CN101829075A - 苦柯胺a和苦柯胺b的用途 - Google Patents

苦柯胺a和苦柯胺b的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种苦柯胺A和苦柯胺B用于制备预防和治疗脓毒症及自身免疫性疾病药物的用途。本发明以诱发脓毒症及自身免疫性疾病的主要病原分子细菌内毒素(LPS)和细菌非甲基化DNA(CpG DNA)为靶点，从中药中定向分离药物先导化合物，克服了现有中药组分和提取物物质基础和作用靶点不明的主要缺陷，研制一种安全、有效、质量可控的新药物，以解决目前脓毒症及自身免疫性疾病缺乏有效治疗药物的问题。

Description

苦柯胺A和苦柯胺B的用途
技术领域
本发明涉及苦柯胺A和苦柯胺B在制备预防和治疗脓毒症及自身免疫性疾病药物的用途
背景技术
脓毒症和自身免疫性疾病是由于机体自身过度免疫反应而引发的两类疾病。目前尚无可靠、有效的药物治疗策略。脓毒症是一种急性炎症综合征，其死亡率可高达30-70％。严重威胁临床危重症患者的生命。据不完全统计，我国每年有超过300万脓毒症患者，因此造成的死亡人数至少在50万人以上。自身免疫性疾病是一类慢性炎症性疾病，流行病学资料显示，该病在我国的发病率大约为3.2％-5.3％，是导致65岁以下女性死亡的主要原因之一。因此脓毒症和自身免疫性疾病的针对性防治是临床关注的焦点和热点问题。
目前脓毒症和自身免疫性疾病的治疗仍然十分棘手，临床方面的主要措施还是经验性地使用糖皮质激素等非特异性抗炎药物。然而这些药物非但并不能确切提高患者的生存率或改善生存质量，反而会造成严重的不良反应。既往数十年针对脓毒症和自身免疫性疾病的药物防治性研究主要以抑制免疫反应中的关键分子和纠正凝血、补体等(造成机体脏器伤的直接因素)的紊乱为主要导向。相关研究结果显示，这些措施非但疗效难以实现(体内免疫反应是一个复杂的网路体系，难以调控)，反而有可能加重免疫系统的紊乱，导致病情进一步恶化。因此到目前为止，相关研究没有取得任何突破性进展，尚无可靠有效的新药进入临床。以上事实表明需要从本质上理解脓毒症和自身免疫性疾病的发病机制与启动环节，并以此为突破口寻找到具有针对性治疗作用的药物。
近年来，有关脓毒症和自身免疫性疾病的发病机制研究取得了重要进展，目前认为，除了患者内分泌、遗传及环境因素影响外，细菌释放出的内毒素(LPS)和细菌非甲基化DNA(CpG DNA)是诱导脓毒症和自身免疫性疾病发病的主要启动因素。诸多实验已经证实，LPS和CpG DNA可单独或协同诱发脓毒症，也可直接诱发或加重类风湿关节炎症状。在急性感染中，病原体的急剧入侵可导致大量LPS和CpG DNA的产生，在短时内诱导TNF-α、IL-1β和IL-6等多种炎症介质的大量表达和释放，引起早期的器官功能衰竭和晚期的免疫麻痹，进而导致脓毒症病人死亡。对自身免疫性疾病来说，LPS和CpG DNA的持续存在可导致炎症反应的持续和慢性演变，诱导炎症介质、免疫球蛋白和类风湿因子等大量生成，形成免疫复合物，沉积在滑膜组织上，同时激活补体，产生过敏毒素，导致炎性病理损伤，最终造成对机体脏器的损害。由此可见，对LPS和CpG DNA的有效拮抗就可从根本和源头发挥对脓毒症和自身免疫性疾病的预防和治疗。有关药物研究也已证实，阻断LPS和CpG DNA对免疫细胞的刺激作用，抑制TNF-α等炎症介质的释放，对脓毒症和自身免疫性疾病具有明显的疗效。因此，对LPS和CpGDNA的拮抗活性能够很好的反映药物对脓毒症和自身免疫性疾病的防治作用。
传统清热解毒中草药长期用于脓毒症和自身免疫性疾病等免疫系统功能紊乱的治疗，并具有较好的疗效。现代药理研究表明，中草药中存在能够结合和拮抗LPS和CpG DNA等病原分子作用的成分，并且是其纠正免疫紊乱、发挥防治脓毒症和自身免疫性疾病作用的重要物质基础。大承气汤、热毒清和热毒平等制剂能够降低脓毒症病人循环血中内毒素、TNF-α、IL-1和IL-6水平，金银花、连翘、黄芩和青蒿等20余种单味中药体外对LPS等病原分子具有良好的拮抗活性；白术汤能显著降低风湿性关节炎患者血清中升高的LPS和TNF-α，抑制血清IgG、IgA、IgM水平，降低RF阳性率。从而实现治疗类风湿性关节炎的作用；由白花蛇舌草、半枝莲、紫草、丹参、益母草等7味清热中药组成狼疮方具可抑制LPS刺激引起的T细胞和B细胞活化，减少IL-6和IL-10及自身抗体的产生，进而发挥对系统性红斑狼疮的治疗作用。然而中草药中成分非常复杂，安全性不明，严重限制其应用于临床治疗，因此分离能够拮抗LPS和CpG DNA的中药单体化合物，对脓毒症和自身免疫性疾病防治水平的提高具有重要意义。
地骨皮为茄科植物枸杞(Lycium chinense Mill.)或宁夏枸杞(Lyciumbarbarum L.)的干燥根皮。在传统中医药理论中，地骨皮具有清热解毒功效。现代药理研究发现，地骨皮主要含有生物碱类、有机酸类、蒽醌类和肽类成分，发挥降血压、降血糖、解热和镇痛等药理作用。但有关地骨皮直接拮抗LPS和CpGDNA和用于脓毒症和自身免疫性疾病治疗的活性研究及应用情况，国内外文献和国内发明专利中均未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的中药组分和提取物物质基础和作用机制不明的主要缺陷，研制一种安全、有效、质量可控的预防治疗脓毒症和自身免疫性疾病的新药物，以解决目前尚无有效药物应用临床治疗的问题。
本发明的技术方案是：
苦柯胺A和苦柯胺B在制备预防和治疗细菌脓毒症和自身免疫性疾病药物中的用途。
所述苦柯胺A和苦柯胺B从中药地骨皮中提取。
所述药物用于治疗脓毒症和自身免疫性疾病。
所述药物用于拮抗导致脓毒症和自身免疫性疾病发病的关键因素细菌内毒素LPS和细菌CpG DNA。
所述地骨皮为茄科植物枸杞(Lycium chinense Mill.)或宁夏枸杞(Lyciumbarbarum L.)的干燥根皮。
申请人长期坚持以LPS和CpG DNA为靶点进行拮抗病原分子的药物研究。通过利用建立的生物传感器筛选和跟踪平台，从清热解毒类中药中筛选和定向分离具有结合和拮抗LPS和CpG DNA作用的活性单体化合物。
本发明以中药地骨皮为原料，经水煎法提取、大孔树脂和阳离子交换树脂分离和反相高效液相色谱纯化等过程分离得到的两种精胺类生物碱化合物苦柯胺A(Kukoamine A)和苦柯胺B(Kukoamine B)，以Lipid A(LPS的活性中心)和CpG DNA为靶点的药物筛选和定向分离平台，以中药提取液和各种组分与LipidA和CpG DNA的结合活性作为筛选指标和定向分离依据，并通过体外LPS中和实验、LPS和CpG DNA与细胞结合抑制实验、体内外对LPS和CpG DNA刺激引起的炎症反应的抑制实验等离体和在体的药理实验评价方法，最终筛选出两种具有良好拮抗LPS和CpG DNA作用的活性成分苦柯胺A(Kukoamine A，K.A)和苦柯胺B(Kukoami ne B，K.B)。
本发明在有效的活性跟踪手段的支持下，从中草药中分离得到拮抗LPS和CpG DNA的活性物质，明确其作用机制，为脓毒症和自身免疫性疾病的防治研究提供安全、可靠和有效的新型药物。
所述苦柯胺A和苦柯胺B为两种从地骨皮中提取、分离得到的精胺类生物碱化合物，分子式C28H42N4O6，分子量530.66，其化学结构为：
苦柯胺A
Figure GDA0000020915150000042
苦柯胺B
本发明中的苦柯胺A和苦柯胺B具有成为治疗脓毒症和自身免疫性疾病有效药物的良好成药前景，具体表现为：
(1)药理活性方面：申请人的离体实验证明，苦柯胺A和苦柯胺B与LPS和CpG DNA具有高亲和活性，可显著中和LPS和CpG DNA，阻断二者与RAW264.7细胞(小鼠巨噬细胞)结合，进而抑制LPS和CpG DNA诱导RAW264.7细胞表达和释放炎症介质(TNF-α和IL-6等)，从源头阻断细胞的炎性活化，避免免疫反应的紊乱；通过在体实验，申请人也观察到苦柯胺A和苦柯胺B可降低热灭活大肠杆菌(模拟LPS和CpG DNA体内注射)注射小鼠体内的LPS和TNF-水平，对LPS和CpG DNA发挥拮抗作用。
(2)药学方面：该两种化合物在药材中含量较高，易于制备，化合物本身理化性质稳定，安全性较好(体外对RAW264.7细胞无明显的毒性作用，体内单独注射短期对小鼠无毒性作用)，因此苦柯胺A和苦柯胺B是一种治疗脓毒症和自身免疫性疾病的理想药物。
附图说明
图1为6种中药水煎液与Lipid A和CpG DNA的结合反应曲线，图中横轴的数值分别表示为：1为地骨皮；2为牡丹皮；3为山茱萸；4为大黄；5.为黄芩；6为肉桂；
图2为CL-1-5与Lipid A和CpG DNA的结合反应曲线；
图3为CL-4a-c与Lipid A和CpG DNA的结合反应曲线；
图4为CL-4b1和CL-4b2组分的高效液相色谱分析图；
图5为K.A和K.B与Lipid A(6a1)及CpG DNA(6a2)的结合活性检测；
图6为K.A和K.B体外对LPS的中和作用；
图7为K.A和K.B对荧光标记的LPS和CpG DNA与RAW264.7细胞结合的抑制，图中**：p＜0.01 vs FITC-LPS or 5FAM-CpG DNA；
图8为K.A和K.B对荧光标记的LPS和CpG DNA与RAW264.7细胞结合的抑制，图中*p＜0.05，**p＜0.01 vs FITC-LPS or 5FAM-CpG DNA；
图9为K.A和K.B对LPS诱导RAW264.7细胞释放TNF-α的影响，图中*p＜0.05，**p＜0.01 vs LPS；
图10为K.A和K.B对CpG DNA诱导RAW264.7细胞释放TNF-α的影响，图中*p＜0.05，**p＜0.01 vs CpG DNA；
图11为K.A和K.B对RAW264.7细胞活力的影响；
图12为K.A和K.B对热灭活大肠杆菌(E.coil)ATCC 35218攻击小鼠血中LPS水平的影响，图中*p＜0.05，**p＜0.01 vs E.coli.；
图13为K.A和K.B对热灭活大肠杆菌(E.coil)ATCC 35218攻击小鼠血中TNF-α水平的影响，图中*p＜0.05，**p＜0.01 vs E.coli.。
具体实施方式
由于LPS和CpG DNA是导致脓毒症和自身免疫性疾病发病的关键因素，因此对LPS和CpG DNA的拮抗活性能够很好的反映药物对脓毒症和自身免疫性疾病的防治作用。本实施方式中选取的模型均用于评价苦柯胺A和苦柯胺B对LPS和CpGDNA的结合和拮抗活性。并以此反应二者对脓毒症和自身免疫性疾病的治疗效果，并通过以下实施例对本发明作更进一步说明。应指出的是，以下实施例仅是说明而非限制本发明。
实施例中药材及主要试剂来源：
1.114种中药材来源：名称及产地见表1。
表1114种中药名称和产地
Figure GDA0000020915150000061
Figure GDA0000020915150000071
2.主要试剂：
提取分离试剂和材料：无水乙醇、磷酸氢二钠(分析纯，重庆川东化工厂(集团)有限公司)，柱层析用AB-8型大孔吸附树脂和D001型强阳离子交换树脂购自天津南开大学化工厂；
三氟醋酸(trifluoroacetic acid，TFA)、甲醇(MeOH，色谱纯，美国霍尼韦尔(Honeywell)公司)
细胞培养试剂：
Figure GDA0000020915150000072
DMEM培养基(美国Invitrogen公司)，新生牛血清(NCS)(美国Hyclone公司)；
传感器结合检测试剂：PBS(20mM，pH 7.2)购自武汉博士德公司，HCl(分析纯)购自重庆川东化工厂(集团)有限公司
活性评价试剂：LPS、FITC标记的LPS、Lipid A、5-FAM标记的CpG DNA、四氮噻唑蓝(MTT)购自sigma公司；
RAW264.7细胞购自ATCC；生物传感器样品池及包被试剂购自Thermo公司；
鲎试剂及LPS检查用水购自湛江安度斯生物有限公司；
小鼠TNF-αELISA试剂盒为美国R&D公司产品；
KM小鼠(SPF级)购自第三军医大学实验动物中心。
实施例1：114种中药水煎液与Lipid A和CpG DNA的结合反应测定结果
1.1实验方法：(1)应用光学亲和生物传感器技术(SPR技术)，将类脂A(Lipid A，LPS的生物学活性中心分子)和CpG DNA分别包被于亲和型特异选择性生物传感器IAsys Plus(Affinity-sensor IAsys plus)的样品池作为固定相配基。对于Lipid A，将其一端的疏水侧链与带有疏水表面的样品池结合，使另一端的磷酸基团(Lipid A活性基团)游离并暴露于外侧，以此作为与中药中治疗疾病的活性物质发生结合作用的靶点，在溶液中的活性物质通过静电作用等方式与Lipid A发生结合作用；对于CpG DNA，首先将亲和素包被于表面带有生物素分子的样品池上，然后将生物素标记的CpG DNA与亲和素链接从而固定于样品池上，未标记基团游离并暴露于外侧，并以此作为与中药中治疗疾病的活性物质发生结合作用的靶点，在溶液中活性物质通过静电作用和嵌入等方式与CpG DNA发生结合作用；(2)将114种中药材磨成粉状，各取1g装入编号试管中，分别加入10ml蒸馏水，100℃水浴1.5h，4000rpm离心20min，过滤，收集上清液，每种药材分别取5μL上清液上样，测定其与Lipid A或CpG DNA的结合反应，具体操作步骤如下：①结合反应：加入PBS45μL，再加入5μL待测样品，结合反应平衡后吸出；②解离反应：PBS冲洗50μL×3，解离反应平衡后吸出；③再生反应：0.1N的HCl 50μL×3，再生反应平衡后吸出；④PBS冲洗50μL×3，曲线回至基线后加入45μL PBS和5μL另一待测样品，开始新的循环。检测结束后，采用FASTplot软件分析数据。
1.2实验结果：114种中药中，地骨皮等6种中药同时与Lipid A和CpG DNA具有高亲和活性，其中又以地骨皮亲和活性最高，提示其含抗LPS和CpG DNA活性物质的可能性较其它中药大。故选择其作为提取分离研究对象，结果如图1所示。
实施例2：地骨皮抗LPS和CpG DNA有效成份苦柯胺A和苦柯胺B的提取与分离
2.1大孔吸附树脂分离及活性部位筛选
2.1.1实验方法：地骨皮(CL)约500g，加5.0L蒸馏水浸泡24h，100℃煎煮1h，粗滤纸滤过，8000rpm/min离心30min，收集上清液减压浓缩至约1.0L；然后上样于AB-8型大孔吸附树脂，分别以蒸馏水和10％、20％、40％、100％的乙醇依次梯度洗脱，收集各洗脱液，分别减压浓缩后冷冻抽干，得到5种组分，按洗脱先后顺序依次命名为CL-1～5，将CL各组分以PBS溶解成1.0mg/ml，取5μL上样，按1.1方法检测其与Lipid A及CpG DNA的结合活性。
2.1.2实验结果：5种组分中，CL-4与Lipid A和CpG DNA结合活性较高，提示其为CL组分的主要活性部位，因此，选择CL-4进一步分离。结果如图2所示。
2.2强阳离子交换树脂分离及活性部位筛选
2.2.1实验方法：CL-4冻干粉加超纯水稀释成100mg/ml，经0.45μm滤膜过滤后上样于D001型强阳离子树脂，分别以蒸馏水和0.3M、0.5M Na2HPO4进行淋洗，收集各洗脱液，分别减压浓缩后冷冻抽干，得到3种组分，分别命名为CL-4a、b和c。
2.2.2实验结果：获得CL-4a、b和c3个组分，按1.1方法检测与Lipid A和CpG DNA的结合活性，筛选出与Lipid A和CpG DNA结合活性较高CL-4b组分。结果如图3所示。
2.3制备液相色谱分离
2.3.1实验方法：①色谱条件选择：仪器采用Agilent 1200 Series高效液相色谱仪(分析型)，CL-4b用流动相(A(0.1％TFA)∶B(MeOH)＝80∶20，v/v，)配制成0.5mg/mL浓度。采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的Agilent XDB-C18色谱柱(150×4.6mm，5μm)，检测波长280nm，流速1mL/min，柱温25℃，进样量10μL；②高效液相色谱制备：仪器采用Agilent 1100 Series高效液相色谱仪(制备型)，CL-4b用流动相(A(0.1％TFA)∶B(MeOH)＝80∶20，v/v，)配制成20mg/mL浓度。采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的KF-C18色谱柱(200×20mm，10μm)，检测波长280nm，流速10mL/min，柱温为室温，进样量20mL。收集保留时间为16至20、20至30分钟的色谱峰馏分，负压抽干，得到2种成分，按保留时间先后顺序依次命名为CL-4b1和CL-4b2，将CL-4b1和CL-4b2组分以PBS溶解成1.0mg/ml，取5μL上样，按1.1方法检测其与Lipid A和CpG DNA的结合活性。
2.3.2实验结果：经高效液相色谱分析与制备，获得CL-4b1和CL-4b2两个主要成分，其色谱行为如图4所示。经高效液相色谱DAD五点峰纯度分析，可初步确认为单一化合物(纯度大于98％)。
2.4化合物CL-4b1和CL-4b2化学结构鉴定
2.4.1实验方法：对CL-4b1和CL-4b2进行紫外吸收光谱、红外吸收光谱、核磁共振波谱以及质谱检测。
2.4.2实验结果：化合物CL-4b1和CL-4b2均为浅黄色块状结晶。紫外吸收光谱λmax 281nm(甲醇)，FAB-mass质谱检测结果为[M+1]+ m/z 531，提示两者为同分异构体，核磁共振结果见表2：
表2苦柯胺A和苦柯胺B的核磁检测结果
Figure GDA0000020915150000101
Figure GDA0000020915150000111
经结构解析，确定CL-4b1为苦柯胺A(Kukoamine A，K.A)，CL-4b2为苦柯胺B(Kukoamine B，K.B)。
实施例3：K.A和K.B体外与Lipid A及CpG DNA的亲和力测定
3.1实验方法：将K.A和K.B制成浓度为100μM的工作液，分别取5μL上样，测定其与Lipid A或CpG DNA的结合反应，具体操作步骤如下：①结合反应：加入PBS 45μL，再加入5μL待测样品，结合反应平衡后吸出；②解离反应：PBS冲洗50μL×3，解离反应平衡后吸出；③再生反应：0.1N的HCl 50μL×3，再生反应平衡后吸出；④PBS冲洗50μL×3，曲线回至基线后加入45μL PBS和5μL另一待测样品，开始新的循环。检测结束后，采用FASTplot软件分析数据。
3.22实验结果：K.A与K.B和Lipid A及CpG DNA均具有高亲和活性。结果如图5所示。
实施例4：K.A和K.B体外结合中和LPS的活性
4.1实验方法：将K.A和K.B均(1，2，4μg/ml)分别与浓度为2.0ng/ml的LPS等体积混合，37℃孵育30min，LPS对照组加等量无热原水，采用动态浊度法鲎试验检测孵育后的LPS值，每个浓度重复检测3次。LPS含量以以均值±标准差表示。具体操作按EDS-99细菌内毒素测定系统说明书进行。
4.2实验结果，K.A和K.B均具有中和LPS的活性。统计学分析表明K.A和K.B对LPS有显著的中和作用(p＜0.05或p＜0.01)并呈现明显的剂量效应关系，提示二者可对LPS进行有效拮抗，进而发挥对脓毒症和自身免疫性疾病的防治作用。结果如图6所示。
实施例5：K.A和K.B对荧光标记的LPS和CpG DNA与RAW264.7细胞结合作用的影响
5.1实验方法：采用含有10％NCS(v/v)的DMEM培养液将RAW264.7细胞稀释至1×106/mL，加入24孔细胞培养板中，在37℃、体积分数为5％的CO2条件下孵育4h贴壁后，分别加入K.A和K.B(均为0.200μg/ml)，随即加入FITC标记的LPS(终浓度400ng/ml)和5FAM标记的CpG DNA(终浓度10μg/ml)，同时设不加任何药物的空白对照组(medium)，继续孵育30min后，PBS洗涤细胞三次，吹打细胞转入EP管中，4％多聚甲醛固定10min后PBS洗涤细胞三次，制成细胞悬液，上流式细胞仪检测，每组重复三次，平均荧光强度以以均值±标准差表示。
5.2实验结果：K.A和K.B显著降低RAW264.7细胞中LPS和CpG DNA的荧光强度(p＜0.01)，表明二者可影响LPS和CpG DNA与RAW264.7细胞的结合，有效抑制二者刺激引起的过度免疫反应，避免对机体的损伤，发挥对脓毒症和自身免疫性疾病的防治作用。结果如图7-8所示。
实施例6：K.A和K.B对LPS和CpG DNA诱导RAW264.7细胞释放TNF-α的影响
6.1实验方法：采用含有10％NCS(v/v)的DMEM培养液将RAW264.7细胞稀释至1×106/mL，加入96孔板(200μL/孔)，在37℃、体积分数为5％的CO2条件下孵育4h贴壁后；更换新鲜培养液，分别加入终浓度为0、50、100μg/ml的K.A和K.B；随即加入LPS(终浓度100ng/ml)和CpG DNA(终浓度10μg/ml)，同时设不加任何刺激物的空白对照组(medium)，继续孵育4h；取上清按照ELISA试剂盒操作说明进行操作，检测TNF-α的浓度，结果以均值±标准差表示。
6.2实验结果：K.A和K.B以剂量依赖的方式抑制LPS和CpGDNA诱导的TNF-α释放，与对照组相比具有显著差异(p＜0.01，结果如图9-10所示)。TNF-α的大量或持续释放对脓毒症和自身免疫性疾病的病理损伤具有重要意义。因此抑制TNF-α的释放可以有效发挥对脓毒症和自身免疫性疾病的防治作用。
实施例7：K.A和K.B对细胞活力影响的测定(MTT法)
7.1实验方法：采用四氮噻唑蓝(MTT)法，用DMEM培养液将RAW264.7细胞稀释至1×106/ml，加入96孔板(200μL/孔)，置37℃，5％CO2培养箱培养4h后，实验组依次加入终浓度为200μg/ml的K.A和K.B；正常对照组不加任何试剂。各组均设6个平行孔。继续培养24h后，弃上清，每孔加入180μL培养液和20μL MTT溶液(5mg/ml)，再继续培养4h，吸弃细胞培养上清，每孔加入150μL二甲基亚砜，振荡10min使结晶充分溶解，以550nm处测定的各孔吸光度(OD550)值表示RAW264.7细胞活力，比较K.A和K.B与对照组之间的吸光度的差异。
7.2实验结果：MTT实验结果显示，200μg/ml K.A和K.B对RAW264.7细胞活力无影响(P＞0.05)，表明该浓度的的K.A和K.B对RAW264.7细胞释放TNF-α的抑制作用不是由其细胞毒性导致的。结果如图11所示。
实施例8：K.A和K.B体内对LPS和CpG DNA的拮抗作用
8.1实验方法：参照文献制备热灭活E.coil悬液，于波长600nm处检测悬液吸光度值(OD600值1.0≈1.0×1010CFU/ml)；昆明小鼠84只，雌雄各半，随机分为热灭活E.coil对照组，K.A(40mg/kg)+E.coil.组和K.B(40mg/kg)+E.coil.组，每组各28只。动物称重后，热灭活E.coil对照组注入热灭活E.coil(1.1×1010CFU/Kg)；，K.A和K.B治疗组于热灭活E.coil(1.1×1011CFU/Kg)注入10min后分别注射40mg/Kg的K.A和K.B。每只动物液体注入总量为200μl/20g，分别在注射后0、2、4、8、12、24、48和72h眼眶取静脉血，鲎试剂动态比浊法检测LPS水平，ELISA法检测TNF-α水平。
8.2实验结果：如图12-13所示，热灭活E.coil.细胞本身无增殖活力，但其中含有大量的LPS和CpG DNA，在体内能够很好地模拟LPS和CpG DNA的刺激作用。热灭活E.coil.对照组小鼠在4h后血LPS和TNF-α迅速升高，在24-48h内回复到初始状态。与热灭活E.coil对照组相比，K.A和K.B治疗组可显著降低小鼠在各时相点的血LPS和TNF-α水平(p＜0.05或p＜0.01)，说明二者在体内对LPS和CpG DNA均具有很好的拮抗活性，可通过抑制LPS和CpG DNA的刺激作用，阻止TNF-α的大量或持续释放，有效发挥对脓毒症和自身免疫性疾病的防治作用。

Claims (5)

1.一种苦柯胺A和苦柯胺B在制备预防和治疗脓毒症及自身免疫性疾病药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述苦柯胺A和苦柯胺B从中药地骨皮中提取。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述地骨皮为茄科植物枸杞或宁夏枸杞干燥根皮。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物用于制备预防和治疗脓毒症及自身免疫性疾病药物的用途
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物用于拮抗导致脓毒症和自身免疫性疾病发病的关键因素细菌内毒素(LPS)和细菌非甲基化DNA(CpGDNA)。
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