素、罗丹明等荧光分子或其衍生物、铕复合物、钐复合物、铽复合物等镧系元素复合物荧光分子以及铂复合物、钯复合物等磷光分子，其中铕复合物为铕与配体螯合后再与其他有机分子形成的复合物，铂复合物为铂与配体（包括卟啉、卟吩、吡啶及其衍生物）螯合形成的复合物，其中铕复合物又为时间分辨荧光复合物，铂复合物又为磷光复合物。

本发明中的‘光致发光微球标记的蛋白检测抗体’指跟光致发光微球耦联的蛋白检测抗体。更具体的，蛋白检测抗体为用目标蛋白免疫动物后动物血液中出现的能跟目标蛋白特异性结合的抗体。

本发明中的‘捕获探针’指结合在试纸条捕获膜上的蛋白捕获抗体（双抗体夹心法）、链亲和素（标记物垫同时含光致发光微球标记的蛋白检测抗体和生物素标记的蛋白捕获抗体）或目标蛋白（双抗原竞争法）。更具体的，蛋白捕获抗体为用目标蛋白免疫动物后动物血液中出现的能跟目标蛋白特异性结合的抗体，但是蛋白捕获抗体与蛋白检测抗体识别目标蛋白的不同部位，两个抗体分别识别并结合抗原后靠双抗体夹心法识别目标蛋白。

本发明中试纸条捕获膜上的‘T线’指捕获探针所在的区域，也就是光致发光微球标记的蛋白检测抗体与目标蛋白结合后再被固定的蛋白捕获抗体捕获（双抗体夹心法）的区域，或者是链亲和素与生物素标记的蛋白捕获抗体结合的区域（光致发光微球标记的蛋白检测抗体和生物素标记的蛋白捕获抗体夹心识别目标蛋白），或者是未结合目标蛋白的自由的光致发光微球标记的蛋白检测抗体与固定的目标蛋白结合的区域（双抗原竞争法）。

本发明中试纸条捕获膜上的‘C线’指光致发光微球标记的蛋白检测抗体与其二抗结合的区域，或者是指含有其他抗原或抗体（羊抗兔抗体）与光致发光微球标记的阳性对照结合的区域。

因为这些蛋白标志物至关重要，所以需要在其浓度很低时尽早快速的检测，早作诊断，早知结果，以便及时采取补救措施或治疗手段。而本发明可以通过免疫层析法方便、简单、快速并且高灵敏度地检测样品中的蛋白，避免疾病进一步发展或食物中毒对身体产生严重伤害。

附图说明

根据一个或多个不同的实施方式，参考下列附图对本发明进行了详细描述。附图仅为示例目的而提供，并且仅描述本发明典型或示例性的实施方式。这些附图被提供以促进读者对本发明的理解，将不被认为限制本发明的宽度、范围或应用性。

图1是本发明中用免疫层析技术检测蛋白的试纸条示意图。图1中，附图标记1-7说明：1-样品垫；2-标记物垫；3-捕获膜；4-吸水垫；5-支撑底板；6-C线；7-T线。

图2是实施例中用免疫层析法所得荧光强度与绒毛膜促性腺激素浓度的关系曲线。

具体实施方式

实施例1，用免疫层析技术检测样品中绒毛膜促性腺激素的试纸条的制备

图1所示的用免疫层析技术检测绒毛膜促性腺激素（HCG）的试纸条准备方法如下：

1，羧基修饰的含铕复合物的SiO₂微球由长春志昂生物科技有限公司提供，HCG抗体以及HCG抗原由芬兰Hytest公司提供。

2，荧光微球与HCG抗体的耦联

将200μl 20mM PBS, pH7.4，固含量1%的荧光微球与6毫克碳化二亚胺混合，室温振荡30分钟，12,000rpm离心10分钟，用硼酸盐缓冲液清洗2次，将活化的荧光微球重悬于300μl硼酸盐缓冲液中。在微球悬液中加入200μl 1mg/ml的HCG抗体，在室温下振荡反应2.5小时。将反应后的溶液于12,000rpm离心10分钟，加入400μl 0.25M乙醇胺在室温再振荡30分钟。将反应后的溶液离心后再用PBS缓冲液洗2次。离心沉淀后加入300μl 2mg/ml的BSA重悬，常温振荡30分钟后用PBS洗3次，再用200μl 50mM PBS, pH7.4, 0.1% Tween 20, 5%蔗糖重悬荧光微球标记的HCG激素抗体。

3，荧光微球标记的HCG检测抗体处理标记物垫，HCG捕获抗体以及羊抗鼠抗体（美国Sigma公司）处理捕获膜（此处为NC膜）

将荧光微球标记的HCG检测抗体溶液用BioDot喷膜仪喷到标记物垫（Millipore公司）上，喷速为10μl/cm。将1mg/ml HCG捕获抗体以及1mg/ml羊抗鼠抗体用BioDot公司喷膜仪划线NC膜（Millipore公司），划线速度为3μl/cm。然后将喷好的标记物垫和NC膜置于37℃恒温箱中干燥1小时，再将标记物垫上含有荧光微球标记的HCG抗体的部分切割下来，得到5mm宽，30cm长的条带。

4，试纸条大卡的组装与切割

按照图1中试纸条的结构所示，将NC膜首先粘贴在支撑底板（Millipore公司）上，在靠T线一侧先后粘贴标记物垫以及样品垫（Millipore公司），在靠C线一侧粘贴吸水垫（Millipore公司），然后用BioDot公司切割机切割成5mm宽的试纸条，于铝箔袋中封闭保存备用。

实施例2，用免疫层析法检测样品中的HCG

将100μl含0mIU/ml, 1mIU/ml, 2mIU/ml, 5mIU/ml, 10mIU/ml, 20mIU/ml, 100mIU/ml, 200mIU/ml, 1000mIU/ml的HCG溶液分别滴加到荧光免疫层析试纸条上，反应15分钟后用荧光检测仪（上海海跃塑模有限公司）检测荧光信号，然后用荧光强度相对HCG浓度做图得荧光强度对HCG浓度的标准曲线如图2。

将100μl含HCG的人尿液滴加到荧光免疫层析试纸条的样品垫上，反应15分钟后检测荧光信号，将荧光强度结合标准曲线计算得HCG浓度为35mIU/ml，与用ELISA法检测的结果一致，说明荧光免疫层析定量检测HCG的方法是可靠的。

实施例3，用免疫层析法检测样品中的尿白蛋白

检测尿白蛋白的试纸条制备方法同实施例1，其中的HCG检测抗体更换为白蛋白检测抗体，HCG捕获抗体更换为白蛋白捕获抗体，HCG抗原更换为白蛋白抗原，白蛋白的抗原和抗体同样由芬兰Hytest公司提供。

将100μl 含0mg/L, 1mg/L, 2mg/L, 10mg/L, 20mg/L, 100mg/L, 200mg/L, 1000mg/L的白蛋白溶液分别滴加到荧光免疫层析试纸条上，反应15分钟后用荧光检测仪（上海海跃塑模有限公司）检测荧光信号，然后用荧光强度相对白蛋白浓度做图得荧光强度对白蛋白浓度的标准曲线。

取100μl含白蛋白的人尿液滴加到荧光免疫层析试纸条的样品垫上，反应15分钟后检测荧光信号，将荧光强度结合标准曲线计算得尿白蛋白浓度为2.5mg/L，与用ELISA法检测的结果一致，说明荧光免疫层析定量检测尿白蛋白的方法是可靠的。

实施例4，用免疫层析法检测样品中的糖化血红蛋白

检测糖化血红蛋白的试纸条制备方法同实施例1，其中的HCG检测抗体更换为血红蛋白检测抗体，HCG捕获抗体更换为糖化血红蛋白捕获抗体，HCG抗原更换为糖化血红蛋白抗原，糖化血红蛋白的抗原和抗体也由芬兰Hytest公司提供。

将100μl 含0g/L, 0.1g/L, 0.2g/L, 1g/L, 2g/L, 5g/L, 10g/L, 20g/L的糖化血红蛋白溶液分别滴加到荧光免疫层析试纸条上，反应15分钟后用荧光检测仪（上海海跃塑模有限公司）检测荧光信号，然后用荧光强度相对糖化血红蛋白浓度做图得荧光强度对糖化血红蛋白浓度的标准曲线。

取100μl含糖化血红蛋白的人血液滴加到荧光免疫层析试纸条的样品垫上，反应15分钟后检测荧光信号，将荧光强度结合标准曲线计算得糖化血红蛋白浓度为4.8g/L，经转换为40mmol/mol，与用ELISA法检测的结果一致，说明荧光免疫层析定量检测糖化血红蛋白的方法是可靠的。

实施例5，用免疫层析检测样品中生长激素的试纸条的制备

用免疫层析检测生长激素的试纸条准备方法如下：

羧基修饰的含铂复合物的聚苯乙烯微球由长春志昂生物科技有限公司提供，生长激素抗体以及生长激素抗原由英国Abcam公司提供。

生长激素抗体与磷光微球的耦联、标记物垫及捕获膜的处理、试纸条的组装同实施例1。

实施例6，用免疫层析法检测样品中的生长激素

将100μl 含0μg/L, 1μg/L, 5μg/L, 10μg/L, 50μg/L, 100μg/L, 500μg/L的生长激素溶液分别滴加到磷光免疫层析试纸条上，反应15分钟后用检测仪（上海海跃塑模有限公司）检测磷光信号，然后用磷光强度相对生长激素浓度做图得磷光强度对生长激素浓度的标准曲线。

取100μl含重组牛生长激素的牛奶滴加到磷光免疫层析试纸条的样品垫上，反应15分钟后检测磷光信号，将磷光强度结合标准曲线计算得生长激素浓度为15μg/L，与用ELISA法检测的结果一致，说明磷光免疫层析定量检测生长激素的方法是可靠的。

实施例7，用免疫层析法检测样品中的金黄色葡萄球菌肠毒素

检测金黄色葡萄球菌肠毒素(A型)的试纸条制备方法同实施例5，其中的生长激素检测抗体更换为金黄色葡萄球菌肠毒素检测抗体，生长激素捕获抗体更换为金黄色葡萄球菌肠毒素捕获抗体，生长激素抗原更换为金黄色葡萄球菌肠毒素抗原，金黄色葡萄球菌肠毒素的抗原和抗体由上海研谨生物科技有限公司提供。

将100μl 含0μg/L, 1μg/L, 2μg/L, 10μg/L, 20μg/L, 100μg/L, 200μg/L, 1000μg/L的金黄色葡萄球菌肠毒素溶液分别滴加到荧光免疫层析试纸条上，反应15分钟后用检测仪（上海海跃塑模有限公司）检测磷光信号，然后用磷光强度相对金黄色葡萄球菌肠毒素浓度做图得磷光强度对金黄色葡萄球菌肠毒素浓度的标准曲线。

取100μl含金黄色葡萄球菌肠毒素的牛奶滴加到荧光免疫层析试纸条的样品垫上，反应15分钟后检测磷光信号，将磷光强度结合标准曲线计算得金黄色葡萄球菌肠毒素浓度为15μg/L，与用ELISA法检测的结果一致，说明磷光免疫层析定量检测金黄色葡萄球菌肠毒素的方法是可靠的。

虽然本申请详细描述了具体的实施例，但本申请不限于这些实施例，相反，其意图涵盖包括在实施例的精神和范围内的各种修改和等同方案，在一些具体情况下，可以缺少和增加某个或某些技术特征而不脱离本发明的精神和范围，本申请的范围仅由权利要求书限定。

Claims

1.一种用免疫层析技术检测蛋白的试纸条，包括标记物垫和捕获膜，其特征在于，所述标记物垫含有光致发光微球标记的蛋白检测抗体，所述捕获膜含有捕获探针。

2. 如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述蛋白是绒毛膜促性腺激素。

3. 如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述蛋白是尿白蛋白。

4. 如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述蛋白是糖化血红蛋白。

5. 如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述蛋白是生长激素。

6. 如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述蛋白是金黄色葡萄球菌肠毒素。

7. 如权利要求1-6任一项所述的试纸条，其特征在于，所述光致发光微球是荧光微球。

8.如权利要求7所述的试纸条，其特征在于，所述荧光微球是时间分辨荧光微球。

9.如权利要求8所述的试纸条，其特征在于，所述时间分辨荧光微球是含铕复合物的荧光微球。

10. 如权利要求1-6任一项所述的试纸条，其特征在于，所述光致发光微球是磷光微球。

11. 如权利要求10所述的试纸条，其特征在于，所述磷光微球是含铂复合物的磷光微球。

12. 如权利要求1-6任一项所述的试纸条，其特征在于，所述光致发光微球是二氧化硅微球。

13. 如权利要求1-6任一项所述的试纸条，其特征在于，所述光致发光微球是聚苯乙烯微球。

14. 一种用免疫层析技术检测蛋白的方法，其特征在于，在权利要求1所述的试纸条样品垫上滴加含待测蛋白的样品，反应后检测光信号。