CN103769060A - 用于清除细菌内毒素、dna和肽聚糖的吸附剂和制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于清除细菌内毒素、DNA和肽聚糖的吸附剂，该吸附剂由苦柯胺B连接在具有良好血液相容性的载体的表面。该吸附剂可有效的从人体血液中吸附细菌内毒素、DNA和肽聚糖，从而达到清除诱发脓毒症的病原体相关分子的目的，发挥治疗脓毒症的作用，具有重要的临床价值。

Description

用于清除细菌内毒素、DNA和肽聚糖的吸附剂和制备方法及用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，特别涉及用于清除细菌内毒素、DNA和肽聚糖的吸附剂和制备方法及用途。

背景技术

脓毒症是感染引发的全身性炎症反应综合征。脓毒症的发生是由于病原体侵入人体后，病原体含有的病原体相关分子被机体天然免疫系统中的模式识别受体识别，导致炎症反应细胞活化，释放大量炎症介质，从而引发全身性炎症反应，造成组织器官损伤甚至死亡。导致脓毒症的病原体90%以上为细菌，而细菌所含的病原体相关分子主要包括细菌内毒素（脂多糖）、DNA和肽聚糖等。因此，若能够拮抗这些致病因子就能对脓毒症取得良好的治疗效果。多年来，人们针对上述病原体相关分子开发了许多拮抗剂，如多粘菌素B、类脂A单克隆抗体、杀菌/通透性增加蛋白等，但是均未取得成功或仍处于研究阶段。

近年来，血液净化治疗被认为有望成为脓毒症新的治疗手段。该疗法的原理是利用特定的吸附剂对患者血液进行灌流，以吸附和除去患者血中的病原体相关分子，发挥治疗作用。目前，最常见的吸附剂是将可吸附细菌内毒素的药物多粘菌素B连接在一定的载体上而制成。比如，日本研究者将多粘菌素B通过共价结合连接在纤维素载体上制成细菌内毒素吸附剂（商品名Toraymyxin），已在日本（1994年）和欧洲（2002年）上市，并正在美国开展Ⅲ期临床试验。临床研究结果显示，在常规治疗基础上使用Toraymyxin能够一定程度改善腹腔内革兰氏阴性菌感染所致的重症脓毒症或脓毒性休克患者的血流动力学和器官功能障碍，并降低28天死亡率（Cruz DN,Antonelli M,Fumagalli R,et al.Early useof polymyxin B hemoperfusion in abdominal septic shock:the EUPHAS randomizedcontrolled trial.JAMA.2009;301(23):2445-2452.）。此外，中国发明专利ZL03144383.4公布了一种以天然或合成高分子材料为载体，二甲基胺为配体制成的细菌内毒素吸附剂。中国发明专利ZL 200710012501.1公布了一种以琼脂糖凝胶为载体，偶联季铵盐阳离子和疏水分子的细菌内毒素吸附剂。中国发明专利201110113987.4公布了一种以分子簇为功能基的细菌内毒素吸附剂。

但是，上述吸附剂仅能吸附细菌内毒素，不能同时有效吸附细菌DNA和肽聚糖。而在由细菌感染引发的脓毒症中，细菌DNA和肽聚糖同内毒素一样也是分布广、毒力强的病原体相关分子，上述吸附剂只清除细菌内毒素，细菌DNA和肽聚糖仍残留血中，不足以完全解决脓毒症的根源问题，这是目前有报道（王亮,马晓春.固定多粘菌素B纤维灌流器吸附内毒素的研究进展.中国血液净化，2010,9:451-453.）称其临床疗效仍然有限的重要原因。

中国发明专利201010156503.X公布了苦柯胺B用于制备预防和治疗脓毒症及自身免疫性疾病药物的用途。已有的研究结果（Liu X,Zheng X,Wang N,et al.Kukoamine B,a novel dual inhibitor of LPS and CpG DNA,is a potential candidatefor sepsis treatment.Br J Pharmacol.2011;162(6):1274-1290.）显示，苦柯胺B在脓毒症模型动物体内对细菌内毒素和DNA均具有良好的中和作用，能够显著改善各项病理生理指标，降低死亡率。尽管苦柯胺B通过体内静脉给药的方式进行治疗可取得较好效果，但仍然不能制备成可同时有效吸附细菌内毒素、DNA和肽聚糖的吸附剂并用于脓毒症血液净化治疗。

发明内容

本发明的目的在于解决现有吸附剂只能吸附细菌内毒素的问题，提供一种用于清除细菌内毒素、DNA和肽聚糖的吸附剂，该吸附剂可同时吸附细菌内毒素、DNA和肽聚糖。采用动物血液进行模拟实验，其结果表明该吸附剂可有效的从血中吸附细菌内毒素、DNA和肽聚糖，从而达到清除诱发脓毒症的病原体相关分子的目的，发挥治疗脓毒症的作用，具有重要的临床价值。

本发明的技术方案是：

用于清除细菌内毒素、DNA和肽聚糖的吸附剂，将苦柯胺B通过共价结合连接在具有良好血液相容性的载体的表面。

所述载体为琼脂糖凝胶、聚乙烯醇、纤维素、聚苯乙烯中的任意一种。

吸附剂中苦柯胺B与载体的质量比为1：0.001～0.01。

上述吸附剂的制备方法，有以下步骤：

1）有机溶剂中活化载体，洗涤、抽滤至干；

2）取苦柯胺B溶于50ml 0.1M NaHCO₃溶液中，与经步骤1）活化的载体混合，25℃振荡反应24小时，用超纯水洗涤，抽滤至干，得到用于清除脓毒症致病因子的吸附剂。

当载体为聚苯乙烯时，苦柯胺B与活化的载体混合振荡反应后，用超纯水洗涤，抽滤至干；将硼氢化钠溶于10ml 0.1M的磷酸缓冲液（pH=7.4），加入抽干的固体物中，25℃振荡反应2小时，用超纯水洗涤，抽滤至干，得到用于清除脓毒症致病因子的吸附剂。

步骤1）所述的有机溶剂为环氧氯丙烷或戊二醛。

琼脂糖凝胶、聚乙烯醇、纤维素载体的活化方法是：取载体，洗涤，抽滤至干，加入0.5M NaOH溶液10ml、环氧氯丙烷10ml，40℃振荡反应5小时。

聚苯乙烯载体活化的方法是：取氨甲基化聚苯乙烯，加入25%的戊二醛溶液5ml，40℃反应2小时。

本发明所述吸附剂在用于制备血液净化治疗的吸附剂中的用途。

当苦柯胺B连接琼脂糖凝胶时，得到琼脂糖凝胶－苦柯胺B吸附剂，其中每克载体连接有3.00～5.00mg苦柯胺B。

当苦柯胺B连接聚乙烯醇时，得到聚乙烯醇－苦柯胺B吸附剂，其中每克载体连接有3.00～5.00mg苦柯胺B。

当苦柯胺B连接纤维素时，得到纤维素－苦柯胺B吸附剂，其中每克载体连接有5.00～10.00mg苦柯胺B。

当苦柯胺B连接聚苯乙烯时，得到聚苯乙烯－苦柯胺B吸附剂，其中每克载体连接有3.00～5.00mg苦柯胺B。

所述吸附剂的使用方法：将含有细菌内毒素、DNA和肽聚糖的血液与吸附剂相接触进行灌流，从而吸附其中的细菌内毒素、DNA和肽聚糖。

实验结果显示：

（1）苦柯胺B可与琼脂糖凝胶、聚乙烯醇、纤维素或聚苯乙烯载体连接制成吸附剂；

（2）制备的吸附剂能够分别或者同时有效地吸附细菌内毒素、DNA和肽聚糖。

细菌内毒素、DNA和肽聚糖是导致脓毒症最主要的病原体相关分子，从患者体内吸附这些分子从而达到清除致病因子的目的对脓毒症的治疗十分重要。本发明所述吸附剂不同于以往研制的仅能吸附细菌内毒素一种病原体相关分子的吸附剂，它能够同时吸附细菌内毒素、DNA和肽聚糖，且吸附效果良好。因此，本发明所述吸附剂能够将诱发脓毒症最主要的病原体相关分子——细菌内毒素、DNA和肽聚糖均有效的从血液中除去，克服了现有吸附剂仅有单一清除作用的缺点，从根源上解决了脓毒症的发病问题，为脓毒症血液净化治疗提供了一种更好的吸附剂。

本领域的技术人员可以理解，除本发明优选的四种载体外，还有更多载体可与苦柯胺B连接。本领域的技术人员亦可理解，本发明所述的吸附剂除可用于人的血液净化治疗外，也可以极其相似的方式用于从其他含有细菌内毒素、DNA和肽聚糖的生物流体，如蛋白质溶液、动物血液、生物试剂中除去这些有害分子。应当说明，如果不脱离本发明的精神和范围——在载体上连接苦柯胺B用于吸附细菌内毒素、DNA和肽聚糖——对本发明进行修改或者等同替换的，均应涵盖在本发明的权利要求的保护范围当中。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的详细说明，特别优选琼脂糖凝胶、聚乙烯醇、纤维素和聚苯乙烯四种不同类型的载体进行说明。应当理解，以下所述仅为本发明的较佳实施例，其不以任何形式限制本发明。

细菌内毒素是指Escherichia coli O111:B4来源的内毒素，购于Sigma-Aldrich；

细菌DNA（CpG ODN 1826），购于生工生物；

细菌肽聚糖（胞壁酰二肽），购于InvivoGen。

实施例1：琼脂糖凝胶－苦柯胺B吸附剂的制备

1.1实验方法：琼脂糖凝胶选用Sepharose CL-4B，购自GE Healthcare。取Sepharose CL-4B琼脂糖凝胶20ml，用超纯水洗涤，抽滤至干。取抽干后的凝胶4g，加入0.5M NaOH溶液10ml、环氧氯丙烷10ml，40℃振荡反应5小时。反应完毕，用超纯水洗涤，抽滤至干。取100mg苦柯胺B，溶于50ml0.1M NaHCO₃溶液中，与经环氧氯丙烷活化的琼脂糖凝胶混合，25℃振荡反应24小时。反应完毕，用超纯水洗涤，抽滤至干（滤液全部收集），得琼脂糖凝胶－苦柯胺B吸附剂。对收集的滤液，采用高效液相色谱法（色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：0.1%三氟乙酸/乙腈=20/80；检测波长：280nm）测定滤液中苦柯胺B的量。同时，取100mg苦柯胺B，溶于50ml0.1M NaHCO₃溶液中，与未经环氧氯丙烷活化的琼脂糖凝胶混合，作为对照组，同法进行反应，反应完毕后采用高效液相色谱法（色谱条件同前）测定滤液中苦柯胺B的量。

1.2实验结果：对照组中，苦柯胺B反应前后的量基本一致，说明本反应不影响苦柯胺B的稳定性，且未活化的琼脂糖凝胶对苦柯胺B几乎没有结合作用。因此，将反应前投入苦柯胺B的量与最终滤液中苦柯胺B的量相减即可准确反映载体上连接的苦柯胺B的量，计算公式如下：

苦柯胺B固载量=（反应前投入苦柯胺B质量－滤液中苦柯胺B含量×滤液体积）÷载体质量

经检测和计算，苦柯胺B固载量=(100mg－0.68mg/ml×122ml)/4g=4.26mg/g，即每克载体连接有4.26mg苦柯胺B。

实施例2：聚乙烯醇－苦柯胺B吸附剂的制备

2.1实验方法：聚乙烯醇－苦柯胺B吸附剂的制备原理与琼脂糖凝胶－苦柯胺B吸附剂相似。聚乙烯醇购自Sigma-Aldrich。将5g聚乙烯醇溶于超纯水中，配制成浓度为10%的水溶液，置90℃恒温水浴中搅拌至完全溶解，然后于﹣20℃冷冻24小时，取出后于室温下解冻4小时，如此反复冷冻、融化3次，得到聚乙烯醇水凝胶。将凝胶抽滤至干，取其中4g凝胶，加入0.5M NaOH溶液10ml、环氧氯丙烷10ml，50℃振荡反应5小时。反应完毕，用超纯水洗涤，抽滤至干。取100mg苦柯胺B，溶于50ml0.1M NaHCO₃溶液中，与经环氧氯丙烷活化的聚乙烯醇水凝胶混合，25℃振荡反应24小时。反应完毕，用超纯水洗涤，抽滤至干，得聚乙烯醇－苦柯胺B吸附剂。苦柯胺B固载量的计算方法同实施例1。

2.2实验结果：经检测和计算，苦柯胺B固载量为3.6mg/g。

实施例3：纤维素－苦柯胺B吸附剂的制备

3.1实验方法：纤维素－苦柯胺B吸附剂的制备原理与琼脂糖凝胶－苦柯胺B吸附剂相似。纤维素购自Sigma-Aldrich。取纤维素5g，加入0.5M NaOH溶液10ml、环氧氯丙烷10ml，40℃振荡反应4小时。反应完毕，用超纯水洗涤、抽滤至干。取200mg苦柯胺B，溶于100ml 0.1M NaHCO₃溶液中，与经环氧氯丙烷活化的纤维素混合，25℃振荡反应24小时。反应完毕，用超纯水洗涤、抽滤至干，得纤维素－苦柯胺B吸附剂。苦柯胺B固载量的计算方法同实施例1。

3.2实验结果：经检测和计算，苦柯胺B固载量为6.3mg/g。

实施例4：聚苯乙烯－苦柯胺B吸附剂的制备

4.1实验方法：氨甲基化聚苯乙烯购自Sigma-Aldrich。取5g氨甲基化聚苯乙烯，加入25%的戊二醛溶液5ml，40℃反应2小时。反应完毕，用超纯水洗涤，抽滤至干。取200mg苦柯胺B，溶于100ml 0.1M NaHCO₃溶液中，与经戊二醛活化的氨甲基化聚苯乙烯混合，25℃振荡反应24小时。反应完毕，用超纯水洗涤，抽滤至干。然后将0.4g硼氢化钠溶于10ml 0.1M的磷酸缓冲液（pH=7.4），加入抽干的固体物中，25℃振荡反应2小时。反应完毕，用超纯水洗涤，抽滤至干，得聚苯乙烯－苦柯胺B吸附剂。苦柯胺B固载量的计算方法同实施例1。

4.2实验结果：经检测和计算，苦柯胺B固载量为4.09mg/g。

实施例5：吸附剂对细菌内毒素的吸附能力测试

5.1实验方法：将一定量的细菌内毒素溶于大鼠血浆中，配制成含细菌内毒素5EU/ml的血浆溶液。取血浆溶液10ml，加入1g吸附剂，并以空白载体（未连接苦柯胺B）为对照组，37℃振荡反应60分钟，离心，检测上清中细菌内毒素的量。检测方法采用动态浊度法（鲎试验），具体实验方法参照中国药典（二部）附录ⅪE细菌内毒素检查法和文献“卫国,郑江.细菌内毒素定量检测的影响因素分析及对策.局解手术学杂志,2003,12:215-216.”。本实验重复三次，结果以平均值±标准偏差表示。血浆中细菌内毒素的初始量减去吸附后的剩余量即为被吸附的量，被吸附的量除以吸附剂用量即为吸附量。

5.2实验结果：空白载体对细菌内毒素没有吸附作用，连接有苦柯胺B的吸附剂则具有较好的吸附作用，吸附量如表1所示。

表1 四种吸附剂对细菌内毒素的吸附效果

吸附剂	吸附量（EU/g吸附剂）
		琼脂糖凝胶－苦柯胺B	21±2
聚乙烯醇－苦柯胺B	18±3
		纤维素－苦柯胺B	31±2
聚苯乙烯－苦柯胺B	20±2

实施例6：吸附剂对细菌DNA（CpG ODN 1826）的吸附能力测试

6.1实验方法：将一定量的CpG ODN 1826溶于大鼠血浆中，配制成含CpGODN 1826 2ng/ml的血浆溶液。取血浆溶液10ml，加入1g吸附剂，并以空白载体（未连接苦柯胺B）为对照组，37℃振荡反应60分钟，离心，检测上清中CpGODN 1826的量。检测方法采用LC-MS法，具体实验方法参照文献“Cen Y,Li X,Liu D,et al.Development and validation of LC-MS/MS method for the detection andquantification of CpG oligonucleotides 107(CpG ODN107)and its metabolites inmice plasma.J Pharm Biomed Anal.2012;70:447-455.”。本实验重复三次，结果以平均值±标准偏差表示。血浆中CpG ODN 1826的初始量减去吸附后的剩余量即为被吸附的量，被吸附的量除以吸附剂用量即为吸附量。

6.2实验结果：空白载体对CpG ODN 1826没有吸附作用，连接有苦柯胺B的吸附剂则具有较好的吸附作用，吸附量如表2所示。

表2 四种吸附剂对细菌DNA（CpG ODN 1826）的吸附效果

吸附剂	吸附量（ng/g吸附剂）
		琼脂糖凝胶－苦柯胺B	8±2

聚乙烯醇－苦柯胺B	7±1
		纤维素－苦柯胺B	12±3
聚苯乙烯－苦柯胺B	8±3

实施例7：吸附剂对细菌肽聚糖（胞壁酰二肽）的吸附能力测试

7.1实验方法：将一定量的胞壁酰二肽溶于大鼠血浆中，配制成含胞壁酰二肽2ng/ml的血浆溶液。取血浆溶液10ml，加入1g吸附剂，并以空白载体（未连接苦柯胺B）为对照组，37℃振荡反应60分钟，离心，检测上清中胞壁酰二肽的量。检测方法采用LC-MS法，具体实验方法参照文献“Volz T,Nega M,Buschmann J,et al.Natural Staphylococcus aureus-derived peptidoglycan fragmentsactivate NOD2 and act as potent costimulators of the innate immune systemexclusively in the presence of TLR signals.FASEB J.2010;24(10):4089-4102.”。本实验重复三次，结果以平均值±标准偏差表示。血浆中胞壁酰二肽的初始量减去吸附后的剩余量即为被吸附的量，被吸附的量除以吸附剂用量即为吸附量。

7.2实验结果：空白载体对胞壁酰二肽没有吸附作用，连接有苦柯胺B的吸附剂则具有较好的吸附作用，吸附量如表3所示。

表3 四种吸附剂对细菌肽聚糖（胞壁酰二肽）的吸附效果

吸附剂	吸附量（ng/g吸附剂）
		琼脂糖凝胶－苦柯胺B	6±2
聚乙烯醇－苦柯胺B	6±1
		纤维素－苦柯胺B	10±3
聚苯乙烯－苦柯胺B	7±2

实施例8：吸附剂对细菌内毒素、DNA（CpG ODN 1826）和肽聚糖（胞壁酰二肽）混合物的吸附能力测试

8.1实验方法：将一定量的细菌内毒素、CpG ODN 1826和胞壁酰二肽溶于大鼠血浆中，配制成含细菌内毒素2EU/ml、CpG ODN 1826 1ng/ml和胞壁酰二肽1ng/ml的混合血浆溶液。取混合血浆溶液10ml，加入1g吸附剂，37℃振荡反应60分钟，离心，检测上清中细菌内毒素、CpG ODN 1826和胞壁酰二肽的量，其中细菌内毒素的检测参照实施例5的方法，CpG ODN 1826的检测参照实施例6的方法，胞壁酰二肽的检测参照实施例7的方法。实验重复三次，结果以平均值±标准偏差表示。混合血浆中细菌内毒素、CpG ODN 1826和胞壁酰二肽各自的初始量减去吸附后各自的剩余量即为被吸附的量，各自被吸附的量除以吸附剂用量即为吸附量。

8.2实验结果：当细菌内毒素、DNA（CpG ODN 1826）和肽聚糖（胞壁酰二肽）混合存在时，四种吸附剂均具有较好的吸附作用，吸附量如表4所示。

表4 四种吸附剂对细菌内毒素、DNA和肽聚糖混合物的吸附效果

实施例9：吸附剂对细菌内毒素、DNA（CpG ODN 1826）和肽聚糖（胞壁酰二肽）混合物的动态吸附能力测试

9.1实验方法：取大鼠血浆50ml，加入一定量的细菌内毒素、CpG ODN 1826和胞壁酰二肽，配制成含细菌内毒素2EU/ml、CpG ODN 1826 1ng/ml和胞壁酰二肽1ng/ml的混合血浆溶液。取5g吸附剂装入径高比为1:3的层析柱中，用50ml混合血浆溶液进行灌流，恒流泵控制流速为每分钟10ml，循环灌流2小时，然后检测血浆中细菌内毒素、CpG ODN 1826和胞壁酰二肽的量，其中细菌内毒素的检测参照实施例5的方法，CpG ODN 1826的检测参照实施例6的方法，胞壁酰二肽的检测参照实施例7的方法。本实验重复三次，结果以平均值±标准偏差表示。混合血浆中细菌内毒素、CpG ODN 1826和胞壁酰二肽的初始量减去吸附后的剩余量即为被吸附的量，被吸附的量除以吸附剂用量即为吸附量。

9.2实验结果：当细菌内毒素、DNA（CpG ODN 1826）和肽聚糖（胞壁酰二肽）混合存在时，经模拟灌流，四种吸附剂均具有较好的吸附作用，吸附量如表5所示。

表5 四种吸附剂对细菌内毒素、DNA和肽聚糖混合物的吸附效果

结论：上述实验结果显示，将苦柯胺B以共价结合的方式连接在琼脂糖凝胶、聚乙烯醇、纤维素或聚苯乙烯载体上制成吸附剂，当细菌内毒素、DNA和肽聚糖单独或混合存在时，本发明所述吸附剂均取得良好的吸附效果，可用于从人体血液中吸附细菌内毒素、DNA和肽聚糖，从而达到从而达到清除诱发脓毒症的病原体相关分子的目的，发挥治疗脓毒症的作用，具有重要的临床价值。

Claims (9)

1.一种用于清除细菌内毒素、DNA和肽聚糖的吸附剂，其特征在于：该吸附剂是将苦柯胺B通过共价结合连接在具有良好血液相容性的载体的表面。

2.根据权利要求1所述的吸附剂，其特征在于：所述载体为琼脂糖凝胶、聚乙烯醇、纤维素、聚苯乙烯中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的吸附剂，其特征在于：吸附剂中苦柯胺B与载体的质量比为1：0.001～0.01。

4.权利要求1～3任一所述吸附剂的制备方法，其特征在于，有以下步骤：

1）有机溶剂中活化载体，洗涤、抽滤至干；

2）取苦柯胺B溶于50ml0.1M NaHCO₃溶液中，与经步骤1）活化的载体混合，25℃振荡反应24小时，用超纯水洗涤，抽滤至干，得到用于清除脓毒症致病因子的吸附剂。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：当载体为聚苯乙烯时，苦柯胺B与活化的载体混合振荡反应后，用超纯水洗涤，抽滤至干；将硼氢化钠溶于10ml0.1M pH=7.4的磷酸缓冲液，加入抽干的固体物中，25℃振荡反应2小时，用超纯水洗涤，抽滤至干，得到用于清除脓毒症致病因子的吸附剂。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤1）所述的有机溶剂为环氧氯丙烷或戊二醛。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，琼脂糖凝胶、聚乙烯醇、纤维素载体的活化方法是：取载体，洗涤，抽滤至干，加入0.5M NaOH溶液10ml、环氧氯丙烷10ml，40℃振荡反应5小时。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，聚苯乙烯载体活化的方法是：取氨甲基化聚苯乙烯，加入25%的戊二醛溶液5ml，40℃反应2小时。

9.权利要求1～3任意所述吸附剂在用于制备脓毒症血液净化治疗的吸附剂中的用途。