CN111665363A - 一种制备含量子点标记的抗犬病毒抗体免疫层析试纸条的方法、制备的试纸条及应用 - Google Patents

一种制备含量子点标记的抗犬病毒抗体免疫层析试纸条的方法、制备的试纸条及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种制备含量子点标记的抗犬病毒抗体免疫层析试纸条的方法，该方法通过优化量子点与所述抗犬病毒抗体比例、抗体封闭液、抗体复溶液、标记抗体和固定抗体浓度，实现了高灵敏度的检测样品中的病毒抗原，其较胶体金免疫层析试纸条灵敏度高50倍以上。且本发明的制备方法通用于多种抗犬病毒抗体对，对多种犬病毒抗体对制备的量子点标记免疫层析试纸条均能灵敏检测病毒抗原；同时保存期可延长至27个月。本发明还涉及该方法制备的量子点标记免疫层析试纸条，以及包含有该量子点标记免疫层析试纸条的试剂盒。

Description

一种制备含量子点标记的抗犬病毒抗体免疫层析试纸条的方 法、制备的试纸条及应用
技术领域
本发明涉及免疫测定法领域，具体涉及一种制备含量子点标记的抗犬病毒抗体免疫层析试纸条的方法、制备的试纸条及试剂盒和应用。
背景技术
量子点(Quantum dot,QD)又称半导体纳米晶，是一种由II-VI族或III-V族元素组成的、半径小于或接近激子波尔半径的纳米荧光材料，多呈球形。量子点作为荧光材料具有优异的荧光特性：拥有窄而对称的荧光发射光谱，发射波长随材料及粒径大小不同而不同，具有宽泛且连续的吸收光谱，斯托克斯位移较大，从而使量子点易于实现单波长激发多波长同时发射的多色标记功能。此外，相对于有机荧光染料，量子点具有很好的光稳定性、耐光漂白、荧光效率高等优点，且随着量子点表面配基化学修饰技术的发展，量子点生物相容性及标记效率的进一步提高，使得相关量子点生物标记物在科研、检测领域中的应用得到了进一步拓展。
目前，量子点免疫层析技术主要应用于人医临床疫病诊断、食品中有害物质的检测，其中人医方面检测的主要靶标为血液或血清样本，这些样本受机体代谢物或排泄物中杂质的干扰影响较小，特别地实验室阶段未检测实际样品，如中国专利CN103529214A、CN103529216A；食品方面的检测多以标准品或以标准品加标回收试验检测为主、实际样品检测较少，如李淑群的“基于胶体金和量子点免疫层析技术的研究及应用”(苏州大学硕士学位论文，2013)。而商品化的量子点免疫层析技术产品目前主要是深圳市金准生物医学工程有限公司生产人医方面的产品如降钙素原(PCT)定量测定试剂盒，但其测定的靶标单一、均为人血清、血浆、全血或末梢血，甚至不需要样品处理液裂解待检样品中的靶标即可完成检测，暂未开发兽用犬类传染病相关的量子点免疫层析技术产品。
而当量子点免疫层析技术应用于兽用疫病抗原的检测时，由于临床检测样品中兽用疫病检测的靶标本身存在很多杂质或动物的代谢物，较为复杂，多为代谢物或排泄物如眼鼻拭子、咽拭子、肛拭子、粪便等，用样品处理液处理后对其影响较大，这进一步增加了检测难度。
在现有技术中，针对感染犬的多种病毒抗原的检测，往往需要针对性地制备含有特定抗体的试剂盒进行检测，同时制备的试剂盒也需要对其制备条件进行多种条件的摸索和组合，费时费力，因此提供一种针对感染犬的多种病毒抗原的、能适应多种特定抗体对的免疫层析试纸条的制备方法具有很强的现实意义。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供一种制备含量子点标记的抗犬病毒抗体免疫层析试纸条的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)用最大吸收峰为500～700nm的量子点标记所述抗犬病毒抗体，所述量子点与所述抗犬病毒抗体摩尔比为1:1～1:150，得到所述量子点标记的抗犬病毒抗体；步骤(2)将所述步骤(1)中的所述量子点标记的抗犬病毒抗体进行封闭，所述量子点标记抗体封闭液包含pH7.4的0.1M PBS、0.2％～0.8％W/V BSA，得到封闭的量子点标记的抗犬病毒抗体；步骤(3)将所述步骤(2)中的所述封闭的量子点标记的抗犬病毒抗体进行复溶，所述量子点标记抗体复溶液包含pH7.4的0.1M PBS、0.4％～2.0％W/V海藻糖、0.02％V/V Tween-20、0.02％V/V Proclin300，得到复溶的量子点标记的抗犬病毒抗体；步骤(4)将所述步骤(3)中的所述复溶量子点标记的抗犬病毒抗体吸附于量子点标记垫上，所述吸附的量子点标记的抗犬病毒抗体浓度为5～150μg/ml；以及步骤(5)将固定抗体用固定抗体稀释液稀释，所述固定抗体稀释液包含pH7.4的0.1M PBS、0.5％W/V蔗糖、0.1％～1.0％W/VPEG 6000，所述固定抗体稀释至0.2～1.0mg/ml，然后固定于检测线上，质控线上固定羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。
本发明通过优化制备方法中各步骤中的参数和配比，实现了本发明的该方法能适用于不同种类的犬疫病病毒单克隆抗体对，制备的针对不同种类的犬疫病抗原的量子点免疫层析试纸条均能实现高灵敏度检测，具有广泛的适用性。
本发明制备方法制备的试纸条具有高灵敏度，其较商业性胶体金检测试纸条更灵敏，且能灵敏检测存在很多杂质或动物代谢物的靶标，不仅满足了兽医临床检测的特殊需要，还简便了检测程序。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的含量子点标记的抗犬病毒抗体免疫层析试纸条的制备方法中，所述步骤(1)中所述抗犬病毒抗体为犬细小病毒单克隆抗体、犬瘟热病毒单克隆抗体、犬腺病毒单克隆抗体、犬腺病毒1型单克隆抗体、犬腺病毒2型单克隆抗体、或犬副流感病毒单克隆抗体，所述量子点最大吸收峰为520～660nm，所述量子点与所述抗犬病毒抗体摩尔比为1:5～1:100。
最大吸收峰的量子点其最大吸收峰可以选自500nm、510nm、520nm、525nm、530nm、535nm、540nm、545nm、550nm、555nm、560nm、565nm、570nm、575nm、580nm、585nm、590nm、595nm、600nm、605nm、610nm、615nm、620nm、625nm、630nm、635nm、640nm、645nm、650nm、655nm、660nm、670nm、680nm、690nm、700nm。
量子点与抗犬病毒抗体摩尔比可选自1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100、1:105、1:110、1:120、1:130、1:140、1:150。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的含量子点标记的抗犬病毒抗体免疫层析试纸条的制备方法中，所述量子点最大吸收峰为520～625nm，所述量子点与所述抗犬病毒抗体摩尔比为1:5～1:20。
作为本发明的一种最优选实施方式，本发明所述的含量子点标记的抗犬病毒抗体免疫层析试纸条的制备方法中，所述量子点最大吸收峰为520～565nm。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的含量子点标记的抗犬病毒抗体免疫层析试纸条的制备方法中，所述步骤(1)中所述抗犬病毒抗体为犬细小病毒单克隆抗体CPV-10B11，所述犬细小病毒单克隆抗体CPV-10B11由保藏号为CCTCC No:C201578的小鼠骨髓杂交瘤细胞10B11株分泌；或为犬瘟热病毒单克隆抗体CDV-1G5，所述犬瘟热病毒单克隆抗体CDV-1G5由保藏号为CCTCC No：C2015201的小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5分泌；或为犬腺病毒单克隆抗体CAV-5G4，所述犬腺病毒单克隆抗体CAV-5G4重链可变区核苷酸序列如SEQ.IDNo.1或其简并序列所示、轻链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.2或其简并序列所示；或为犬腺病毒1型单克隆抗体CAV1-2F9，所述犬腺病毒1型单克隆抗体CAV1-2F9其重链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.5或其简并序列所示、轻链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.6或其简并序列所示；或为犬腺病毒2型单克隆抗体CAV2-4H12，所述犬腺病毒2型单克隆抗体CAV2-4H12重链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.9或其简并序列所示、轻链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.10或其简并序列所示；或为犬副流感病毒单克隆抗体CPIV-4H1，所述犬副流感病毒单克隆抗体CPIV-4H1重链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.13或其简并序列所示、轻链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.14或其简并序列所示。
本发明的制备方法可以用于制备含多种抗犬病毒抗原的单克隆抗体对的量子点免疫层析试纸条，不需调整各步骤中的参数和配比，即能制备高灵敏的检测相应病毒的试纸条。
作为本发明的一种实施方式，所述犬用量子点试纸条上的量子点标记抗体制备时用量子点标记抗体封闭液处理，所述量子点标记抗体封闭液包括磷酸盐缓冲液、牛血清白蛋白BSA，所述磷酸盐缓冲液为pH7.4 0.1M PBS溶液，优选为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.2％～0.8％W/V BSA。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的含量子点标记的抗犬病毒抗体免疫层析试纸条的制备方法中，所述步骤(2)中所述量子点标记抗体封闭液包含pH7.4的0.1MPBS、0.2％～0.8％W/V BSA，0.02％W/V海藻糖。
通过在量子点标记抗体封闭液添加海藻糖成份能进一步提高检测的灵敏度，例如能提高3～7倍。
作为本发明的一种实施方式，所述量子点标记抗体使用量子点标记抗体复溶液复溶，所述量子点标记抗体复溶液包括pH7.4 0.1M PBS溶液、海藻糖、Tween-20、Proclin300；所述量子点标记抗体复溶液优选为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.4％～2.0％W/V海藻糖、0.02％V/V Tween-20、0.02％V/V Proclin300。
作为本发明的一种实施方式，所述犬用量子点试纸条上的固定抗体使用固定抗体稀释液稀释，所述固定抗体稀释液包括pH7.4 0.1M PBS溶液、蔗糖、PEG6000；所述固定抗体稀释液优选为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.5％W/V蔗糖、0.1％～1.0％W/V PEG6000。
本发明的试剂盒通过特定组分的量子点标记抗体封闭液、量子点标记抗体复溶液、固定抗体稀释液组合使用，避免非特异，并提高了检测的灵敏度。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的含量子点标记的抗犬病毒抗体免疫层析试纸条的制备方法中，所述步骤(4)中所述吸附的量子点标记的抗犬病毒抗体浓度为10～100μg/ml；所述量子点标记垫为玻璃纤维膜或聚酯膜。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的含量子点标记的抗犬病毒抗体免疫层析试纸条的制备方法中，所述步骤(5)中所述固定抗体为犬细小病毒抗体、犬瘟热病毒抗体、犬腺病毒1型抗体、或犬腺病毒2型抗体、或犬副流感病毒抗体；所述羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗浓度为0.4～2.5mg/ml。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的含量子点标记的抗犬病毒抗体免疫层析试纸条的制备方法中，所述步骤(5)中所述固定抗体为犬细小病毒单克隆抗体CPV-10H4，所述犬细小病毒单克隆抗体CPV-10H4由保藏号为CCTCC No:C201579的小鼠骨髓杂交瘤细胞10H4株分泌；或为犬瘟热病毒单克隆抗体CDV-6E11，所述犬瘟热病毒单克隆抗体CDV-6E11由保藏号为CCTCC No：C2015202的小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株分泌；或为犬腺病毒单克隆抗体CAV-1A1，所述犬腺病毒单克隆抗体CAV-1A1重链可变区核苷酸序列如SEQ.IDNo.3或其简并序列所示、轻链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.4或其简并序列所示；或为犬腺病毒1型单克隆抗体CAV1-4F3，所述犬腺病毒1型单克隆抗体CAV1-4F3重链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.7或其简并序列所示、轻链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.8或其简并序列所示；或为犬腺病毒2型单克隆抗体CAV2-1C5，所述犬腺病毒2型单克隆抗体CAV2-1C5重链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.11或其简并序列所示、轻链可变区核苷酸序列如SEQ.IDNo.12或其简并序列所示；或为犬副流感病毒单克隆抗体CPIV-2B7，所述犬副流感病毒单克隆抗体CPIV-2B7重链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.15或其简并序列所示、轻链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.16或其简并序列所示。
犬细小病毒单克隆抗体CPV-10B11由小鼠骨髓杂交瘤细胞10B11株(保藏号为CCTCC No:C201578)分泌获得，犬细小病毒单克隆抗体CPV-10H4由小鼠骨髓杂交瘤细胞10H4株(保藏号为CCTCC No:C201579)分泌获得。2株小鼠杂交瘤细胞均保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2015年05月20日，公开于中国专利CN104928258A。
犬瘟热病毒单克隆抗体CDV-1G5由小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5(保藏号为CCTCC No：C2015201)分泌获得，犬瘟热病毒单克隆抗体CDV-6E11由小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株(保藏号为CCTCC No：C2015202)分泌获得。2株杂交瘤细胞均保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2015年11月25日，公开于中国专利CN105695420A。
犬腺病毒单克隆抗体CAV-5G4，其重链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.1或其简并序列所示、轻链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.2或其简并序列所示；和犬腺病毒单克隆抗体CAV-1A1，其重链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.3或其简并序列所示、其轻链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.4或其简并序列所示，公开于中国专利CN109232734A。
犬腺病毒1型单克隆抗体CAV1-2F9，其重链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.5或其简并序列所示、轻链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.6或其简并序列所示；和犬腺病毒1型单克隆抗体CAV1-4F3，其重链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.7或其简并序列所示、其轻链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.8或其简并序列所示。
犬腺病毒2型单克隆抗体CAV2-4H12，其重链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.9或其简并序列所示、轻链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.10或其简并序列所示；和犬腺病毒2型单克隆抗体CAV2-1C5，其重链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.11或其简并序列所示、其轻链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.12或其简并序列所示。
犬副流感病毒单克隆抗体CPIV-4H1，其重链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.13或其简并序列所示、轻链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.14或其简并序列所示；和犬副流感病毒单克隆抗体CPIV-2B7，其重链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.15或其简并序列所示、其轻链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.16或其简并序列所示。
作为本发明的一种优选的实施方式，本发明所述的含量子点标记的抗犬病毒抗体免疫层析试纸条的制备方法中，所述试纸条包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有样品垫、量子点标记垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，所述量子点标记垫上吸附有量子点标记抗体，所述硝酸纤维素膜上近所述底板第二端的位置包括检测线和质控线，所述检测线上固定化有固定抗体，所述质控线上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗，所述硝酸纤维素膜与量子点标记垫接触或与样品垫、量子点标记垫接触使得抗原与所述量子点标记抗体的结合体能在其上向底板第二端迁移。
作为本发明的一种更优选的实施方式，本发明所述的含量子点标记的抗犬病毒抗体免疫层析试纸条的制备方法中，所述检测线和质控线两线间距≥5mm。
本发明还提供所述方法制备的含量子点标记的抗犬病毒抗体免疫层析试纸条。
本发明的含量子点标记的抗犬病毒抗体免疫层析试纸条具有高灵敏度，且能针对存在很多杂质或动物代谢物的靶标，例如粪便和肛拭子进行高灵敏度检测，其结果与PCR检测符合率至少可达95％。抗犬病毒抗体免疫层析试纸条保存期长，可长达27个月。
本发明还提供一种试剂盒，其中，所述试剂盒包含所述的含量子点标记的抗犬病毒抗体免疫层析试纸条和样品处理液；所述样品处理液包含pH7.4的0.1M PBS、0.5％W/VTriton-X 100、0.05％～0.25％W/V EDTA、0.02％V/V Proclin300。
本发明的试剂盒通过特定的样品处理液处理，可以针对存在很多杂质或动物代谢物的靶标进行检测前的处理，避免了其中的杂质或动物代谢物对检测灵敏度的影响，实现了针对临床兽用疫病抗原的高灵敏度检测，检测结果与PCR检测具有高度的一致性，符合率至少可达95％。
作为本发明的一种优选的实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述样品处理液包括pH7.4 0.1M PBS溶液、Triton-X 100、EDTA、Proclin300；所述样品处理液优选为pH7.40.1M PBS溶液、0.5％V/V Triton-X 100、0.05％～0.25％W/V EDTA、0.02％V/VProclin300。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述样品处理液为处理的抗原病毒液、粪便、血清、微生物拭子(含眼鼻拭子、鼻咽拭子、泄殖拭子、肛拭子)、研磨后的组织样品的样品处理液。
作为本发明的一种更优选的实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述样品处理液1ml溶解固体样品0.08～0.5g和/或所述样品处理液1ml溶解液体样品500～1500μl。
作为本发明的一种进一步优选的实施方式，本发明所述的试剂盒中，所述样品选自病毒液、组织、血清、肛门分泌物(即肛拭子)、粪便、咽鼻分泌物(即鼻咽拭子)、眼鼻分泌物(即眼鼻拭子)。
本发明还涉及一种所述试剂盒的制备方法，其中，所述制备方法包括：步骤(1)用量子点标记单克隆抗体为量子点标记抗体，用所述量子点标记抗体封闭液封闭所述量子点标记抗体，再用所述量子点标记抗体复溶液稀释所述量子点标记抗体至5～150μg/ml，然后将所述量子点标记抗体吸附于玻璃纤维膜或聚酯膜即成量子点标记垫，干燥后使用；步骤(2)固定抗体、羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗分别经所述固定抗体稀释液稀释至0.2～1.0mg/ml、0.4～2.5mg/ml，分别吸附于硝酸纤维素膜的一端作为检测线、质控线，所述检测线、质控线两线间距≥5mm，干燥所述硝酸纤维素膜；步骤(3)配制样品处理液，分装；以及步骤(4)将所述步骤(1)所制备的量子点标记垫、所述步骤(2)制备的硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴底板上，裁剪；连同所述步骤(3)制备的样品处理液组装成试剂盒。
作为本发明的一种实施方式，所述步骤(1)中所述量子点标记抗体时量子点最大吸收峰为500～700nm、量子点与抗体摩尔比为1∶1～1∶150，所述量子点标记抗体封闭液为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.2％～1.0％W/V BSA，或pH7.4 0.1M PBS溶液、0.2％～1.0％W/VBSA、0.02％W/V海藻糖；所述量子点标记抗体复溶液为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.4％～2.0％W/V海藻糖、0.02％V/V Tween-20、0.02％V/V Proclin300；
所述步骤(2)中所述固定抗体稀释液为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.5％W/V蔗糖、0.1％～1.0％W/V PEG6000；
所述步骤(3)中所述样品处理液为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.5％V/V Triton-X100、0.05％～0.25％W/V EDTA、0.02％V/V Proclin300。
本发明还提供了所述试剂盒用于非诊断目的的动物疫病抗原检测中的应用，所述非诊断目的的动物疫病抗原检测包括流行病学分析、健康体检、对离体组织进行定性定量检测、表位鉴定研究。
作为本发明的一种实施方式，所述动物疫病抗原包括犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒1型、犬腺病毒2型。
本发明还提供了一种量子点标记抗体封闭液，所述量子点标记抗体封闭液包括磷酸盐缓冲液、牛血清白蛋白BSA，所述磷酸盐缓冲液为pH7.4 0.1M PBS溶液，优选为pH7.40.1M PBS溶液、0.2％～0.8％W/V BSA；进一步量子点标记抗体封闭液还包括海藻糖，所述海藻糖的含量为0.02％W/V海藻糖。
本发明还提供了一种量子点标记抗体复溶液，所述量子点标记抗体复溶液包括pH7.4 0.1M PBS溶液、海藻糖、Tween-20、Proclin300；所述量子点标记抗体复溶液优选为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.4％～2.0％W/V海藻糖、0.02％V/V Tween-20、0.02％V/VProclin300。
本发明还提供了一种固定抗体稀释液，所述固定抗体稀释液包括pH7.4 0.1M PBS溶液、蔗糖、PEG6000；所述固定抗体稀释液优选为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.5％W/V蔗糖、0.1％～1.0％W/V PEG6000。
本发明还提供了一种样品处理液，所述样品处理液包括pH7.40.1M PBS溶液、Triton-X 100、EDTA、Proclin300；所述样品处理液优选为pH7.4 0.1M PBS溶液、0.5％W/VTriton-X 100、0.05％～0.25％W/V EDTA、0.02％V/V Proclin300。
本发明的样品处理液不仅可有效裂解多种动物疫病抗原样品，还能增加检测灵敏度、避免非特异反应。
作为本发明的一种实施方式，本发明的样品处理液处理的样品选自病毒液、组织、血清、肛拭子、粪便、鼻咽拭子、眼鼻拭子。
本发明制备的样品处理液，可用于病毒液、粪便、血清、微生物拭子(含眼鼻拭子、鼻咽拭子、泄殖拭子)、研磨后的组织样品的溶解后犬用量子点试纸条的准确检测。
作为本发明的一种实施方式，本发明的所述样品处理液1ml溶解固体样品0.08～0.5g和/或所述样品处理液1ml溶解液体样品500～1500μl。
本发明的优势：
(1)本发明制备的犬用量子点试纸条可用于犬类动物多种兽用疫病的检测；检测效果可与分子生物学方法如PCR或RT-PCR的灵敏度相媲美，甚至高于分子生物学方法的灵敏度，实现了快速实时定量检测，解决了分子生物学方法只能在实验室操作且需要专业技术人员、耗时费力操作、不便于临床即时应用的问题。
(2)本发明的犬用量子点试纸条在制备过程中经量子点标记抗体封闭液、量子点标记抗体复溶液、固定抗体稀释液、样品处理液等一系列处理，使用时能使有效提高犬类动物多种兽用疫病的检测，并避免非特异反应。
(3)本发明制备的犬用量子点试纸条检测样品时经样品处理液处理，可用于犬类动物多种动物疫病的抗原病毒液、粪便、血清、微生物拭子(含眼鼻拭子、鼻咽拭子、泄殖拭子)、研磨后的组织样品等的准确检测。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
术语“量子点免疫层析试纸条”或“量子点试纸条”可互换使用。
术语“量子点”(Quantum Dots，QDs)又称半导体纳米晶，呈近球形，指粒径小于或接近于激子玻尔半径的半导体纳米晶粒，一般由II-VI族元素(如CdS、CdSe、CdTe、ZnSe、ZnS)等或III-V族元素(无镉量子点，如InP、InS等)等半导体材料构成，也可由两种或两种以上的半导体材料构成核壳结构(如常见的CdSe/ZnS核壳结构量子点等)；本发明所用量子点为最大吸收峰为500～700nm的量子点，更优选为520～660nm的量子点，更优选为520～655nm的量子点，最优选为最大吸收峰为520～565nm的量子点。本发明量子点包括但不限于水溶性羧基量子点、核壳型量子点、单一化合物形成的量子点，还可以是在水相中合成或者油相合成然后进行水相改性。所述核壳型量子点为ZnS/CdSe或ZnS/CdTe形成的量子点。所述单一元素化合物为以下化合物的任一种：第IIIA族元素和第VA族元素形成的化合物、第IIA族元素和第VIA族元素形成的化合物、第IIB族元素和第VIA族元素形成的化合物、第IVA族元素和第IVA族元素组成的化合物、第IVA族元素和第VIA族元素组成的化合物，具体为GaSb、InAs、InP、InGaAs、InAlAs、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、SiC、SiGe、SiSe、SiTe和SiS中的任一种。
术语“量子点试纸条”又称“量子点免疫层析试纸条”、“量子点检测试纸条”或“量子点试纸”。
术语“量子点标记抗体复溶液”也可称“量子点标记抗体缓冲液”、“量子点标记抗体稀释液”、“量子点标记抗体重悬液”。
术语“固定抗体”又称捕获抗体，固定于检测试纸条检测线(简称T线)上，用于捕获层析而来的抗原与标记抗体形成的复合物。
术语“玻璃纤维膜”简称玻璃纤维，包括玻璃纤维素膜、玻璃纤维滤膜及玻璃纤维滤纸。
术语“质控线”又称对照线或C线。
术语“微生物拭子”中的眼鼻拭子、鼻咽拭子、泄殖拭子又称眼鼻分泌物、鼻咽分泌物、泄殖分泌物，可互换使用。
术语“犬腺病毒抗体”为同时识别犬腺病毒1型、2型病毒抗原的抗体。
本发明所指的单克隆抗体双抗为犬类单克隆抗体双抗，可以包括：
(1)犬细小病毒单克隆抗体CPV-10B11由小鼠骨髓杂交瘤细胞10B11株(保藏号为CCTCC No:C201578)分泌获得，犬细小病毒单克隆抗体CPV-10H4由小鼠骨髓杂交瘤细胞10H4株(保藏号为CCTCC No:C201579)分泌获得。2株小鼠杂交瘤细胞均保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2015年05月20日，公开于中国专利CN104928258A。
(2)犬瘟热病毒单克隆抗体CDV-1G5由小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5(保藏号为CCTCCNo：C2015201)分泌获得，犬瘟热病毒单克隆抗体CDV-6E11由小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株(保藏号为CCTCC No：C2015202)分泌获得。2株杂交瘤细胞均保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏时间为2015年11月25日，公开于中国专利CN105695420A。
(3)犬腺病毒单克隆抗体CAV-5G4，其重链可变区核苷酸序列为SEQ.ID No.1、轻链可变区核苷酸序列为SEQ.ID No.2；和犬腺病毒单克隆抗体CAV-1A1，其重链可变区核苷酸序列为SEQ.ID No.3、其轻链可变区核苷酸序列为SEQ.ID No.4，公开于中国专利CN109232734A。
(4)犬腺病毒1型单克隆抗体CAV1-2F9，其重链可变区核苷酸序列为SEQ.ID No.5、轻链可变区核苷酸序列为SEQ.ID No.6；和犬腺病毒1型单克隆抗体CAV1-4F3，其重链可变区核苷酸序列为SEQ.ID No.7、其轻链可变区核苷酸序列为SEQ.ID No.8。
(5)犬腺病毒2型单克隆抗体CAV2-4H12，其重链可变区核苷酸序列为SEQ.IDNo.9、轻链可变区核苷酸序列为SEQ.ID No.10；和犬腺病毒2型单克隆抗体CAV2-1C5，其重链可变区核苷酸序列为SEQ.ID No.11、其轻链可变区核苷酸序列为SEQ.ID No.12。
(6)犬副流感病毒单克隆抗体CPIV-4H1，其重链可变区核苷酸序列为SEQ.IDNo.13、轻链可变区核苷酸序列为SEQ.ID No.14；和犬副流感病毒单克隆抗体CPIV-2B7，其重链可变区核苷酸序列为SEQ.ID No.15、其轻链可变区核苷酸序列为SEQ.ID No.16。
术语“防腐剂”包括但不限于庆大霉素、硫酸卡那霉素、叠氮钠、硫柳汞及其盐类、Proclin300，优选为Proclin300。
处理样品通过对动物疫病抗原的排毒途径而针对性获得。本发明中动物疫病抗原的排毒途径主要是针对靶抗原感染后通过机体排毒途径进行代谢，如犬细小病毒主要是肛拭子、粪便、组织等排毒，犬瘟热病毒主要是通过眼鼻拭子、肛拭子、粪便、组织等排毒，犬腺病毒主要是通过眼鼻拭子、肛拭子、粪便、血液、组织等排毒，犬副流感病毒主要通过眼鼻拭子、鼻咽拭子、血液、组织等排毒。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用到PBS缓冲液配制示例如下：氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g，调pH7.4，定容1L，包括但不限于此配方；化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
试纸条临床应用时检测靶标主要包括眼鼻拭子、肛拭子、粪便、血液以及处理后的组织等，其中肛拭子、粪便中所含杂质为最多，故本发明以肛拭子、粪便为检测靶标，和制备的犬用犬细小病毒量子点试纸条为例进行详细的阐述。
为更好地评价层析类试纸条如犬细小病毒量子点试纸条，本发明以固定抗体为10H4、标记抗体为10B11进行试纸条制备(参见实施例2.1部分)，并将犬细小病毒CVCCAV298株(购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心)，犬细小病毒流行株CPV不同基因型(CPV不同基因型之间具有同源性，但是现在的出了新的变异，新型CPV与原来毒株具有较低的同源性)的S2株、S0425株、S0304株(参见Preparation and application of two monoclonalantibodies against canine parvovirus vaccine and field strains,Journal ofVaccines and Immunology,2017,3(1):001-004)，以及20份阳性粪便、20份阴性粪便(分别经犬细小病毒PCR鉴定结果为阳性、阴性)作为样品盘，对试纸条进行全面调控。
实施例1量子点标记抗体及其相关溶液的优化
1.1量子点最大吸收峰的选择
购买多家的商品化量子点，其最大吸收峰为500～700nm之间，对不同动物种类的抗体进行系统标记与大量地摸索，以下仅以最大吸收峰为500nm、520nm、525nm、540nm、565nm、585nm、605nm、625nm、655nm、660nm、700nm的量子点为例进行阐述。
将具有不同最大吸收峰的量子点与犬细小病毒单克隆抗体10B11按1∶10摩尔比混合后进行标记，标记过程为：①将活化剂EDC与量子点按摩尔比2000∶1于pH7.4的PBS缓冲液混匀后在室温振荡反应1小时以活化量子点；②将活化后的量子点与待标记的抗体按摩尔比混匀，室温振荡反应2～3小时；③向②的反应体系中加入实施例1.3中的量子点标记抗体封闭液，室温振荡反应0.5～2.0小时；④将③得到的反应物先以2000转/分钟离心，取上清再于12000转/分钟离心30分钟，弃上清，将沉淀用1/5体积的实施例1.4中的量子点标记抗体复溶液重悬，得到量子点标记抗体。
按实施例2所描述的方法依次制备成试纸条A1～A11，并按实施例2.3将样品盘样品用实施例2制备的样品处理液F4稀释并进行检测，结果见表1，显示：当量子点最大吸收峰为500～700nm时制备的量子点标记抗体A1～A11，进而制备的试纸条检测后CPV不同基因型毒株的灵敏度为101.5～105.2TCID50/ml，检测临床样品与PCR检测结果一致性为≥30％；当量子点最大吸收峰为520～660nm时制备的量子点标记抗体A2～A10进而制备的试纸条检测后CPV不同基因型毒株的灵敏度为101.5～103.8TCID50/ml，检测临床样品与PCR检测结果一致性为≥50％；当量子点最大吸收峰为520～625nm时制备的量子点标记抗体A2～A8，进而制备的试纸条检测后CPV不同基因型毒株的灵敏度为101.5～103.3TCID50/ml，检测临床样品与PCR检测结果一致性为80％～100％；当量子点最大吸收峰为520～565nm时制备的量子点标记抗体A2～A5，进而制备的试纸条检测后CPV不同基因型毒株的灵敏度为101.5～102.0TCID50/ml，检测临床样品与PCR检测结果一致性为100％。
表1含不同最大吸收峰的量子点标记抗体进而制备的试纸条后的检测结果汇总
Figure BDA0001988584750000161
注：阳性结果占阳性粪便比例、阴性结果占阴性粪便比例表示试纸条检测结果/PCR检测阳性或阴性样本总数。
1.2量子点与抗体含量的优化
量子点标记抗体时将量子点与抗体进行大量系统的摸索，以下仅以将量子点与抗体按摩尔比为1∶1、1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶100、1∶150为例进行阐述。
将最大吸收峰为525nm的量子点与犬细小病毒单克隆抗体10B11按表2所述摩尔比混合后进行标记，按实施例2所描述的方法依次制备成试纸条B1～B9，并按实施例2.3将样品盘样品用实施例2制备的样品处理液F4稀释并进行检测，结果见表2，显示：当量子点与抗体的摩尔比为1∶1～1∶150制备的量子点标记抗体B1～B9进而制备的试纸条检测后CPV不同基因型毒株的灵敏度为101.5～105.2TCID50/ml，检测临床样品与PCR检测结果一致性为≥35％；当量子点与抗体的摩尔比为1∶5～1∶100制备的量子点标记抗体B3～B8进而制备的试纸条检测后CPV不同基因型毒株的灵敏度为101.5～103.5TCID50/ml，检测临床样品与PCR检测结果一致性为75％～100％；当量子点与抗体的摩尔比为1∶5～1∶20制备的量子点标记抗体B3～B5进而制备的试纸条检测后CPV不同基因型毒株的灵敏度为101.5～102.3TCID50/ml，检测临床样品与PCR检测结果一致性≥95％。
表2含不同最大吸收峰的量子点标记抗体进而制备的试纸条后的检测结果汇总
Figure BDA0001988584750000171
注：阳性结果占阳性粪便比例、阴性结果占阴性粪便比例表示试纸条检测结果/PCR检测阳性或阴性样本总数。
1.3量子点标记抗体封闭液的选择
将具有实施例1.1的不同最大吸收峰的量子点与犬细小病毒单克隆抗体10B11按实施例1.2的摩尔比混合后进行标记，加入表3中的量子点标记抗体封闭液C1～C5后按标记过程进行，之后取沉淀并用表5中的量子点标记抗体复溶液重悬。
表3量子点标记抗体封闭液组分汇总
Figure BDA0001988584750000181
将表3中的不同量子点标记抗体用封闭液封闭后制备成试纸条C1～C5，并按实施例2.3将样品盘样品用实施例2制备的样品处理液F4稀释并进行检测，结果(见表4)如下：仅当量子点标记抗体封闭液为C3时制备的试纸条检测后CPV不同基因型毒株的灵敏度较高(102.1～102.3TCID50/ml)，检测临床样品与PCR检测结果一致性≥90％，而其它的量子点标记抗体封闭液为C1、C2、C4、C5时检测CPV不同基因型毒株的灵敏度较低(104.8～105.2TCID50/ml)，检测临床样品与PCR检测结果一致性较差(15％～35％)。
表4不同量子点标记抗体封闭液制备的试纸条检测结果汇总
Figure BDA0001988584750000191
注：阳性结果占阳性粪便比例、阴性结果占阴性粪便比例表示试纸条检测结果/PCR检测阳性或阴性样本总数。
为进一步评价量子点标记抗体封闭液中所含BSA的浓度的影响，在C3的基础上将BSA浓度稀释成终浓度为0.1％、0.8％(C6)、1.0％、1.5％W/V，进行对比，结果：当量子点标记抗体封闭液中BSA为0.1％、1.0％、1.5％时制备的量子点标记抗体进而制备的试纸条检测CPV的灵敏度均下降10～20倍，且检测阳性粪便、阴性粪便存在非特异性；当量子点标记抗体封闭液中BSA为0.8％时检测效果与0.2％(C3)效果相当。因此将量子点标记抗体封闭液中BSA的浓度设定为0.2％～0.8％W/V。
为进一步提高检测灵敏度，将优选的量子点标记抗体封闭液中再添加0.02％V/V海藻糖(见表3中C7、C8)进行检测，结果(见表4)表明：添加海藻糖后检测CPV不同基因型毒株的灵敏度可提高3～7倍。
1.4量子点标记抗体复溶液的制备
用不同的量子点标记抗体复溶液(见表5)重悬量子点标记抗体，其它条件一致的情况下制备成试纸条D1～D6，并将样品盘样品用实施例2制备的样品处理液F4稀释并进行检测，结果见表6。
表5量子点标记抗体复溶液组分汇总
Figure BDA0001988584750000201
结果显示(见表6)：当量子点标记抗体复溶液D5时制备的试纸条检测后CPV毒株的灵敏度最高(101.5～101.8TCID50/ml)，检测临床样品与PCR检测结果一致性为100％)；当量子点标记抗体复溶液为D1～D4时制备的试纸条检测灵敏度下降(≥105.1TCID50/ml)，且检测临床样品出现非特异反应强。
表6不同量子点标记抗体复溶液制备的试纸条检测结果汇总
Figure BDA0001988584750000202
Figure BDA0001988584750000211
注：阳性结果占阳性粪便比例、阳性结果占阴性粪便比例表示试纸条检测结果/PCR检测阳性或阴性样本总数。
为进一步摸索海藻糖的含量的影响，将量子点标记抗体复溶液中的海藻糖含量依次设为0.2％、0.4％(见表6中的D5)、0.8％、1.5％、2.0％(见表6中的D6)、2.5％W/V进行检测，结果表明：添加海藻糖的含量为0.4％～2.0％W/V时检测结果相当，而含量为0.2％、2.5％W/V后检测CPV不同基因型毒株的灵敏度下降50～100倍(表6中未列出)，且出现非特异现象。
实施例2试剂盒的制备
2.1试纸条的制备
2.1.1量子点标记垫的制备
用实施例1制备的复溶的量子点标记抗体，将其鉴定后吸附于玻璃纤维膜或聚酯膜，干燥后即为量子点标记垫，可使用。
为评价量子点标记垫制备时量子点标记抗体使用浓度的影响，在A3、B4、C7、D5的基础上用量子点标记抗体复溶液将量子点标记抗体稀释成工作浓度为2.5、5、10、20、50、100、150、200μg/ml后制备试纸条，并进行检测，结果(见表7)：当量子点标记抗体工作浓度为2.5μg/ml、200μg/ml时制备的试纸条检测CPV的灵敏度较低(105.0～105.5TCID50/ml)且存在非特异性强(与PCR一致性≤40％)；而当量子点标记抗体工作浓度为5、10、20、50、100、150μg/ml时制备的试纸条检测灵敏度为101.5～103.6TCID50/ml，检测阳性粪便、阴性粪便结果均正确率高(≥75％)，故而将量子点标记抗体工作浓度设定为5～150μg/ml，优选10～100μg/ml。
表7不同量子点标记抗体工作浓度制备试纸条后检测结果汇总
Figure BDA0001988584750000221
注：阳性结果占阳性粪便比例、阴性结果占阴性粪便比例表示试纸条检测结果/PCR检测阳性或阴性样本总数。
2.1.2硝酸纤维素膜的制备
将固定抗体10H4用固定抗体稀释液(见表8)E1～E6稀释至0.2～1.0mg/ml，羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗用pH7.4 0.1M PBS缓冲液或优选的固定抗体稀释液稀释至0.4～2.5mg/ml，分别喷涂于硝酸纤维素膜一端的检测线和质控线，两线间距≥5mm，干燥后制备成试纸条，用样品盘样品进行检测，结果(见表9)显示：当固定抗体稀释液为E4时制备的硝酸纤维素膜，进而制备的试纸条检测后CPV毒株的灵敏度较高(101.5～101.8TCID50/ml)，检测临床样品与PCR检测结果一致；当固定抗体稀释液为E1、E2、E3、E5、E6时制备的硝酸纤维素膜进而制备的试纸条检测灵敏度下降(104.5～105.5TCID50/ml)，且检测临床样品出现严重的非特异反应。
表8固定抗体稀释液组分汇总
编号 固定抗体稀释液组分
E1 pH7.4的0.1M PBS
E2 pH7.4的0.1M PBS、0.5％W/V蔗糖
E3 pH7.4的0.1M PBS、0.5％W/V蔗糖、0.1％W/VPEG4000
E4 pH7.4的0.1M PBS、0.5％W/V蔗糖、0.1％W/VPEG6000
E5 pH7.4的0.1M PBS、0.5％W/V蔗糖、0.1％W/VPEG8000
E6 pH7.4的0.1M PBS、0.5％W/V蔗糖、0.1％W/VPEG12000
E7 pH7.4的0.1M PBS、0.5％W/V蔗糖、1.0％W/VPEG6000
表9不同固定抗体稀释液制备硝酸纤维素膜进而制备的试纸条后检测结果汇总
Figure BDA0001988584750000231
注：阳性结果占阳性粪便比例、阴性结果占阴性粪便比例表示试纸条检测结果/PCR检测阳性或阴性样本总数。
为进一步摸索PEG6000的含量对检测的影响，将固定抗体稀释液中的PEG6000含量设为0.05％、0.1％(见表8中的E4)、0.5％、1.0％(见表8中的E7)、1.5％W/V进行检测，结果表明：添加PEG6000的含量为0.1％～1.0％W/V时检测结果相当，而含量为0.05％、1.5％W/V后检测CPV不同基因型毒株的灵敏度下降50～200倍(表9中未列出)，且出现非特异现象。
为评价硝酸纤维素膜制备时固定抗体浓度对检测灵敏度的影响，用固定抗体稀释液将固定抗体稀释成工作浓度为0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2mg/ml以制备试纸条，结果(见表10)：当固定抗体工作浓度为0.1、1.2mg/ml时制备的试纸条检测CPV流行株的灵敏度为104.7～105.5TCID50/ml，且与PCR符合率≤50％，存在严重的非特异现象；而当固定抗体浓度为0.2、0.4、0.8、1.0mg/ml时制备的试纸条检测灵敏度为101.5～102.4TCID50/ml，检测阳性粪便、阴性粪便结果均正确率较高(与PCR符合率≥95％)，故而将固定抗体工作浓度设定为0.2～1.0mg/ml。
表10不同固定抗体工作浓度制备试纸条后检测结果汇总
Figure BDA0001988584750000241
注：阳性结果占阳性粪便比例、阴性结果占阴性粪便比例表示试纸条检测结果/PCR检测阳性或阴性样本总数。
为评价质控线用羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗的工作浓度，将其稀释成0.4～2.5mg/ml不同浓度时试纸条检测均有效，＜0.4mg/ml时无效比例为30％，≥2.5mg/ml时检测结果虽有效但成本较高，故将羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗的工作浓度设定为0.4～2.5mg/ml。
2.1.3样品处理液的制备
配制以下样品处理液(见表11)，取样进行外观检测、无菌检验(按现行中国兽药典附录进行)及保存期研究，结果：外观均澄清、无菌检验均合格，保存期均为27个月。
将其制备成试纸条进行检测，结果(见表11～12)显示：当样品处理液为F4时制备的试剂盒检测后CPV毒株的灵敏度较高(101.5～101.8TCID50/ml)，检测临床样品与PCR检测结果一致性为100％；当样品处理液为F1、F2、F3时制备的试纸条检测灵敏度为104.2～105.3TCID50/ml，且检测临床样品出现严重的非特异反应(与PCR检测一致性≤50％)。
表11样品处理液所含组分汇总
Figure BDA0001988584750000251
表12用不同样品处理液制备试剂盒后检测结果汇总
Figure BDA0001988584750000261
注：阳性结果占阳性粪便比例、阳性结果占阴性粪便比例表示试纸条检测结果/PCR检测阳性或阴性样本总数。
为评价样品处理液中EDTA的含量，在F4中其他成分保持不变的情况下将EDTA含量调整为0.02％、0.05％(表11中F4)、0.15％(表11中F5)、0.25％(表11中F6)、0.5％W/V以制备试纸条并进行检测，结果：当样品处理液中所含EDTA为0.02％、1.5％时制备的试剂盒检测CPV的灵敏度均下降20～50倍且检测5～10份阴性粪便为阳性(表12中未示出)；当样品处理液中所含EDTA为0.05％～1.0％时制备的试纸条检测CPV的灵敏度均与表12中F4结果相当，检测临床样品时与PCR方法的符合率为100％，故而将样品处理液中EDTA含量设定为0.05％～0.25％W/V。
2.2试剂盒的制备方法
量子点试纸条包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有样品垫、量子点标记垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，所述量子点标记垫上吸附有量子点标记抗体，所述硝酸纤维素膜上近所述底板第二端的位置包括检测线和质控线，所述检测线上固定化有固定抗体，所述质控线上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗，所述硝酸纤维素膜与量子点标记垫接触或与样品垫、量子点标记垫接触使得抗原与所述量子点标记抗体的结合体能在其上向底板第二端迁移。
试剂盒制备时，包括以下步骤：
步骤(1)用量子点标记单克隆抗体为量子点标记抗体，用量子点标记抗体封闭液先封闭量子点标记抗体，再用量子点标记抗体复溶液稀释至5～150μg/ml，吸附于玻璃纤维膜或聚酯膜即成量子点标记垫，干燥后使用；
步骤(2)固定抗体、羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗分别经固定抗体稀释液稀释至0.2～1.0mg/ml、0.4～2.5mg/ml，分别吸附于硝酸纤维素膜的一端作为检测线、质控线，两线间距≥5mm，干燥后使用；
步骤(3)配制样品处理液，分装成1ml/管；
步骤(4)将步骤(1)所制备的量子点标记垫、步骤(2)所制备的的硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴底板上，裁剪；连同步骤(3)制备的样品处理液组装成试剂盒。
2.3试剂盒的检测方法
试剂盒的检测方法包括：步骤(1)根据动物疫病抗原的排毒途径采集临床样品，取固体样品0.08～0.5g和/或液体样品500～1500μl溶解于样品处理液中；步骤(2)将处理后的样品滴加50～150μl至加样孔中，静置5～20分钟在检测区用紫外分析仪或紫外灯照射观察结果。
结果判定标准：反应5～20分钟时，若质控线无荧光，无论检测线是否有荧光结果均无效；若质控线有荧光，检测线有荧光即为阳性，检测线无荧光即为阴性。一般而言，强阳性样本5分钟即可报观察结果，弱阳、阴性样本20分钟报结果。
2.4试剂盒评价
根据以上调试结果，以下仅对以最优条件制备的犬用CPV量子点试纸条并组装成的试剂盒及其评价与应用进行详细阐述。
2.4.1敏感性检测
将CPV试剂盒用CPV不同基因型毒株进行灵敏度评价，并对样品盘的20份阳性粪便、20份阴性粪便(均经PCR鉴定)进行检测。同时用商品化韩国安捷犬细小病毒胶体金检测试纸条进行平行试验，结果(见表13)：量子点试纸条检测灵敏度为101.5～101.8TCID50/ml，比安捷CPV胶体金检测试纸条的灵敏度高100～158倍；检测阳性、阴性样品结果均准确，未出现非特异性反应，高于安捷CPV胶体金检测试纸条检测临床样品的符合率。
表13 CPV试剂盒与商品化试剂盒后检测结果比较
Figure BDA0001988584750000281
2.4.2特异性检测
将CPV试剂盒分别检测特异性样品，包括犬瘟热病毒液、犬副流感病毒液、犬腺病毒1型病毒液、犬腺病毒2型病毒液、犬狂犬病毒液、健康犬粪便、犬瘟热病毒阳性犬粪便、犬轮状病毒阳性犬粪便、犬冠状病毒病毒液等样品，结果均为阴性，表明特异性良好。
2.4.3重复性研究
将CPV试剂盒用样品盘中样品、特异性检测用样品进行批间、批内重复性研究，结果：CPV试剂盒的批间、批内重复性良好。
2.4.4保存期研究
将CPV试剂盒于4～25℃放置6、9、12、15、18、21、24、27个月进行灵敏度、特异性检测，结果：检测结果符合率均为100％，表明试剂盒可在4～25℃保存24个月甚至27个月。
2.4.5临床应用
为观察CPV试剂盒的临床应用效果，进一步扩大临床样本量进行检测。将经PCR鉴定为阳性、阴性各200份的临床样品用CPV试剂盒进行检测，结果(见表14)：CPV试剂盒检测总符合率为99％，优于商品化试剂盒(符合率为90％)；可代替操作耗时且繁琐、需要专门的技术人员、专门的仪器设备才能实现的PCR检测方法，进行临床的快速、准确的鉴定。
表14不同试剂盒检测临床样品结果汇总
Figure BDA0001988584750000291
实施例3其他犬用量子点试纸条的制备
为进一步评价实施例2所优化的各个条件能否满足犬类其它抗原等动物疫病诊断检测中的应用，特将犬瘟热病毒、犬腺病毒、犬腺病毒1型、犬腺病毒2型、犬副流感病毒等逐一进行调试及评价，结果：(1)灵敏度比商品化胶体金检测试纸条明显提高至少50倍；(2)特异性均良好，无非特异性现象发生；(3)重复性均良好；(4)保存期可保存至27个月，远优于现有人用量子点试纸条保存期(18个月)；(5)临床应用效果较好，均能快速、实地、准确地确诊。以下就犬瘟热病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒为代表进行简要阐述。
3.1犬瘟热病毒量子点试纸条
3.1.1灵敏度比较
按实施例1、2制备犬瘟热病毒CDV量子点试纸条(标记抗体CDV-1G5，固定抗体CDV-6E11)并组装成CDV试剂盒，用CDV不同毒株(CVCC AV299株，见专利CN105695420A；及临床分离野毒株HL001株、HNly150520B株，见Liu YX,et al.Development and characterizationof canine distemper virus monoclonal antibodies,Monoclonal antibodies inimmunodiagnosis and immunotherapy,2017,36,3(1):119-123)以及RT-PCR鉴定的临床阳性眼鼻拭子、阴性眼鼻拭子、阳性唾液、阴性唾液进行评价，同时用市售商品化韩国安捷CDV胶体金检测试纸条做比较。结果(见表15)：CDV试剂盒检测CDV不同毒株的灵敏度为101.8～102.2TCID50/ml，远高于安捷CDV胶体金试纸条的检测结果(103.5～104.5TCID50/ml)；检测阳性、阴性样品结果均准确，未出现非特异性反应。
表15 CDV试剂盒与商品化胶体金检测试纸条检测结果比较
Figure BDA0001988584750000301
3.1.2特异性检测
将CDV试剂盒分别检测特异性样品，包括犬细小病毒病毒液、犬副流感病毒液、犬腺病毒1型病毒液、犬腺病毒2型病毒液、犬狂犬病毒液、健康犬粪便、犬细小病毒阳性犬粪便、犬轮状病毒阳性犬粪便、犬冠状病毒病毒液等样品结果均为阴性，表明特异性良好。
3.1.3重复性研究
分别将CDV试剂盒用样品盘中样品、特异性检测用样品进行批间、批内重复性研究，结果：PEDV试剂盒的批间、批内重复性良好。
3.1.4保存期研究
分别将CDV试剂盒于4～25℃放置6、9、12、15、18、21、24、27个月进行灵敏度、特异性检测，结果：检测结果符合率均为100％，表明试剂盒可在4～25℃保存24个月甚至27个月。
3.1.5临床应用
将经病毒分离鉴定及RT-PCR鉴定为阳性200份、阴性200份临床样品用CDV试剂盒进行检测，结果(见表16)：CDV试剂盒检测总符合率为96％，远高于安捷CDV胶体金检测试纸条的检测结果；可代替操作耗时且繁琐、需要专门的技术人员、专门的仪器设备才能实现的病毒分离鉴定或RT-PCR检测方法进行临床的快速、准确的鉴定。
表16 CDV试剂盒与商品化胶体金检测试纸条检测临床样品的结果比较
Figure BDA0001988584750000311
3.2犬腺病毒量子点试纸条
3.2.1灵敏度检测
按实施例1、2制备犬腺病毒CAV量子点试纸条(标记抗体CAV-5G4，固定抗体CAV-1A1)并组装成CAV试剂盒，制备CAV1量子点试纸条(标记抗体CAV1-2F9，固定抗体CAV1-4F3)并组装成CAV1试剂盒，制备CAV2(标记抗体CAV2-4H12，固定抗体CAV2-1C5)量子点试纸条并组装成CAV2试剂盒，用犬腺病毒1型CAV1Utrecht株、犬腺病毒2型CAV2Toronto A26/61株(均源自ATCC)以及PCR鉴定的临床样品(含CAV1阳性粪便、CAV1阴性粪便、CAV2阳性眼鼻拭子、CAV2阴性眼鼻拭子)进行评价，并用商品化韩国安捷CAV-CDV胶体金试纸条、美国艾博CAV胶体金检测试纸条进行检测，结果(见表17)：CAV试剂盒检测犬腺病毒1型、犬腺病毒2型的灵敏度分别为102.8TCID50/ml、101.5TCID50/ml，CAV1试剂盒检测犬腺病毒1型的灵敏度为102.5TCID50/ml，CAV2试剂盒检测犬腺病毒2型的灵敏度为101.5TCID50/ml，均远高于商品化试纸条检测结果；且检测不同阳性、阴性的临床样品结果均准确，均未出现商品化试纸条检测的非特异性现象。
表17 CAV试剂盒与商品化胶体金检测试纸条检测结果比较
Figure BDA0001988584750000312
3.2.2特异性检测
将CAV试剂盒、CAV1试剂盒、CAV2试剂盒分别检测特异性样品，包括犬瘟热病毒液、犬细小病毒液、犬副流感病毒液、犬狂犬病毒液、健康犬粪便、犬细小病毒阳性犬粪便、犬轮状病毒阳性犬粪便、犬冠状病毒液等样品，结果均为阴性，表明特异性良好。
3.2.3重复性研究
将CAV试剂盒、CAV1试剂盒、CAV2试剂盒用样品盘中样品、特异性检测用样品进行批间、批内重复性研究，结果：批间、批内重复性良好。
3.2.4保存期研究
将CAV试剂盒、CAV1试剂盒、CAV2试剂盒于4～25℃放置6、9、12、15、18、21、24、27个月进行灵敏度、特异性检测，结果：检测结果符合率均为100％，表明试剂盒可在4～25℃保存24个月甚至27个月。
3.2.5临床应用
将收集的临床犬、狐狸病料用世纪元亨CAV PCR检测试剂盒按照说明书检测后获得193份临床样品(包括124份阳性含90份CAV-1阳性、24份CAV-2阳性、10份CAV-1与CAV-2双阳性，69份阴性)，用CAV试剂盒、CAV1试剂盒、CAV2试剂盒分别进行检测，并用商品化韩国安捷CAV-CDV胶体金试纸条、美国艾博CAV胶体金检测试纸条按照各自试剂盒说明书进行检测，结果(见表18～19)：CAV试剂盒、CAV1试剂盒、CAV2试剂盒检测总符合率分别为94％、95％、98％，远高于商品化试纸条的检测结果，可代替操作耗时且繁琐、需要专门的技术人员、专门的仪器设备才能实现PCR检测方法以进行临床的快速、准确的鉴定。
表18 CAV试剂盒与商品化胶体金检测试纸条检测临床样品结果比较
Figure BDA0001988584750000331
表19 CAV1试剂盒、CAV2试剂盒检测临床样品结果汇总
试剂盒 阳性/鉴定总阳性 阴性/鉴定总阴性 总符合率
CAV1试剂盒 90/100 103/93 95％
CAV2试剂盒 29/34 164/159 98％
3.3犬副流感病毒量子点试纸条
3.3.1灵敏度比较
按实施例1、2制备犬副流感病毒CPIV量子点试纸条(标记抗体CPIV-4H1，固定抗体CPIV-2B7)并组装成CPIV试剂盒，并用CPIV HeN0718株(Liu CH,et.al.Isolation andgenomic characterization of a canine parainfluenza virus type 5strain inChina.Archives of virology,2017,162(8):2337-2344)、D008株(源自ATCC)进行灵敏度检测，并对RT-PCR鉴定的临床样品(阳性眼鼻拭子、阴性眼鼻拭子、阳性鼻咽拭子、阴性鼻咽拭子)进行检测，同时用商品化上海快灵犬副流感病毒一步法胶体金快速检测试纸条进行比较，结果(见表20)：CPIV试剂盒检测不同毒株的灵敏度为102.5～102.8TCID50/μl，远高于商品化试纸条的检测结果，且检测阳性、阴性样品结果均准确，未出现商品化试纸条所出现的非特异性现象。
表20 CPIV试剂盒与商品化试纸条检测结果比较
Figure BDA0001988584750000341
3.3.2特异性检测
将CPIV试剂盒分别检测特异性样品，包括犬瘟热病毒液、犬细小病毒液、犬腺病毒1型病毒液、犬腺病毒2型病毒液、犬狂犬病毒液、健康犬粪便、犬细小病毒阳性犬粪便、犬轮状病毒阳性犬粪便、犬冠状病毒液等样品，结果均为阴性，表明特异性良好。
3.3.3重复性研究
将CPIV试剂盒用样品盘中样品、特异性检测用样品进行批间、批内重复性研究，结果：CPIV试剂盒的批间、批内重复性良好。
3.3.4保存期研究
将CPIV试剂盒于4～25℃放置6、9、12、15、18、21、24、27个月进行灵敏度、特异性检测，结果：检测结果符合率均为100％，表明试剂盒可在4～25℃保存24个月甚至27个月。
3.3.5临床应用
将收集的且经CPIV RT-PCR检测CPIV阳性64份、阴性38份临床病料用CPIV试剂盒进行检测，同时用商品化上海快灵犬副流感病毒一步法胶体金快速检测试纸条进行比较，结果(见表21)：CPIV试剂盒检测总符合率为91％，远优于商品化试纸条的检测结果，可代替操作耗时且繁琐、需要专门的技术人员、专门的仪器设备才能实现的RT-PCR检测方法以进行临床的快速、准确的鉴定。
表21 CPIV试剂盒检测临床样品结果汇总
试剂盒 阳性/鉴定总阳性 阴性/鉴定总阴性 总符合率
CPIV试剂盒 55/64 47/38 91％
快灵CPIV试纸条 31/64 71/38 68％
综上所述，本发明制备的量子点标记抗体封闭液、量子点标记抗体复溶液、固定抗体稀释液、样品处理液组合使用时检测样品不会引起非特异反应，而且样品处理液还可处理犬类动物多种动物疫病不同的靶标。特别地，本发明制备的犬用量子点试纸条组装的试剂盒检测灵敏度比商品化胶体金检测试纸条至少高50倍；保存期可延长至27个月，优于现有商品化人用量子点试纸条的(18个月)。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
序列表
<110> 北京中科基因技术有限公司
<120> 一种制备含量子点标记的抗犬病毒抗体免疫层析试纸条的方法、制备的试纸条及应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 351
<212> DNA
<213> 杂交瘤细胞5G4株(hybridoma cell strain 5G4)
<400> 1
gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag gttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacaa tttctggctt aaacattaag gacacctata tccactgggt gaagcagagg 120
cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg tttgatcctg tgaatgttaa tagtaaatat 180
gacccgaaat accagggcaa ggccactata acatcagaca catcctccaa cacagcctac 240
ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagaggaggt 300
aactctgcta tggactactg gggtcaagga agctcagtca ccgtctcctc a 351
<210> 2
<211> 321
<212> DNA
<213> 杂交瘤细胞5G4株(hybridoma cell strain 5G4)
<400> 2
gatgttgtga tgaccccgac tcccaaattc ctgcttgtgt cgccaggaga cagggttacc 60
ataacctgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtcg cttggtacca gcagaagcca 120
gggcagtctc ctaaattact gatatactat gcatcccatc gctacactgg agtccctgtt 180
cgcttcactg gcagtggata tgggacggat ttcactttca ccatcagcac tgtgcaggct 240
gaagacctgg caatttattt ctgtcagcag gattttgcct ctccgctcac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa a 321
<210> 3
<211> 360
<212> DNA
<213> 杂交瘤细胞1A1株(hybridoma cell strain 1A1)
<400> 3
gtttttgcgt ctggtgctca cggagaaggt gtgatgatcc gaactaccaa attcggaaaa 60
aggtcgccag gcgttcatct agtcgacatg aagatgtggg tgaactgggt gaaggaggct 120
ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggccgg ataaacacca acaatgaagt gtcaacatat 180
gctgaagagt tcaagggacg gtttgccttc tctttggaag cctctgccag cactgcctat 240
ttacagatca atgacctcac aaatgaagac tcggctacat atttctgtgc aagaatggac 300
agttcgggct acgtctggtt tacttactgg ggccaaggga ctcttgtcac tgtctctgca 360
<210> 4
<211> 321
<212> DNA
<213> 杂交瘤细胞1A1株(hybridoma cell strain 1A1)
<400> 4
gacactgtta tgacccagtc tcaaaaattc atatccacat caataggaga cagggtcagc 60
gtcacctgca cggccagtca gaatgtgggt acttttgttg tctggtatca acggaaatca 120
gggcaatctc ctaaagcact gatttattcg gcatcctacc ggtacagtgg agtccctgat 180
cgcttcacag gcagtggctc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgaagtct 240
gaagacttgg cagagtattt ctgtcagcaa tatgacagct atcctctgac gttcggtgga 300
ggtaccaagc tggaaatcaa a 321
<210> 5
<211> 351
<212> DNA
<213> 杂交瘤细胞2F9株(hybridoma cell strain 2F9)
<400> 5
cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60
tcctgcaagg cttctggttc taccttcaca gccttttcaa tgcactgggt gaagcaggct 120
ccaggagagg gtttaaagtg gatgggctgg atatacactg agactggtga gccaacatat 180
gcagatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccac cactgcctat 240
ttgcagatca acaacctcaa aagtgaggac acggctacat atttctgtag tagagagggg 300
gggacgtcgt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351
<210> 6
<211> 324
<212> DNA
<213> 杂交瘤细胞2F9株(hybridoma cell strain 2F9)
<400> 6
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct cctctactac acatcaagat tgcactcagg agtcccgtca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtgctaccc ttccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataga acgg 324
<210> 7
<211> 360
<212> DNA
<213> 杂交瘤细胞4F3株(hybridoma cell strain 4F3)
<400> 7
caggtgcaac tgaaggaatc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatt 60
acctgcgctg tctctgggtt ctcattaagc aactatgata taagttggaa tcgccagcca 120
ccaggaaagg gtctggagtg gcttggagta atatgggctg gtggacgtac agattataat 180
tccgctttca tgtccagact gagcatcagc aaggacaact ccaagagcca agttttctta 240
aaaatgaaca gtctgcaatc tgatgacaca gccatatatt actgtgtaag agaggggggg 300
ctctaccaag attacgacgg ggcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360
<210> 8
<211> 321
<212> DNA
<213> 杂交瘤细胞4F3株(hybridoma cell strain 4F3)
<400> 8
caaattgttc tcacccagtc tccaacaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
ataacctgca gtgccacctc aagtgtaagt tacatgcact ggttccagca gaagccaggc 120
acttctccca aactctggat ttatagcaca tccaacctgg cttctggagt cccttctcgc 180
ttcagtggca gtggatctgg gacctcttat tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattattg ccagcaaagg agtagttacc cacccacgtt cggagggggg 300
accaagctgg aaatgaaacg g 321
<210> 9
<211> 345
<212> DNA
<213> 杂交瘤细胞4H12株(hybridoma cell strain 4H12)
<400> 9
caggttcagc tgcagcagtc tggtgctgag ctggcgaggc ccggggcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg cttctggcta cgccttcact gactaccatt tacactgggt gaggcagagg 120
actggacagg gccttgagtg gattggcgag atttatcctg gaagtggtaa tgcttactac 180
aatgagaagt tcaaggccaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240
atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgttc aagaggatta 300
cctcttgact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctca 345
<210> 10
<211> 321
<212> DNA
<213> 杂交瘤细胞4H12株(hybridoma cell strain 4H12)
<400> 10
caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga ggagatcacc 60
ctaacctgca gtgccaggtc gagtgtaact tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120
acttctccca aactcttgat ttatagcaca tccaacctgg cttctggagt cccttctcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gaccttttat tctctcacaa tcagcagtgt ggaggctgaa 240
gatgctgccg attattactg ccatcagtgg agtagttatc catgcacgtt cggagggggg 300
accaagctgg aaataaaacg g 321
<210> 11
<211> 348
<212> DNA
<213> 杂交瘤细胞1C5株(hybridoma cell strain 1C5)
<400> 11
gaagtgcagt tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaggc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caatttcagt tggaatgcca tgtcttgggc tcgccagtct 120
ccagagaaga ggctggagtg gatcgcagaa attagtagta gtggtagtta cacctactat 180
ccagacactg tgacgggcca attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240
ctggaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt attactgtac aatgtgtggt 300
tacgacgcgg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348
<210> 12
<211> 318
<212> DNA
<213> 杂交瘤细胞1C5株(hybridoma cell strain 1C5)
<400> 12
caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt ttcatgtact ggtaccacca gaagccagga 120
tcctccccca gactcctgat ttatgacaca tccaacctgg cttctggagt ccctgttcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgag 240
gatgctgcca cttattactg ccaccaatgg aatacttacc cacggacgtt cggtggaggc 300
accaagctgg aaatcaaa 318
<210> 13
<211> 351
<212> DNA
<213> 杂交瘤细胞4H1株(hybridoma cell strain 4H1)
<400> 13
gaggtgcagc ttgttgagac tggtggagga ttggtgcagc ctaaagggtc attgaaactc 60
tcatgtgcag cctcacctat actagtcgac atgaagatgt gggtgaactg ggtccgccag 120
gctccaggaa agggtttgga atgggttgct cgcataagaa gtaaaagtaa taattatgca 180
acatattatg ccgattcagt gaaagacagg ttcaccatct ccagagatga ttcacaaagc 240
atggtctatc tgcaaatgaa caacttgaaa actgaggaca cagccatgta ttactgtgtg 300
agagaagctc tctactactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351
<210> 14
<211> 336
<212> DNA
<213> 杂交瘤细胞4H1株(hybridoma cell strain 4H1)
<400> 14
gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acagagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgtaga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagttc acatgttcct 300
ccgacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336
<210> 15
<211> 348
<212> DNA
<213> 杂交瘤细胞2B7株(hybridoma cell strain 2B7)
<400> 15
gaggtgcagc ttgttgagac tggtggagga ttggtgcagc ctaaagggtc attgaaactc 60
tcatgtgcag cctctttact agtcgacatg aagatgtggg tgaactgggt ccgccaggct 120
ccaggaaagg ttttggaatg ggttgctcgc ataagaagta aaagtaataa ttatgcaaca 180
tattatgccg attcagtgaa agacaggttc accatctcca gagatgattc acaaagcatg 240
ctctatcttc aaatgaacaa cttgaaaact gaggacacag ccatgtatta ctgtgtgaga 300
gaagctctct actactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348
<210> 16
<211> 336
<212> DNA
<213> 杂交瘤细胞2B7株(hybridoma cell strain 2B7)
<400> 16
gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120
ttcctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acagagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcggt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcggagtgg ggactgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagttc acatgttcct 300
ccgacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaag 336

Claims (10)

1.一种制备含量子点标记的抗犬病毒抗体免疫层析试纸条的方法，其中，所述方法包括：
步骤(1)用最大吸收峰为500～700nm的量子点标记所述抗犬病毒抗体，所述量子点与所述抗犬病毒抗体摩尔比为1:1～1:150，得到所述所述量子点标记的抗犬病毒抗体；
步骤(2)将所述步骤(1)中的所述量子点标记的抗犬病毒抗体进行封闭，所述量子点标记抗体封闭液包含pH7.4的0.1M PBS、0.2％～0.8％W/V BSA，得到封闭的量子点标记的抗犬病毒抗体；
步骤(3)将所述步骤(2)中的所述封闭的量子点标记的抗犬病毒抗体进行复溶，所述量子点标记抗体复溶液包含pH7.4的0.1M PBS、0.4％～2.0％W/V海藻糖、0.02％V/V Tween-20、0.02％V/V Proclin300，得到复溶的量子点标记的抗犬病毒抗体；
步骤(4)将所述步骤(3)中的所述复溶量子点标记的抗犬病毒抗体吸附于量子点标记垫上，所述吸附的量子点标记的抗犬病毒抗体浓度为5～150μg/ml；以及
步骤(5)将固定抗体用固定抗体稀释液稀释，所述固定抗体稀释液包含pH7.4的0.1MPBS、0.5％W/V蔗糖、0.1％～1.0％W/VPEG 6000，所述固定抗体稀释至0.2～1.0mg/ml，然后固定于检测线上，质控线上固定羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(1)中所述抗犬病毒抗体为犬细小病毒单克隆抗体、犬瘟热病毒单克隆抗体、犬腺病毒单克隆抗体、犬腺病毒1型单克隆抗体、犬腺病毒2型单克隆抗体、或犬副流感病毒单克隆抗体，所述量子点最大吸收峰为520～660nm，所述量子点与所述抗犬病毒抗体摩尔比为1:5～1:100；优选地，所述量子点最大吸收峰为520～625nm，所述量子点与所述抗犬病毒抗体摩尔比为1:5～1:20；最优选地，所述量子点最大吸收峰为520～565nm。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(1)中所述抗犬病毒抗体为犬细小病毒单克隆抗体CPV-10B11，所述犬细小病毒单克隆抗体CPV-10B11由保藏号为CCTCC No:C201578的小鼠骨髓杂交瘤细胞10B11株分泌；或为犬瘟热病毒单克隆抗体CDV-1G5，所述犬瘟热病毒单克隆抗体CDV-1G5由保藏号为CCTCC No：C2015201的小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5分泌；或为犬腺病毒单克隆抗体CAV-5G4，所述犬腺病毒单克隆抗体CAV-5G4重链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.1或其简并序列所示、轻链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.2或其简并序列所示；或为犬腺病毒1型单克隆抗体CAV1-2F9，所述犬腺病毒1型单克隆抗体CAV1-2F9其重链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.5或其简并序列所示、轻链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.6或其简并序列所示；或为犬腺病毒2型单克隆抗体CAV2-4H12，所述犬腺病毒2型单克隆抗体CAV2-4H12重链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.9或其简并序列所示、轻链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.10或其简并序列所示；或为犬副流感病毒单克隆抗体CPIV-4H1，所述犬副流感病毒单克隆抗体CPIV-4H1重链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.13或其简并序列所示、轻链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.14或其简并序列所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(2)中所述量子点标记抗体封闭液包含pH7.4的0.1M PBS、0.2％～0.8％W/V BSA，0.02％W/V海藻糖。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(4)中所述吸附的量子点标记的抗犬病毒抗体浓度为10～100μg/ml；所述量子点标记垫为玻璃纤维膜或聚酯膜。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(5)中所述固定抗体为犬细小病毒抗体、犬瘟热病毒抗体、犬腺病毒1型抗体、犬腺病毒2型抗体、或犬副流感病毒抗体；所述羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗浓度为0.4～2.5mg/ml。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(5)中所述固定抗体为犬细小病毒单克隆抗体CPV-10H4，所述犬细小病毒单克隆抗体CPV-10H4由保藏号为CCTCC No:C201579的小鼠骨髓杂交瘤细胞10H4株分泌；或为犬瘟热病毒单克隆抗体CDV-6E11，所述犬瘟热病毒单克隆抗体CDV-6E11由保藏号为CCTCC No：C2015202的小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株分泌；或为犬腺病毒单克隆抗体CAV-1A1，所述犬腺病毒单克隆抗体CAV-1A1重链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.3或其简并序列所示、轻链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.4或其简并序列所示；或为犬腺病毒1型单克隆抗体CAV1-4F3，所述犬腺病毒1型单克隆抗体CAV1-4F3重链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.7或其简并序列所示、轻链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.8或其简并序列所示；或为犬腺病毒2型单克隆抗体CAV2-1C5，所述犬腺病毒2型单克隆抗体CAV2-1C5重链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.11或其简并序列所示、轻链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.12或其简并序列所示；或为犬副流感病毒单克隆抗体CPIV-2B7，所述犬副流感病毒单克隆抗体CPIV-2B7重链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.15或其简并序列所示、轻链可变区核苷酸序列如SEQ.ID No.16或其简并序列所示。
8.根据权利要求1～7所述方法制备的含量子点标记的抗犬病毒抗体免疫层析试纸条。
9.一种试剂盒，其中，所述试剂盒包含权利要求8所述的含量子点标记的抗犬病毒抗体免疫层析试纸条和样品处理液；所述样品处理液包含pH7.4的0.1M PBS、0.5％W/V Triton-X 100、0.05％～0.25％W/V EDTA、0.02％V/V Proclin300。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中，所述样品处理液为处理的抗原病毒液、粪便、血清、微生物拭子(含眼鼻拭子、鼻咽拭子、泄殖拭子)、研磨后的组织样品的样品处理液。
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