CN114558529B - 一种内毒素胶乳微球及其制备方法和应用 - Google Patents

一种内毒素胶乳微球及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种内毒素胶乳微球及其制备方法和应用，所述内毒素胶乳微球的制备方法，包括：将带有羧基的胶乳微球和乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺混合反应，待反应结束后，加入水合肼继续混合反应，获得激活的胶乳微球；用高碘酸钠将内毒素非结合活性区域Fc端羟基氧化成醛基；将所述激活的胶乳微球和醛基化的内毒素混合反应，待反应结束后，加入醛基化聚乙二醇封闭胶乳微球上未反应的基团，待反应结束后，再加入硼氢化钠继续反应，获得偶联内毒素的胶乳微球。本发明能够排除环境中的内毒素对样本检测结果的干扰，有利于提升检测结果的准确性和可信度。

Description

一种内毒素胶乳微球及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及细菌内毒素检测技术领域，具体而言，涉及一种内毒素胶乳微球及其制备方法和应用。
背景技术
内毒素是革兰氏阴性杆菌(gram-negativebacteria，GNB)细胞膜外壁的主要组成部分，对细菌的稳定性起重要作用。细菌内毒素分子是一种双糖结构的酰胺类脂复合物，其分子量一般在2000～2300之间，因分子量小，极易从肠系膜或组织液侵入，随血液进入循环系统。内毒素几乎无处不在，是一种毒性极强的致炎和热原物质，是内毒素血症及感染性休克的主要致病介质。内毒素血症是由于血液中或病灶内细菌释放出大量细菌内毒素至血液，或输入大量内毒素污染的液体而引起的一种病症。当机体受到创伤(包括手术)、烧伤、感染、放疗、化疗和接受长期传统的肠外营养时，肠黏膜通透性增高，肠黏膜对细菌和内毒素的通透性增高，细菌和内毒素就会大量进入血液。
目前常用的内毒素检测方法有半定量法与定量法。半定量法即凝胶法，结果判读简便、经济、便捷，但精密度较差，凝胶形成容易受反应物中诸多因素影响，无法精确定量检测。定量法主要分为如下几种：(1)显色基质法，该方法所需仪器和试剂都较昂贵，操作较复杂；(2)浊度法，该方法检测范围宽、操作简便，广泛地应用于临床，但是需要配套仪器试剂；(3)免疫学方法，该方法主要基于酶联免疫吸附试验法，准确率和特异度均较高，但操作相对繁琐，缺乏临床验证。另外，利用高效液相色谱、流式细胞术和细胞因子检测也可对内毒素含量进行间接的检测，临床也有利用鲎试剂法检测人体血液细菌内毒素，试图将细菌内毒素检测法应用到人体液的检查，以辅助疾病诊断，但是由于鲎试剂法易受蛋白酶等杂质的影响，影响检测结果的准确性。因此，依靠生物分子的内毒素感测器和内毒素探针随之开发。
由于内毒素广泛存在于环境中，如何降低环境中内毒素对检测样本的干扰，提供一种抗干扰能力强、灵敏度高、特异性检测内毒素的试剂盒是本领域亟待解决的技术问题。现有技术中多选用牛血清白蛋白作为封闭试剂，但是由于牛血清白蛋白中有无法除去的内毒素，将其作为内毒素检测试剂的封闭试剂产生的干扰会很大，实验结果偏差大，因此在制备内毒素检测试剂时无法采用。
发明内容
本发明旨在解决现有技术的上述缺陷，提供一种可以排除环境中的内毒素对样本检测结果干扰的内毒素胶乳微球。
为解决上述问题，本发明第一方面提供了一种内毒素胶乳微球的制备方法，包括：
将带有羧基的胶乳微球和乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺混合反应，待反应结束后，加入水合肼继续混合反应，获得激活的胶乳微球；
用高碘酸钠将内毒素非结合活性区域Fc端羟基氧化成醛基；
将所述激活的胶乳微球和醛基化的内毒素混合反应，待反应结束后，加入醛基化聚乙二醇封闭胶乳微球上未反应的基团，待反应结束后，再加入硼氢化钠继续反应，获得偶联内毒素的胶乳微球。
进一步地，所述乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺和所述带有羧基的胶乳微球的质量比为1～10：1；所述水合肼和所述带有羧基的胶乳微球的质量比为5～25：1。
进一步地，所述高碘酸钠和所述内毒素的质量比为1～5：1。
进一步地，所述醛基化的内毒素和所述激活的胶乳微球的质量比为0.25～7.5：1，所述醛基化聚乙二醇和所述激活的胶乳微球的质量比为5～20：1，所述硼氢化钠和封闭的胶乳微球的质量比为0.06～0.15：1。
进一步地，所述醛基化聚乙二醇的分子量为300～1000。
本发明第二方面提供了一种内毒素胶乳微球，采用第一方面任一项所述的制备方法制备得到。
本发明第三方面提供了一种内毒素检测试剂盒，包括试剂R1，所述试剂R1包括如第二方面所述的内毒素胶乳微球。
进一步地，所述试剂R1还包括缓冲液、防腐剂、稳定剂和表面活性剂。
进一步地，还包括试剂R2、试剂R3和试剂R4，所述试剂R2包括用真核原核细胞表达的FC-rFC蛋白、缓冲液、防腐剂和稳定剂；所述试剂R3包括CaCl2、缓冲液、稳定剂和表面活性剂；所述试剂R4包括缓冲液、防腐剂和稳定剂。
进一步地，所述试剂R1、所述试剂R2和所述试剂R3的体积比为1：1～8：0.5～1.5，所述试剂R1中所述内毒素胶乳微球的体积分数为0.002％～0.01％，所述试剂R2中所述用真核原核细胞表达的FC-rFC蛋白的浓度为50～250ug/mL，所述试剂R3中所述CaCl2的浓度为50～250mmol/L。
本发明将内毒素非结合活性区域Fc端偶联到胶乳微球上，形成内毒素胶乳微球检测探针，且使用醛基化聚乙二醇作为内毒素胶乳微球的封闭试剂，能够排除环境中的内毒素对样本检测结果的干扰，有利于提升检测结果的准确性和可信度；此外，本发明中采用定向偶联法，得到的内毒素胶乳微球的稳定性较好，内毒素不会从胶乳微球上脱落；
本发明提供的内毒素检测试剂盒，通过C因子重组蛋白的介导，吸引内毒素胶乳微球聚集，增强散射信号或者减弱透射信号，采用散射的方式检测内毒素，有效的避免了血液本身的透射与吸光的影响，而且内毒素检测试剂盒中试剂可以即用，配合携带有散射检测功能的生化检测仪，可以在10min～15min内得到内毒素检测结果(不含血液处理过程，血液处理过程一般为20min～30min)，而通常的鲎试剂检测内毒素均在30min以上(不含血液处理过程)，提升了检测效率，在临床上例如脓毒症等ICU病人可以通过该内毒素检测试剂盒进行快速检测，协助进行病情判断。
附图说明
图1为本发明实施例提供的制备内毒素胶乳微球的工艺流程图；
图2为本发明实施例2提供的内毒素胶乳微球的非特异性识别曲线图；
图3为本发明实施例2提供的用PEG-750封闭的胶乳微球进行水相内毒素检测的结果图；
图4为本发明实施例4提供的不同浓度的内毒素的信号变化结果图；
图5为本发明实施例4提供的标准曲线图；
图6为本发明实施例4提供的不同样品中的内毒素检测回收率的结果图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
另外，术语“包含”、“包括”、“含有”、“具有”的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。如无特殊说明的，材料、设备、试剂均为市售。
此外，本发明虽然对制备中的各步骤进行了如S1、S2、S3等形式的描述，但此描述方式仅为了便于理解，如S1、S2、S3等形式并不表示对各步骤先后顺序的限定。
结合图1所示，本申请的实施例第一方面提供了一种内毒素胶乳微球的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1、将带有羧基的胶乳微球和乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺混合反应，待反应结束后，加入水合肼继续混合反应，获得激活的胶乳微球；
步骤S2、用高碘酸钠将内毒素非结合活性区域Fc端羟基氧化成醛基；
步骤S3、将激活的胶乳微球和醛基化的内毒素混合反应，待反应结束后，加入醛基化聚乙二醇封闭胶乳微球上未反应的基团，待反应结束后，再加入硼氢化钠继续反应，获得偶联内毒素的胶乳微球。
本申请的实施例中将内毒素非结合活性区域Fc端偶联到胶乳微球上，形成内毒素胶乳微球检测探针，且使用醛基化聚乙二醇作为内毒素胶乳微球的封闭试剂，能够排除环境中的内毒素对样本检测结果的干扰，有利于提升检测结果的准确性和可信度；此外，本申请的实施例中采用定向偶联法，得到的内毒素胶乳微球的稳定性较好，内毒素不会从胶乳微球上脱落。
需要说明的是，在制备内毒素胶乳微球之前，所有试剂和耗材均需要进行无热原(主要指细菌性热原，例如内毒素)处理，并进行内毒素检测后使用，检测至所有试剂和耗材无内毒素后，方可使用，且所有的操作均需在无菌条件下进行，其中，试剂包括但不限于带有羧基的胶乳微球、乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺、水合肼、高碘酸钠、醛基化聚乙二醇和硼氢化钠等等，耗材包括但不限于试管、烧杯和滴管等等。
其中，带有羧基的胶乳微球是指胶乳微球上具有羧基，本实施例中对带有羧基的胶乳微球的具体种类不做进一步地限定，本领域的技术人员可以根据实际需求进行选择，在一些可选实施例中，带有羧基的胶乳微球为bangs lab公司商业化的羧基化胶乳微球。
由于带羧基的胶乳微球的粒径与透射和散射的效率及角度有关，影响胶乳微球聚集产生的光密度，影响最终试验的敏感度要求，因此，本实施例中对带羧基的胶乳微球的粒径不做进一步地限定，本领域的技术人员可以根据实际需求进行选择，在一些可选实施例中，带有羧基的胶乳微球的粒径为130nm～200nm。
乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺(以下简称EDC)和带有羧基的胶乳微球的质量比为1～10：1；水合肼和带有羧基的胶乳微球的质量比为5～25：1，水合肼的量过量，有利于在带有羧基的胶乳微球上接枝水合肼。
高碘酸钠和内毒素的质量比为1～5：1，高碘酸钠和内毒素的量控制在一定的范围内，有利于将内毒素非活性区域Fc端羟基氧化成醛基。
醛基化的内毒素和激活的胶乳微球的质量比为0.25～7.5：1，醛基化聚乙二醇(以下简称醛基化PEG)和激活的胶乳微球的质量比为5～20：1，硼氢化钠和封闭的胶乳微球的质量比为0.06～0.15：1。采用水合肼和醛基化PEG封闭能在一定程度上屏蔽内毒素的非特异性吸附，且水合肼和醛基化PEG中的内毒素在制备之前，经过无热原处理，能够去除内毒素，与无法去除内毒素的试剂(例如牛血清白蛋白)相比，能够排除环境中的内毒素对样本检测结果的干扰，有利于提升检测结果的准确性和可信度。
带有羧基的胶乳微球对很多蛋白均有非特异性吸附能力，通过醛基化PEG进行封闭，能够直接避免胶乳微球的非特异性吸附，若分子量过小，则避免胶乳微球的非特异性吸附效果不佳，若分子量过大，则会影响胶乳微球上分子的结合能力，在一些优选实施例中，醛基化PEG的分子量为300～1000，较佳地，醛基化PEG的分子量为400～800，例如：可以选择分子量为300～400的醛基化PEG，分子量为400～600的醛基化PEG，还可以选择分子量为600～800的醛基化PEG，以及分子量为800～1000的醛基化PEG。
在制备内毒素胶乳微球的过程中，反应温度为常温，反应时间本领域的技术人员可以根据实际情况控制，在一些可选实施例中，步骤S1、步骤S2和步骤S3每步的反应时间均为1h～3h。
本申请的实施例第二方面提供了一种内毒素胶乳微球，该内毒素胶乳微球采用第一方面的制备方法制备得到。
本申请的实施例第三方面提供了一种内毒素检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2、试剂R3和试剂R4，其中，试剂R1包括第二方面所述的内毒素胶乳微球、缓冲液、防腐剂、稳定剂和表面活性剂；试剂R2包括用真核原核细胞表达的FC-rFC蛋白、缓冲液、防腐剂和稳定剂；试剂R3包括CaCl2、缓冲液、稳定剂和表面活性剂；试剂R4包括缓冲液、防腐剂和稳定剂。
本申请的实施例提供的内毒素检测试剂盒，通过C因子重组蛋白的介导，吸引内毒素胶乳微球聚集，增强散射信号或者减弱透射信号，采用散射的方式检测内毒素，有效的避免了血液本身的透射与吸光的影响，而且内毒素检测试剂盒中试剂可以即用，配合携带有散射检测功能的生化检测仪，可以在10min～15min内得到内毒素检测结果(不含血液处理过程，血液处理过程一般为20min～30min)，而通常的鲎试剂检测内毒素均在30min以上(不含血液处理过程)，提升了检测效率，在临床上例如脓毒症等ICU病人可以通过该内毒素检测试剂盒进行快速检测，协助进行病情判断；此外，该内毒素检测试剂盒中的内毒素胶乳微球能够排除环境中的内毒素对样本检测结果的干扰，有利于提升检测结果的准确性和可信度。
其中，用真核原核细胞表达的FC-rFC蛋白采用如下方法制备得到：
采用基因克隆技术制备含鲎C因子(即Factor C，简称FC)基因的pINFUSE-hIgG1质粒，采用瞬时转染导入HEK293F细胞或者CHO细胞中；
将HEK293F细胞或者CHO细胞培养到适宜的浓度，表达1周～2周后，收集培养液，采用Protein A/G柱纯化得到带有FC标签的重组融合蛋白(recombinant Factor C，以下均缩写为FC-rFC)；
经过凝胶过滤层析后，得到纯度高的蛋白，用10mmol/L、pH为8.0的硼酸盐缓冲液于-80℃下保存备用。
需要说明的是，本领域的技术人员可以根据实际情况确定培养HEK293F细胞或者CHO细胞的浓度，本申请的实施例中对此不做进一步的限定。在制备用真核原核细胞表达的FC-rFC蛋白的过程中，所用的实验方法若无特殊说明，则均为本领域的常规方法。
试剂盒在检测时，试剂R1、试剂R2和试剂R3的体积比为1：1～8：0.5～1.5，剩余部分由试剂R4补充到终体积。
其中，试剂R1中内毒素胶乳微球的体积分数为0.002％～0.01％；试剂R2中用真核原核细胞表达的FC-rFC蛋白的浓度为50～250ug/mL；试剂R3中CaCl2的浓度为50～250mmol/L。
缓冲液包括但不限于PBS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液)、Tris缓冲液(三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液)、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸盐缓冲液、碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液、2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液和氯化铵缓冲液中的一种或几种的组合，当缓冲液为几种的混合物时，彼此间以任意比例混合。
防腐剂包括但不限于山梨酸钾、苯甲酸钠、叠氮钠、亚硝酸钠和Proclin 300中的一种或几种的组合，当防腐剂为几种的混合物时，彼此间以任意比例混合。
稳定剂包括但不限于聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇、BSA(牛血清白蛋白)和抗坏血酸钠中的一种或者几种的组合，当稳定剂为几种的混合物时，彼此间以任意比例混合。
表面活性剂包括但不限于TWEEN系列表面活性剂(例如tween-20)、SPAN系列表面活性剂(例如span-80)和TRITON系列表面活性剂(例如Triton X-100)中的一种或几种的组合，当表面活性剂为几种的混合物时，彼此间以任意比例混合。
本申请实施例提供的内毒素检测试剂盒在使用时，可以依次加入试剂R4、试剂R1、内毒素(血清)、试剂R2和试剂R3，也可以依次加入试剂R4、内毒素(血清)、试剂R1、试剂R2和试剂R3，或者试剂R4、试剂R1、试剂R2、内毒素标准液和试剂R3。
为了对本发明进行进一步详细说明，下面将结合具体实施例对本发明进行进一步说明。本发明中的实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；本发明中的实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为市场购买所得。
实施例1
本实施例提供了一种内毒素胶乳微球的制备方法，包括如下步骤：
(1)取0.1mg粒径为130～200nm的羧基化胶乳微球(bangs lab公司商业化的羧基化胶乳微球)，用10～50mmol/LMES缓冲液(pH为4.0)洗涤2次；加入一定体积的缓冲液，加入0.1mg的EDC(sigma公司购入)，常温下振荡反应15～30min，反应结束后，离心去除上清液，用缓冲液清洗2次，加入过量的水合肼(N2H4)溶液，使得混合溶液中的羧基化胶乳微球的终浓度约为0.1％w/v，在常温下振荡反应90～120min，反应结束后，离心去除上清液，用10～50mmol/L硼酸盐缓冲液(pH为8.0)清洗2次，获得激活的胶乳微球；
(2)取0.5uL 5mg/mL内毒素(sigma公司购入)，与高碘酸钠混合均匀后在避光条件下反应30min，完成氧化，获得醛基化内毒素；
(3)将步骤(2)中的醛基化内毒素与步骤(1)中激活的胶乳微球在常温下混合反应90min，待反应结束后，加入醛基化PEG(醛基化PEG550或醛基化PEG750)，在常温下混合反应90min，反应结束后，再加入30uL 50mmol/L硼氢化钠溶液反应30min，反应结束后，离心去除上清液，用硼酸盐缓冲液洗3次，并用硼酸盐缓冲液重悬为1％w/v的偶联内毒素的胶乳微球溶液，于4℃保存。
实施例2
本实施例提供了一种对内毒素胶乳微球的非特异性识别进行验证的方法，根据实施例1的制备方法分别制备：
(a)裸球：羧基化胶乳微球；
(b)EDC活化胶乳微球：指实施例1步骤(1)中仅用EDC活化后的胶乳微球；
(c)活化后接枝水合肼胶乳微球：指实施例1步骤(1)中制备的激活的胶乳微球；
(d)活化后接枝水合肼与内毒素的胶乳微球：指实施例1步骤(3)中醛基化内毒素与激活的胶乳微球在常温下混合反应后的反应产物；
(e)活化后接枝水合肼与内毒素并用PEG-550封闭的胶乳微球：指实施例1步骤(3)中用醛基化PEG-550封闭的偶联内毒素胶乳微球；
(f)活化后接枝水合肼与内毒素并用PEG-750封闭的胶乳微球：指实施例1步骤(3)中用醛基化PEG-750封闭的偶联内毒素胶乳微球；
(g)活化后接枝水合肼并用PEG-550封闭的胶乳微球：指激活的胶乳微球未与醛基化内毒素反应，直接用醛基化PEG-550封闭的胶乳微球；
(h)活化后接枝水合肼并用PEG-750封闭的胶乳微球：指激活的胶乳微球未与醛基化内毒素反应，直接用醛基化PEG-750封闭的胶乳微球。
对(a)至(h)制得的胶乳微球进行非特异性吸附，得到如图2所示的结果图，由图2可以看出，(a)裸球本身具有一定的非特异性吸附rFC的能力，会影响检测的准确性，当在裸球上接枝水合肼，获得(c)活化后接枝水合肼胶乳微球时，水合肼可以大幅度阻隔裸球的非特异性吸附，当在裸球上采用水合肼接枝与醛基化PEG封闭后，获得(g)活化后接枝水合肼并用PEG-550封闭的胶乳微球和(h)活化后接枝水合肼并用PEG-750封闭的胶乳微球时，基本完全解除了裸球的非特异性吸附，直接避免了裸球的非特异性识别的问题，当在裸球上接枝内毒素，获得(e)活化后接枝水合肼与内毒素并用PEG-550封闭的胶乳微球和(f)活化后接枝水合肼与内毒素并用PEG-750封闭的胶乳微球时，会使胶乳微球具有特异性识别rFC并产生聚集的能力；此外，由图2可以看出，用PEG-550和用PEG-750封闭的胶乳微球的信号有差异，这是由于PEG分子量的大小对于内毒素暴露在外的基团有明显的限制，从而导致胶乳微球外表面的可活动区域不同，造成封闭后内毒素暴露的基团不同，导致对rFC的识别效率不一样，从而导致信号有差异。
用(f)活化后接枝水合肼与内毒素并用PEG-750封闭的胶乳微球进行水相内毒素检测，得到如图3所示的结果图，由图3可以看出，内毒素的含量不同，胶乳微球对内毒素的响应信号也有差异，但(f)活化后接枝水合肼与内毒素并用PEG-750封闭的胶乳微球可以在内毒素的含量为0.001～10EU/mL范围内产生明显的响应。
实施例3
本实施例提供了一种对内毒素检测试剂盒的制备方法，包括：
(1)试剂R1的制备：
Figure BDA0003524089510000101
按照试剂R1中各组分的含量，将各组分物质置于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R1；
(2)试剂R2的制备：
Figure BDA0003524089510000111
按照试剂R2中各组分的含量，将各组分物质置于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R2；
(3)试剂R3的制备：
Figure BDA0003524089510000112
按照试剂R3中各组分的含量，将各组分物质置于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R3；
(4)试剂R4的制备：
Figure BDA0003524089510000113
按照试剂R4中各组分的含量，将各组分物质置于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R4；
在使用时，将试剂R1、试剂R2、试剂R3和试剂R4以及内毒素(血清)按照特定的顺序和比例加入，即可使用。
实施例4
本实施例提供了一种内毒素检测试剂盒的测定方法，包括如下步骤：
(1)标准曲线的制定：
配制内毒素标准液：配制内毒素的终浓度为0、0.001EU/mL、0.01EU/mL、0.1EU/mL、1.0EU/mL、10EU/mL、100EU/mL的溶液，该溶液中除了内毒素外，还含有抗坏血酸钠、Tween-20和PEG600；
将试剂R1、试剂R2、试剂R3、试剂R4以及内毒素标准液按照1：1：1：6：1的比例进行混合，得到胶乳微球混合液，胶乳微球混合液的总体积为400～1000uL，加入顺序依次为试剂R4、试剂R1、试剂R2、内毒素标准液和试剂R3；将胶乳微球混合液用移液器吸打进入比色皿中，测定胶乳微球混合液的散射信号强度，按照信号变化计算出标准曲线，得到如图4和图5所示的结果图，根据图4各个曲线的斜率，制作标准曲线，得到图5所示的标准曲线。
(2)内毒素的检测：
取含内毒素的样品，用检测缓冲液梯度稀释2、4、8、16、32、64倍，稀释后各分为两份，其中一份另行添加0.5EU/mL内毒素标准品作为对照，记为S0，另一份记为S1，每个样品平行测定3次，取平均值；
将试剂R1、试剂R2、试剂R3、试剂R4以及样品溶液S(包括S0和S1)按照1：1：1：6：1的比例进行混合，得到胶乳微球混合液，胶乳微球混合液的总体积为400～1000uL，加入顺序为试剂R4、试剂R1、试剂R2、内毒素标准液和试剂R3；将胶乳微球混合液用移液器吸打进入比色皿，测定胶乳微球混合溶液的散射信号强度，按照信号变化，从标准曲线中计算得到内毒素浓度，计算结果如表1所示。
表1
Figure BDA0003524089510000131
根据表1中的结果计算，该含内毒素的样品中含有5EU/mL左右的内毒素，添加0.5EU/mL作为对照的组别，也可以很精确的计算得出结果。
为了检测试剂盒的检测效果，同时在多种样品中添加相同量的内毒素，以检测结果值/内毒素的添加量＝回收率，可以发现不同样品回收率有较大不同，图6为不同样品中的内毒素检测回收率示意图，由图6可以看出，在灭菌注射用水中回收率为0.99，说明本实施例中的检测试剂盒检测内毒素的效果明显。基于内毒素的特性，血浆样品(兔血浆或人血浆)中本身会存在内毒素，而血清与灭菌注射用水中表现良好，说明本实施例中的检测试剂盒可以适用于水相与血清中的内毒素检测。
实施例5
本实施例提供了内毒素检测试剂盒各项性能指标测试
(1)灵敏度试验
测定7种不同的内毒素含量的样品，即内毒素的浓度分别为0.0001EU/mL、0.0002EU/mL、0.0005EU/mL、0.001EU/mL、0.002EU/mL、0.005EU/mL、0.01EU/mL，每个样品测10次，通过计算均值和SD值(标准差值)，得到如表2所示的结果，从表2可见，本实施例中的检测试剂盒的灵敏度为0.001EU/mL。
表2
Figure BDA0003524089510000141
(2)高值线性测定
测定6个不同内毒素含量的样品，即内毒素的浓度分别为0.001EU/mL、0.010EU/mL、0.100EU/mL、1EU/mL、10EU/mL、100EU/mL，每个样品测3次，得到表3所示的结果，从表3可见，本实施例中的检测试剂盒的最高检测范围可达到100EU/mL，判定依据r2≥0.990。
表3
Figure BDA0003524089510000142
(3)精密度试验
使用2个不同内毒素含量的样品，测定本实施例中的检测试剂盒的批内精密度，使用3批次检测试剂盒分别测定1个样品20次，计算本实施例中的检测试剂盒的批间相对极差，得到表4和表5所示的结果。结果表明，本实施例中的检测试剂盒的批内精密度为6.95％(见表4，以误差最大值计)，批间相对极差为5％(见表5，以误差最大值计)。
表4
Figure BDA0003524089510000151
表5
Figure BDA0003524089510000152
(4)稳定性试验
在2～8℃贮存条件下，分别在0天、2周、1个月、2个月、4个月、6个月、8个月、12个月对同一血清样品进行测定，每个样品测5次，取平均值(结果见表6)。结果表明，6个月以前的测得值相比0天差异很小，说明本发明的检测试剂盒在2～8℃贮存条件下可稳定6个月。
表6
Figure BDA0003524089510000153
Figure BDA0003524089510000161
由以上实施例可以看出，本发明实施例提供的内毒素检测试剂盒具有灵敏度高、特异性好、准确性好、抗干扰性好及生产成本低的优点。
虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种内毒素胶乳微球的制备方法，其特征在于，包括：
将带有羧基的胶乳微球和乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺混合反应，待反应结束后，加入水合肼继续混合反应，获得激活的胶乳微球；
用高碘酸钠将内毒素非结合活性区域Fc端羟基氧化成醛基；
将所述激活的胶乳微球和醛基化的内毒素混合反应，待反应结束后，加入醛基化聚乙二醇封闭胶乳微球上未反应的基团，待反应结束后，再加入硼氢化钠继续反应，获得偶联内毒素的胶乳微球。
2.根据权利要求1所述的内毒素胶乳微球的制备方法，其特征在于，所述乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺和所述带有羧基的胶乳微球的质量比为1～10：1；所述水合肼和所述带有羧基的胶乳微球的质量比为5～25：1。
3.根据权利要求1所述的内毒素胶乳微球的制备方法，其特征在于，所述高碘酸钠和所述内毒素的质量比为1～5：1。
4.根据权利要求1所述的内毒素胶乳微球的制备方法，其特征在于，所述醛基化的内毒素和所述激活的胶乳微球的质量比为0.025～7.5：1，所述醛基化聚乙二醇和所述激活的胶乳微球的质量比为5～20：1，所述硼氢化钠和封闭的胶乳微球的质量比为0.06～0.15：1。
5.根据权利要求1所述的内毒素胶乳微球的制备方法，其特征在于，所述醛基化聚乙二醇的分子量为300～1000。
6.一种内毒素胶乳微球，其特征在于，采用权利要求1至5任一项所述的制备方法制备得到。
7.一种内毒素检测试剂盒，其特征在于，包括试剂R1，所述试剂R1包括如权利要求6所述的内毒素胶乳微球。
8.根据权利要求7所述的内毒素检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1还包括缓冲液、防腐剂、稳定剂和表面活性剂。
9.根据权利要求7所述的内毒素检测试剂盒，其特征在于，还包括试剂R2、试剂R3和试剂R4，所述试剂R2包括用真核原核细胞表达的FC-rFC蛋白、缓冲液、防腐剂和稳定剂；所述试剂R3包括CaCl2、缓冲液、稳定剂和表面活性剂；所述试剂R4包括缓冲液、防腐剂和稳定剂。
10.根据权利要求9所述的内毒素检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1、所述试剂R2和所述试剂R3的体积比为1：1～8：0.5～1.5，所述试剂R1中所述内毒素胶乳微球的体积分数为0.002％～0.01％，所述试剂R2中所述用真核原核细胞表达的FC-rFC蛋白的浓度为50～250ug/mL，所述试剂R3中所述CaCl2的浓度为50～250mmol/L。
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