CN112326750A - 一种基于微流控方法的甲型流感病毒检测装置与检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于微流控方法的甲型流感病毒检测装置及检测方法，装置包括由PET板和印在其上三电极系统组成的一次性生物电化学传感器和与其粘合的微流控检测卡，微流控检测卡由传感器、底板、刺凸、微流控板、试剂袋、盖板以及顶板组成，刺凸放置在底板上，刺凸另一侧粘合试剂袋，微流控板固定在底板上，顶板覆盖在微流控板上，盖板黏贴在试剂袋上。检测方法包括生物电化学传感器和微流控检测卡制作以及样品检测。本发明检测装置能成功对抗原实现精准检测，检测过程采用微流控方法，有效避免人为检测误差，采用免疫学方法，特异性强，采用电化学检测方法，敏感性高，阳性检出率达95％，检测速度快，检测过程小于15分钟。

Description

一种基于微流控方法的甲型流感病毒检测装置与检测方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于微流控方法的甲型流感病毒检测装置与检测方法。
背景技术
甲型流感较流感，禽流感的潜伏期更长，潜伏期时长七天。早期症状与普通人流感相似，包括发热，咳嗽，喉痛，身体疼痛，头痛等，有些人还会出现腹泻或呕吐，肌肉酸痛或疲倦，眼睛发红等症状。流感的传染源主要是病人，其次是隐性感染者。动物亦可能为重要贮存宿主和中间宿主。对于流感病毒，人群普遍易感。因此，如何快速、准确的对疑似人群和隐性感染者进行甲型流感病毒检测是应对该病毒的重要问题。
现有的检测技术主要为核酸检测和抗体检测，但是，核酸检测存在检测时间较长以及检测环境局限的问题，同时对检测设备、平台和操作人员的要求较高；抗体检测大多是在试纸条上利用胶体金免疫层析技术对患者样本进行检测从而定性地判断样本中是否含有甲型流感病毒抗体，无法定量精准判断。而一般咽试子检测是从呼吸道标本或血清中分离到特定病毒，经过测序证实或两次血清抗体检测抗体滴度4倍升高，可确诊为感染了，在做之前还要做个血常规。因此，如何在复杂环境下精准且快速筛查疑似病例和隐性感染者是亟需解决的问题。
电化学分析法是仪器分析的重要组成部分之一。它是根据溶液中物质的电化学性质及其变化规律，建立在以电位、电导、电流和电量等电学量与被测物质某些量之间的计量关系的基础之上，对组分进行定性和定量的仪器分析方法，也称电分析化学法。
微流控系统集压力控制和流速控制于一体，既可以提供快速稳定的无脉冲压力输出，外接流量传感器时又可以提供精确稳定的流速控制，既适用于工业产品的开发应用，又适用于科研开发。
如能尝试通过ELISA(酶联免疫吸附测定)原理，利用抗体-抗原-抗体-酶的成熟体系，研发出一种基于微流控-电化学法的检测装置与检测方法，是一种新的突破，也必将具有广泛的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于时序控制的微流控-电化学法的甲型流感病毒H5N1的抗原检测装置，还提供一种基于时序控制的微流控-电化学法的甲型流感病毒H5N1的抗原检测方法，以克服现有检测方法无法实现甲型流感病毒 H5N1人群筛查和疑似病例快速精准检测的缺点。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种基于微流控方法的甲型流感病毒检测装置，包括一次性生物电化学传感器和微流控检测卡；所述一次性生物电化学传感器固定在微流控板上；
所述一次性生物电化学传感器由三电极系统和PET板组成；所述三电极系统印在PET板上；所述三电极系统由羟基化石墨为基底的工作电极、银对电极和氯化银参比电极组成；
所述微流控检测卡由传感器、底板、两个刺凸、微流控板、试剂袋、盖板以及顶板组成；所述传感器与微流控板相连；所述两个刺凸放置在底板上，在刺凸位置另一侧粘合试剂袋，包括清洗试剂袋和指示试剂袋；所述微流控板固定在底板上；所述顶板覆盖在微流控板上；所述盖板黏贴在试剂袋上，盖板左下侧设有与微流控板样品注入口204对应的样品孔。
进一步地，所述三电极系统丝网印刷在厚度为0.2mm的PET板上。
进一步地，所述工作电极用等离子体清洗机处理并采用NHS和EDC活化。
进一步地，所述对电极采用捕获抗体A溶液点样，采用PBS清洗后用BSA 封闭。
进一步地，所述微流控板粘合在底板上。
进一步地，所述一次性生物电化学传感器粘合在微流控板相应区域(上部分)。
进一步地，所述底板采用聚对苯二甲酸乙二醇酯制备；所述微流控板采用二甲基硅氧烷制备。
一种基于微流控方法的甲型流感病毒的检测方法，包括以下步骤：
a、生物电化学传感器制作，包括以下步骤：
a1、丝印电极准备：利用丝网印刷技术印制丝网印刷电极，把反应所需的三电极系统印在厚度为0.2mm的PET板上；
a2、用原核表达手段，制备甲型流感病毒H5N1血凝素/HA蛋白，再制备鼠抗血凝素/HA蛋白的单克隆抗体，筛选配对抗体：捕获抗体A和检测抗体B，采用过碘酸钠法以HRP标记检测抗体B；
a3、对基底工作电极部分进行活化：用等离子体清洗机处理三电极系统的工作电极，并用1mmol/L的NHS和1mmol/L的EDC活化，NHS和EDC的体积比是1.2:1，活化时间为2小时；
a4、用生物芯片点样仪，将步骤a2中的捕获抗体A溶液(稀释1000倍) 点样在三电极系统的对电极，37℃，80％湿度反应过夜，用PBS清洗后用1％BSA 封闭；
a5、采用PBS冲洗10s，4℃保存待用，一次性生物电化学传感器制作完成。
b、微流控检测卡的制作，包括以下步骤：
b1、在底板上放上两个刺凸，在刺凸位置另一侧(刺凸Ⅰ216和刺凸Ⅱ218) 粘合清洗(PBST)试剂袋和指示(TMB)试剂袋；
b2、采用双面胶将微流控板粘合在底板上；
b3、将步骤a制备的一次性生物电化学传感器粘合在微流控板相应区域；
b4、覆盖上顶板，微流控检测卡制作完成。
c、采用咽拭子采样，进行前处理溶解离心取上清，上清液最少150μl方可检测，将150μl上清液加入微流控检测卡样品孔，启动微型电化学工作站， 12分钟工作站即可显示本次测量电荷转移量，根据结果判断出是否感染甲型流感病毒。
进一步地，步骤b1，所述底板采用聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)制备。
进一步地，步骤b2，所述微流控板采用二甲基硅氧烷(PDMS)制备。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明基于微流控方法的甲型流感病毒检测装置，能够成功对抗原实现精准检测；
2、检测过程采用微流控方法，有效避免人为检测误差；
3、采用免疫学方法，特异性强；
4、采用电化学检测方法，敏感性高，阳性检出率达95％；
5、检测速度快，整个检测过程小于15分钟。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为生物电化学传感器简化示意图；
图2为微流控板切面图；
图3为微管道各部位示意图；
图4为一次性生物传感器各部位简化示意图；
图5为电子转移机理图；
图6为刺凸工作原理图；
图7为阀门关闭时流体运动原理图；
图8为阀门打开时流体运动原理图；
图9为制备与检测流程图。
图中，204.样品注入口 206.样品管线 208交联垫位置 210.除气泡开关阀 212.除去气泡装置 214.试剂进入管道 216.刺凸Ⅰ 218.刺凸Ⅱ 220.废液池 222.底物袋224a.废液排出管道Ⅰ 224.废液排出管道Ⅱ 224b.废液排出管道Ⅲ 226.混合池 228.检测孔 250.气泵与微流控板链接位置。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明：
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明具体实施例及相应的附图对本发明技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
电化学法测量原
被检测样品可以是咽喉部分泌物分离样品，也可是血清样品；向样品注入口加入150μL被检测样品，微流控系统控制下，流体流经检测抗体B-HRP吸附垫，在混合池混合均匀。流体顺着微孔道流入检测孔228，在检测孔228与生物电化学传感器电极部分偶联的捕获抗体A发生免疫反应。刺破PBST试剂袋，清洗试剂在微流控系统作用下均匀流入检测孔，在微流控系统控制下清洗检测孔228，清洗后从废液排出管道Ⅱ224管道流入废液池220。微型电化学工作站引脚与传感器工作电极、参比电极、对电极三电极接触链接，用恒电位极化法进行测量，输出电压控制在-25mV。刺破TMB试剂袋，TMB试剂在微流控系统作用下均匀流入检测孔228，此时微型工作站有相应电信号(电量)产生，电子转移方程式如图5所示。
时序微流控检测原理
微型电化学工作站严格按照编写的时序程序运行，接入检测卡后，内置气泵与检测卡底板微孔道相连接，链接气泵与微流控板链接位置250。微流控板由七层PDMS材料粘合而成，密布微孔道；至少一个流通路径，每个流通路径包括一流道与一气道，其中，在所述至少一个流通路径的至少一个气道中，每个气道具有包括两端，每个气道的一端与底板所述腔道连通，沿所述滑动方向，每个气道的另一端在其一端与所述腔道底部的区域之间与所述腔道连通；在所述至少一个流通路径的至少一个流道中，每个流道具有包括两端，且一端与所述腔道连通，另一端与所述至少一个流通路径中其他流道的另一端连通；其中，任一个通道移动至与任一个流通路径对应的预定位置时，将该流通路径中的流道与气道连通。刺凸刺破试剂袋：微流控板关闭刺凸处一侧阀门，时序程序控制气泵加压，刺凸与柔性薄膜同时向上，与底板相接触的试剂袋被刺破。道引导试剂流量在微管道内流动：通过时序控制施加气道气压正负，实现流道的流体流通。
本发明基于微流控方法的甲型流感病毒检测装置，包括一次性生物电化学传感器和微流控检测卡。所述一次性生物电化学传感器粘合在微流控板相应区域。
如图1所示，所述一次性生物电化学传感器由三电极系统和PET板组成。如图4所示，所述三电极系统丝网印刷在厚度为0.2mm的PET板上。所述三电极系统是由以羟基化石墨为基底的工作电极、银对电极和氯化银参比电极组成，如图4所示，。所述工作电极用等离子体清洗机处理并采用NHS和EDC活化。所述对电极采用捕获抗体A溶液点样，采用PBS清洗后用BSA封闭。
所述微流控检测卡由传感器、底板、两个刺凸、微流控板、试剂袋(包括清洗试剂袋和指示试剂袋)、盖板以及顶板组成。所述两个刺凸放置在底板上，在刺凸位置另一侧粘合清洗试剂袋和指示试剂袋。所述微流控板粘合在底板上。所述顶板覆盖在微流控板上。所述盖板黏贴在试剂袋上，盖板左下侧设有与微流控板样品注入口204(图3)对应的样品孔。
所述底板采用聚对苯二甲酸乙二醇酯制备。所述微流控板采用二甲基硅氧烷制备。
本发明提供了相应地一种基于时序控制的定量加液方法，控制多种不同液体的加入顺序与时间。
如图9所示，本发明基于微流控方法的甲型流感病毒检测方法，包括以下步骤：
前期准备
a、如图1所示，生物电化学传感器制作，包括以下步骤：
a1、丝印电极准备：利用丝网印刷技术印制丝网印刷电极，把反应所需的三电极系统印在厚度为0.2mm的PET板上；
a2、用原核表达手段，制备甲型流感病毒H5N1血凝素/HA蛋白，再制备鼠抗血凝素/HA蛋白的单克隆抗体，筛选配对抗体：捕获抗体A和检测抗体B，采用过碘酸钠法以HRP标记检测抗体B；
a3、对基底工作电极部分进行活化：用等离子体清洗机处理三电极系统的工作电极，并用1mmol/L的NHS和1mmol/L的EDC活化，NHS和EDC的体积比是1.2:1，活化时间为2小时；
a4、用生物芯片点样仪，将步骤a2中的捕获抗体A溶液(稀释1000倍) 点样在三电极系统的对电极，37℃，80％湿度反应过夜，用PBS清洗后用1％BSA 封闭；
a5、采用PBS冲洗10s，4℃保存待用，一次性生物电化学传感器制作完成。
b、如图2所示，微流控检测卡的制作，包括以下步骤：
b1、在底板上放上两个刺凸，在刺凸位置另一侧(刺凸Ⅰ216和刺凸Ⅱ218) 粘合清洗(PBST)试剂袋和指示(TMB)试剂袋；
b2、采用双面胶将微流控板粘合在底板上；
b3、将步骤a制备的一次性生物电化学传感器粘合在微流控板相应区域；
b4、覆盖上顶板，微流控检测卡制作完成。
其中，步骤b1，所述底板主要材料是聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)，具有硬度高、耐高温、耐磨性强的优点。
步骤b2，所述微流控板主要材料为二甲基硅氧烷(PDMS)，具有气体渗透性低，低湿润性，低表面能等优点。
样品检测
c、采用咽拭子采样，进行前处理溶解离心取上清，上清液最少150μl方可检测，将150μl上清液加入微流控检测卡样品孔，启动微型电化学工作站， 12分钟工作站即可显示本次测量电荷转移量，根据结果判断出是否感染甲型流感病毒。
实施例1
基于以上传感器制作成功，微流控板气密性完好，微型电化学工作站正常工作。我们利用本方法和设备，对原核表达的不同浓度H5N1的HA蛋白样品进行检测，步骤和结果如下。
1、取检测卡9张，每三张为一组，分为3组。
2、配置HA蛋白浓度分别是20μg/ml、2μg/ml、0μg/ml的检测溶液。
3、接入分析仪，然后每三张检测卡检测同一种HA蛋白浓度溶液。
4、记录电流平稳后连续3s电荷转移量，结果如下。
表1
Figure BDA0002764517730000101
5、结果显示：样品含有甲型流感病毒H5N1抗原HA蛋白，能够利用本方法和仪器进行有效检测，检测结果转移电荷量X≤-2400nC，说明检测结果呈阳性。
实施例2
基于以上传感器制作成功，微流控板气密性完好，微型电化学工作站正常工作。我们利用本方法和设备，对不同干扰项进行检测，步骤和结果如下。
1、取检测卡12张，每三张为一组，分为4组。
2、配置健康人血清稀释100倍、3％BSA溶液、猪血清溶液稀释100倍、以及0ng/ml的HA蛋白检测溶液。
3、接入分析仪，然后每三张检测卡检测以上同一种溶液。
4、记录电流平稳后连续3s电荷转移量，结果如下。
表2
Figure BDA0002764517730000102
5、结果显示：样品中不含有甲型流感病毒抗原的溶液，会对本方法和仪器有一定的干扰行为，但干扰能力有限，不影响最终结果。我们把阳性判断值控制在-2400nC,灵敏性为78％，特异性95％；可以有效实现疑似病例确诊，当检测值X≤-2400nC呈阳性，否则呈阴性。
实施例3
基于以上传感器制作成功，微流控板气密性完好，微型电化学工作站正常工作。我们利用本方法和设备，对流感患者灭活的咽拭子采样样品和正常人采样样品稀释相同的倍数进行检测，步骤和结果如下。
1、取检测卡12张，每三张为一组，分为4组。
2、同时把健康人口腔分泌物稀释处理、3位流感患者口腔分泌物稀释处理进行检测。
3、接入分析仪，然后每三张检测卡检测以上同一种口腔分泌物。
4、记录电流平稳后连续3s电荷转移量，结果如下。
表3
Figure BDA0002764517730000111
5、结果显示：当检测值X≤-2400nC呈阳性，能有效解决甲型流感病毒 H5N1人群筛查和疑似病例快速检测问题。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种基于微流控方法的甲型流感病毒检测装置，其特征在于：包括一次性生物电化学传感器和微流控检测卡；所述一次性生物电化学传感器固定在微流控板上；
所述一次性生物电化学传感器由三电极系统和PET板组成；所述三电极系统印在PET板上；所述三电极系统由羟基化石墨为基底的工作电极、银对电极和氯化银参比电极组成；
所述微流控检测卡由传感器、底板、两个刺凸、微流控板、试剂袋、盖板以及顶板组成；所述两个刺凸放置在底板上，刺凸Ⅰ(216)和刺凸Ⅱ(218)位置粘合试剂袋，包括清洗试剂袋和指示试剂袋；所述微流控板固定在底板上；所述顶板覆盖在微流控板上；所述盖板黏贴在试剂袋上；所述盖板左下侧设有与微流控板样品注入口(204)对应的样品孔。
2.根据权利要求1所述的一种基于微流控方法的甲型流感病毒检测装置，其特征在于：所述三电极系统丝网印刷在厚度为0.2mm的PET板上。
3.根据权利要求1所述的一种基于微流控方法的甲型流感病毒检测装置，其特征在于：所述工作电极用等离子体清洗机处理并采用NHS和EDC活化。
4.根据权利要求1所述的一种基于微流控方法的甲型流感病毒检测装置，其特征在于：所述对电极采用捕获抗体A溶液点样，采用PBS清洗后用BSA封闭。
5.根据权利要求1所述的一种基于微流控方法的甲型流感病毒检测装置，其特征在于：所述微流控板粘合在底板上。
6.根据权利要求1所述的一种基于微流控方法的甲型流感病毒检测装置，其特征在于：所述一次性生物电化学传感器粘合在微流控板相应区域。
7.根据权利要求1所述的一种基于微流控方法的甲型流感病毒检测装置，其特征在于：所述底板采用聚对苯二甲酸乙二醇酯制备；所述微流控板采用二甲基硅氧烷制备。
8.一种基于微流控方法的甲型流感病毒检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、生物电化学传感器制作，包括以下步骤：
a1、丝印电极准备：利用丝网印刷技术印制丝网印刷电极，把反应所需的三电极系统印在厚度为0.2mm的PET板上；
a2、用原核表达手段，制备甲型流感病毒H5N1血凝素/HA蛋白，再制备鼠抗血凝素/HA蛋白的单克隆抗体，筛选配对抗体：捕获抗体A和检测抗体B，采用过碘酸钠法以HRP标记检测抗体B；
a3、对基底工作电极部分进行活化：用等离子体清洗机处理三电极系统的工作电极，并用1mmol/L的NHS和1mmol/L的EDC活化，NHS和EDC的体积比是1.2:1，活化时间为2小时；
a4、用生物芯片点样仪，将步骤a2中的捕获抗体A溶液稀释1000倍点样在三电极系统的对电极，37℃，80％湿度反应过夜，用PBS清洗后用1％BSA封闭；
a5、采用PBS冲洗10s，4℃保存待用，一次性生物电化学传感器制作完成。
b、微流控检测卡的制作，包括以下步骤：
b1、在底板上放上两个刺凸，在刺凸位置另一侧粘合清洗PBST试剂袋和指示TMB试剂袋；
b2、采用双面胶将微流控板粘合在底板上；
b3、将步骤a制备的一次性生物电化学传感器粘合在微流控板相应区域；
b4、覆盖上顶板，微流控检测卡制作完成。
c、采用咽拭子采样，进行前处理溶解离心取上清，上清液最少150μl方可检测，将150μl上清液加入微流控检测卡样品孔，启动微型电化学工作站，12分钟工作站即可显示本次测量电荷转移量，根据结果判断出是否感染甲型流感病毒。
9.根据权利要求8所述的一种基于微流控方法的甲型流感病毒检测方法，其特征在于：步骤b1，所述底板采用PET制备。
10.根据权利要求8所述的一种基于微流控方法的甲型流感病毒检测方法，其特征在于：步骤b2，所述微流控板采用PDMS制备。
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