CN111308064A - 一种提升免疫层析标记物灵敏度的方法及在白介素6检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提升免疫层析标记物灵敏度的方法，将抗体与荧光微球偶联得到抗体‑荧光微球偶联物，将抗体‑荧光微球偶联物再次与荧光微球偶联，得到的增强型抗体‑荧光微球偶联物作为免疫层析标记物。该方法通过将已标记好的抗体‑荧光微球偶联物再次偶联，使同一个抗体能携带更多的荧光微球，大大提升检测线上的荧光物质强度，提高试剂灵敏度。本发明还公开该方法白介素6检测中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及免疫层析技术领域，具体涉及一种提升免疫层析标记物灵敏度的方法及在白介素6检测中的应用。
背景技术
免疫层析技术，也称测流免疫法(Lateral flow immunoassay)，起源于上世纪80年代，是建立在层析膜上以抗原抗体特异性反应为基础的免疫检测技术，以其快捷简便、间隔低廉、灵敏度高等优势而广泛运用于并于病原体检测、食品安全测量、环境监测等方面，其中以胶体金免疫层析技术发展最为成熟，但多局限于定性或半定量检测。伴随着材料科学和生物工程技术的蓬勃发展，新型荧光层析技术已逐渐在定量检测领域站稳脚跟。在当前的荧光层析研究中，提升荧光物质标记灵敏度是提升产品性能的关键点。
当前的抗体-荧光微球偶联一般采用化学偶联，先将微球表面基团(一般是羧基)活化，加入抗体，抗体的氨基与活化后的羧基结合，固定至微球表面，再使用惰性蛋白(一般是BSA)进行将微球表面空位进行封闭。荧光层析的标记灵敏度低是普遍存在的痛点。灵敏度由捕获在检测线上的荧光物质强度所决定，而现有的抗体-荧光微球偶联技术，通常都是很多个抗体对应一个荧光微球，因此检测线在捕获抗体-荧光微球偶联物时，捕获很多抗体才能有一个荧光微球的荧光强度。
IL-6主要由巨噬细胞、T细胞、B细胞等多种细胞产生，是一种多功能的细胞因子，调节免疫应答、血细胞生成、组织损伤时的急性时相反应、炎症反应等。在心脑血管疾病、肾脏疾病、肿瘤、关节炎、创伤、感染等疾病发生时，IL-6水平增高。IL-6上升的水平与疾病的活动期、肿瘤的发展变化、排斥反应程度以及治疗效果都密切相关。因此，对病人体液中IL-6水平的检测可反映患者的病情变化。罗氏白介素6检测试剂盒参考值范围＜7pg/ml，最低检出限＜2pg/ml，是一个对试剂灵敏度要求很高的项目。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明公开一种提升免疫层析标记物灵敏度的方法，该方法通过将已标记好的抗体-荧光微球偶联物再次偶联，使同一个抗体能携带更多的荧光微球，大大提升检测线上的荧光物质强度，提高试剂灵敏度。本发明还公开该方法白介素6检测中的应用。
本发明通过下述技术方案实现：
一种提升免疫层析标记物灵敏度的方法，将抗体与荧光微球偶联得到抗体-荧光微球偶联物，将抗体-荧光微球偶联物再次与荧光微球偶联，得到的增强型抗体-荧光微球偶联物作为免疫层析标记物。
现有的抗体-荧光微球偶联技术，通常都是很多个抗体对应一个荧光微球，因此检测线在捕获抗体-荧光微球复合物时，捕获很多抗体才能有一个荧光微球的荧光强度。
本发明通过将已标记好的抗体-荧光微球复合物再次偶联，使同一个抗体能携带更多的荧光微球，大大提升检测线上的荧光物质强度，提高试剂灵敏度。
一种提升免疫层析标记物灵敏度的方法在白介素6检测中的应用，标记物的制备方法如下：
(1)将抗IL-6单克隆抗体(抗IL-6单克隆抗体1)与荧光微球偶联，得到IL-6抗体-荧光微球偶联物；
(2)将IL-6抗体-荧光微球偶联物再次与荧光微球偶联，得到增强型IL-6抗体-荧光微球偶联物。
其中，步骤(1)中，IL-6抗体-荧光微球偶联物的制备方法如下：
(11)取出荧光微球放入离心管中离心，沉降、去除上清；
(12)向沉降物中加入偶联缓冲液，混匀，然后加入EDC溶液、sulfo-NHS溶液混匀、孵育；
(13)将步骤(12)的溶液离心，沉降、去除上清，再加入偶联缓冲液混匀；
(14)加入抗IL-6单克隆抗体，混匀，室温下用孵育，得到IL-6抗体-荧光微球偶联物。
进一步的，步骤(2)中，增强型IL-6抗体-荧光微球偶联物的制备方法如下：
(21)重复步骤(11)、(12)，处理后的荧光微球与已经偶联孵育完成的IL-6抗体-荧光微球偶联物等比例混合，室温下孵育；
(22)孵育完毕后离心，沉降、去除上清，然后加入封闭液混匀，孵育；
(23)最后离心、沉降、去除上清，加入保存液混匀。
进一步的，白介素6检测在荧光层析检测试纸条上进行，荧光层析检测试纸条包括基板和基板上依次衔接的样品垫、标记物垫、层析膜和吸水垫，所述标记物垫为玻纤垫，所述层析膜为硝酸纤维素膜。
进一步的，所述玻纤垫经过如下处理：
将处理液喷涂于玻纤垫一侧，然后将增强型IL-6抗体-荧光微球偶联物和兔IgG-荧光微球偶联物的混合液喷涂于玻纤另一侧，37℃烘干。
进一步的，所述硝酸纤维素膜经过如下处理：将另一种抗IL-6抗体(抗IL-6单克隆抗体2)，使用稀释液稀释至1mg/mL，划线于纤维素膜上一侧作为检测线；将羊抗兔IgG使用稀释液稀释至0.5mg/mL，划线于纤维素膜上作为质控线，37℃烘干24h。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明一种提升免疫层析标记物灵敏度的方法，通过将已标记好的抗体-荧光微球复合物再次偶联，使同一个抗体能携带更多的荧光微球，大大提升检测线上的荧光物质强度，提高试剂灵敏度；
2、本发明一种提升免疫层析标记物灵敏度的方法在白介素6检测中的应用，将已标记好的IL-6抗体-荧光微球复合物再次偶联，得到增强型IL-6抗体-荧光微球复合物，使同一个IL-6抗体能携带更多的荧光微球，大大提升检测线上的荧光信号强度，提高试剂灵敏度和检测灵敏度。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为本发明增强型抗体-荧光微球偶联物示意图，图中
表示抗体。
图2为本发明IL-6检测结果示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1
一种提升免疫层析标记物灵敏度的方法在白介素6检测中的应用，标记物的制备方法如下：
1.取出500ul荧光微球(1％浓度W/V，绿色荧光-激发475nm-发射525nM)放入离心管中。
2.离心(根据不同的粒径选择12000rpm-20000rpm转速)10min，使微球沉降，去除上清。
3.加入500ul偶联缓冲液(50mM MES ph6.0)，混匀。
4.加入20ul EDC溶液(200mM)，20ul sulfo-NHS溶液(200mM)，混匀，并在转盘混匀器上孵育30min。
5.离心(根据不同的粒径选择12000rpm-20000rpm转速)10min，使微球沉降，去除上清。
6.加入500ul偶联缓冲液(50mM MES ph6.0)，混匀后加入0.1mg抗IL-6单克隆抗体，混匀，室温下用转盘混匀器孵育1h。
7.重复步骤1-4.
8.将用EDC、NHS处理后的荧光微球与已经偶联孵育完成的荧光微球等比例混合，室温下用转盘混匀器孵育1h。
9.离心(根据不同的粒径选择12000rpm-20000rpm转速)10min，使微球沉降，去除上清。
10.加入封闭液(1％BSA水溶液)，混匀，室温下用转盘混匀器孵育1h。
11.离心(根据不同的粒径选择12000rpm-20000rpm转速)10min，使微球沉降，去除上清。
12.加入500ul保存液(1％BSA，1％蔗糖，Tirs-HCl ph 9.0)，混匀，产物如图1所示。
实施例2
一种提升免疫层析标记物灵敏度的方法在白介素6检测中的应用，标记物的制备方法如下：
1.取出500ul荧光微球(1％浓度W/V，绿色荧光-激发475nm-发射525nM)放入离心管中。
2.离心(根据不同的粒径选择12000rpm-20000rpm转速)10min，使微球沉降，去除上清。
3.加入500ul偶联缓冲液(50mM MES ph6.0)，混匀。
4.加入20ul EDC溶液(200mM)，20ul sulfo-NHS溶液(200mM)，混匀，并在转盘混匀器上孵育30min。
5.离心(根据不同的粒径选择12000rpm-20000rpm转速)10min，使微球沉降，去除上清。
6.加入500ul偶联缓冲液(50mM MES ph6.0)，混匀后加入0.1mg抗IL-6单克隆抗体，混匀，室温下用转盘混匀器孵育1h。
7.重复步骤1-4.
8.将用EDC、NHS处理后的荧光微球与已经偶联孵育完成的荧光微球等比例混合，室温下用转盘混匀器孵育1h。
9.离心(根据不同的粒径选择12000rpm-20000rpm转速)10min，使微球沉降，去除上清。
10.加入封闭液(1％BSA水溶液)，混匀，室温下用转盘混匀器孵育1h。
11.离心(根据不同的粒径选择12000rpm-20000rpm转速)10min，使微球沉降，去除上清。
12.加入500ul保存液(1％BSA，1％蔗糖，Tirs-HCl ph 9.0)，混匀。
实施例3
白介素6(IL-6)荧光层析检测试纸条的制备：
荧光层析检测试纸条包括基板和基板上依次衔接的样品垫、标记物垫、层析膜和吸水垫，所述标记物垫为玻纤垫，所述层析膜为硝酸纤维素膜。
基板采用PVC板，样品垫、标记物垫、层析膜和吸水垫间粘贴部分相互重合2mm，组装并斩切后成为4mm宽的试纸条，装入卡壳，封装在铝箔袋中。
具体步骤如下：
1.玻纤垫的制备：将玻纤裁切为3*3cm的规格，使用喷金仪将处理液(阻断剂10％，吐温20 0.5％，抗红细胞抗体1％，50mM PBS ph 7.2)喷涂于玻纤一侧，喷量4ul/cm；将前述增强型IL-6抗体-荧光微球偶联物和兔IgG-荧光微球偶联物的混合液(20:1)喷涂于玻纤另一侧；37℃烘干24h。
2.硝酸纤维素膜的制备：将另一种抗IL-6抗体，使用稀释液(5％蔗糖，50mM PBSph7.5)稀释至1mg/mL，划线于纤维素膜上一侧作为检测线；将羊抗兔IgG使用稀释液(5％蔗糖，50mM PBS ph7.5)稀释至0.5mg/mL，划线于纤维素膜上作为质控线；划膜量1ul/cm，37℃烘干24h。
3.将PVC基板上贴好吸水垫、制备好的玻纤垫，硝酸纤维素膜，斩切为4mm宽的试纸条，装入卡壳，封装至铝箔袋。
实施例4
本实施例与实施例3的区别仅在于：标记物采用IL-6抗体-荧光微球偶联物。
将4种不同IL-6浓度的样本和IL-6检测试纸条恢复至室温，每种样本分为两组，分别采用实施例3、4的IL-6检测试纸条检测，具体检测方法为：
取75ul样本加入至200ul稀释液(50mM PBS ph7.2)中，混匀，取75ul加入至试纸条样品垫中，15min后使用荧光检测仪读取结果。
结果如图2和下表所示：
由上表和图2可知，实施例3试纸条的检测灵敏度远高于实施例4试纸条。即采用本发明的加强型抗体-荧光微球偶联物检测IL-6，灵敏度显著高于传统抗体-荧光微球偶联物。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种提升免疫层析标记物灵敏度的方法，其特征在于，将抗体与荧光微球偶联得到抗体-荧光微球偶联物，将抗体-荧光微球偶联物再次与荧光微球偶联，得到增强型抗体-荧光微球偶联物。
2.一种提升免疫层析标记物灵敏度的方法在白介素6检测中的应用，其特征在于，标记物的制备方法如下：
(1)将抗IL-6单克隆抗体与荧光微球偶联，得到IL-6抗体-荧光微球偶联物；
(2)将IL-6抗体-荧光微球偶联物再次与荧光微球偶联，得到增强型IL-6抗体-荧光微球偶联物。
3.根据权利要求2所述的一种提升免疫层析标记物灵敏度的方法在白介素6检测中的应用，其特征在于，步骤(1)中，IL-6抗体-荧光微球偶联物的制备方法如下：
(11)取出荧光微球放入离心管中离心，沉降、去除上清；
(12)向沉降物中加入偶联缓冲液，混匀，然后加入EDC溶液、sulfo-NHS溶液混匀、孵育；
(13)将步骤(12)的溶液离心，沉降、去除上清，再加入偶联缓冲液混匀；
(14)加入抗IL-6单克隆抗体，混匀，室温下用孵育，得到IL-6抗体-荧光微球偶联物。
4.根据权利要求3所述的一种提升免疫层析标记物灵敏度的方法在白介素6检测中的应用，其特征在于，步骤(2)中，增强型IL-6抗体-荧光微球偶联物的制备方法如下：
(21)重复步骤(11)、(12)，处理后的荧光微球与已经偶联孵育完成的IL-6抗体-荧光微球偶联物等比例混合，室温下孵育；
(22)孵育完毕后离心，沉降、去除上清，然后加入封闭液混匀，孵育；
(23)最后离心、沉降、去除上清，加入保存液混匀。
5.根据权利要求2所述的一种提升免疫层析标记物灵敏度的方法在白介素6检测中的应用，其特征在于，白介素6检测在荧光层析检测试纸条上进行，荧光层析检测试纸条包括基板和基板上依次衔接的样品垫、标记物垫、层析膜和吸水垫，所述标记物垫为玻纤垫，所述层析膜为硝酸纤维素膜。
6.根据权利要求5所述的一种提升免疫层析标记物灵敏度的方法在白介素6检测中的应用，其特征在于，所述玻纤垫经过如下处理：
将处理液喷涂于玻纤垫一侧，然后将增强型IL-6抗体-荧光微球偶联物和兔IgG-荧光微球偶联物的混合液喷涂于玻纤另一侧，37℃烘干。
7.根据权利要求6所述的一种提升免疫层析标记物灵敏度的方法在白介素6检测中的应用，其特征在于，所述硝酸纤维素膜经过如下处理：将另一种抗IL-6抗体，使用稀释液稀释至1mg/mL，划线于硝酸纤维素膜上一侧作为检测线；将羊抗兔IgG使用稀释液稀释至0.5mg/mL，划线于硝酸纤维素膜上作为质控线，37℃烘干24h。
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