CN104122397A - 超敏c反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒及其检测方法，包括HS-CRP反应板，HS-CRP检测缓冲液，HS-CRP ID芯片；所述的HS-CRP检测缓冲液是指含荧光标记的小鼠抗人HS-CRP的单克隆抗体和含荧光标记的羊抗兔IgG；所述的HS-CRP反应板包括吸水纸，硝酸纤维素膜，样品垫，PVC底板，小鼠抗人CRP的单克隆抗体，兔IgG。其目的是提供一种特异性强，灵敏度高，获得检测结果的时间短，操作方式简便，检测结果准确可靠的超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒及其检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定血清的试剂盒及其测试方法，尤其是超敏C反应蛋白(HS-CRP)荧光免疫层析法定量测定试剂盒及其检测方法。
背景技术
C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)因其能和肺炎双球菌的细胞壁的C多糖起沉淀反应而得名，是相对分子质量为115-140KD的血清β球蛋白。CRP持续增高提示机体存在慢性炎症或自身免疫疾病，CRP在病毒感染时不会升高，其变化不受患者的个体差异、机体状态和治疗药物的影响。近年来，随着检测技术的进步，采用超敏感方法检测到的CRP被称为超敏CRP。大量的文章研究显示，它在冠心病、中风、周围血管栓塞等疾病诊断和预测中发挥越来越重要的作用，甚至被认为是心血管病危险评估的“金标准”。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性强，灵敏度高，获得检测结果的时间短，操作方式简便，检测结果准确可靠的超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒及其检测方法。
本发明的超敏C反应蛋白(HS-CRP)荧光免疫层析法检测试剂盒，包括HS-CRP反应板，HS-CRP检测缓冲液，HS-CRP ID芯片；所述的HS-CRP检测缓冲液是指含荧光标记的小鼠抗人HS-CRP的单克隆抗体和含荧光标记的羊抗兔IgG；所述的HS-CRP反应板包括吸水纸，硝酸纤维素膜，样品垫，PVC底板，小鼠抗人CRP的单克隆抗体，兔IgG；
所述HS-CRP反应板采用如下步骤制成：
(1)、取3.44gNa2HPO4H2O，100g蔗糖，2.1g吐温20(TWEEN-20)，10gPVPK-30，全部加入1L烧瓶中，再向加入1L烧瓶中800ml纯化水，充分搅拌混匀；
(2)、向加入1L烧瓶中加入盐酸或氢氧化钠溶液调pH，控制pH在7.40-7.45范围内，定容至1000ml；
(3)、取20ml步骤(2)得到的液体，加入到50ml烧杯中，再向50ml烧杯中加入4mg小鼠抗人CRP抗体，编号AB2，使抗体的终浓度为0.2mg/ml；
(4)、取20ml步骤(2)得到的液体，加入到另一个50ml烧杯中，加入6mg兔IgG，使兔IgG终浓度为0.3mg/ml；
(5)、取硝酸纤维素膜(NC膜)，将其裁剪为宽为2.5cm的长条，长条的一端设定为A端，另一端设定为B端，将步骤(3)制得的液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，在距A端1.4cm处划线即为检测线；将步骤(4)制得的液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，在距A端1.1cm处划线即为质控线；
(6)、将步骤(5)制备的硝酸纤维素膜(NC膜)在37度下干燥至少2小时，干燥环境湿度恒定在20％以下；
(7)、将硝酸纤维素膜(NC膜)的非点样面粘帖在PVC底板上，将样品垫裁剪为2cm宽的长条，粘帖于B端的PVC底板上，覆盖硝酸纤维素膜(NC膜)B端2mm，将吸收垫裁剪为1.8cm宽的长条，粘帖于A端的PVC底板上，覆盖硝酸纤维素膜(NC膜)A端约5mm，用滚刷轻压已粘帖好的检测版；
(8)、用剪切机从A端到B端裁剪为3mm宽的检测条，装壳，并将壳与干燥剂一同放入铝箔袋，抽真空并封口，即得HS-CRP反应板；
所述HS-CRP检测缓冲液采用如下步骤制成：
(1)、准备1mg含荧光标记的小鼠抗人CRP的单克隆抗体，编号AB1，使用Sephadex G25层析柱用0.2M NaHCO3 pH9.0溶液进行脱盐处理，收集脱盐液2.5ml，将其浓缩为2ml，终浓度为1mg/ml；
(2)、用0.2M NaHCO3PH9.0溶液配置0.5mg/ml的Alexa Fluor610溶液，并将其转移到棕色玻璃瓶中；
(3)、按照以下公式计算需要加入的0.5mg/ml的Alexa Fluor610的体积
抗体量(mg)X0.102(ml/mg)＝0.5mg/ml Alexa Fluor610的体积，
此处需要加入0.102ml Alexa Fluor610
(4)、在室温下搅拌混匀16小时；
(5)、使用Sephadex G25层析柱用0.2M NaHCO3pH9.0溶液对步骤(4)制备的液体进行脱盐处理，将收集液用0.2MM滤器过滤后收集于棕色玻璃瓶中，共2.5ml，得到1号过滤液；
(6)、准备1mg含荧光标记的羊抗兔IgG，编号AB2，使用Sephadex G25层析柱用0.2MNaHCO3pH9.0溶液进行脱盐处理，收集脱盐液2.5ml，将其浓缩为2ml；终浓度为1mg/ml；
(7)、用0.2M NaHCO3 PH9.0溶液配置0.5mg/ml的Alexa Fluor610溶液，并将其转移到棕色玻璃瓶中；
(8)、按照以下公式计算需要加入的0.5mg/ml的Alexa Fluor610的体积
抗体量(mg)X0.102(ml/mg)＝0.5mg/ml Alexa Fluor610的体积，
此处需要加入0.102ml Alexa Fluor610
(9)、在室温下搅拌混匀16小时；
(10)、使用Sephadex G25层析柱用0.2M NaHCO3 pH9.0溶液对步骤(9)制备的液体进行脱盐处理，将收集液用0.2MM滤器过滤后收集于棕色玻璃瓶中，共2.5ml，得到二号过滤液；
(11)、配置100ml0.01M的pH7.2的PBS，然后向PBS中添加2g的BSA，向PBS中添加0.3g的吐温20(TWEEN-20)，向PBS中添加0.04g的casein，得到制备液；
(12)、将步骤(5)所得的液体按照1份一号过滤液：1500份制备液的比例添加到步骤(11)制备的液体中，将步骤(10)所得的液体按照1份二号过滤液：500份制备液的比例添加到步骤(11)制备的液体中，即得HS-CRP检测缓冲液。
所述的HS-CRP ID芯片采用以下步骤制成：
将HS-CRP标准曲线，质控及批号信息用读写器通过读写软件写入外购的ID芯片，即得HS-CRP ID芯片。
本发明的超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒，其中所述HS-CRP ID芯片中所存储的标准曲线中各标准点的浓度分别为0、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0μg/ml。
本发明的超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒，其中所述室温的温度为20℃-24℃。
本发明的超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
1)、将10μl的样本加入500μl的所述检测缓冲液中，充分混匀；
2)、取60μl混合液，加入到HS-CRP反应板的测试区，反应3分钟；
3)、将HS-CRP反应板放入荧光检测仪中，插入ID卡，仪器自动测量并出结果报告。
本发明的超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒及其检测方法，包括HS-CRP反应板，HS-CRP检测缓冲液，HS-CRP ID芯片；所述的HS-CRP检测缓冲液是指含荧光标记的小鼠抗人HS-CRP的单克隆抗体和含荧光标记的羊抗兔IgG；所述的HS-CRP反应板包括吸水纸，硝酸纤维素膜，样品垫，PVC底板，小鼠抗人CRP的单克隆抗体，兔IgG；通过上千例的大量实验表明，本发明的超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒及其检测方法，具有特异性强，灵敏度高，获得检测结果的时间短，操作方式简便，检测结果极其准确可靠(实验中的准确率高达100％)的特点，具有突出的实质性特点和显著的进步。
下面对本发明的超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒及其检测方法作进一步详细说明。
具体实施方式
本发明的超敏C反应蛋白(HS-CRP)荧光免疫层析法检测试剂盒，包括HS-CRP反应板，HS-CRP检测缓冲液，HS-CRP ID芯片；所述的HS-CRP检测缓冲液是指含荧光标记的小鼠抗人HS-CRP的单克隆抗体和含荧光标记的羊抗兔IgG；所述的HS-CRP反应板包括吸水纸，硝酸纤维素膜，样品垫，PVC底板，小鼠抗人CRP的单克隆抗体，兔IgG；
所述HS-CRP反应板采用如下步骤制成：
(1)、取3.44gNa2HPO4H2O，100g蔗糖，2.1g吐温20(TWEEN-20)，10gPVPK-30，全部加入1L烧瓶中，再向加入1L烧瓶中800ml纯化水，充分搅拌混匀；
(2)、向加入1L烧瓶中加入盐酸或氢氧化钠溶液调pH，控制pH在7.40-7.45范围内，定容至1000ml；
(3)、取20ml步骤(2)得到的液体，加入到50ml烧杯中，再向50ml烧杯中加入4mg小鼠抗人CRP抗体，编号AB2，使抗体的终浓度为0.2mg/ml；
(4)、取20ml步骤(2)得到的液体，加入到另一个50ml烧杯中，加入6mg兔IgG，使兔IgG终浓度为0.3mg/ml；
(5)、取硝酸纤维素膜(NC膜)，将其裁剪为宽为2.5cm的长条，长条的一端设定为A端，另一端设定为B端，将步骤(3)制得的液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，在距A端1.4cm处划线即为检测线；将步骤(4)制得的液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，在距A端1.1cm处划线即为质控线；
(6)、将步骤(5)制备的硝酸纤维素膜(NC膜)在37度下干燥至少2小时，干燥环境湿度恒定在20％以下；
(7)、将硝酸纤维素膜(NC膜)的非点样面粘帖在PVC底板上，将样品垫裁剪为2cm宽的长条，粘帖于B端的PVC底板上，覆盖硝酸纤维素膜(NC膜)B端2mm，将吸收垫裁剪为1.8cm宽的长条，粘帖于A端的PVC底板上，覆盖硝酸纤维素膜(NC膜)A端约5mm，用滚刷轻压已粘帖好的检测版；
(8)、用剪切机从A端到B端裁剪为3mm宽的检测条，装壳，并将壳与干燥剂一同放入铝箔袋，抽真空并封口，即得HS-CRP反应板；
所述HS-CRP检测缓冲液采用如下步骤制成：
(1)、准备1mg含荧光标记的小鼠抗人CRP的单克隆抗体，编号AB1，使用Sephadex G25层析柱用0.2M NaHCO3pH9.0溶液进行脱盐处理，收集脱盐液2.5ml，将其浓缩为2ml，终浓度为1mg/ml；
(2)、用0.2M NaHCO3PH9.0溶液配置0.5mg/ml的Alexa Fluor610溶液，并将其转移到棕色玻璃瓶中；
(3)、按照以下公式计算需要加入的0.5mg/ml的Alexa Fluor610的体积
抗体量(mg)X0.102(ml/mg)＝0.5mg/ml Alexa Fluor610的体积，
此处需要加入0.102ml Alexa Fluor610
(4)、在室温下搅拌混匀16小时；
(5)、使用Sephadex G25层析柱用0.2M NaHCO3 pH9.0溶液对步骤(4)制备的液体进行脱盐处理，将收集液用0.2MM滤器过滤后收集于棕色玻璃瓶中，共2.5ml，得到1号过滤液；
(6)、准备1mg含荧光标记的羊抗兔IgG，编号AB2，使用Sephadex G25层析柱用0.2MNaHCO3pH9.0溶液进行脱盐处理，收集脱盐液2.5ml，将其浓缩为2ml；终浓度为1mg/ml；
(7)、用0.2M NaHCO3PH9.0溶液配置0.5mg/ml的Alexa Fluor610溶液，并将其转移到棕色玻璃瓶中；
(8)、按照以下公式计算需要加入的0.5mg/ml的Alexa Fluor610的体积
抗体量(mg)X0.102(ml/mg)＝0.5mg/ml Alexa Fluor610的体积，
此处需要加入0.102ml Alexa Fluor610
(9)、在室温下搅拌混匀16小时；
(10)、使用Sephadex G25层析柱用0.2M NaHCO3 pH9.0溶液对步骤(9)制备的液体进行脱盐处理，将收集液用0.2MM滤器过滤后收集于棕色玻璃瓶中，共2.5ml，得到二号过滤液；
(11)、配置100ml0.01M的pH7.2的PBS，然后向PBS中添加2g的BSA，向PBS中添加0.3g的吐温20(TWEEN-20)，向PBS中添加0.04g的casein，得到制备液；
(12)、将步骤(5)所得的液体按照1份一号过滤液：1500份制备液的比例添加到步骤(11)制备的液体中，将步骤(10)所得的液体按照1份二号过滤液：500份制备液的比例添加到步骤(11)制备的液体中，即得HS-CRP检测缓冲液。
所述的HS-CRP ID芯片采用以下步骤制成：
将HS-CRP标准曲线，质控及批号信息用读写器通过读写软件写入外购的ID芯片，即得HS-CRP ID芯片。
所述HS-CRP ID芯片中所存储的标准曲线中各标准点的浓度分别为0、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0μg/ml。
上述室温的温度为20℃-24℃。
本发明的超敏C反应蛋白(HS-CRP)荧光免疫层析法检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
1)、将10μl的样本加入500μl的所述检测缓冲液中，充分混匀；
2)、取60μl混合液，加入到HS-CRP反应板的测试区，反应3分钟；
3)、将HS-CRP反应板放入荧光检测仪中，插入ID卡，仪器自动测量并出结果报告。
Claims (4)
1.超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒，其特征在于：包括HS-CRP反应板，HS-CRP检测缓冲液，HS-CRP ID芯片；所述的HS-CRP检测缓冲液是指含荧光标记的小鼠抗人HS-CRP的单克隆抗体和含荧光标记的羊抗兔IgG；所述的HS-CRP反应板包括吸水纸，硝酸纤维素膜，样品垫，PVC底板，小鼠抗人CRP的单克隆抗体，兔IgG；
所述HS-CRP反应板采用如下步骤制成：
(1)、取3.44gNa2HPO4H2O，100g蔗糖，2.1g吐温20(TWEEN-20)，10gPVPK-30，全部加入1L烧瓶中，再向加入1L烧瓶中800ml纯化水，充分搅拌混匀；
(2)、向加入1L烧瓶中加入盐酸或氢氧化钠溶液调pH，控制pH在7.40-7.45范围内，定容至1000ml；
(3)、取20ml步骤(2)得到的液体，加入到50ml烧杯中，再向50ml烧杯中加入4mg小鼠抗人CRP抗体，编号AB2，使抗体的终浓度为0.2mg/ml；
(4)、取20ml步骤(2)得到的液体，加入到另一个50ml烧杯中，加入6mg兔IgG，使兔IgG终浓度为0.3mg/ml；
(5)、取硝酸纤维素膜(NC膜)，将其裁剪为宽为2.5cm的长条，长条的一端设定为A端，另一端设定为B端，将步骤(3)制得的液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，在距A端1.4cm处划线即为检测线；将步骤(4)制得的液体装入划膜机，设定划线量为1μl/cm，在距A端1.1cm处划线即为质控线；
(6)、将步骤(5)制备的硝酸纤维素膜(NC膜)在37度下干燥至少2小时，干燥环境湿度恒定在20％以下；
(7)、将硝酸纤维素膜(NC膜)的非点样面粘帖在PVC底板上，将样品垫裁剪为2cm宽的长条，粘帖于B端的PVC底板上，覆盖硝酸纤维素膜(NC膜)B端2mm，将吸收垫裁剪为1.8cm宽的长条，粘帖于A端的PVC底板上，覆盖硝酸纤维素膜(NC膜)A端约5mm，用滚刷轻压已粘帖好的检测版；
(8)、用剪切机从A端到B端裁剪为3mm宽的检测条，装壳，并将壳与干燥剂一同放入铝箔袋，抽真空并封口，即得HS-CRP反应板；
所述HS-CRP检测缓冲液采用如下步骤制成：
(1)、准备1mg含荧光标记的小鼠抗人CRP的单克隆抗体，编号AB1，使用Sephadex G25层析柱用0.2M NaHCO3 pH9.0溶液进行脱盐处理，收集脱盐液2.5ml，将其浓缩为2ml，终浓度为1mg/ml；
(2)、用0.2M NaHCO3 PH9.0溶液配置0.5mg/ml的Alexa Fluor610溶液，并将其转移到棕色玻璃瓶中；
(3)、按照以下公式计算需要加入的0.5mg/ml的Alexa Fluor610的体积
抗体量(mg)X0.102(ml/mg)＝0.5mg/ml Alexa Fluor610的体积，
此处需要加入0.102ml Alexa Fluor610
(4)、在室温下搅拌混匀16小时；
(5)、使用Sephadex G25层析柱用0.2M NaHCO3pH9.0溶液对步骤(4)制备的液体进行脱盐处理，将收集液用0.2MM滤器过滤后收集于棕色玻璃瓶中，共2.5ml，得到1号过滤液；
(6)、准备1mg含荧光标记的羊抗兔IgG，编号AB2，使用Sephadex G25层析柱用0.2MNaHCO3pH9.0溶液进行脱盐处理，收集脱盐液2.5ml，将其浓缩为2ml；终浓度为1mg/ml：
(7)、用0.2M NaHCO3PH9.0溶液配置0.5mg/ml的Alexa Fluor610溶液，并将其转移到棕色玻璃瓶中；
(8)、按照以下公式计算需要加入的0.5mg/ml的Alexa Fluor610的体积
抗体量(mg)X0.102(ml/mg)＝0.5mg/ml Alexa Fluor610的体积，
此处需要加入0.102ml Alexa Fluor610
(9)、在室温下搅拌混匀16小时；
(10)、使用Sephadex G25层析柱用0.2M NaHCO3pH9.0溶液对步骤(9)制备的液体进行脱盐处理，将收集液用0.2MM滤器过滤后收集于棕色玻璃瓶中，共2.5ml，得到二号过滤液；
(11)、配置100ml0.01M的pH7.2的PBS，然后向PBS中添加2g的BSA，向PBS中添加0.3g的吐温20(TWEEN-20)，向PBS中添加0.04g的casein，得到制备液；
(12)、将步骤(5)所得的液体按照1份一号过滤液：1500份制备液的比例添加到步骤(11)制备的液体中，将步骤(10)所得的液体按照1份二号过滤液：500份制备液的比例添加到步骤(11)制备的液体中，即得HS-CRP检测缓冲液。
所述的HS-CRPID芯片采用以下步骤制成：
将HS-CRP标准曲线，质控及批号信息用读写器通过读写软件写入外购的ID芯片，即得HS-CRP ID芯片。
2.按照权利要求1所述的超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒，其特征在于：所述HS-CRP ID芯片中所存储的标准曲线中各标准点的浓度分别为0、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0μg/ml。
3.按照权利要求2所述的超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒，其特征在于：所述室温的温度为202-24℃。
4.如权利要求1或2或3所述的超敏C反应蛋白荧光免疫层析法检测试剂盒的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)、将10μl的样本加入500μl的所述检测缓冲液中，充分混匀；
2)、取60μl混合液，加入到HS-CRP反应板的测试区，反应3分钟；
3)、将HS-CRP反应板放入荧光检测仪中，插入ID卡，仪器自动测量并出结果报告。
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