CN110988331A - 一种基于磁珠技术和试剂冻干技术的微流控芯片检测方法和微流控芯片 - Google Patents

一种基于磁珠技术和试剂冻干技术的微流控芯片检测方法和微流控芯片 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于磁珠技术和试剂冻干技术的微流控芯片检测方法和实现此方法的微流控芯片，该方法以微流控技术为基础，将样本与试剂的混合、流动混合捕获反应、磁分离、清洗、检测等集成在芯片上，并将反应所需的所有试剂组分都集成在了芯片上，使客户操作简便，能随时随地完成检测。该微流控芯片内形成供试样流动的封闭式微流道，所述微流道包含有依次连通的混合仓、反应仓、延时通道、捕获仓和废液仓。

Description

一种基于磁珠技术和试剂冻干技术的微流控芯片检测方法和 微流控芯片
技术领域
本发明涉及微流控即时检测技术领域，具体涉及一种基于磁珠技术和试剂冻干技术的微流控芯片检测方法和微流控芯片。
背景技术
POCT(Point-of-care Testing)，又称为即时检测，或现场快速检测，是指在采样现场进行的、利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的一种检测方式。就目前市场情况来看，应用最多的还是以免疫层析技术为基础的检测系统。这种检测系统成本较低、操作简单，所以很受基层医院的青睐。但存在的缺点是：由于层析方法等多方面的原因导致重复性测试变异系数(CV)较大，无法达到精确定量的目的。因此很多厂家都在寻求新的方式方法来实现准确定量的检测，微流控芯片检测技术应运而生。
微流控芯片又称为芯片实验室(Lab-on-a-chip)，是指把生物、化学和医学等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块具有微米尺度微通道的芯片上，自动完成反应和分析的全过程。基于微流控芯片的分析检测装置的优点是：样本用量少，分析速度快，便于制成便携式仪器，非常适用于即时、现场分析。
市面现有微流控芯片存在以下缺点：1)芯片过于复杂，成本太高；2)检测设备复杂，检测时间长，通量低；3)芯片实用性差。目前大多数的微流控芯片为非均相的荧光微流控固相芯片，将捕获抗体固定在芯片中的某个点或者是固定在3D柱状捕获区，当荧光抗体和样本中靶标分析物反应后流经捕获点时被捕获。但是由于捕获反应时间较短，接触表面积较小，所以灵敏度较差，同时受到捕获抗体固定效率的影响较为明显，抗体固定的生产良品率较低，成本太高。而均相的流式液相芯片，采用磁珠作为捕获抗体的载体，拥有大的捕获面积，通过荧光标记物和磁珠的组合可以来测定不同的靶标的含量。但是由于这种方法对磁珠是按个来进行测量，所以对仪器的精密度和灵敏度要求非常高，导致成本极高，无法应用在POCT领域。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种基于磁珠技术和试剂冻干技术的微流控芯片检测方法。与现有技术相比，该方法的检测时间更短，灵敏度更高，重复性更好。
本发明的第二目的在于提供实现该方法的微流控芯片。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明涉及一种基于磁珠技术和试剂冻干技术的微流控芯片检测方法，所述方法包括以下步骤：
(1)加样：将试样注入微流控芯片的试样加注口内，所述微流控芯片内具有微流道，所述微流道包括依次连通的混合仓、反应仓、延时通道、捕获仓和废液仓，试样进入混合仓使试剂球溶化，得到混合试样，
所述试剂球预先装入所述混合仓内，包括捕获试剂球和标记试剂球，所述捕获试剂球为包被了抗体、抗原或二抗的磁珠，所述标记试剂球为包被了抗体、抗原或二抗的荧光微球；所述试剂球用于与所述试样发生免疫反应；
(2)反应：所述混合试样从所述混合仓进入反应仓，进一步进入延时通道内，使免疫反应充分进行；
(3)捕获：免疫反应完成后，所述混合试样从所述延时通道进入捕获仓，位于所述捕获仓底壁的磁铁将免疫反应产生的包被了抗体、抗原或二抗的磁珠的结合物吸附于捕获仓，剩余试样继续流入废液仓；
(4)清洗：向微流道内注入清洗液，使剩余混合试样进入废液仓，捕获仓内只含有被吸附的磁珠结合物；
(5)检测：将所述微流控芯片推入检测模块进行检测。
优选地，所述捕获试剂球通过以下方法制备得到：
[1]在磁珠表面包被抗体、抗原或二抗；
[2]将包被后的所述磁珠在液氮中冷冻，然后抽真空干燥。
优选地，所述磁珠为超顺磁性颗粒，材质为三氧化二铁和/或四氧化三铁。
优选地，所述磁珠的粒径为0.1～10μm，优选1μm。
优选地，所述磁珠的磁感应强度为1000～30000高斯，优选为2000～10000高斯。
优选地，所述标记试剂球通过以下方法制备得到：
[1]在荧光微球表面包被抗体、抗原或二抗；
[2]将包被后的所述荧光微球在液氮中冷冻，然后抽真空干燥。
优选地，所述荧光微球为含有稀土元素的聚苯乙烯荧光微球，所述稀土元素选自Eu、Tb和Sm中的一种。
优选地，步骤(1)中，在注入试样前，需要对微流控芯片进行亲水性处理，所述的亲水处理方式选自等离子表面清洗处理、化学表面改性、多聚物亲水物处理、化学气相沉积(CVD)、表面自组装中的至少一种。
优选地，步骤(4)中，所述清洗液中含有缓冲体系、表面活性剂、封闭剂和防腐剂，其中缓冲体系选自磷酸盐、碳酸盐、tris-HCL中的至少一种，清洗液的pH值为5～11；
所述封闭剂选自牛血清白蛋白、酪蛋白、鱼皮明胶和人工合成封闭剂中的至少一种；
所述表面活性剂选自吐温20、Triton x-100中的至少一种；
所述防腐剂选自Proclin-300、叠氮钠中的至少一种。
本发明实施例中，使用的清洗液中含有吐温20、酪蛋白、Proclin-300的pH值为7.4的磷酸缓冲液。
优选地，步骤(5)中，是利用时间分辨荧光检测仪检测捕获仓内的荧光强度，然后利用标准曲线，确定待测物中抗原或抗体的浓度。
本发明还涉及一种微流控芯片，用于实现本发明所述的基于磁珠技术和试剂冻干技术的微流控芯片检测方法，所述微流控芯片具有以下结构：
所述微流控芯片包括基片和上盖，所述基片具有凹腔，所述上盖将所述凹腔封闭、并形成供试样流动的封闭式微流道，
所述微流道包含有依次连通的混合仓、反应仓、捕获仓和废液仓，且所述微流道设置有与外界大气连通的通气孔及与所述混合仓连通的试样加注口，所述混合仓与所述反应仓之间设置有第一连通通道，所述捕获仓与所述废液仓之间设有第二连通通道，
所述反应仓和所述捕获仓之间设置有连通二者的延时通道，所述延时通道呈曲折结构、以供所述试样在所述延时通道内曲折流动，所述混合仓内设置有用于与所述试样发生免疫反应的固体状试剂球，
所述捕获仓的底壁上设置有用于吸附所述磁珠的磁铁。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种基于磁珠技术和试剂冻干技术的微流控芯片检测方法，该方法以微流控技术为基础，将试样与试剂球的混合过程、流动反应和捕获过程、磁分离过程、清洗和检测过程均集成在芯片上，并将反应所需的所有试剂组分都集成在了芯片上，使客户操作简便，能随时随地完成检测。
进一步地，本发明将冻干试剂球和微流控芯片结合，能够实现冻干试剂的快速释放和混合，无需使用时将试剂球和试样来回抽吸混合。另外冻干试剂球的使用使得芯片整体在常温下能够长期存储，解决了传统液相芯片中试剂必须在4℃存放并需要冷链运输等要求，大大减少了试剂的运输和存储成本。
附图说明
图1为本发明实施例中单通道荧光免疫分析微流控芯片的整体示意图；
图2为本发明实施例中上盖和基片的组成示意图；
图3本发明实施例中微流道的结构示意图；
图4为本发明实施例中单通道荧光免疫分析微流控芯片的竖剖示意图；
图5为本发明实施例中上盖的上表面示意图；
图6为本发明实施例中上盖的下表面示意图。
图1-图6中：
上盖-1、连接柱-101、基片-2、插孔-201、微流道-3、混合仓-301、反应仓-302、延时通道-303、捕获仓-304、废液仓-305、试样加注口-306、通气孔-307、第一连通通道-308、第二连通通道-309、清洗液放置仓-4、开口-401、注入通道-5、刺破柱-501、清洗液泡-6、试剂球-7。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
本发明涉及一种基于磁珠技术和试剂冻干技术的微流控芯片检测方法，该方法在具有以下结构的微流控芯片中进行。
﹝微流控芯片﹞
如图1～6所示，本发明的微流控芯片包括基片2和上盖1，其中基片2具有凹腔，通过上盖1将凹腔封闭、并形成供试样流动的封闭式微流道3。
微流道3包含有依次连通的混合仓301、反应仓302、捕获仓304和废液仓305，且微流道3设置有与外界大气连通的通气孔307及与混合仓301连通的试样加注口306。试样注入后在微流道3内进行流动并在流动过程中发生免疫反应和试样分离等制备过程。混合仓301与反应仓302之间设置有第一连通通道308，捕获仓304与废液仓305之间设有第二连通通道309。
反应仓302和捕获仓304之间设置有连通二者的延时通道303，延时通道303呈曲折结构、以供试样在延时通道303内曲折流动，混合仓301内设置有用于与试样发生免疫反应的固体状试剂球7。
试剂球7包括捕获试剂球和标记试剂球，捕获试剂球为包被了抗体、抗原或二抗的磁珠，标记试剂球为包被了抗体、抗原或二抗的荧光微球。
捕获仓304的底壁上设置有用于吸附磁珠的磁铁。
﹝试剂球﹞
使用捕获试剂球和标记试剂球进行检测是基于非竞争结合测定中的双抗体夹心法和双抗原夹心法，以及竞争法测定抗体或抗原。以传统的双抗体夹心法为例，这一方法包括以下步骤：1)将特异性抗体与固相载体联接，形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质；2)加入待检试样，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物，洗涤除去其它未结合物质；3)加入酶标抗体，保温反应。固相抗原抗体复合物上的抗原与酶标抗体结合，洗涤除去未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。4)加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物，通过比色测知标本中抗原的量。
本发明采用的标记方法包含物理吸附、化学交联或生物分子间特异性作用，将分析物的配体连接到磁珠或者荧光微球表面。得到配体标记的荧光微球或配体标记的磁珠。其中配体能特异性的与待分析物结合或竞争。磁珠作为捕获抗体的载体具有较大的比表面积，将其与荧光微球联用，通过与待测样本一起液相流动捕获后，将磁颗粒富集后检测特异的荧光信号，具有背景低、灵敏度高、线性范围宽的优点。同时将成千上万的磁颗粒富集后再测荧光，荧光信号更强，比传统液相芯片中测单磁颗粒的荧光信号再累计100个磁颗粒进行计算的方法简单，对仪器要求更低，仪器成本大幅度降低。
本发明所述的物理吸附主要利用磁珠或者荧光微球的疏水表面，与蛋白的疏水基团进行非特异的吸附，从而将磁颗粒或者荧光颗粒标记到蛋白的表面。
本发明所述的化学交联，主要是利用磁珠或者荧光微球表面的官能基团，通过交联剂的活化后与抗体或抗原等蛋白表面的对应基团结合，将磁珠或者荧光微球与抗体或抗原特异的交联在一起。
在本发明的实施例中采用化学交联的方法将磁珠标记到蛋白的表面：利用碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联剂将磁珠表面的官能基团的羧基活化后，与抗体或抗原等蛋白分子的表面的氨基连接。
在本发明的实施例中采用化学交联的方法将荧光微球标记到蛋白的表面：利用EDC+NHS交联剂将荧光标记物表面的官能基团羧基活化后，与抗体或抗原等蛋白分子的表面氨基连接。
本发明所述的生物间特异性作用包括但不限于生物素-亲和素系统等，将亲和素与磁颗粒或荧光标记物通过化学交联的方法偶联在一起后，用生物素标记抗体或抗原，再将亲和素-磁颗粒或亲和素-荧光标记物与生物素-抗体或抗原放在体系中孵育，利用生物素和亲和素的特异性亲和力，将抗体或抗原与亲和素-磁颗粒或亲和素-荧光标记物连接在一起。
根据本发明，捕获试剂球可通过以下方法制备得到：
[1]在磁珠表面包被抗体、抗原或二抗。实施例中磁珠表面预先结合羧基。以包被抗体为例，在缓冲液中加入捕获抗体反应完成后，再加入封闭液，得到磁珠标记的捕获抗体。
[2]将包被后的磁珠在液氮中冷冻，然后抽真空干燥，得到冻干的捕获试剂球。
进一步地，磁珠为超顺磁性颗粒，材质为三氧化二铁和/或四氧化三铁。本发明实施例中所用的磁珠是以聚苯乙烯为壳，四氧化三铁为核的颗粒。
进一步地，磁珠的粒径为0.1～10μm，优选1μm。
进一步地，磁珠的磁感应强度为1000～30000高斯，优选为2000～10000高斯。磁感应强度对检测结果有明显的影响，如果磁感应强度偏小，磁铁对磁珠的捕获效率低，捕获量不均匀；如果磁感应强度偏大，磁捕获速度过快，可能导致捕获线形状不均匀，不同区域的磁珠数量不同，同样使检测结果发生偏差。
根据本发明，标记试剂球可通过以下方法制备得到：
[1]在荧光微球表面包被抗体、抗原或二抗。与磁珠的包被类似，实施例中荧光微球表面预先结合羧基。以包被抗体为例，在缓冲液中加入捕获抗体反应完成后，再加入封闭液，得到荧光微球标记的捕获抗体。
[2]将包被后的荧光微球在液氮中冷冻，然后抽真空干燥。
本发明的标记试剂球包括但不限于时间分辨荧光胶乳颗粒、量子点、荧光微球、胶体金、彩色胶乳等。优选使用时间分辨荧光胶乳颗粒，即荧光微球。
进一步地，荧光微球为含有稀土元素的聚苯乙烯荧光微球，稀土元素选自Eu、Tb和Sm中的一种。稀土荧光微球应具有同样的激发波长和不同的发射波长，荧光物质之间发射峰不重叠。上述稀土元素在波长为365nm左右的激发光下均有较强的吸收能力，不同的稀土元素对应不同的发射波长区间，但发射波长都在500-650nm范围内。上述荧光微球包括激发波长为350-360nm，发射波长为615nm的含有Eu配合物的羧基聚苯乙烯微球，激发波长为350-360nm，发射波长为547nm的含有Tb配合物的羧基聚苯乙烯微球，激发波长为350-360nm，发射波长为645nm的含有Sm配合物的羧基聚苯乙烯微球。
试剂球7可以在生产时塞入混合仓301的凹槽内，再将上盖1与基片2相扣合连接。使试剂球7一体封装在芯片本体内，实现一体运输。且为避免试剂球7在运输途中发生质变，可以先将试剂球7进行冰冻然后再塞入混合仓301内。
﹝检测方法﹞
使用该微流控芯片进行检测的方法包括以下步骤：
(1)加样：将试样注入试样加注口306内，试样进入混合仓301使试剂球7溶化，得到混合试样。与现有技术相比，通过在微流控芯片内设置混合仓301和内置试剂球7，试剂球7可以完全的溶化于试样并充分与试样混合、保证免疫反应的充分进行。且试剂球7可以随试样共同流动，在流动的整个过程中都可以进行免疫反应。
在本发明的一个实施例中，在注入试样前，需要对微流控芯片进行亲水性处理。亲水处理方式包括但不限于等离子表面清洗处理、化学表面改性、多聚物亲水物处理、化学气相沉积(CVD)、表面自组装等方式。本发明实施例中，主要通过喷涂PEG改性多聚物水溶液来实现亲水性处理。
在本发明的一个实施例中，注入的试样体积为10～300μl，优选为20～100μl。在本发明的具体实施例中，对同一微流控芯片，样本加入量为40μl，稀释液加入量也是40μl，共计80μl。现有技术中微流控芯片的注入试样通常为250μl。因此本发明微流控芯片的样本用量大幅降低。
(2)反应：混合试样从混合仓301经过第一连通通道308进入反应仓302，进一步地充分混匀并发生免疫反应。接着混合试样进入延时通道303内，使免疫反应充分进行。延时通道303可以是螺旋型曲折结构、V形曲折结构或其它形状的曲折结构。
第一连通通道308可以是连通孔也可以是连通口、整体的横截面积均呈窄小状。如，可以是狭缝结构。流状液体受第一连通通道308的汇聚和流通作用可以起到混匀的效果。
如图2或图3所示，延时通道303设置有多个毛细孔，多个毛细孔沿反应仓302至捕获仓304的方向排列，且多个毛细孔首尾依次连通、以形成呈S形结构的延时通道303。这种设置方式使得混合试样需要较长的时间才能流过。既保证了免疫反应充分进行的时间，且流动过程可以促进试剂球7与试样保持充分混匀状态，利于免疫反应充分进行。
(3)捕获：免疫反应完成后，混合试样从延时通道303进入捕获仓304，位于捕获仓304底壁的磁铁将免疫反应产生的包被了抗体、抗原或二抗的磁珠的结合物吸附于捕获仓304，剩余试样继续流入废液仓305。
与现有技术相比，这种流动式捕获的结构也使得结合物流入废液仓305的量显著减少，保证了检测用量也使得所需要的试样用量减少、节省试样成本。如此设置，与现有技术中的与液体状试剂固化为一体的微流控芯片相比，本发明提供的单通道荧光免疫分析微流控芯片不仅结构简单、生产难度降低、生产合格率提升；还能保证试剂与试样充分混合并保证免疫反应进行的时长，使免疫反应充分进行、结合物易于被捕获，保证了检测的正确性。
本发明中的免疫反应时间为1-30分钟，优选为5分钟。免疫反应时间为试样流经混合仓、反应仓和延时通道的时间。现有的微流控芯片一般为15-20min，因此使用本发明微流控芯片的免疫反应时间也明显缩短。
(4)清洗：混合试样流过延时通道303后，免疫反应完成。当混合试样流经捕获仓304时，铺设在捕获仓304底壁的磁铁将免疫反应生产的包被了抗体、抗原或二抗的磁珠的结合物吸附在捕获仓304，剩余试样继续流入废液仓305。此时，需要向微流道3内注入清洗液，使剩余试样能够完全进入废液仓305、捕获仓304只剩余被吸附的结合物。清洗时间一般为2分钟。
在本发明的一个实施例中，微流控芯片上设置有用于盛放清洗液的清洗液放置仓4，清洗液放置仓4通过注入通道5与反应仓302连通。且芯片本体上还设置有可以封闭注入通道5的阻隔件，以在试样发生免疫反应时封闭注入通道5，在需要注入清洗液时再导通注入通道5。如图1所示，清洗液放置仓4位于上盖1、由凹陷于上盖1的凹槽形成，且清洗液放置仓4设置有供清洗液流出的开口401。如图3所示，注入通道5位于基片2上。如图4所示，上盖1与基片2扣合后，注入通道5的一端与开口401连通、另一端与反应仓302连通。而阻隔件可以是横截面与注入通道5的横截面相匹配的挡片或塞子，可插入可拔出的连接在注入通道5内；或者阻隔件可以是将清洗液包裹住的薄膜袋，如铝箔或者塑料薄膜制成的薄膜袋。薄膜袋包裹清洗液形成清洗液泡6。注入通道5内设置有用于刺破该薄膜袋的刺破柱501、从开口401处伸入至清洗液放置仓4内。如此设置，清洗液可以与芯片本体一体封装，当需要向微流道3内注入清洗液时，挤压清洗液泡6使刺破柱501刺破薄膜袋。清洗液自动流出，通过开口401流入注入通道5再注入反应仓302内，避免人工手动注入清洗液或者使用配套的全自动检测仪通过复杂的结构自动注入清洗液。
本发明中，清洗液的作用为清洗微流道3及捕获的磁珠，除去非特异性吸附的影响检测结果的物质。实施例中的清洗液中含有缓冲体系、表面活性剂、封闭剂和防腐剂，其中缓冲体系包括但不限于磷酸盐、碳酸盐、tris-HCL等，清洗液的pH值为5～11；封闭剂包括但不限于牛血清白蛋白、酪蛋白、鱼皮明胶和人工合成封闭剂等；表面活性剂包括但不限于吐温20、Triton x-100等；防腐剂包括但不限于Proclin-300、叠氮钠等。本发明实施例中，使用的清洗液中含有吐温20、酪蛋白、Proclin-300的pH值为7.4的磷酸缓冲液。
(5)检测：将微流控芯片推入检测模块进行检测。
在本发明的一个实施例中，检测过程是利用时间分辨荧光检测仪检测捕获仓304内的荧光强度，然后利用标准曲线，确定待测物中抗原或抗体的浓度。
由于磁珠作为捕获抗体的载体具有较大的比表面积，将其与荧光微球联用通过与待测试样进行免疫反应后，将磁珠进行富集并检测特异性荧光信号。这一检测过程具有背景噪声低、灵敏度高、线性范围宽的优点。同时将成千上万的磁珠富集后进行检测，荧光信号更强，比传统luminex液相芯片中测单磁颗粒的荧光信号再累计100个磁颗粒进行计算的方法简单，对仪器要求更低，因此仪器成本大幅度降低。
实施例1：双抗体夹心测定降钙素原(PCT)
一、抗体标记
1、磁珠标记
取1mg的COOH-磁珠，磁珠的直径为1μm，加入到1ml的pH为6.0的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液中，混合均匀。再加入10mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和10mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和0.1mg的PCT捕获抗体，涡旋震荡后在室温混合反应4h。反应完成后磁分离去上清液，加入pH为8.5的50mM的甘氨酸封闭液1ml，封闭1h后，得到磁珠标记的PCT捕获抗体。
2、荧光微球标记
取1mg的COOH-Eu-聚苯乙烯荧光微球，微球直径为300nm，加入到1ml的pH为6.0的MES缓冲液中，混合均匀。再加入10mg的EDC、10mgNHS和0.1mg的PCT标记抗体，涡旋震荡后在室温混合反应4h。反应完成后离心去上清液，加入pH为8.5的50mM的甘氨酸封闭液，封闭1h后，得到荧光微球标记的PCT标记抗体。
二、磁珠捕获抗体和荧光微球标记抗体的冷冻干燥
将磁珠标记的PCT捕获抗体和荧光微球标记的PCT标记抗体按照2μl/滴的速率，用喷墨点样机喷到液氮中，形成冰冻小球。将冰冻小球放入冷冻干燥机通过抽真空干燥后，制得冻干的两种试剂球。
三、微流控芯片的组装
将微流控芯片的基片和上盖表面喷涂上含0.01％PEG改性多聚物的水溶液，在烘箱中烘干1小时。得到表面亲水性改性的微流控芯片。将冻干的两种试剂球装载入混合仓301后，将微流控芯片的基片2和上盖1用超声焊接机建合成封闭的芯片。再将清洗液泡6粘贴于供清洗液流出的开口401。将磁铁安装在捕获仓304底壁。组装完成后，将微流控芯片和干燥剂放入铝箔袋内进行真空包装。
四、样本检测
用不含有PCT的小牛血清做稀释液，将PCT的标准品稀释成如下浓度：0pg/ml、50pg/ml、500pg/ml、2pg/ml、10ng/ml、100ng/ml。将80μl试样加入到芯片的试样加注口306中。将芯片放入孵育检测仪。试样迅速将冻干试剂球7溶化后，混合试样从混合仓301经过第一连通通道308进入反应仓302，在反应仓302中形成均匀的混合液，进一步进入延时通道303内，使免疫反应充分进行。免疫反应完成后，混合试样进入捕获仓304，位于所述捕获仓304底壁的磁铁将免疫反应产生的包被了抗体的磁珠结合物吸附于捕获仓304，剩余试样继续流入废液仓305。在混合试样完成流动捕获后，孵育检测仪中的加压装置会推动清洗液6，使清洗液泡6被下部的刺破柱501刺破，在压力的作用下，清洗液进入到微流道3中，开始对微流道3和捕获仓304所捕获的磁珠进行清洗，残留的未反应的荧光微球标记抗体被冲入废液仓305中，完成清洗。仪器检测系统通过紫外光激发检测荧光信号强度。整体反应和检测时间为8分钟。每个样本分别用测3次，计算获得平均值，并绘制标准曲线，可以得到样本中待测PCT的含量。其中荧光信号越强，说明样本中PCT含量越高。
通过检测结果表明，微流控芯片的最低检测限为10pg/ml，线性范围为10pg/ml-100ng/ml，其与对照试剂的相关性R2>98％。可用于区分细菌和病毒感染提供诊断参考。
实施例2：竞争法测定T3在血清样本中的浓度
一、抗体标记
1、磁珠标记
取1mg的COOH-磁珠，磁珠的直径为3μm，加入到1ml的pH为6.0的MES缓冲液中，混合均匀。再加入10mg的EDC和10mg的NHS和0.1mg的T3捕获抗体，涡旋震荡后在室温混合反应4h。反应完成后磁分离去上清液，加入pH为8.5的50mM的甘氨酸封闭液1ml，封闭1h后，得到磁珠标记的T3捕获抗体。
2、荧光微球标记
取1mg的COOH-Eu-聚苯乙烯荧光微球，微球直径为300nm，加入到1ml的pH为6.0的MES缓冲液中，混合均匀。再加入10mg的EDC、10mgNHS和0.1mg的T3-BSA标记抗原，涡旋震荡后在室温混合反应4h。反应完成后离心去上清液，加入pH为8.5的50mM的甘氨酸封闭液，封闭1h后，得到荧光微球标记的T3-BSA标记抗原。
二、磁珠捕获抗体和荧光微球标记抗体的冷冻干燥
将磁珠标记的T3捕获抗体和荧光微球标记的T3-BSA标记抗原按照2μl/滴的速率，用喷墨点样机喷到液氮中，形成冰冻小球。将冰冻小球放入冷冻干燥机通过抽真空干燥后，制得冻干的两种试剂球。
三、微流控芯片的组装
将微流控芯片的基片和上盖表面喷涂上含0.01％PEG改性多聚物的水溶液，在烘箱中烘干1小时。得到表面亲水性改性的微流控芯片。将冻干的两种试剂球装载入混合仓301后，将微流控芯片的基片2和上盖1用超声焊接机建合成封闭的芯片。再将清洗液泡6粘贴于供清洗液流出的开口401。将磁铁安装在捕获仓304底壁。组装完成后，将微流控芯片和干燥剂放入铝箔袋内进行真空包装。
四、样本检测
用不含有T3的人血清做稀释液，将T3的标准品稀释成如下浓度：0nmol/L、0.150nmol/L、0.60nmol/L、1.80nmol/L、5.40nmol/L、12.30nmol/L。将80μl试样加入到芯片的试样加注口306中。将芯片放入孵育检测仪。试样迅速将冻干试剂球7溶化后，混合试样从混合仓301经过第一连通通道308进入反应仓302，在反应仓302中形成均匀的混合液，进一步进入延时通道303内，试样中的T3与荧光微球标记的T3-BSA竞争性的与磁珠标记的T3捕获抗体结合。免疫反应完成后，混合试样进入捕获仓304，位于所述捕获仓304底壁的磁铁将免疫反应产生的包被了抗体的磁珠结合物吸附于捕获仓304，剩余试样继续流入废液仓305。在混合试样完成流动捕获后，孵育检测仪中的加压装置会推动清洗液6，使清洗液泡6被下部的刺破柱501刺破，在压力的作用下，清洗液进入到微流道3中，开始对微流道3和捕获仓304所捕获的磁珠进行清洗，残留的未反应的荧光微球标记抗体被冲入废液仓305中，完成清洗。仪器检测系统通过紫外光激发检测荧光信号强度。整体反应和检测时间为8分钟。每个样本分别用测3次，计算获得平均值，并绘制标准曲线，可以得到样本中待测T3的含量。其中荧光信号越强，说明样本中T3含量越低。
通过检测结果表明，微流控芯片的最低检测限为0.15nmol/L，线性范围为0.15nmol/L-12.3nmol/L，其与对照试剂的相关性R2>97％。可以用于血液中T3浓度的测定。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种基于磁珠技术和试剂冻干技术的微流控芯片检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)加样：将试样注入微流控芯片的试样加注口内，所述微流控芯片内具有微流道，所述微流道包括依次连通的混合仓、反应仓、延时通道、捕获仓和废液仓，试样进入混合仓使试剂球溶化，得到混合试样，
所述试剂球预先装入所述混合仓内，包括捕获试剂球和标记试剂球，所述捕获试剂球为包被了抗体、抗原或二抗的磁珠，所述标记试剂球为包被了抗体、抗原或二抗的荧光微球；所述试剂球用于与所述试样发生免疫反应；
(2)反应：所述混合试样从所述混合仓进入反应仓，进一步进入延时通道内，使免疫反应充分进行；
(3)捕获：免疫反应完成后，所述混合试样从所述延时通道进入捕获仓，位于所述捕获仓底壁的磁铁将免疫反应产生的包被了抗体、抗原或二抗的磁珠的结合物吸附于捕获仓，剩余试样继续流入废液仓；
(4)清洗：向微流道内注入清洗液，使剩余混合试样进入废液仓，捕获仓内只含有被吸附的磁珠结合物；
(5)检测：将所述微流控芯片推入检测模块进行检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕获试剂球通过以下方法制备得到：
[1]在磁珠表面包被抗体、抗原或二抗；
[2]将包被后的所述磁珠在液氮中冷冻，然后抽真空干燥。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述磁珠为超顺磁性颗粒，材质为三氧化二铁和/或四氧化三铁。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述磁珠的粒径为0.1～10μm，优选1μm；
和/或，所述磁珠的磁感应强度为1000～30000高斯，优选为2000～10000高斯。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记试剂球通过以下方法制备得到：
[1]在荧光微球表面包被抗体、抗原或二抗；
[2]将包被后的所述荧光微球在液氮中冷冻，然后抽真空干燥。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光微球为含有稀土元素的聚苯乙烯荧光微球，所述稀土元素选自Eu、Tb和Sm中的一种。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，在注入试样前，需要对微流控芯片进行亲水性处理，所述的亲水处理方式选自等离子表面清洗处理、化学表面改性、多聚物亲水物处理、化学气相沉积、表面自组装中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述清洗液中含有缓冲体系、表面活性剂、封闭剂和防腐剂，其中缓冲体系选自磷酸盐、碳酸盐、tris-HCL中的至少一种，清洗液的pH值为5～11；
所述封闭剂选自牛血清白蛋白、酪蛋白、鱼皮明胶和人工合成封闭剂中的至少一种；
所述表面活性剂选自吐温20、Triton x-100中的至少一种；
所述防腐剂选自Proclin-300、叠氮钠中的至少一种。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，利用时间分辨荧光检测仪检测捕获仓内的荧光强度，然后通过标准曲线确定待测物中抗原或抗体的浓度。
10.一种微流控芯片，用于实现权利要求1至9任一项所述的基于磁珠技术和试剂冻干技术的微流控芯片检测方法，其特征在于，
所述微流控芯片包括基片和上盖，所述基片具有凹腔，所述上盖将所述凹腔封闭、并形成供试样流动的封闭式微流道，
所述微流道包含有依次连通的混合仓、反应仓、捕获仓和废液仓，且所述微流道设置有与外界大气连通的通气孔及与所述混合仓连通的试样加注口，所述混合仓与所述反应仓之间设置有第一连通通道，所述捕获仓与所述废液仓之间设有第二连通通道，
所述反应仓和所述捕获仓之间设置有连通二者的延时通道，所述延时通道呈曲折结构、以供所述试样在所述延时通道内曲折流动，所述混合仓内设置有用于与所述试样发生免疫反应的固体状试剂球，
所述捕获仓的底壁上设置有用于吸附所述磁珠的磁铁。
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