CN102464591B - 苦柯胺b盐及制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种苦柯胺B盐，以及其制备方法和在制备预防和治疗脓毒症药物中的用途。实验显示，苦柯胺B盐对介导脓毒症的主要致病因子具有良好的拈抗作用，可用于制备预防和治疗脓毒症的药物。苦柯胺B盐与药学上可接受的任何载体和/或稀释剂制成各种制剂，在目前临床上缺乏确切有效的脓毒症治疗措施的情况下，为此类难治性疾病提供了一种有效的防治手段。

Description

苦柯胺B盐及制备方法和用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，特别涉及一种苦柯胺B盐及其制备方法和苦柯胺B盐用于制备预防和治疗脓毒症药物的用途。
背景技术
脓毒症是感染因素介导的全身炎症反应综合征(systemic inflammatoryresponse syndrome，SIRS)，是烧伤、创伤、肿瘤和感染性疾病等患者的常见并发症，现已成为全球公认的导致重症监护病房(ICU)患者死亡的首要因素。脓毒症的现有临床治疗手段主要为早期使用抗生素和纠正缺血低氧性损害，采用常规治疗器官衰竭和休克的方法，尚无特效治疗措施。药物治疗通常以经验性地使用糖皮质激素、胰岛素、免疫调节剂等非特异性药物为主，但疗效一直未被肯定。20世纪90年代，抗lipid A的单抗HA-1A(Centoxin)曾在海湾战争期间用于美军战伤和烧伤后脓毒症的治疗，该药也曾在欧洲部分国家和日本临床使用，但因对脓毒症休克反而可能有不利作用，1992年未能获得美国FDA的批准，随即亦从欧洲市场消失。重组人活化蛋白C(recombinant human activated protein C，rhAPC)是目前唯一被FDA批准的治疗脓毒症的药物(商品名Xigris)。临床试验结果显示rhAPC可降低脓毒症病人28天死亡率，于2001年11月经FDA批准上市。然而2005年的第二次临床试验结果却显示rhAPC组28天的死亡率与对照组没有差异。2007年的临床试验中，rhAPC不仅不具有提高脓毒症病人生存率的作用，还具有导致患者严重出血倾向的副作用，因此组织此次临床试验的机构建议不要推荐使用其作为治疗脓毒症的临床药物。
病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)及其模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)的发现，使人类对脓毒症的认识发生了质的飞跃。现已证实脓毒症的发病机制是病原体侵入机体后，其菌体的PAMPs(主要包括脂多糖/内毒素(lipopolysaccharide/endotoxin，LP S)、细菌基因组DNA(CpG DNA)和肽聚糖(peptideglycan，PGN)等)被机体非特异性免疫系统中炎症反应细胞膜上/细胞内相应的PRRs识别，导致炎症反应细胞活化，释放炎症介质而引发全身性炎症反应，进而导致组织器官的损伤。因此，在既往拈抗炎症反应中的重要效应分子，纠正凝血、补体等系统的紊乱，以及单一拈抗LPS等治疗措施失败之际，寻找同时拈抗多个主要PAMPs(LPS、CpG DNA和PGN等)的药物，从源头阻断脓毒症的发生可能为其治疗带来突破性进展。
苦柯胺B(kukoamine B)，又名地骨皮乙素，是从中药地骨皮中分离得到的一种天然存在的生物碱类化合物，化学结构如下：
苦柯胺B最早由日本的Shinji Funayama于1995年从地骨皮中发现，以游离碱形式存在(S.Funayama，G.Zhang和S.Nozoe.Phytochemistry.1995；38：1529-1531)。除从植物中提取、分离和纯化方法以及结构表征外，未见苦柯胺B的任何生物活性研究报道。在本申请人较早提交的中国专利申请中公开了苦柯胺B在制备预防和治疗脓毒症及自身免疫性疾病药物中的用途(中国专利申请号201010156503.X)。
苦柯胺B在不同产地、采收期的地骨皮药材中含量差异较大，因此从植物中直接提取、分离和纯化苦柯胺B用以制备预防和治疗脓毒症的药物具有来源不稳定、生产成本高、能耗大等缺点。化学合成为苦柯胺B的制备提供了新的方法，而追溯既往研究报道和专利，未见对苦柯胺B的全化学合成研究。
较之天然产物苦柯胺B，苦柯胺B盐以新的盐形式存在，具有新的化学结构。对于苦柯胺B盐及其全化学合成方法，迄今未见专利、文献报道，亦未见其治疗脓毒症，特别未见通过同时拈抗多个PAMPs(LPS和CpG DNA)治疗脓毒症的报道。
发明内容
本发明针对上述不足，提供一种苦柯胺B盐和制备方法，本发明还提供一种苦柯胺B盐及包含苦柯胺B盐的药物组合物在制备预防和治疗脓毒症药物中的用途。使用苦柯胺B盐和包含苦柯胺B盐的药物组合物，治疗脓毒症的作用机制新颖，疗效好，安全可靠，为脓毒症的治疗提供了一种新的手段。
本发明的技术方案是：
苦柯胺B盐具有如下化学结构
其中，A为无氧酸或含氧酸的无机酸或羧酸或羟基酸或磺酸或酸性氨基酸的有机酸。
所述的苦柯胺B盐是在化合物结构的碱性基团部位形成酸式盐，包括无机酸盐和有机酸盐。
所述无氧酸为盐酸和氢溴酸中的任意一种。
所述含氧酸为硫酸、磷酸和硝酸中的任意一种。
所述无机酸为盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸中的任意一种，效果较好。
所述羧酸为醋酸、丙酸、丁酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、己二酸、苯甲酸、苯丙酸、肉桂酸、硬脂酸、三氟醋酸、马来酸、富马酸、烟酸和棕榈酸中的任意一种。
所述羟基酸为苹果酸、柠檬酸、乳酸、羟基丁酸、乳糖酸、酒石酸、扁桃酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸和抗坏血酸中的任意一种。
所述磺酸为甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸和樟脑磺酸中的任意一种。
所述酸性氨基酸为谷氨酸和天冬氨酸中的任意一种。
所述有机酸为醋酸、马来酸、琥珀酸、苹果酸、乳酸、酒石酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、谷氨酸和天冬氨酸中的任意一种，效果较好。
所述的苦柯胺B盐中的酸广泛选自多种无机酸和/或有机酸，主要是从医药上允许使用的各类酸中分别选取2～3个具有代表性的酸对制备苦柯胺B盐的共性问题进行说明，包括从无机酸中的无氧酸中选取盐酸和氢溴酸，含氧酸中选取硫酸和磷酸，有机酸中的羧酸中选取醋酸、马来酸和琥珀酸，羟基酸中选取苹果酸、乳酸和酒石酸，磺酸中选取甲磺酸和对甲苯磺酸，酸性氨基酸中选取谷氨酸和天冬氨酸。虽然申请人的实验只显示了这四种无机酸和十种有机酸的实验结果，但是其他无机酸和/或有机酸(包括本发明已例举的和未例举的酸)均是可以相同方式制备苦柯胺B盐。
所述的使用苦柯胺B盐和包含苦柯胺B盐的药物组合物制备的预防和治疗脓毒症的药物，可经胃肠道给药，如以散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂等剂型给药；或非经胃肠道给药，如注射给药，腔道给药，粘膜给药等方式给药。对成人而言，用药量以每公斤体重每天0.1～15mg为宜，用药方式可以为一天一次或多次。
苦柯胺B盐的制备方法，是以3，4-二甲氧基苯丙酸(或3，4-二羟基苯丙酸)和丁二胺为原料，通过一系列化学反应合成获得，具体如下：
(1)取下式中的化合物I与氢溴酸在100～160℃反应，生成化合物II，化合物I∶氢溴酸的当量比为1∶2～5；
(2)将化合物II溶于N，N-二甲基甲酰胺中，使反应体系处于N，N-二甲基甲酰胺溶液环境中，加入碳酸钾和苄氯，60～100℃反应，生成化合物III，化合物II∶碳酸钾∶苄氯的当量比为1∶3～6∶3～5；
(3)将化合物III加入氢氧化钠溶液中，加入甲醇，使反应体系处于甲醇溶液环境中，40～90℃反应，生成化合物IV，化合物III∶氢氧化钠的当量比为1∶1～3；
(4)将化合物IV溶解于二氯甲烷中，加入N，N-二甲基甲酰胺，使反应体系处于二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺混合溶液环境中，加入二氯亚砜，45～65℃反应，生成化合物V，化合物IV∶二氯亚砜的当量比为1∶1～2；
(5)将氢氧化钠溶液加入化合物VI中，加入二碳酸二叔丁酯的乙醇溶液，室温下反应，生成化合物VII，氢氧化钠∶化合物VI∶二碳酸二叔丁酯的当量比为1～2∶1∶0.5～1；
(6)将化合物VII溶解于甲醇中，使反应体系处于甲醇溶液环境中，加入丙烯腈的甲醇溶液，室温下反应，生成化合物VIII，化合物VII∶丙烯腈的当量比为1∶1～2；
(VIII)
(7)在化合物VIII中加入四氢呋喃和三乙胺，使反应体系处于四氢呋喃和三乙胺混合溶液环境中，加入氯甲酸苄酯的四氢呋喃溶液，室温下反应，生成化合物IX，化合物VIII∶氯甲酸苄酯的当量比为1∶1～2；
(8)取化合物IX于高压釜中，加入饱和的氨气的甲醇溶液至完全溶解，加入相当于化合物IX质量10～50％的雷尼镍，换气，使体系处于1～10MPa的氢气压力下，35～50℃反应，生成化合物X；
(9)将化合物X溶解于二氯甲烷中，加入三乙胺，使反应体系处于二氯甲烷和三乙胺混合溶液环境中，于0℃以下将化合物V的二氯甲烷溶液加入其中，反应生成化合物XI，化合物X∶化合物V的当量比为1∶1～1.5；
(10)将化合物XI溶解于二氯甲烷中，使反应体系处于二氯甲烷溶液环境中，加入三氟乙酸，室温下反应，生成化合物XII，化合物XI∶三氟乙酸的当量比为1∶2～5；
(11)将化合物XII溶于甲醇中，加入三乙胺，使反应体系处于甲醇和三乙胺的混合溶液环境中，升温至50～80℃，加入丙烯腈的甲醇溶液，降至室温反应，生成化合物XIII，化合物XII∶丙烯腈的当量比为1∶1～2；
(12)将化合物XIII溶解于二氯甲烷中，加入三乙胺，使反应体系处于二氯甲烷和三乙胺混合溶液环境中，于0℃以下将化合物V的二氯甲烷溶液加入其中，反应生成化合物XIV，化合物XIII∶化合物V的当量比为1∶1～1.5；
(13)取化合物XIV于高压釜中，加入饱和的氨气的甲醇溶液与四氢呋喃的混合溶液至完全溶解，使反应体系处于该溶液环境中，加入相当于化合物XIV质量10～50％的雷尼镍，换气，使体系处于1～10MPa的氢气压力下，35～50℃反应，生成化合物XV；
(14)将化合物XV与上述的任意一种酸置于高压釜中，加入甲醇、四氢呋喃与水的混合溶液至完全溶解，使反应体系处于该溶液环境中，加入相当于化合物XV质量10～30％的钯碳，换气，使反应体系处于1～10MPa的氢气压力下，25～45℃反应，生成苦柯胺B盐，化合物XV∶酸的当量比为1∶1～8。
苦柯胺B盐的药物组合物，包含上述的苦柯胺B盐作为活性成分和药学上可接受的载体和/或稀释剂。
苦柯胺B盐在制备预防和治疗脓毒症药物中的应用。
苦柯胺B盐的药物组合物在制备预防和治疗脓毒症药物中的用途。
经申请人实验证明，上述合成反应苦柯胺B盐的收率为15％。
本发明所述的苦柯胺B盐的药物组合物，包含苦柯胺B盐作为活性成分和药学上可接受的载体和/或稀释剂。
本发明所述的苦柯胺B盐可以用于制备预防和治疗脓毒症药物。
申请人通过药理活性实验显示：
(1)苦柯胺B盐能与LPS的活性中心lipid A结合；
(2)苦柯胺B盐能在体外以剂量依赖的方式中和LPS；
(3)苦柯胺B盐能以剂量依赖的方式分别抑制LPS和CpG DNA诱导RAW264.7细胞释放炎症介质。
本发明使用苦柯胺B盐和包含苦柯胺B盐的药物组合物，治疗脓毒症的作用机制新颖，能同时拈抗介导脓毒症的多个PAMPs，不同于现有的糖皮质激素、胰岛素、抗炎症介质药物、抗凝药物、抗LPS多肽及lipid A单抗等药物；疗效好，能够通过同时拈抗多个病原分子从而显著抑制其诱导的炎症反应，为脓毒症的治疗提供了一种新的手段。
本发明广泛选取多种无机酸和/或有机酸对制备苦柯胺B盐的共性问题进行说明，化学和药学领域的技术人员可以理解，使用同类的无机酸和/或有机酸均可以相同的方式，通过化学领域熟知的方法制备苦柯胺B盐。本领域技术人员亦可理解，其中的苦柯胺B可通过常规植物化学方法从植物中提取、分离和纯化获得。因此应当说明，用其他无机酸和/或有机酸替代本发明列举的无机酸和/或有机酸，以及以天然存在的或化学合成的苦柯胺B为对象进行基于本发明设计思想的结构修饰和改造均应属于本发明的技术方案内容和专利保护范围，本领域技术人员在本说明的启示下对本发明实施所作的任何变动均在本申请的权利要求范围之内。
附图说明
图1为苦柯胺B盐与lipid A的结合反应。其中，A是苦柯胺B苹果酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、盐酸盐和硫酸盐的实验结果，B是苦柯胺B对甲苯磺酸盐、谷氨酸盐、醋酸盐、马来酸盐、天冬氨酸盐、氢溴酸盐和磷酸盐的实验结果；
图2为苦柯胺B盐在体外中和LPS。其中，A是苦柯胺B苹果酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、盐酸盐和硫酸盐的实验结果，B是苦柯胺B对甲苯磺酸盐、谷氨酸盐、醋酸盐、马来酸盐、天冬氨酸盐、氢溴酸盐和磷酸盐的实验结果；
图3为苦柯胺B盐抑制LPS诱导RAW264.7细胞释放炎症介质。其中，A，B，C，D，E，F，G，H，I和J分别为苦柯胺B苹果酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、谷氨酸盐、醋酸盐、盐酸盐和硫酸盐的实验结果；
图4为苦柯胺B盐抑制CpG DNA诱导RAW264.7细胞释放炎症介质。其中，A，B，C，D，E，F，G，H，I和J分别为苦柯胺B苹果酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、谷氨酸盐、醋酸盐、盐酸盐和硫酸盐的实验结果。
具体实施方式
LPS和CpG DNA是导致脓毒症发病的关键致病因子，药物对LPS和CpG DNA的拈抗反映了其对脓毒症的防治作用。
以下实施例是对本发明的详细说明，特别优选药用性质成熟的苦柯胺B苹果酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、谷氨酸盐、醋酸盐、盐酸盐和硫酸盐进行说明。应当理解，以下所述仅为本发明的较佳实施例，其不以任何形式限制本发明。应当说明，如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换的，均应涵盖在本发明的权利要求的保护范围当中。
若未经特别说明，本文中所用试剂均为分析纯。
若未经特别说明，在文中下列英文缩写均具有所述中文含义：
TLC 薄层色谱
DMF N，N-二甲基甲酰胺
MeOH 甲醇
HCl 盐酸
(Boc)2O 二碳酸二叔丁酯
DCM 二氯甲烷
EtOH 乙醇
THF 四氢呋喃
Cbz-Cl 氯甲酸苄酯
Raney Ni 雷尼镍
MPa 兆帕
h 小时
TFA 三氟乙酸
rt 室温
Pd/C 钯碳
NMR 核磁共振
PBS 磷酸盐缓冲液
M 摩尔/升
arc seconds 弧秒
实施例1：苦柯胺B苹果酸盐的合成
1.1实验方法：(1)称取50g化合物f1溶于100ml氢溴酸(浓度40％)中，加热至140℃反应。TLC监测，反应完全之后，直接冷却可见黄色晶体析出，抽滤，用少量石油醚洗涤，可得黄色固体化合物f2 40g。将40g化合物f2溶于120ml DMF中，加入116g碳酸钾及86ml卞氯升温至80℃反应。TLC监测，反应完全之后，直接过滤，乙酸乙酯萃取，水洗，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，浓缩得化合物f3。将14.4g氢氧化钠溶解于80ml水中，将85g化合物f3加入其中，再加入80ml的甲醇，升温至90℃回流反应。TLC监测，反应完全之后，旋转蒸发干，倾入烧杯中，加入浓HCl至强酸性，过滤，收集滤饼，干燥可得银黄色化合物f60g，收率69％，化学反应方程式如下所示：
(2)称取20g丁二胺(化合物a)于500ml圆底烧瓶中，加入28％的氢氧化钠溶液23ml，待溶解完全之后，室温搅拌下缓慢滴入浓度为12.5％的(Boc)2O的乙醇溶液200ml，待滴加完全之后，室温搅拌反应。TLC监测，反应完全之后，浓缩旋转蒸发干乙醇，DCM萃取多次直至产品萃取完全，合并有机层，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，静置，抽滤，浓缩得无色油状物b 13.7g，收率64％，化学反应方程式如下所示：
(3)称取27g化合物b溶解于60ml甲醇中，于室温搅拌下滴入12ml丙烯腈与20ml甲醇的混合溶液，待滴加完全之后，室温搅拌反应。TLC监测，反应完全之后，浓缩旋转蒸发干，即得无色油状物c 31g，收率88.6％，化学反应方程式如下所示：
(4)称取30g化合物c于250ml圆底烧瓶中，加入80ml THF及26ml三乙胺，室温搅拌下滴入21ml Cbz-Cl与50ml THF的混合溶液，待滴加完全之后，室温搅拌反应。TLC监测，反应完全之后，浓缩旋转蒸发干有机溶剂，乙酸乙酯萃取，1mol/L HCl溶液洗涤三次，水洗，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，静置，抽滤，浓缩得淡黄色油状物。待浓缩后加入部分石油醚搅拌可有大量白色固体析出，抽滤，白色固体用石油醚洗涤，得风干的白色固体d 40g，收率86％，化学反应方程式如下所示：
(5)称取15g化合物d于高压釜中，加入150ml饱和的氨气的甲醇溶液溶解至完全澄清，加入4.5g Raney Ni，换气，使体系处于5～10MPa的氢气压力下，升温至50℃搅拌反应。TLC监测，反应完全之后，硅藻土抽滤，浓缩得蓝色的油状物e 13.8g，收率92％，化学反应方程式如下所示：
(6)称取13.1g化合物f溶解于40ml无水DCM中，加入0.1ml DMF，于室温搅拌下滴入3.9ml二氯亚砜，待滴加完毕后，升温至45～65℃回流搅拌反应5h，浓缩旋转蒸发干DCM，得化合物f0，在新制的化合物f0中加入无水甲苯旋转蒸发干以除去多余的二氯亚砜。另称取13.8g化合物e溶解于50ml无水DCM中，加入12ml的三乙胺，于0℃的条件下将新制的化合物f0的DCM溶液(浓度10％)40ml缓慢滴入其中，TLC监测，反应完全之后，抽滤，浓缩，用乙醚萃取，依次用饱和的碳酸钾溶液3次、1mol/LHCl溶液、水、饱和的食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，静置，抽滤旋干得红色油状物g 23g，收率88％，化学反应方程式如下所示：
(7)称取13g化合物g溶解于30ml的DCM中，加入5ml TFA，室温搅拌。TLC监测，反应完全之后，浓缩旋转蒸发干DCM后，加入乙酸乙酯萃取，水洗，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，静置，抽滤，浓缩得红色油状物h 11g，收率85％，化学反应方程式如下所示：
(8)称取18.1g化合物h溶于40ml MeOH中，加入8ml三乙胺，升温至60℃，在搅拌的过程中缓慢滴入2.1ml丙烯腈与15ml甲醇的混合溶液。待滴加完毕后，逐渐降至室温搅拌反应。TLC监测，反应完全之后，直接浓缩旋转蒸发干除掉有机溶剂，得化合物i，化学反应方程式如下所示：
(9)称10.5g取化合物f于100ml的圆底烧瓶中，加入35ml无水DCM，加入2滴(0.1ml)DMF，再缓慢滴加2.6ml的二氯亚砜，待滴加完后升温至45～65℃回流反应4h，浓缩旋转蒸发干DCM，得化合物f0，加入干燥的甲苯于新制的化合物f0中旋转蒸发干以除去多余的二氯亚砜。另称取19.6g化合物i溶解于50ml无水DCM中，加入12ml三乙胺，于0℃的条件下将新制的化合物f0的DCM溶液(浓度10％)缓慢滴入其中，TLC监测，反应完全之后，抽滤，浓缩，用乙酸乙酯萃取，依次用饱和的碳酸钾溶液3次、1mol/LHCl溶液、水、饱和的食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，静置，抽滤，旋转蒸发干得红色油状物。将此红色油状物采用硅胶柱层析法进行分离，以200～300目的硅胶为固定相，乙酸乙酯∶石油醚(2∶1)为流动相，收集全部流出液并浓缩至干，可得化合物j 21g，收率79％，化学反应方程式如下所示：
(10)称取20g化合物j于高压釜中，加入饱和的氨气的甲醇溶液∶THF为3∶1的溶液400ml，换气使反应体系处于1～2MPa下，50℃搅拌反应。TLC监测，反应完全之后，抽滤，浓缩即得蓝色的油状化合物k 18.6g，收率93％，化学反应方程式如下所示：
(11)称取化合物k 1g及苹果酸0.8g于高压釜中，加入MeOH∶THF∶水为3∶1∶1的溶液30ml溶解澄清后，加入0.2g Pd/C催化剂，换气，使反应体系处于10MPa的氢气压力下，升温至45℃条件下反应，TLC薄层监测，反应完全之后，抽滤，浓缩至干得深绿色的半固体，加入乙醇30ml，超声震荡，静置沉降，倾去上层清液，反复多次，最后抽滤，可得深绿色固体粉末407mg，化学反应方程式如下所示：
1.2实验结果：得到深绿色固体粉末407mg。紫外吸收光谱：λmax nm＝280(甲醇)；质谱：[M+H]+m/z 531.36；核磁共振氢谱1H-NMR(400MHz，D2O)：δ(ppm)6.88-6.73(m，6H)，4.41(s，1H)，3.43-3.23(m，6H)，2.86-2.59(m，16H)，1.87-1.41(m，8H)，鉴定为苦柯胺B苹果酸盐，化学结构如下所示：
实施例2：苦柯胺B琥珀酸盐的合成
2.1实验方法：步骤(1)～(10)同实施例1步骤(1)～(10)；
(11)称取化合物k 1g及琥珀酸0.71g于高压釜中，加入MeOH∶THF∶水为3∶1∶1的溶液30ml溶解澄清后，加入0.2g Pd/C催化剂，换气，使反应体系处于10MPa的氢气压力下，升温至45℃条件下反应，TLC薄层监测，反应完全之后，抽滤，浓缩至干得墨绿色的半固体，加入乙醇30ml，超声震荡，静置沉降，倾去上层清液，反复多次，最后抽滤，可得墨绿色固体粉末365mg，化学反应方程式如下所示：
2.2实验结果：得到墨绿色粉末状固体365mg。紫外吸收光谱：λmax nm＝280(甲醇)；质谱：[M+H]+m/z 531.36，鉴定为苦柯胺B琥珀酸盐，化学结构如下所示：
实施例3：苦柯胺B乳酸盐的合成
3.1实验方法：步骤(1)～(10)同实施例1步骤(1)～(10)；
(11)称取化合物k 1g及乳酸0.5ml于高压釜中，加入MeOH∶THF∶水为3∶1∶1的溶液30ml溶解澄清后，加入0.2g Pd/C催化剂，换气，使反应体系处于10MPa的氢气压力下，升温至45℃条件下反应，TLC薄层监测，反应完全之后，抽滤，浓缩至干得黄色的半固体，加入乙醇30ml，超声震荡，静置沉降，倾去上层清液，反复多次，最后抽滤，可得黄色固体粉末340mg，化学反应方程式如下所示：
3.2实验结果：得到黄色粉末状固体340mg。紫外吸收光谱：λmax nm＝280(甲醇)；质谱：[M+H]+m/z 531.36，鉴定为苦柯胺B乳酸盐，化学结构如下所示：
实施例4：苦柯胺B酒石酸盐的合成
4.1实验方法：步骤(1)～(10)同实施例1步骤(1)～(10)；
(11)称取化合物k 1g及酒石酸0.9g于高压釜中，加入MeOH∶THF∶水为3∶1∶1的溶液30ml溶解澄清后，加入0.2g Pd/C催化剂，换气，使反应体系处于10MPa的氢气压力下，升温至45℃条件下反应，TLC薄层监测，反应完全之后，抽滤，浓缩至干得黄色的半固体，加入乙醇30ml，超声震荡，静置沉降，倾去上层清液，反复多次，最后抽滤，可得黄色固体粉末383mg，化学反应方程式如下所示：
4.2实验结果：得到黄色粉末状固体383mg。紫外吸收光谱：λmax nm＝280(甲醇)；质谱：[M+H]+m/z 531.36，鉴定为苦柯胺B酒石酸盐，化学结构如下所示：
实施例5：苦柯胺B甲磺酸盐的合成
5.1实验方法：步骤(1)～(10)同实施例1步骤(1)～(10)；
(11)称取化合物k 1.0g及甲磺酸0.58g于高压釜中，加入MeOH∶THF∶水为3∶1∶1的溶液30ml溶解澄清后，加入0.2g Pd/C催化剂，换气，使反应体系处于10MPa的氢气压力下，升温至45℃条件下反应，TLC薄层监测，反应完全之后，抽滤，浓缩至干得淡黄色的半固体，加入乙醇30ml，超声震荡，静置沉降，倾去上层清液，反复多次，最后抽滤，可得淡黄色固体粉末355mg，化学反应方程式如下所示：
5.2实验结果：得到淡黄色粉末状固体355mg。紫外吸收光谱：λmax nm＝280(甲醇)；质谱：[M+H]+m/z 531.36，鉴定为苦柯胺B苯磺酸盐，化学结构如下所示：
实施例6：苦柯胺B对甲苯磺酸盐的合成
6.1实验方法：步骤(1)～(10)同实施例1步骤(1)～(10)；
(11)称取化合物k 1g及对甲苯磺酸盐1g于高压釜中，加入MeOH∶THF∶水为3∶1∶1的溶液30ml溶解澄清后，加入0.2g Pd/C催化剂，换气，使反应体系处于10MPa的氢气压力下，升温至45℃条件下反应，TLC薄层监测，反应完全之后，抽滤，浓缩至干得淡黄色的半固体，加入乙醇30ml，超声震荡，静置沉降，倾去上层清液，反复多次，最后抽滤，可得淡黄色固体粉末396mg，化学反应方程式如下所示：
6.2实验结果：得到淡黄色粉末状固体396mg。紫外吸收光谱：λmax nm＝280(甲醇)；质谱：[M+H]+m/z 531.36，鉴定为苦柯胺B对甲苯磺酸盐，化学结构如下所示：
实施例7：苦柯胺B谷氨酸盐的合成
7.1实验方法：步骤(1)～(10)同实施例1步骤(1)～(10)；
(11)称取化合物k 1.0g及谷氨酸0.88g于高压釜中，加入MeOH∶THF∶水为3∶1∶1的溶液30ml溶解澄清后，加入0.2g Pd/C催化剂，换气，使反应体系处于10MPa的氢气压力下，升温至45℃条件下反应，TLC薄层监测，反应完全之后，抽滤，浓缩至干得淡黄色的半固体，加入乙醇30ml，超声震荡，静置沉降，倾去上层清液，反复多次，最后抽滤，可得淡黄色固体粉末380mg，化学反应方程式如下所示：
7.2实验结果：得到淡黄色粉末状固体380mg。紫外吸收光谱：λmax nm＝280(甲醇)；质谱：[M+H]+m/z 531.36，鉴定为苦柯胺B谷氨酸盐，化学结构如下所示：
实施例8：苦柯胺B醋酸盐的合成
8.1实验方法：步骤(1)～(10)同实施例1步骤(1)～(10)；
(11)称取化合物k 1.0g及醋酸0.4ml于高压釜中，加入MeOH∶THF∶水为3∶1∶1的溶液30ml溶解澄清后，加入0.2g Pd/C催化剂，换气，使反应体系处于10MPa的氢气压力下，升温至45℃条件下反应，TLC薄层监测，反应完全之后，抽滤，浓缩至干得淡黄色的半固体，加入乙醇30ml，超声震荡，静置沉降，倾去上层清液，反复多次，最后抽滤，可得淡黄色固体粉末330mg，化学反应方程式如下所示：
8.2实验结果：得到淡黄色粉末状固体330mg。紫外吸收光谱：λmax nm＝280(甲醇)；质谱：[M+H]+m/z 531.36，鉴定为苦柯胺B谷氨酸盐，化学结构如下所示：
实施例9：苦柯胺B盐酸盐的合成
9.1实验方法：步骤(1)～(10)同实施例1步骤(1)～(10)；
(11)称取化合物k 1g及盐酸0.64ml于高压釜中，加入MeOH∶THF∶水为3∶1∶1的溶液30ml溶解澄清后，加入0.2g Pd/C催化剂，换气，使反应体系处于10MPa的氢气压力下，升温至45℃条件下反应，TLC薄层监测，反应完全之后，抽滤，浓缩至干得黄色的半固体，加入乙醇30ml，超声震荡，静置沉降，倾去上层清液，反复多次，最后抽滤，可得黄色固体粉末320mg，化学反应方程式如下所示：
9.2实验结果：得到黄色粉末状固体320mg。紫外吸收光谱：λmax nm＝280(甲醇)；质谱：[M+H]+m/z 531.36，鉴定为苦柯胺B盐酸盐，化学结构如下所示：
实施例10：苦柯胺B硫酸盐的合成
10.1实验方法：步骤(1)～(10)同实施例1步骤(1)～(10)；
(11)称取化合物k 1.0g及硫酸0.4ml于高压釜中，加入MeOH∶THF∶水为3∶1∶1的溶液30ml溶解澄清后，加入0.2g Pd/C催化剂，换气，使反应体系处于10MPa的氢气压力下，升温至45℃条件下反应，TLC薄层监测，反应完全之后，抽滤，浓缩至干得淡黄色的半固体，加入乙醇30ml，超声震荡，静置沉降，倾去上层清液，反复多次，最后抽滤，可得淡黄色固体粉末355mg，化学反应方程式如下所示：
10.2实验结果：得到淡黄色粉末状固体355mg。紫外吸收光谱：λmax nm＝280(甲醇)；质谱：[M+H]+m/z 531.36，鉴定为苦柯胺B硫酸盐，化学结构如下所示：
实施例11：苦柯胺B马来酸盐的合成
11.1实验方法：步骤(1)～(10)同实施例1步骤(1)～(10)；
(11)称取化合物k 1.0g及马来酸0.7g于高压釜中，加入MeOH∶THF∶水为3∶1∶1的溶液30ml溶解澄清后，加入0.2g Pd/C催化剂，换气，使反应体系处于10MPa的氢气压力下，升温至45℃条件下反应，TLC薄层监测，反应完全之后，抽滤，浓缩至干得黄色的半固体，加入乙醇30ml，超声震荡，静置沉降，倾去上层清液，反复多次，最后抽滤，可得黄色固体粉末365mg，化学反应方程式如下所示：
11.2实验结果：得到黄色粉末状固体365mg。紫外吸收光谱：λmax nm＝280(甲醇)；质谱：[M+H]+m/z 531.36，鉴定为苦柯胺B马来酸盐，化学结构如下所示：
实施例12：苦柯胺B天冬氨酸盐的合成
12.1实验方法：步骤(1)～(10)同实施例1步骤(1)～(10)；
(11)称取化合物k 1.0g及天冬氨酸0.8g于高压釜中，加入MeOH∶THF∶水为3∶1∶1的溶液30ml溶解澄清后，加入0.2g Pd/C催化剂，换气，使反应体系处于10MPa的氢气压力下，升温至45℃条件下反应，TLC薄层监测，反应完全之后，抽滤，浓缩至干得淡黄色的半固体，加入乙醇30ml，超声震荡，静置沉降，倾去上层清液，反复多次，最后抽滤，可得淡黄色固体粉末374mg，化学反应方程式如下所示：
12.2实验结果：得到淡黄色粉末状固体374mg。紫外吸收光谱：λmax nm＝280(甲醇)；质谱：[M+H]+m/z 531.36，鉴定为苦柯胺B天冬氨酸盐，化学结构如下所示：
实施例13：苦柯胺B氢溴酸盐的合成
13.1实验方法：步骤(1)～(10)同实施例1步骤(1)～(10)；
(11)称取化合物k 1.0g及氢溴酸0.5ml于高压釜中，加入MeOH∶THF∶水为3∶1∶1的溶液30ml溶解澄清后，加入0.2g Pd/C催化剂，换气，使反应体系处于10MPa的氢气压力下，升温至45℃条件下反应，TLC薄层监测，反应完全之后，抽滤，浓缩至干得淡黄色的半固体，加入乙醇30ml，超声震荡，静置沉降，倾去上层清液，反复多次，最后抽滤，可得淡黄色固体粉末345mg，化学反应方程式如下所示：
13.2实验结果：得到淡黄色粉末状固体345mg。紫外吸收光谱：λmax nm＝280(甲醇)；质谱：[M+H]+m/z 531.36，鉴定为苦柯胺B氢溴酸盐，化学结构如下所示：
实施例14：苦柯胺B磷酸盐的合成
14.1实验方法：步骤(1)～(10)同实施例1步骤(1)～(10)；
(11)称取化合物k 1.0g及磷酸0.4ml于高压釜中，加入MeOH∶THF∶水为3∶1∶1的溶液30ml溶解澄清后，加入0.2g Pd/C催化剂，换气，使反应体系处于10MPa的氢气压力下，升温至45℃条件下反应，TLC薄层监测，反应完全之后，抽滤，浓缩至干得淡黄色的半固体，加入乙醇30ml，超声震荡，静置沉降，倾去上层清液，反复多次，最后抽滤，可得淡黄色固体粉末354mg，化学反应方程式如下所示：
14.2实验结果：得到淡黄色粉末状固体354mg。紫外吸收光谱：λmax nm＝280(甲醇)；质谱：[M+H]+m/z 531.36，鉴定为苦柯胺B磷酸盐，化学结构如下所示：
实施例15：苦柯胺B盐与lipid A的亲和力测定
15.1实验方法：参照申请者本人的中国专利“一种从中草药中筛选、分离的活性组分或活性物质在制备治疗脓毒症药物中的应用”(中国专利号ZL 200510070677.3)中所述方法进行实验，主要包括以下步骤：
(1)按照IAsys plus亲和传感器仪器使用说明中有关脂质的包被操作说明，将lipid A包被于非衍生型样品池上。其中，lipid A疏水侧链与样品池结合，亲水端游离于外侧，作为发生结合作用的靶点。
(2)取苦柯胺B盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、醋酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、谷氨酸盐和天冬氨酸盐各1mg，分别加PBS(0.01M，pH 7.4)1ml充分溶解；
(3)取上述溶液各5μl分别加入已预先包被有lipid A的亲和传感器样品池中(样品池含45μl PBS)，进行反应；
(4)结合反应时间3分钟，记录结合反应曲线；
(5)以50μl PBS冲洗样品池3次，记录解离曲线；
(6)以0.1M HCl冲洗样品池3次，记录再生曲线。
15.2实验结果：各种苦柯胺B盐均能与lipid A发生结合，结合反应曲线如图1所示。其中，图1A是苦柯胺B苹果酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、盐酸盐和硫酸盐的实验结果；图1.B是苦柯胺B对甲苯磺酸盐、谷氨酸盐、醋酸盐、马来酸盐、天冬氨酸盐、氢溴酸盐和磷酸盐的实验结果。
实施例16：苦柯胺B盐体外中和LPS实验
16.1实验方法：按照32 Well Kinetic Tube Reader(ATi321-06)内毒素检测仪操作说明进行实验，主要包括以下步骤：
(1)取苦柯胺B盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、醋酸盐、马来酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、谷氨酸盐和天冬氨酸盐，分别以无热原水配置成20μM的溶液；
(2)取上述溶液100μl分别与等体积的LPS溶液(0.25ng/ml)混合，同时设立对照组，对照组为100μl无热原水与等体积的LPS溶液(0.25ng/ml)混合，37℃孵育30分钟，然后各组取100μl，分别加入含有100μl鲎试剂溶液的检测管中，按照32 Well Kinetic TubeReader(ATi321-06)细菌内毒素测定系统操作说明，采用动态浊度法检测各组LPS值，每个浓度重复检测3次；
16.2实验结果：各种苦柯胺B盐均能在体外中和LPS，结果如图2所示。其中，图2A是苦柯胺B苹果酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、盐酸盐和硫酸盐的实验结果；图2.B是苦柯胺B对甲苯磺酸盐、谷氨酸盐、醋酸盐、马来酸盐、天冬氨酸盐、氢溴酸盐和磷酸盐的实验结果。
实施例17：苦柯胺B盐抑制LPS诱导RAW264.7细胞释放炎症介质的实验
17.1实验方法：采用DMEM培养液将RAW264.7细胞稀释至1×106/ml，加入96孔板(200μl/孔)，在37℃、体积分数为5％的CO2条件下孵育4小时，贴壁后更换细胞上清为200μl无血清的DMEM培养液，然后加入LPS(终浓度100ng/ml)，同时分别加入终浓度为0，50，100，200μM的各种苦柯胺B盐(包括苦柯胺B苹果酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、谷氨酸盐、醋酸盐、盐酸盐和硫酸盐)，空白对照组(Medium)不加LPS，继续孵育4小时，取上清，按照ELISA试剂盒操作说明检测TNF-α的浓度。
17.2实验结果：各种苦柯胺B盐均能抑制LPS诱导RAW264.7细胞释放炎症介质TNF-α，实验结果如图3所示。其中，图3A为苦柯胺B苹果酸盐的实验结果；图3.B为苦柯胺B琥珀酸盐的实验结果；图3.C为苦柯胺B乳酸盐的实验结果；图3.D为苦柯胺B酒石酸盐的实验结果；图3.E为苦柯胺B甲磺酸盐的实验结果；图3.F为苦柯胺B对甲苯磺酸盐的实验结果；图3.G为苦柯胺B谷氨酸盐的实验结果；图3.H为苦柯胺B醋酸盐的实验结果；图3.I为苦柯胺B盐酸盐的实验结果；图3.J为苦柯胺B硫酸盐的实验结果。
实施例18：苦柯胺B盐抑制CpG DNA诱导RAW264.7细胞释放炎症介质的试验
18.1实验方法：采用DMEM培养液将RAW264.7细胞稀释至1×106/ml，加入96孔板(200μl/孔)，在37℃、体积分数为5％的CO2条件下孵育4小时，贴壁后更换细胞上清为200μl无血清的DMEM培养液，然后加入CpG DNA(终浓度10μg/ml)，同时分别加入终浓度为0，50，100，200μM的各种苦柯胺B盐(包括苦柯胺B苹果酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、谷氨酸盐、醋酸盐、盐酸盐和硫酸盐)，空白对照组(Medium)不加LPS，继续孵育4h，取上清，按照ELISA试剂盒操作说明检测TNF-α的浓度。
18.2实验结果：各种苦柯胺B盐均能抑制CpG DNA诱导RAW264.7细胞释放炎症介质TNF-α，实验结果如图4所示。其中，图4A为苦柯胺B苹果酸盐的实验结果；图4.B为苦柯胺B琥珀酸盐的实验结果；图4.C为苦柯胺B乳酸盐的实验结果；图4.D为苦柯胺B酒石酸盐的实验结果；图4.E为苦柯胺B甲磺酸盐的实验结果；图4.F为苦柯胺B对甲苯磺酸盐的实验结果；图4.G为苦柯胺B谷氨酸盐的实验结果；图4.H为苦柯胺B醋酸盐的实验结果；图4.I为苦柯胺B盐酸盐的实验结果；图4.J为苦柯胺B硫酸盐的实验结果。

Claims (1)

1.一种苦柯胺B盐的制备方法，其特征在于，该苦柯胺B盐具有如下化学结构
其中，A为盐酸或氢溴酸或硫酸或磷酸或醋酸或马来酸或琥珀酸或苹果酸或乳酸或酒石酸或甲磺酸或对甲苯磺酸或谷氨酸或天冬氨酸中的任意一种，其制备方法有以下步骤：
(1)取下式中的化合物Ⅰ与氢溴酸在100～160℃反应，生成化合物Ⅱ，化合物Ⅰ：氢溴酸的当量比为1：2～5；
(2)将化合物Ⅱ溶于N,N-二甲基甲酰胺中，使反应体系处于N,N-二甲基甲酰胺溶液环境中,加入碳酸钾和苄氯，60～100℃反应，生成化合物Ⅲ，化合物Ⅱ：碳酸钾：苄氯的当量比为1：3～6：3～5；
(3)将化合物Ⅲ加入氢氧化钠溶液中，加入甲醇，使反应体系处于甲醇溶液环境中，40～90℃反应，生成化合物Ⅳ，化合物Ⅲ：氢氧化钠的当量比为1：1～3；
(4)将化合物Ⅳ溶解于二氯甲烷中，加入N,N-二甲基甲酰胺，使反应体系处于二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺混合溶液环境中，加入二氯亚砜，45～65℃反应，生成化合物Ⅴ，化合物Ⅳ：二氯亚砜的当量比为1：1～2；
(5)将氢氧化钠溶液加入化合物Ⅵ中，加入二碳酸二叔丁酯的乙醇溶液，室温下反应，生成化合物Ⅶ，氢氧化钠：化合物Ⅵ：二碳酸二叔丁酯的当量比为1～2：1：0.5～1；
(6)将化合物Ⅶ溶解于甲醇中，使反应体系处于甲醇溶液环境中，加入丙烯腈的甲醇溶液，室温下反应，生成化合物Ⅷ，化合物Ⅶ：丙烯腈的当量比为1：1～2；
(7)在化合物Ⅷ中加入四氢呋喃和三乙胺，使反应体系处于四氢呋喃和三乙胺混合溶液环境中，加入氯甲酸苄酯的四氢呋喃溶液，室温下反应，生成化合物Ⅸ，化合物Ⅷ：氯甲酸苄酯的当量比为1：1～2；
(8)取化合物Ⅸ于高压釜中，加入饱和的氨气的甲醇溶液至完全溶解，加入相当于化合物Ⅸ质量10～50％的雷尼镍，换气，使体系处于1～10MPa的氢气压力下，35～50℃反应，生成化合物Ⅹ；
(9)将化合物Ⅹ溶解于二氯甲烷中，加入三乙胺，使反应体系处于二氯甲烷和三乙胺混合溶液环境中，于0℃以下将化合物Ⅴ的二氯甲烷溶液加入其中，反应生成化合物Ⅺ，化合物Ⅹ：化合物Ⅴ的当量比为1：1～1.5；
(10)将化合物Ⅺ溶解于二氯甲烷中，使反应体系处于二氯甲烷溶液环境中，加入三氟乙酸，室温下反应，生成化合物Ⅻ，化合物Ⅺ：三氟乙酸的当量比为1：2～5；
(11)将化合物Ⅻ溶于甲醇中，加入三乙胺，使反应体系处于甲醇和三乙胺的混合溶液环境中，升温至50～80℃，加入丙烯腈的甲醇溶液，降至室温反应，生成化合物ⅩⅢ，化合物Ⅻ：丙烯腈的当量比为1：1～2；
(12)将化合物ⅩⅢ溶解于二氯甲烷中，加入三乙胺，使反应体系处于二氯甲烷和三乙胺混合溶液环境中，于0℃以下将化合物Ⅴ的二氯甲烷溶液加入其中，反应生成化合物ⅩⅣ，化合物ⅩⅢ：化合物Ⅴ的当量比为1：1～1.5；
(13)取化合物ⅩⅣ于高压釜中，加入饱和的氨气的甲醇溶液与四氢呋喃的混合溶液至完全溶解，使反应体系处于该溶液环境中，加入相当于化合物ⅩⅣ质量10～50％的雷尼镍，换气，使体系处于1～10MPa的氢气压力下，35～50℃反应，生成化合物ⅩⅤ；
(14)将化合物ⅩⅤ与苦柯胺B盐结构式中A所述的任意一种酸置于高压釜中，加入甲醇、四氢呋喃与水的混合溶液至完全溶解，使反应体系处于该溶液环境中，加入相当于化合物ⅩⅤ质量10～30％的钯碳，换气，使反应体系处于1～10MPa的氢气压力下，25～45℃反应，生成苦柯胺B盐，化合物ⅩⅤ：酸的当量比为1：1～8。
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