CN109772269A - 一种内毒素吸附剂及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明以KB为配体、交联纤维素微球为载体制备内毒素吸附剂。包括以粉状纤维素为载体材料制备适宜粒径、机械强度良好的纤维素微球载体；对纤维素微球进行活化、修饰，改变其末端基团并延长固定配体的手臂，得到醛基末端的载体；考查KB在配体固定反应体系中的稳定性，并以醛基末端的载体固定KB得到内毒素吸附剂；最后，用试验证实了所得到的吸附剂对内毒素等的吸附作用。可以用于体外吸附细菌内毒素，肽聚糖和CpG DNA。

Description

一种内毒素吸附剂及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种内毒素吸附剂及其制备方法和用途。

背景技术

脓毒症(sepsis)是由感染引起的全身性炎症反应综合征(SystemicInflammatory Response Syndrome,SIRS)，根据严重程度可分为脓毒症、严重脓毒症、脓毒性休克，最 终可导致多器官功能障碍综合征(MODS)，而后者则是造成重症监护病房(ICU)患者 死亡的主要原因。尽管在医疗卫生领域科技不断进步的今天，ICU危重症救治技术水平 大幅提升，但脓毒症仍是医学界尚未攻克的难题，其高发病率(约50-95/10万)、高死亡率(高达70％)、高治疗耗费始终威胁着人类健康。针对脓毒症目前尚无特效的治疗药物 或方法，临床上主要通过控制感染、体液复苏、升压治疗、控制血糖、机械通气等方法 来控制脓毒症的发展。

内毒素(endotoxin)是革兰氏阴性菌裂解时释放的一种细胞壁成分——脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)，主要结构为脂质A、核心多糖及多糖O-抗原三部分，其中脂 质A(Lipid A)为内毒素的主要毒性成分。革兰氏阴性感染时内毒素进入人体循环系统， 刺激单核-巨噬细胞系统(mononuclear phagocyte system)免疫应答，释放肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素(IL-1、IL-6)、一氧化氮(NO)等细胞因子，引发炎症级联反应， 最终炎症反应失控发展成为全身炎症反应综合征(SIRS)，导致机体发热(故又称内毒素 为热原，pyrogen)，并造成血压骤降、血管栓塞、糖脂代谢紊乱等。因此，内毒素被认 为在革兰氏阴性菌所致脓毒症的发病早期起到关键作用，是后续级联反应的起点。

基于上述观点，若能在感染早期控制并降低患者体内的内毒素水平，一方面可减少 内毒素的直接毒性作用，另外还能减弱甚至阻断其所引发的炎症反应。但抗生素治疗对其几乎无效，相反，抗生素的杀菌作用破坏细菌细胞壁后会产生更多的内毒素而加重炎 症反应。20年来，随着血液净化技术在脓毒症治疗中的应用，及亲和色谱法在医药工业 中的应用，越来越多的研究关注到内毒素的体外亲和吸附对于脓毒症治疗的潜在意义。 区别于传统的非特异性吸附依靠孔隙吸附作用、分子间作用力、离子交换作用，亲和色 谱法是利用大分子某一部位的结构特性与特定的配体(又称配基，ligand)间的结合作用 来达到层析或吸附的目的，作用机制可形象地表现为“钥匙与锁孔”。这种亲和作用往往 不是单一的作用力，而是基于特定化学结构和空间构象的大分子基团与配体之间静电吸 引、氢键、色散力、配位键等作用力的综合。

理想的内毒素亲和吸附剂有良好的血液相容性、理化稳定性、大比表面积，此外，对内毒素和其他血液成分的选择性吸附是至关重要的，这就要求吸附剂具有对内毒素高度亲和而不吸附其他血液成分的配体。已报道的内毒素配基包括多粘菌素B(polymyxin B,PMB)、氨基酸类、聚阳离子类(如聚乙烯亚胺PEI、聚赖氨酸PLL等)、脱氧胆酸(DOC)、 壳聚糖等。多粘菌素B是由10个氨基酸构成的七肽环两亲性抗生素，结构中含有5个氨 基正电荷、6个二氨基丁酸残基(Dab残基)和1条N-末端疏水酰基链的(如下所示)， PMB可通过其伯氨基正电荷与脂多糖磷酸基团的库仑力、末端酰基链与脂多糖末端脂肪 酸链的强疏水作用实现与内毒素分子以1：1的化学计量比结合。因其强烈的肾毒性及神 经毒性作用限制了体内应用，故而将其固定于聚苯乙烯衍生物纤维或其他载体材料上。 PMB是目前针对内毒素吸附应用最广、相对成熟的配基。氨基酸类配基有组胺(Him)、 组氨酸(His)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)等，研究表明氨基酸类配基对内毒素的 吸附机制与多粘菌素B相似，如组胺主要是通过仲胺基所携带正电荷与LPS磷酸基团的 静电作用、咪唑环及己二胺手臂与LipidA的疏水作用吸附内毒素。此外，不同氨基酸配 体对内毒素亲和力的研究发现，氨基酸的等电点(pI)越高(氨基数量多或解离度高)、 极性越大，对内毒素的吸附作用越强。几种典型的配体结构及与载体的固定方式如下所 示。

前述配基中多粘菌素B的研究相对成熟，且已有供临床辅助治疗脓毒症的产品上市， 但其他带正电荷的配基因选择性吸附较差鲜有临床试验研究。积极寻找对内毒素具有高 亲和力、高选择性的配基对内毒素吸附法治疗脓毒症意义重大。

苦柯胺B(Kukoamine B,苦柯胺B，KB)是从中药地骨皮(Cortex Lycii)提取分离得到的一种生物碱，其结构为二氢咖啡酸酰化的精胺，结构如下所示。郑江等选择内毒 素(LPS)及细菌CpG DNA为靶点，通过生物传感器从114味中药中筛选出对靶标最高 表现最高亲和力的地骨皮，随后使用生物传感器偶联色谱法分离出地骨皮成分中的高亲 和力部位，并最终纯化出能同时拮抗脂多糖LPS和CpG DNA的苦柯胺B。其中，CpG DNA 在脓毒症发病过程中能直接刺激单核巨噬细胞系统及树突状细胞释放炎症因子。刘鑫等 进一步地验证了苦柯胺B对LPS及CpG DNA的体内外亲和作用，结果显示与二者的亲 和力常数分别为7.4nM和197.2nM。苦柯胺B能与LPS分子结合形成复合物，这种结合 作用将改变LPS的构象，使其不能被相应的受体识别而阻断了对受体的激活，从而抑制 了炎症介质的释放和炎症反应的发生。

发明内容

本发明的目的在于提供一种内毒素吸附剂。

本发明所述的内毒素吸附剂对细菌内毒素、CpG DNA、肽聚糖等能有效的吸附并清除。

本发明所述的内毒素吸附剂，结构上分为对内毒素具有高亲和力的配基和固定配基 的载体，配基为苦柯胺B，载体为纤维素醚，在配基和载体之间通过一定长度的固定手臂连接。

本发明所述的内毒素吸附剂，其结构如式Ⅰ或式Ⅱ所示：

其中，n2为≥2的正整数，

优选的，n2取值范围为2-4。

或

其中，n1、n2为≥2的正整数，

优选的，所述n1取值范围为2-6，n2取值范围为2-4。

根据本发明实施例之一，内毒素吸附剂的结构如下所示：

根据本发明实施例之一，内毒素吸附剂的结构如下所示：

根据本发明实施例之一，内毒素吸附剂的结构如下所示：

本发明的另一个目的在于提供内毒素吸附剂的制备方法。

本发明所述的制备方法，包括以下步骤：

(1)环氧基纤维素微球Epoxy CMs的制备

①纤维素的溶解

以7：12：81的质量比配制氢氧化钠-尿素-水混合溶液若干，备用。取上述溶液若干预冷却至-12℃，加入一定量的纤维素剧烈搅拌约5min至纤维素完全溶解，超声脱气得 到澄清的纤维素溶液。

②反相悬浮交联法制备湿态纤维素微球

向500mL三颈圆底烧瓶中加入200mL液体石蜡、2-10g Span80，常温下以400r/min的转速搅拌30min后，将40-100mL 4％纤维素溶液于30min内缓慢滴入烧瓶中，转速 保持400rpm。

将3mL环氧氯丙烷加入体系中，转速不变，升温至40℃保持5h。结束后静置，移 除上层液体石蜡，用稀盐酸洗至中性后用乙醇、大量蒸馏水依次淋洗，至：向洗涤液中 加入适量硫代硫酸钠Na₂S₂O₃(浓度约为1.3M)，常温振摇2h后加入酚酞不变红，确保 纤维素微球中无ECH及OH^-残留。真空抽干至一定压力下无水渗出，即得湿态纤维素微 球。

③环氧化反应制备环氧基纤维素微球

取上述抽干的湿态纤维素微球放入小烧瓶中，向其中依次加入二甲基亚砜DMSO、环氧氯丙烷、NaOH水溶液，振摇均匀后于40℃恒温水浴摇床上振荡反应2-6h。

反应结束后，经大量蒸馏水在超声波中洗涤。至：向洗涤液中加入适量Na₂S₂O₃(浓度约为1.3M)，常温振摇2h后加入酚酞不变红，确保纤维素微球中无ECH及OH^-残留。

洗涤过的纤维素微球经真空抽干，即得环氧基纤维素微球Epoxy CMs。

(2)醛基纤维素微球Aldehyde CMs的制备

①氨基纤维素微球Amino CMs的制备

取上述洗涤过的环氧基纤维素微球置于小烧瓶中，向小烧瓶内加入25％氨水或20-50％ 的乙二胺、己二胺等的甲醇或水溶液，密封，40℃下振荡反应2-5h。

反应结束后，大量蒸馏水淋洗纤维素微球至淋洗液呈中性，确保纤维素微球中无氨 基分子残留，真空抽干，即得氨基纤维素微球Amino CMs。

②醛基纤维素微球Aldehyde CMs的制备

取上述制备胺化纤维素微球置于小烧瓶中，向小烧瓶内加入20-50％的戊二醛、丁二 醛等二醛溶液，密封，常温下振荡反应4-8h。反应结束后，大量蒸馏水于超声波中洗涤，至洗涤液与2,4-二硝基苯肼反应呈阴性，真空抽干，即得醛基纤维素微球Aldehyde CMs。(3)固定化苦柯胺B(CM-nC-KB)的制备

取醛基纤维素微球，加入一定浓度的草酸KB溶液一定量，混匀，用饱和NaHCO₃溶液调节pH至7.0，常温下于摇床上振荡反应，避光。反应结束后保护KB中的羰基， 以催化加氢还原碳氮双键即得。

其中，草酸KB溶液的浓度为3-4mg/mL。草酸KB溶液的溶剂为30-80％DMSO-水； 震荡反应时间为8-12h。

其中，纤维素醚载体通过一定长度的固定手臂能有效地连接苦柯胺B。

本发明的另一个目的在于提供内毒素吸附剂的药物应用。

本发明所述的式Ⅰ或式Ⅱ所示的内毒素吸附剂在制备体外吸附细菌内毒素、CpGDNA、 肽聚糖的药物中的应用。

内毒素高亲和力提示我们苦柯胺B也可作为内毒素吸附剂的配体，其伯氨基活性较 高，可作为枝接基团与载体反应将苦柯胺B固定。而苦柯胺B分子结构中其他含氮基团即精胺骨架上仲胺、叔胺，可通过静电作用吸引LPS的磷酸基团。此外，与载体固定时 可引入一定长度的碳链，从而达到对Lipid A末端脂肪酸链的疏水作用。

本发明以KB为配体、交联纤维素微球为载体制备内毒素吸附剂。包括以粉状纤维素为载体材料制备适宜粒径、机械强度良好的纤维素微球载体；对纤维素微球进行活化、修饰，改变其末端基团并延长固定配体的手臂，得到醛基末端的载体；考查KB在配体 固定反应体系中的稳定性，并以醛基末端的载体固定KB得到内毒素吸附剂；最后，用 试验证实了所得到的吸附剂对内毒素等的吸附作用。可以用于体外吸附细菌内毒素，肽 聚糖和CpGDNA。

该吸附剂在结构上分为两部分：其一即对内毒素具有高亲和力的配基；其二则是固 定配基的载体。所述配基为苦柯胺B，所述载体为纤维素醚，在配基和载体之间通过一定长度的固定手臂连接。

本发明的内毒素吸附剂，对于细菌内毒素、CpG DNA、肽聚糖具有非常好的吸附和清除的效果。此外，本发明的制备方法操作简单，节约制备时间，降低成本，特别适合 大规模生产。

对说明书中词语作进一步的解释：

KB：苦柯胺B

草酸KB：草酸苦柯胺B

CpG DNA：CpG序列；含胞嘧啶鸟嘌呤核苷酸的免疫刺激元件

MODS：多器官功能障碍综合征

ICU：重症监护病房

LPS：脂多糖

PMB：多粘菌素B

Lipid A：脂质A

具体实施方式

以下实施例是对本发明技术方案的最终吸附剂形式的具体举例，本发明包括但不限 于9C手臂的固定化KB、12C手臂的固定化KB、16C手臂的固定化KB这三种最终形式。

实施例1：环氧基纤维素微球的制备

以7：12：81的质量比配制氢氧化钠-尿素-水混合溶液若干，备用。取上述溶液200mL预冷却至-12℃，加入8g纤维素剧烈搅拌约5min至纤维素完全溶解，超声脱气得到 澄清的纤维素溶液。向500mL三颈圆底烧瓶中加入200mL液体石蜡、8g Span80，常 温下以400r/min的转速搅拌30min后，将60mL 4％纤维素溶液于30min内缓慢滴入烧 瓶中，转速保持400rpm。将3mL环氧氯丙烷加入体系中，转速不变，升温至40℃保持 5h。结束后静置，移除上层液体石蜡，用稀盐酸洗至中性后用乙醇、大量蒸馏水依次淋 洗，至：向洗涤液中加入适量硫代硫酸钠Na₂S₂O₃(浓度约为1.3M)，常温振摇2h后加 入酚酞不变红，确保纤维素微球中无ECH及OH^-残留。真空抽干至一定压力下无水渗出， 即得湿态纤维素微球。所得纤维素微球，经检测，其粒径D_0.9约为330μm。

取上述抽干的湿态纤维素微球放入小烧瓶中，向其中依次加入二甲基亚砜DMSO、环氧氯丙烷ECH、NaOH水溶液，振摇均匀后于40℃恒温水浴摇床上振荡反应4h。反 应结束后，经大量蒸馏水在超声波中洗涤。至：向洗涤液中加入适量Na₂S₂O₃(浓度约为 1.3M)，常温振摇2h后加入酚酞不变红，确保纤维素微球中无ECH及OH^-残留。洗涤过 的纤维素微球经真空抽干，即得环氧基纤维素微球Epoxy CMs。经检测环氧基固载量为 100μmol/g(wet)。

实施例2：氨基、醛基、苦柯胺B固载量的计算

①氨基纤维素微球氨基含量测定

采用返滴定法测定胺化纤维素微球中的末端氨基含量，通过过量定量的盐酸将伯氨 基质子化，NaOH标准溶液滴定剩余盐酸。

准确称取所制的胺化纤维素微球5g置于小烧瓶中，向小烧瓶内加入0.01mol/LHCl 标准溶液25mL，密封，于室温下振荡12h，使HCl溶液与纤维素微球充分接触、伯氨 基充分质子化。反应结束后静置，定量吸取一定量的上清液，以酚酞试液(0.5％酚酞的 乙醇溶液)为指示剂用0.01mol/L NaOH标准溶液滴定剩余盐酸。氨基含量通过公式(2-2) 估算。

其中：AM为载体末端伯氨基含量(μmol/g)，C₁、C₂分别为HCl、NaOH标准溶液 的浓度(mol/L)，V₀为与纤维素微球反应的HCl标准溶液体积(mL)，V₁为反应结束后 所取上清液的体积(mL)，V₂为滴定所用NaOH标准溶液体积(mL)，w为氨基纤维素 微球的质量(g)。

②醛基纤维素微球醛基含量测定

取3.5g NH₂OH·HCl溶于15mL水中，用无水乙醇稀释至100mL，待用。取吡啶5mL 及0.4％溴酚兰乙醇溶液0.5mL，用无水乙醇稀释至250mL，待用。测定时，称取一定量 的醛基纤维素微球，加入上述NH₂OH·HCl溶液10mL、吡啶溶液50mL，常温下置于摇床 中反应4h，反应结束后用NaOH的乙醇标准溶液滴定至溶液由黄色变为蓝绿色。醛基含 量通过公式(2-3)计算。

其中：AD为载体醛基的含量(μmol/g)，C为NaOH乙醇标准液的浓度(mol/L)， V为消耗NaOH乙醇标准液的体积(mL)，w为醛基纤维素微球质量(g)。

③固定化苦柯胺B中KB固载量的测定

色谱条件：

高压泵系统：LC-20AT型高效液相色谱仪

检测器：SPD-10Avp型紫外可见光检测器

色谱柱：Sepax TechnologiesAmetyst C18-H(4.6×150mm,5μm)

检测波长：280nm

流动相：甲醇-20mM四丁基硫酸氢铵水溶液(15:85)(氨水调pH至3.0)

柱温：30℃

流速：1mL/min

进样量：20μL

反应结束后，将反应体系超声处理10min，静置，取上清液若干，经微孔滤头滤过(滤头经KB溶液饱和)，滤过液按上述色谱条件进样，记录峰面积，计算KB浓度，按 如下公式计算KB固载量。

其中，KB为载体上KB的含量(mg/g)，C₀为反应体系中草酸KB的初始浓度(mg/mL)，V为反应体系中加入草酸KB溶液的体积(mL)，C为反应结束后测得KB的浓度(mg/mL)， 0.855为草酸KB与KB的质量换算系数。

实施例3：9C手臂的固定化KB

取实施例1所制环氧基纤维素微球2g与4mL 25％氨水在40℃水浴中振荡反应3h。以实施例2中氨基含量测定法测定末端氨基固载量可达60μmol/g以上。取上述氨基纤维 素微球2g与5mL 20％戊二醛溶液室温下振荡反应6h。以实施例2中醛基含量测定法测 定末端醛基固载量可达50μmol/g。取上述醛基纤维素微球5g，3mg/mL草酸KB的 75％DMSO溶液，pH调节至7.0，常温，振荡反应6h。以实施例2中苦柯胺B固载量测 定法测定KB固载量可达11mg/g。结构如下：

实施例4：12C手臂的固定化KB

取实施例1所制环氧基纤维素微球2g与6mL 40％乙二胺在50℃水浴中振荡反应5h。 以实施例2中氨基含量测定法测定末端氨基固载量可达60μmol/g以上。取上述氨基纤维 素微球2g与5mL 20％戊二醛溶液室温下振荡反应6h。以实施例2中醛基含量测定法测定末端醛基固载量可达70μmol/g。取上述醛基纤维素微球5g，3mg/mL草酸KB的 75％DMSO溶液，pH调节至7.0，常温，振荡反应6h。以实施例2中苦柯胺B固载量测 定法测定KB固载量可达18mg/g。结构如下：

实施例5：16C手臂的固定化KB

取实施例1所制环氧基纤维素微球2g与6mL 25％己二胺在50℃水浴中振荡反应5h。 以实施例2中氨基含量测定法测定末端氨基固载量可达50μmol/g以上。取上述氨基纤维 素微球2g与5mL 20％戊二醛溶液室温下振荡反应6h。以实施例2中醛基含量测定法测定末端醛基固载量可达70μmol/g。取上述醛基纤维素微球5g，3mg/mL草酸KB的 75％DMSO溶液，pH调节至7.0，常温，振荡反应6h。以实施例2中苦柯胺B固载量测 定法测定KB固载量可达25mg/g。结构如下：

通过如下实验，进一步说明本发明的技术效果。

取本发明实施例3所得吸附剂为样品1；

取本发明实施例4所得吸附剂为样品2；

取本发明实施例5所得吸附剂为样品3；

按中国发明专利CN 103769060 B制备纤维素-苦柯胺B为样品4。

其中，样品4的纤维素-苦柯胺B的可能结构为：

实施例6：吸附剂对细菌内毒素的吸附能力测试

①实验方法：将一定量的细菌内毒素溶于大鼠血浆中，配制成含细菌内毒素5EU/mL 的血浆溶液。取血浆溶液10mL，分别加入1g吸附剂，并以空白纤维素载体(未连接苦 柯胺B)为对照组，37℃振荡反应60min，离心，检测上清中细菌内毒素的量。检测方法 采用动态浊度法(鲎试验)，具体实验方法参照中国药典(二部)附录ⅪE细菌内毒素 检查法和文献“卫国,郑江.细菌内毒素定量检测的影响因素分析及对策.局解手术学杂 志,2003,12:215-216.”。本实验重复三次，结果以平均值±标准偏差表示。血浆中细菌内 毒素的初始量减去吸附后的剩余量即为被吸附的量，被吸附的量除以吸附剂用量即为吸 附量。

②实验结果：空白载体对细菌内毒素没有吸附作用，连接有苦柯胺B的吸附剂则具有 较好的吸附作用，吸附量如表1所示。

表1四种吸附剂对细菌内毒素的吸附效果

吸附剂	吸附量(EU/g吸附剂)
		样品1	35±2
样品2	38±3
		样品3	47±3
样品4	29±2

实施例7：吸附剂对细菌DNA(CpG ODN 1826)的吸附能力测试

①实验方法：将一定量的CpG ODN 1826溶于大鼠血浆中，配制成含CpG ODN 18262 ng/mL的血浆溶液。取血浆溶液10mL，分半加入1g吸附剂，并以纤维素空白载体(未连 接苦柯胺B)为对照组，37℃振荡反应60min，离心，检测上清中CpG ODN 1826的量。 检测方法采用LC-MS法，具体实验方法参照文献“Cen Y,Li X,Liu D,et al.Developmentandvalidation of LC-MS/MS method for the detection and quantification of CpGoligonucleotides 107(CpG ODN107)and its metabolites in mice plasma.J PharmBiomed Anal.2012；70:447-455.”。本实验重复三次，结果以平均值±标准偏差表示。血浆中CpG ODN 1826的初始量减去吸附后的剩余量即为被吸附的量，被吸附的量除以吸附剂用量即为吸 附量。

②实验结果：空白载体对CpG ODN 1826没有吸附作用，连接有苦柯胺B的吸附剂则具有较好的吸附作用，吸附量如表2所示。

表2四种吸附剂对细菌DNA(CpG ODN 1826)的吸附效果

吸附剂	吸附量(ng/g吸附剂)
		样品1	18±2
样品2	21±3
		样品3	24±3
样品4	12±2

实施例8：吸附剂对细菌肽聚糖(胞壁酰二肽)的吸附能力测试

①实验方法：将一定量的胞壁酰二肽溶于大鼠血浆中，配制成含胞壁酰二肽2ng/mL 的血浆溶液。取血浆溶液10mL，加入1g吸附剂，并以空白载体(未连接苦柯胺B)为对 照组，37℃振荡反应60min，离心，检测上清中胞壁酰二肽的量。检测方法采用LC-MS 法，具体实验方法参照文献“Volz T,Nega M,Buschmann J,et al.Natural Staphylococcusaureus-derived peptidoglycan fragments activate NOD2and act as potentcostimulators of the innate immune system exclusively in the presence of TLRsignals.FASEB J.2010；24(10):4089-4102.”。本实验重复三次，结果以平均值±标准偏差表示。血浆中胞壁 酰二肽的初始量减去吸附后的剩余量即为被吸附的量，被吸附的量除以吸附剂用量即为 吸附量。

②实验结果：空白载体对胞壁酰二肽没有吸附作用，连接有苦柯胺B的吸附剂则具有 较好的吸附作用，吸附量如表3所示。

表3四种吸附剂对细菌肽聚糖(胞壁酰二肽)的吸附效果

实施例9：吸附剂对细菌内毒素、DNA(CpG ODN 1826)和肽聚糖(胞壁酰二肽) 混合物的吸附能力测试

①实验方法：将一定量的细菌内毒素、CpG ODN 1826和胞壁酰二肽溶于大鼠血浆中，配制成含细菌内毒素2EU/mL、CpG ODN 1826 1ng/mL和胞壁酰二肽1ng/mL的混合 血浆溶液。取混合血浆溶液10mL，加入1g吸附剂，37℃振荡反应60min，离心，检测上 清中细菌内毒素、CpG ODN 1826和胞壁酰二肽的量。实验重复三次，结果以平均值±标 准偏差表示。混合血浆中细菌内毒素、CpG ODN 1826和胞壁酰二肽各自的初始量减去吸 附后各自的剩余量即为被吸附的量，各自被吸附的量除以吸附剂用量即为吸附量。

实验结果：当细菌内毒素、DNA(CpG ODN 1826)和肽聚糖(胞壁酰二肽)混合存 在时，四种吸附剂均具有较好的吸附作用，吸附量如表4所示。

表4四种吸附剂对细菌内毒素、DNA和肽聚糖混合物的吸附效果

结论：上述实验结果显示，纤维素微球对苦柯胺B的固载量受固定手臂的长度影响较大，且手臂长度最终影响了吸附剂对细菌内毒素、CpG DNA、肽聚糖等致病因子的吸 附。故本发明通过环氧化反应、胺化反应、醛化反应等三步反应对环氧基进行修饰和固 定手臂的延长，使苦柯胺B的固载量增大、吸附剂吸附能力增强，另一方面，手臂的延 长使空间位阻减小，也有利于吸附剂配基对内毒素等致病因子的吸附作用。

Claims (10)

1.一种内毒素吸附剂，结构上分为对内毒素具有高亲和力的配基和固定配基的载体，所述配基为苦柯胺B，所述载体为纤维素醚，在配基和载体之间通过一定长度的固定手臂连接，其特征在于，内毒素吸附剂的结构式如下：

其中，n2为≥2的正整数,优选的，n2取值范围为2-4。

2.一种内毒素吸附剂，结构上分为对内毒素具有高亲和力的配基和固定配基的载体，所述配基为苦柯胺B，所述载体为纤维素醚，在配基和载体之间通过一定长度的固定手臂连接，其特征在于，内毒素吸附剂的结构式如下：

其中，n1、n2为≥2的正整数,优选的，所述n1取值范围为2-6，n2取值范围为2-4。

3.如权利要求1所述的内毒素吸附剂，其特征在于，内毒素吸附剂的结构式如下：

4.如权利要求2所述的内毒素吸附剂，其特征在于，内毒素吸附剂的结构式如下：

5.如权利要求2所述的内毒素吸附剂，其特征在于，内毒素吸附剂的结构式如下：

6.权利要求1或2所述的内毒素吸附剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)环氧基纤维素微球Epoxy CMs的制备：

(2)醛基纤维素微球Aldehyde CMs的制备：

①氨基纤维素微球Amino CMs的制备，反应过程如下：

②醛基纤维素微球Aldehyde CMs的制备，反应过程如下：

(3)固定化苦柯胺B(CM-nC-KB)的制备，反应过程如下：

7.权利要求3所述内毒素吸附剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

取环氧基纤维素微球2g与4mL 25％氨水在40℃水浴中振荡反应3h，得氨基纤维素微球；取上述氨基纤维素微球2g与5mL 20％戊二醛溶液室温下振荡反应6h，得醛基纤维素微球；取上述醛基纤维素微球5g，3mg/mL草酸KB的75％DMSO溶液，pH调节至7.0，常温，振荡反应6h，即得。

8.权利要求4所述内毒素吸附剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

取环氧基纤维素微球2g与6mL 40％乙二胺在50℃水浴中振荡反应5h，得氨基纤维素微球；取氨基纤维素微球2g与5mL 20％戊二醛溶液室温下振荡反应6h，得醛基纤维素微球；取醛基纤维素微球5g，3mg/mL草酸KB的75％DMSO溶液，pH调节至7.0，常温，振荡反应6h，即得。

9.权利要求5所述内毒素吸附剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

取环氧基纤维素微球2g与6mL 25％己二胺在50℃水浴中振荡反应5h，即得氨基纤维素微球；取氨基纤维素微球2g与5mL 20％戊二醛溶液室温下振荡反应6h，即得醛基纤维素微球；取醛基纤维素微球5g，3mg/mL草酸KB的75％DMSO溶液，pH调节至7.0，常温，振荡反应6h，即得。

10.权利要求1-5所述的任一内毒素吸附剂，在制备体外吸附细菌内毒素，肽聚糖或CpGDNA的药物中的应用。