CN115215771B - 和厚朴酚衍生物及制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

和厚朴酚衍生物及制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明以和厚朴酚为原料，合成了两种和厚朴酚衍生物，分别具有如式VI和式VII所示的结构式：

Description

和厚朴酚衍生物及制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，具体是和厚朴酚衍生物及其制备方法，以及以和厚朴酚衍生物为活性成分的药物组合物在治疗恶性肿瘤中的应用。
背景技术
和厚朴酚(honokiol)是中药厚朴(Magnolia officinalis)的有效成分之一，结构上属于联苯型新木脂素类。现代药理学研究表明，和厚朴酚具有多种药理作用，如抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗血小板、降低胆固醇等，特别是抗肿瘤作用备受关注。我国拥有丰富的中药材资源，从中提取分离得到活性化合物/先导化合物，并对其进行结构修饰，增强药理活性、降低毒副作用、改善药代动力学性质等，是实现中药现代化和创制新药的有效途径之一。
和厚朴酚于1972年首次被报道以来，在抗肿瘤作用研究方面取得了重大进展，目前已处于临床I期(肺癌)研究阶段，是极具开发前景的天然产物之一。但是，和厚朴酚具有单用抗肿瘤活性不显著、水溶性差等缺点，严重限制了其临床应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一系列和厚朴酚衍生物及其制备方法和在制备临床抗肿瘤药物中，以和厚朴酚为原料制备了两类结构的和厚朴酚衍生物，阐明其生物活性，并证明和厚朴酚衍生物VI-1、VI-2、VI-3、VII-1、VII-2、VII-3具有较强的抑制四种肿瘤细胞增殖的作用。其中，和厚朴酚衍生物VII-1具有较强的诱导人鼻咽癌CNE-2Z细胞凋亡、抑制CNE-2Z细胞增殖、迁移与侵袭的作用。
为实现上述目的，本发明提供了两种和厚朴酚衍生物，分别具有如式VI和式VII所示的结构式：
其中，R是
其制备方法包括以下步骤：
(1)将和厚朴酚溶于二甲基甲酰胺中，加入25％碳酸钠水溶液和对氟苄氯、邻氟苄氯或间氟苄氯，在70～75℃温度下反应3～4h，纯化得第一步产物；
(2)将第一步产物置于反应瓶中，然后依次加入25％的氢氧化钠溶液、TBAB和氯仿，65℃温度下反应2～3h，降至室温后，纯化得第二步产物；
(3)取第二步产物加入无水乙醇中，加入碳酸氨基胍和冰醋酸，65℃温度下反应3～4h，减压浓缩，纯化得式VI或式VII所示的和厚朴酚衍生物。
其中，和厚朴酚与对氟苄氯、邻氟苄氯或间氟苄氯的摩尔比是1：(0.65～1)；第二步产物与碳酸氨基胍的摩尔比是1：(1.5～4)。
上述式VI和式VII所示的和厚朴酚衍生物都以和厚朴酚为原料，制备方法简单，能够快速大量地制备和厚朴酚衍生物，操作简单可行，无污染，成本低廉，收率稳定，且重复性好。制备的两种和厚朴酚衍生物具有较强的抑制四种肿瘤细胞(鼻咽癌CNE-2Z细胞、人胃癌SG7901细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和睾丸癌I-10细胞)增殖的作用。其中，式VII-1所示的和厚朴酚衍生物具有较强的诱导人鼻咽癌CNE-2Z细胞凋亡、抑制人鼻咽癌CNE-2Z细胞增殖、迁移与侵袭的作用。
本发明还提供了式VI和式VII所示的和厚朴酚衍生物在制备临床抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤为人鼻炎瘤(鼻咽癌)、人胃瘤(胃癌)、人乳腺瘤(乳腺癌)或睾丸瘤(睾丸癌)。
本发明的两种和厚朴酚衍生物具有较强的抑制四种肿瘤细胞(MDA-MB-231、SMMC7721、HepG2和SW480)增殖的作用，且式VII-1所示的和厚朴酚衍生物具有较强的诱导人鼻咽癌CNE-2Z细胞凋亡、抑制CNE-2Z细胞增殖、迁移与侵袭的作用，具有很好的临床抗肿瘤药的应用前景。
所述的和厚朴酚衍生物被用于制成肠道或非肠道组合药的剂型。剂型为液体制剂、片剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、胶囊、缓释剂、滴丸剂或注射剂。剂型的给药方式为口服给药或注射给药。
附图说明
图1是和厚朴酚衍生物的合成路线图。
图2是和厚朴酚衍生物VII-1对人鼻咽癌CNE-2Z细胞增殖的影响。
图3是和厚朴酚衍生物VII-1的体内抗肿瘤活性。
图4是和厚朴酚衍生物VII-1诱导人鼻咽癌CNE-2Z细胞凋亡的作用。
图5是免疫印迹法和厚朴酚衍生物VII-1对人鼻咽癌CNE-2Z细胞内的Bax、Bcl-2蛋白的表达的影响。
图6是和厚朴酚衍生物VII-1对人鼻咽癌CNE-2Z细胞迁移的影响。
图7是和厚朴酚衍生物VII-1对人鼻咽癌CNE-2Z细胞侵袭的影响。
图8是免疫印迹法和厚朴酚衍生物VII-1对人鼻咽癌CNE-2Z细胞内的MMP-2、MMP-9、HIF-1α蛋白的表达的影响。
具体实施方式
以下结合实施例进一步说明发明。
实施例1.第一步产物的制备：
(1)化合物I-1、II-1和III-1的制备：
取和厚朴酚550mg(2.1mmol)溶解于6mL二甲基甲酰胺(DMF)中，加入4mL 25％碳酸钠水溶液和255μL对氟苄氯(2.1mmol)，在75℃油浴中持续搅拌4小时，TLC监控反应(展开剂：石油醚:乙酸乙酯＝5:1)，降至室温后，并用乙酸乙酯萃取，蒸干乙酸乙酯。采用正相硅胶色谱分离，用石油醚:乙酸乙酯＝80:1至20:1的洗脱液进行梯度洗脱，分别得到化合物I-1(44.9mg)、II-1(52.4mg)和III-1(77.1mg)。
化合物I-1(黄色油状物,产率为18％),1H-NMR(600MHz,CD3OD):δ7.29(m,2H),7.23(d,1H,J＝2.2Hz),7.14(dd,1H,J＝2.2,8.2Hz),7.06(d,1H,J＝2.2Hz),7.03(dd,1H,J＝2.3,8.3Hz),7.00(m,1H),6.99(m,2H),6.78(d,1H,J＝8.3Hz),5.91-5.99(m,2H),4.94-5.06(m,4H),4.93(s,2H),3.33(m,4H).13C-NMR(150MHz,CD3OD):δ161.6(C-5”),160.0(C-4'),152.3(C-2),136.4(C-8),135.5(C-8'),132.0(C-2'),131.4(C-5),130.1(C-1'),129.5(C-6),128.9(C-4),128.3(C-2”),127.5(C-3”),127.4(C-7”),126.4(C-6'),125.9(C-3'),124.2(C-1),113.1(C-3),113.0(C-9),112.8(C-9'),112.5(C-4”),112.5(C-6”),112.3(C-5'),68.4(2-OCH2 C6H4),37.5(C-7),32.4(C-7').HR-ESI-MS:分子式为C25H23FO2,m/z 373.1631[M-H]-.
化合物II-1(黄色油状物,产率为21％),1H-NMR(600MHz,CD3OD):δ7.46(m,2H),7.33(dd,1H,J＝2.3,8.4Hz),7.31(d,1H,J＝2.2Hz),7.09(m,2H),6.99(m,2H),6.91(dd,1H,J＝2.2,8.1Hz),6.77(d,1H,J＝8.2Hz),5.07(s,2H),5.91-6.03(m,2H),4.97-5.05(m,4H),3.33(m,4H).13C-NMR(150MHz,CD3OD):δ161.7(C-5”),153.7(C-4'),150.5(C-2),136.6(C-8),135.5(C-8'),132.2(C-2'),130.0(C-5),127.5(C-3”),127.4(C-7”),127.0(C-6),126.9(C-1'),126.7(C-3'),126.7(C-1),126.6(C-2”),126.4(C-4),126.1(C-6'),114.0(C-3),113.3(C-9),113.2(C-9'),112.7(C-4”),112.5(C-6”),109.8(C-5'),67.5(4'-OCH2 C6H4),37.5(C-7),32.7(C-7').HR-ESI-MS:分子式为C25H24FO2,m/z 373.1637[M-H]-.
化合物III-1(黄色油状物,产率为24％),1H-NMR(600MHz,CD3OD):δ7.00-7.47(m,8H,Ar-H),7.31(d,1H,J＝2.3Hz),7.27(dd,1H,J＝2.2,8.2Hz),7.06(dd,1H,J＝2.2,8.3Hz),7.00(d,1H,J＝8.3Hz),7.00(m,1H),6.97(d,1H,J＝2.2Hz),5.89-6.00(m,2H),5.08(s,2H),4.97-5.07(m,2H),4.95(s,2H),3.38(d,2H,J＝6.6Hz),3.34(d,2H,J＝6.6Hz).13C-NMR(150MHz,CD3OD):δ161.7(C-5”),161.6(C-5”'),153.8(C-4'),152.4(C-2),136.3(C-8),135.4(C-8'),132.7(C-2”),132.1(C-2”'),131.9(C-5),131.5(C-2'),129.7(C-1'),129.6(C-1),129.5(C-6),128.9(C-6'),128.9(C-4),128.8(C-3'),127.5(C-3”),127.5(C-7”),126.5(C-3”'),126.4(C-7”'),113.6(C-9),113.4(C-9'),113.3(C-4”),113.2(C-6”),112.8(C-4”'),112.2(C-6”'),112.2(C-3),109.7(C-5'),68.4(2-CH2 C6H4),67.5(4'-CH2 C6H4),37.5(C-7),32.6(C-7').HR-ESI-MS:分子式为C32H28F2O2,m/z 483.2123[M+H]+.
(2)、化合物I-2、II-2和III-2的制备：
取和厚朴酚840mg(3.2mmol)溶解于二甲基甲酰胺(DMF)5mL中，加入25％碳酸钠水溶液4mL，邻氟苄氯(194.4μL,2.1mmol)，在70℃油浴中持续搅拌3小时，TLC监控反应(展开剂:石油醚:乙酸乙酯＝5:1)，降至室温后，并用EtOAc萃取，蒸干乙酸乙酯。采用正相硅胶色谱分离，用石油醚:乙酸乙酯＝80:1至20:1的洗脱液进行梯度洗脱，分别得到化合物I-2(60mg)、II-2(127.6mg)和III-2(128.6mg)。
化合物I-2(黄色油状物,产率为15％),1H-NMR(600MHz,CD3OD):δ7.07-7.35(m,4H,Ar-H),7.23(d,1H,J＝2.3Hz),7.14(dd,1H,J＝2.3,8.2Hz),7.06(m,1H),7.05(d,1H,J＝2.3Hz),7.02(d,1H,J＝8.2Hz),6.76(d,1H,J＝8.2Hz),5.90-6.00(m,2H),4.93-5.08(m,4H),5.03(s,2H),3.33(m,4H).13C-NMR(150MHz,CD3OD):δ159.6(C-5”),153.8(C-4'),153.7(C-2),137.8(C-8),137.0(C-8'),133.1(C-2'),131.6(C-5),130.9(C-6),130.4(C-4),129.7(C-1'),129.6(C-1),129.3(C-3'),128.3(C-2”),127.8(C-6'),127.4(C-7”),123.8(C-3”),114.6(C-6”),114.5(C-4”),114.3(C-3),114.1C-9),114.0(C-9'),113.6(C-5'),64.3(2-OCH2 C6H4),39.0(C-7),33.8(C-7').HR-ESI-MS:分子式为C25H24FO2,m/z 373.1662[M-H]-.
化合物II-2(黄色油状物,产率为32％),1H-NMR(600MHz,CD3OD):δ7.12-7.54(m,4H,Ar-H),7.35(dd,1H,J＝2.3,8.3Hz),7.32(d,1H,J＝2.3Hz),7.00(d,1H,J＝2.3Hz),6.92(dd,1H,J＝2.3,8.2Hz),6.78(d,1H,J＝8.2Hz),6.77(d,1H,J＝8.2Hz),5.92-6.02(m,2H),5.07(s,2H),4.96-5.05(m,4H),3.41(d,2H,J＝6.7Hz),3.29(m,2H).13C-NMR(150MHz,CD3OD):δ159.8(C-3”),155.1(C-4'),152.0(C-2),138.1(C-8),137.0(C-8'),131.7(C-1'),131.7(C-5),131.1(C-1),130.7(C-2'),130.2(C-6),129.6(C-5”),129.5(C-7”),128.2(C-3'),127.9(C-4),127.6(C-6'),124.6(C-2”),115.5(C-4”),114.9(C-6”),114.7(C-9),114.2(C-9'),114.0(C-3),111.3(C-5'),63.7(4'-OCH2 C6H4),39.0(C-7),34.2(C-7').HR-ESI-MS:分子式为C25H24FO2,m/z 373.1624[M-H]-.
化合物III-2(黄色油状物,产率为25％),1H-NMR(600MHz,CD3OD):δ7.04-7.54(m,8H,Ar-H),7.34(dd,1H,J＝2.3,8.3Hz),7.32(d,1H,J＝2.3Hz),7.10(m,1H),7.08(d,1H,J＝2.3Hz),7.06(dd,1H,J＝2.2,8.2Hz),7.02(d,1H,J＝8.3Hz),5.87-6.01(m,2H),5.17(s,2H),4.92-5.08(m,2H),5.05(s,2H),3.36(m,4H).13C-NMR(150MHz,CD3OD):δ159.6(C-3”),159.5(C-3”'),155.2(C-4'),153.8(C-2),137.8(C-8),136.8(C-8'),133.1(C-5),131.3(C-1'),131.1(C-1),131.0(C-2'),130.4(C-6),129.6(C-4),129.6(C-5”),129.5(C-7”),129.5(C-2”),129.3(C-6”),129.3(C-5”'),129.3(C-3'),128.0(C-6'),127.8(C-7”'),124.4(C-2”'),124.0(C-6”'),114.7(C-4”),114.5(C-4”'),114.3(C-9),114.2(C-9'),113.5(C-3),111.2(C-5'),64.3(2-CH2 C6H4),63.7(4'-CH2 C6H4),39.0(C-7),34.1(C-7').HR-ESI-MS:分子式为C32H28F2O2,m/z 481.1993[M-H]-.
(3)、化合物I-3、II-3和III-3的制备：
取和厚朴酚522mg(1.96mmol)溶解于二甲基甲酰胺(DMF)5ml中，加入25％碳酸钠水溶液4ml，间氟苄氯(238.1μL,1.96mmol)，在75℃油浴中持续搅拌3.5小时，TLC监控反应(展开剂:石油醚:乙酸乙酯＝5:1)，降至室温后，并用EtOAc萃取，蒸干乙酸乙酯。采用正相硅胶色谱分离，用石油醚:乙酸乙酯＝80:1至20:1的洗脱液进行梯度洗脱，分别得到化合物I-3(63.6mg)、II-3(132mg)和III-3(126mg)。
化合物I-3(黄色油状物,产率为13％),1H-NMR(600MHz,CD3OD):δ7.25(d,1H,J＝2.3Hz),7.16(dd,1H,J＝2.3,8.2Hz),6.95-7.13(m,4H,Ar-H),7.07(d,1H,J＝2.3Hz),7.04(m,1H),6.98(d,1H,J＝8.2Hz),6.79(d,1H,J＝8.2Hz),5.92-6.02(m,2H),4.92-5.07(m,4H),4.97(s,2H),3.35(d,2H,J＝6.6Hz),3.33(d,2H,J＝6.7Hz).13C-NMR(150MHz,CD3OD):δ162.1(C-4”),153.9(C-4'),153.7(C-2),137.8(C-8),137.0(C-8'),133.0(C-2'),131.6(C-5),130.9(C-6),130.4(C-4),129.8(C-1'),129.7(C-1),129.6(C-3'),127.9(C-6'),127.5(C-6”),125.7(C-2”),122.4(C-7”),114.3(C-9),114.1(C-9'),113.8(C-3),113.6(C-3”),113.6(C-5”),113.4(C-5'),69.6(2-OCH2 C6H4),39.0(C-7),33.8(C-7').HR-ESI-MS:分子式为C25H24FO2,m/z 373.1651[M-H]-.
化合物II-3(黄色油状物,产率为27％),1H-NMR(600MHz,CD3OD):δ7.12-7.54(m,4H,Ar-H),7.35(dd,1H,J＝2.3,8.3Hz),7.32(d,1H,J＝2.3Hz),7.00(d,1H,J＝2.3Hz),6.92(dd,1H,J＝2.3,8.2Hz),6.78(d,1H,J＝8.2Hz),6.77(d,1H,J＝8.2Hz),5.92-6.02(m,2H),5.07(s,2H),4.96-5.05(m,4H),3.41(d,2H,J＝6.7Hz),3.29(m,2H).13C-NMR(150MHz,CD3OD):δ162.2(C-4”),155.0(C-4'),152.0(C-2),138.1(C-8),137.0(C-8'),131.6(C-5),131.1(C-2”),130.7(C-2'),130.2(C-6),129.9(C-1'),129.8(C-1),128.2(C-3'),128.0(C-4),127.6(C-6'),122.4(C-6”),115.5(C-7”),114.2(C-9),114.0(C-9'),113.5(C-3”),113.3(C-3),111.2(C-5'),68.8(4'-OCH2 C6H4),39.0(C-7),34.2(C-7').HR-ESI-MS:分子式为C25H24FO2,m/z373.1668[M-H]-.
化合物III-3(黄色油状物,产率为20％),1H-NMR(600MHz,CD3OD):δ7.38(dd,1H,J＝2.3,8.2Hz),7.03-7.30(m,8H,Ar-H),7.09(d,1H,J＝2.3Hz),7.07(dd,1H,J＝2.2,8.3Hz),7.01(m,1H),6.99(d,1H,J＝8.4Hz),5.92-6.00(m,2H),5.14(s,2H),4.96-5.07(m,2H),5.00(s,2H),3.43(d,2H,J＝6.5Hz),3.34(d,2H,J＝6.7Hz).13C-NMR(150MHz,CD3OD):δ162.1(C-4”),159.5(C-4”'),155.2(C-4'),153.8(C-2),137.8(C-8),136.8(C-8'),133.0(C-5),131.3(C-1'),131.1(C-1),131.0(C-2'),130.4(C-6),129.9(C-2”),129.8(C-6”),129.6(C-4),128.0(C-6'),128.0(C-2”'),127.9(C-3'),127.8(C-6”'),122.5(C-7”),122.4(C-7”'),114.3(C-9),114.3(C-9'),114.0(C-5”),113.9(C-5”'),113.8(C-3”),113.7(C-3”'),113.3(C-3),111.2(C-5'),69.7(2-CH2 C6H4),68.9(4'-CH2 C6H4),39.0(C-7),34.1(C-7').HR-ESI-MS:分子式为C32H28F2O2,m/z 483.1971[M+H]+.
实施例2、第二步产物的制备：
(1)、化合物IV-1的制备：
称取化合物I-1 34mg(0.1mmol)置于三口烧瓶中，然后依次加入25％的氢氧化钠溶液2mL，TBAB 15mg，氯仿3mL，在恒温磁力搅拌器中油浴65℃反应2h，用TLC实时监控化学反应的进程，展开剂系统为石油醚:乙酸乙酯＝5:1，当产物不再增加时，终止反应。降至室温后，用HCl水溶液调成酸性，并用乙酸乙酯萃取，蒸干乙酸乙酯。采用正相硅胶色谱分离，石油醚:乙酸乙酯＝120:1到20:1的洗脱液梯度洗脱，得到化合物IV-1(27mg)。化合物IV-1(棕色油状物,产率为33.5％),1H-NMR(600MHz,CD3OD):δ9.94(s,1H),7.50(m 1H,),7.48(m,2H),7.41(d,1H,J＝2.2Hz),7.37(d,1H,J＝2.2Hz),7.08(m,2H),7.05(m,1H),5.94-6.05(m,2H),5.00(s,2H),5.00-5.12(m,4H),3.41(d,2H,J＝6.7Hz),3.39(m,2H).13C-NMR(150MHz,CD3OD):δ197.4(5'-CHO),163.2(C-5”),152.7(C-4'),147.7(C-2),138.5(C-8),136.8(C-8'),136.6(C-2'),134.5(C-1'),132.9(C-5),132.2(C-6),131.3(C-1),129.7(C-4),129.2(C-3”),129.1(C-7”),127.7(C-3'),127.2(C-3),126.8(C-6'),124.5(C-2”),118.6(C-5'),114.6(C-9),114.1(C-9'),113.5(C-4”),113.5(C-6”),69.8(2-OCH2 C6H4),39.0(C-7),34.5(C-7').HR-ESI-MS:分子式为C26H23FO3,m/z 401.1563[M-H]-.
(2)、化合物IV-2的制备：
称取化合物I-2 51mg(0.14mmol)置于三口烧瓶中，然后依次加入25％的氢氧化钠溶液3mL，TBAB 22mg，氯仿3mL，在恒温磁力搅拌器中油浴65℃反应3h，用TLC实时监控化学反应的进程，展开剂系统为石油醚:乙酸乙酯＝5:1，当产物不再增加时，终止反应。降至室温后，用HCl水溶液调成酸性，并用乙酸乙酯萃取，蒸干乙酸乙酯。采用正相硅胶色谱分离，石油醚:乙酸乙酯＝120:1到20:1的洗脱液梯度洗脱，得到化合物IV-2(24mg)。化合物IV-2(黄色油状物,产率为21.3％),1H-NMR(600MHz,CD3OD):δ9.89(s,1H),7.44(m,1H),7.38(d,1H,J＝2.3Hz),7.37(m,1H),7.07-7.33(m,4H),6.99(d,1H,J＝8.3Hz),5.87-6.03(m,2H),4.95-5.08(m,4H),5.05(s,2H),3.36(m,4H).13C-NMR(150MHz,CD3OD):δ197.1(3-CHO),158.1(C-3”),153.5(C-4'),151.7(C-2),137.7(C-8),136.4(C-8'),132.8(C-2'),131.0(C-5),130.6(C-6),129.9(C-4),129.6(C-1'),129.1(C-1),128.2(C-3'),127.5(C-2”),126.9(C-6'),124.6(C-6”),124.2(C-7”),123.6(C-5”),121.1(C-5'),114.9(C-4”),114.0(C-9),114.0(C-9'),103.5(C-3),64.0(2-OCH2 C6H4),38.7(C-7),33.3(C-7').HR-ESI-MS:分子式为C26H23FO3,m/z 401.1554[M-H]-.
(3)、化合物IV-3的制备：
称取化合物I-3 77mg(0.21mmol)置于三口烧瓶中，然后依次加入25％的氢氧化钠溶液3mL，TBAB 21mg，氯仿3mL，在恒温磁力搅拌器中油浴65℃反应3h，用TLC实时监控化学反应的进程，展开剂系统为石油醚:乙酸乙酯＝5:1，当产物不再增加时，终止反应。降至室温后，用HCl水溶液调成酸性，并用乙酸乙酯萃取，蒸干乙酸乙酯。采用正相硅胶色谱分离，石油醚:乙酸乙酯＝120:1到20:1的洗脱液梯度洗脱，得到化合物IV-3(30mg)。化合物IV-3(黄色油状物,产率为17.6％),1H-NMR(600MHz,CD3OD):δ9.92(s,1H),7.67(d,1H,J＝2.3Hz),7.64(d,1H,J＝2.3Hz),7.29(d,1H,J＝2.2Hz),7.03-7.26(m,4H,Ar-H),7.14(m,1H),7.04(m,1H),5.89-6.02(m,2H),5.01(s,2H),4.95-5.08(m,4H),3.38(m,4H).13C-NMR(150MHz,CD3OD):δ197.4(5'-CHO),162.1(C-4”),157.9(C-3”),153.5(C-4'),152.0(C-2),138.2(C-8),137.8(C-8'),137.7(C-2”),135.7(C-2'),133.2(C-5),132.4(C-6),131.3(C-1'),130.3(C-1),129.6(C-4),128.5(C-6'),127.8(C-3'),127.2(C-6”),122.5(C-3),115.1(C-7”),114.4(C-9),113.9(C-9'),113.7(C-5”),103.6(C-5').69.6(2-OCH2 C6H4),39.0(C-7),32.5(C-7').HR-ESI-MS:分子式为C26H23FO3,m/z 401.1564[M-H]-.
(4)、化合物V-1的制备：
称取化合物II-1 70mg(0.2mmol)置于三口烧瓶中，然后依次加入25％的氢氧化钠溶液5mL，TBAB 20mg，氯仿5mL，在恒温磁力搅拌器中油浴65℃反应3h，用TLC实时监控化学反应的进程，展开剂系统为石油醚:乙酸乙酯＝5:1，当产物不再增加时，终止反应。降至室温后，用HCl水溶液调成酸性，并用乙酸乙酯萃取，蒸干乙酸乙酯。采用正相硅胶色谱分离，石油醚:乙酸乙酯＝120:1到20:1的洗脱液梯度洗脱，得到化合物V-1(41mg)。化合物V-1(黄色油状物,产率为27％),1H-NMR(600MHz,CD3OD):δ9.92(s,1H),7.48(m,2H),7.44(m,1H),7.41(d,1H,J＝2.2Hz),7.36(d,1H,J＝2.2Hz),7.10(m,2H),7.02(d,1H,J＝8.9Hz),5.96-6.03(m,2H),5.09(s,2H),5.01-5.12(m,4H),3.43(d,2H,J＝6.7Hz),3.41(m,2H).13C-NMR(150MHz,CD3OD):δ197.4(3-CHO),163.2(C-5”),156.7(C-4'),155.8(C-2),137.6(C-8),137.1(C-8'),136.8(C-2'),133.5(C-1'),133.5(C-5),132.0(C-6),131.6(C-1),130.6(C-4),129.0(C-3”),129.0(C-7”),129.8(C-3'),128.3(C-3),128.0(C-6'),120.9(C-2”),115.1(C-4”),114.8(C-9),114.7(C-9'),114.4(C-6”),111.4(C-5'),69.0(4'-OCH2 C6H4),38.5(C-7),34.1(C-7').HR-ESI-MS:分子式为C26H23FO3,m/z 401.1564[M-H]-.
(5)化合物V-2的制备：
称取化合物II-2 132mg(0.36mmol)置于三口烧瓶中，然后依次加入25％的氢氧化钠溶液3mL，TBAB 20mg，氯仿4mL，在恒温磁力搅拌器中油浴65℃反应3h，用TLC实时监控化学反应的进程，展开剂系统为石油醚:乙酸乙酯＝5:1，当产物不再增加时，终止反应。降至室温后，用HCl水溶液调成酸性，并用乙酸乙酯萃取，蒸干乙酸乙酯。采用正相硅胶色谱分离，石油醚:乙酸乙酯＝120:1到20:1的洗脱液梯度洗脱，得到化合物V-2(65mg)。化合物V-2(黄色油状物,产率为22.5％),1H-NMR(600MHz,CD3OD):δ9.94(s,1H),7.14-7.55(m,4H,Ar-H),7.46(d,1H,J＝2.3Hz),7.40(dd,1H,J＝2.3,8.3Hz),7.37(d,1H,J＝2.3Hz),7.20(m,1H),7.08(d,1H,J＝8.4Hz),5.96-6.04(m,2H),5.20(s,2H),4.98-5.13(m,4H),3.42(m,4H).13C-NMR(150MHz,CD3OD):δ197.4(3-CHO),159.8(C-3”),156.7(C-4'),155.7(C-2),137.6(C-8),137.1(C-8'),132.0(C-2'),131.7(C-5),130.8(C-1'),130.6(C-6),129.8(C-1),129.6(C-4),129.6(C-6'),129.2(C-5”),129.2(C-7”),129.2(C-6”),128.5(C-3'),124.0(C-2”),120.9(C-3),115.1(C-4”),114.7(C-9),114.2(C-9'),111.3(C-5'),63.7(4'-OCH2 C6H4),38.5(C-7),34.1(C-7').HR-ESI-MS:分子式为C26H23FO3,m/z 401.1556[M-H]-.
(6)化合物V-3的制备：
称取化合物II-3 57mg(0.14mmol)置于三口烧瓶中，然后依次加入25％的氢氧化钠溶液3mL，TBAB 15mg，氯仿3mL，在恒温磁力搅拌器中油浴65℃反应3h，用TLC实时监控化学反应的进程，展开剂系统为石油醚:乙酸乙酯＝5:1，当产物不再增加时，终止反应。降至室温后，用HCl水溶液调成酸性，并用EtOAc萃取，蒸干乙酸乙酯。采用正相硅胶色谱分离，石油醚:乙酸乙酯＝120:1到20:1的洗脱液梯度洗脱，得到化合物V-3(23mg)。化合物V-3(黄色油状物,产率为20.4％),1H-NMR(600MHz,CD3OD):δ9.92(s,1H),7.45(d,1H,J＝2.3Hz),7.20-7.41(m,4H,Ar-H),7.38(m,1H),7.27(d,1H,J＝2.3Hz),7.20(m,1H),7.03(m,1H),7.01(d,1H,J＝8.3Hz),5.96-6.05(m,2H),5.14(s,2H),5.01-5.12(m,4H),3.46(d,2H,J＝6.6Hz),3.41(d,2H,J＝6.6Hz).13C-NMR(150MHz,CD3OD):δ197.4(3-CHO),162.2(C-4”),156.7(C-4'),155.6(C-2),137.6(C-8),137.1(C-8'),136.8(C-2'),132.0(C-6),131.7(C-5),130.7(C-4),129.9(C-1'),129.9(C-1),129.2(C-2”),128.3(C-6'),128.0(C-7”),128.0(C-3'),122.4(C-6”),120.9(C-3),115.1(C-5”),114.1(C-3”),114.1(C-9),113.9(C-9'),111.3(C-5'),68.8(4'-OCH2 C6H4),38.5(C-7),34.2(C-7').HR-ESI-MS:分子式为C26H23FO3,m/z 401.1562[M-H]-.
实施例3、和厚朴酚衍生物VI-1的制备：
取化合物IV-1 20mg(0.05mmol)，加入无水乙醇4mL，碳酸氨基胍24mg(0.18mmol)，另加入1mL冰乙酸，65℃油浴搅拌反应3h。减压浓缩，用半制备液相(Waters 2535Q,SunFireTM C18色谱柱(250mm x 10mm))50％ACN等度洗脱纯化得和厚朴酚衍生物VI-1(11.3mg)。化合物VI-1(黄色油状物,产率为24.7％),1H-NMR(600MHz,CD3OD):δ8.31(s,1H),7.45(d,1H,J＝2.2Hz),7.41(d,1H,J＝2.3Hz),7.34(m,1H),7.11-7.33(m,4H,Ar-H),7.13(m,1H),7.10(d,1H,J＝8.2Hz),5.91-6.02(m,2H),4.98-5.09(m,4H),5.08(s,2H),3.42(d,2H,J＝6.5Hz),3.37(d,2H,J＝6.5Hz).13C-NMR(150MHz,CD3OD):δ160.5(C-5”),156.2(5'-C＝NH),155.9(C-4'),155.6(C-2),149.6(5'-CH),139.0(C-8),138.4(C-8'),134.7(C-2'),132.8(C-1'),130.8(C-2”),129.4(C-1),128.7(C-5),128.2(C-6),127.6(C-3”),127.5(C-7”),125.8(C-4),124.3(C-3'),123.5(C-6'),118.4(C-3),116.0(C-4”),115.7(C-6”),114.1(C-9),114.1(C-9'),112.2(C-5'),64.2(2-OCH2 C6H4),38.7(C-7),33.1(C-7').HR-ESI-MS:分子式为C28H31FN4O2,m/z 459.2237[M+H]+.
实施例4、和厚朴酚衍生物VI-2的制备：
取化合物IV-2 21.6mg(0.06mmol)，加入无水乙醇5mL，碳酸氨基胍30mg(0.22mmol)，另加入1mL冰乙酸，65℃油浴搅拌反应4h。减压浓缩，用半制备液相(Waters2535Q,SunFireTM C18色谱柱(250mm x 10mm))50％ACN等度洗脱纯化得和厚朴酚衍生物VI-2(15mg)。化合物VI-2(棕色油状物,产率为27.3％),1H-NMR(600MHz,CD3OD):δ8.31(s,1H),7.45(d,1H,J＝2.2Hz),7.41(d,1H,J＝2.3Hz),7.34(m,1H),7.11-7.33(m,4H,Ar-H),7.13(m,1H),7.10(d,1H,J＝8.2Hz),5.91-6.02(m,2H),4.98-5.09(m,4H),5.08(s,2H),3.42(d,2H,J＝6.5Hz),3.37(d,2H,J＝6.5Hz).13C-NMR(150MHz,CD3OD):δ161.1(C-3”),159.5(5'-C＝NH),154.9(C-4'),153.5(C-2),150.9(5'-CH),137.4(C-8),135.8(C-8'),133.9(C-2'),132.9(C-5),130.0(C-6),129.9(C-4),129.9(C-1'),129.5(C-1),129.4(C-3'),129.2(C-2”),127.9(C-6'),127.9(C-7”),124.0(C-3”),123.5(C-6”),116.8(C-4”),114.4(C-9),114.3(C-9'),113.6(C-5'),113.2(C-3),64.2(2-OCH2 C6H4),38.7(C-7),33.1(C-7').HR-ESI-MS:分子式为C28H31FN4O2,m/z 459.2231[M+H]+.
实施例5、和厚朴酚衍生物VI-3的制备：
取化合物IV-3 29.5mg(0.08mmol)，加入无水乙醇4mL，碳酸氨基胍33mg(0.24mmol)，另加入1mL冰乙酸，65℃油浴搅拌反应4h。减压浓缩，用半制备液相(Waters2535Q,SunFireTM C18色谱柱(250mm x 10mm))50％ACN等度洗脱纯化得和厚朴酚衍生物VI-3(20mg)。化合物VI-3(黄色油状物,产率为27.3％),1H-NMR(600MHz,CD3OD):δ8.38(s,1H),7.46(d,1H,J＝2.3Hz),7.41(d,1H,J＝2.2Hz),7.03-7.30(m,4H,Ar-H),7.30(m,1H),7.13(m,1H),7.11(m,1H),5.94-6.00(m,2H),4.98-5.09(m,4H),5.03(s,2H),3.44(d,2H,J＝6.6Hz),3.36(d,2H,J＝6.6Hz).13C-NMR(150MHz,CD3OD):δ164.2(C-4”),162.1(5'-C＝NH),156.7(C-4'),153.7(C-2),150.0(5'-CH),137.8(C-8),137.0(C-8'),133.6(C-2'),131.1(C-5),130.3(C-6),129.7(C-4),129.0(C-1'),129.0(C-1),128.2(C-3'),127.4(C-2”),126.2(C-6'),124.5(C-3”),123.7(C-6”),116.8(C-5'),114.5(C-7”),114.4(C-9),114.3(C-9'),113.2(C-3),113.2(C-3”),63.0(2-OCH2 C6H4),39.0(C-7),34.6(C-7').HR-ESI-MS:分子式为C28H31FN4O2,m/z 459.2233[M+H]+.
实施例6、和厚朴酚衍生物VII-1的制备：
取化合物V-1 25.5mg(0.07mmol)，加入无水乙醇4mL，碳酸氨基胍41mg(0.3mmol)，另加入1mL冰乙酸，65℃油浴搅拌反应3h。减压浓缩，并用半制备液相(Waters 2535Q,SunFireTM C18色谱柱(250mm x 10mm))50％ACN等度洗脱纯化得和厚朴酚衍生物VII-1(17mg)。化合物VII-1(黄色油状物,产率为23.2％),1H-NMR(600MHz,CD3OD):δ8.36(s,1H),7.48(m,2H),7.34(d,1H,J＝2.3Hz),7.33(m,1H),7.32(d,1H,J＝2.2Hz),7.16(d,1H,J＝2.2Hz),7.04(d,1H,J＝8.9Hz),5.94-6.03(m,2H),5.11(s,2H),4.98-5.09(m,4H),3.43(d,2H,J＝6.7Hz),3.36(d,2H,J＝6.6Hz).13C-NMR(150MHz,CD3OD):δ161.6(C-5”),155.6(3-C＝NH),155.3(C-4'),152.3(C-2),150.3(3-CH),137.5(C-8),136.8(C-8'),133.6(C-2'),133.5(C-5),131.8(C-1'),130.8(C-6),130.1(C-1),130.0(C-2”),129.0(C-3”),129.0(C-7”),128.8(C-4),128.4(C-3'),128.0(C-6'),118.4(C-3),114.8(C-9),114.7(C-6”),114.7(C-4”),114.3(C-9'),111.4(C-5'),63.7(4'-OCH2C6H4),38.7(C-7),34.2(C-7').HR-ESI-MS:分子式为C28H31FN4O2,m/z 459.2252[M+H]+.
实施例7、和厚朴酚衍生物VII-2的制备：
取化合物V-2 30mg(0.07mmol)，加入无水乙醇4mL，碳酸氨基胍30mg(0.22mmol)，另加入1mL冰乙酸，65℃油浴搅拌反应3h。减压浓缩，并用半制备液相(Waters 2535Q,SunFireTM C18色谱柱(250mm x 10mm))50％ACN等度洗脱纯化得和厚朴酚衍生物VII-2(13mg)。化合物VII-2(黄色油状物,产率为20.3％),1H-NMR(600MHz,CD3OD):δ8.37(s,1H),7.14-7.56(m,4H,Ar-H),7.36(m,1H),7.34(m,2H),7.17(d,1H,J＝2.3Hz),7.09(d,1H,J＝8.3Hz),5.96-6.03(m,2H),5.20(s,2H),4.98-5.11(m,4H),3.43(d,2H,J＝6.7Hz),3.38(d,2H,J＝6.7Hz).13C-NMR(150MHz,CD3OD):δ161.5(C-3”),155.6(3-C＝NH),155.3(C-4'),152.3(C-2),150.3(3-CH),137.5(C-8),136.8(C-8'),133.6(C-2'),131.8(C-1'),130.7(C-1),130.3(C-6),129.9(C-5),129.7(C-4),129.6(C-5”),128.7(C-6'),128.6(C-2”),128.3(C-3'),128.1(C-7”),124.0(C-6”),118.3(C-3),117.8(C-4”),114.9(C-9),114.3(C-9'),111.4(C-5'),63.7(4'-OCH2 C6H4),38.7(C-7),34.2(C-7').HR-ESI-MS:分子式为C28H31FN4O2,m/z459.2222[M+H]+.
实施例8、和厚朴酚衍生物VII-3的制备：
取化合物V-3 56mg(0.14mmol)，加入无水乙醇4mL，碳酸氨基胍30mg(0.22mmol)，另加入1mL冰乙酸，65℃油浴搅拌反应3h。减压浓缩，并用半制备液相(Waters 2535Q,SunFireTM C18色谱柱(250mm x 10mm))50％ACN等度洗脱纯化得和厚朴酚衍生物VII-3(21.2mg)。化合物VII-3(淡黄色油状物,产率为16.5％),1H-NMR(600MHz,CD3OD):δ8.37(s,1H),7.03-7.41(m,4H,Ar-H),7.40(m,1H),7.34(m,2H),7.17(d,1H,J＝2.3Hz),7.05(m,1H),5.96-6.07(m,2H),5.17(s,2H),5.02-5.11(m,4H),3.48(d,2H,J＝6.5Hz),3.38(d,2H,J＝6.6Hz).13C-NMR(150MHz,CD3OD):δ163.8(C-4”),155.5(3-C＝NH),155.3(C-4'),152.3(C-2),150.3(3-CH),140.5(C-2”),137.5(C-8),136.8(C-8'),133.6(C-2'),131.8(C-5),130.7(C-6),130.2(C-1'),129.9(C-1),129.7(C-4),128.8(C-6”),128.4(C-6'),128.3(C-3'),122.4(C-7”),118.1(C-3),114.7(C-3”),114.4(C-9),114.1(C-9'),113.5(C-5”),111.4(C-5'),68.8(4'-OCH2 C6H4),38.7(C-7),34.2(C-7').HR-ESI-MS:分子式为C28H31FN4O2,m/z 459.2236[M+H]+.
实施例9、MTT法检测实施例3—8制备的和厚朴酚衍生物VI-1、VI-2、VI-3、VII-1、VII-2和VII-3对四种肿瘤细胞(人鼻炎癌CNE-2Z细胞、人胃癌SG7901细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、睾丸癌I-10细胞)增殖的影响：
(1)实验材料：
细胞株：人鼻炎癌CNE-2Z细胞、人胃癌SG7901细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、睾丸癌I-10细胞来源于中国上海细胞库。
试剂与材料：顺铂(DDP)、MTT购自美国Sigma公司；DMEM或RPMI1640培养液、DMSO、0.25％胰蛋白酶、青霉素和链霉素购自Hyclone；96孔培养板购自Corning公司；胎牛血清购自中国杭州四季青生物技术公司。
仪器：SP-DJ系列垂直净化工作台(上海普通物理光学仪器厂)，二氧化碳培养箱(Thermo Scientific公司)，多功能酶标仪(美国BioTek公司)，倒置显微镜(日本Olympus公司)。
(2)方法：
将上述4种肿瘤细胞分别接种于DMEM或RPMI1640(含10％灭活胎牛血清，100IU/l青霉素，100μg/mL链霉素)，置5％CO2、37℃饱和湿度环境下培养并传代。取对数生长期的肿瘤细胞，用0.25％胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，按每孔5000个细胞的密度接种于96孔板中，置于培养箱中培养。培养16小时后，处理不同浓度的化合物以及顺铂(阳性对照组)，每个处理3个复孔，继续培养72小时(VII-1对鼻咽癌CNE-2Z细胞作用24小时、48小时及72小时)。培养结束后，每孔加入10μL浓度为5g/L的MTT溶液继续孵育4小时，弃去培养液，并加入DMSO 150μL，置于37℃孵育30分钟，微量振荡器振荡10分钟使结晶物充分溶解，用酶标仪在570nm波长下检测每孔的吸光度(A)值，计算细胞存活率：细胞存活率/％＝实验组A570nm/对照组A570nm×100％，绘制剂量效应曲线。
(3)实验结果：从表1结果可看出，和厚朴酚衍生物VI-1、VI-2、VI-3、VII-1、VII-2、VII-3具有较强的体外抑制四种肿瘤细胞增殖的作用，其半数抑制浓度(IC50)值范围为5.30～19.18μmol/L。
(4)实验结果：从图2可以看出，随着新化合物VII-1给药浓度的增加及作用时间的延长，人鼻咽癌CNE-2Z细胞存活率逐渐降低，呈现浓度、时间依赖性。
表1.和厚朴酚衍生物对四种肿瘤细胞增殖的影响(IC50,μM)
实施例10、评价和厚朴酚衍生物VII-1的体内抗肿瘤活性：
(1)方法：购买BALB/c品系裸鼠、4周龄、体重18～20g，于蚌埠医学院实验动物中心(SPF级)进行实验。取生长状态良好的人鼻咽癌CNE-2Z细胞进行消化、离心、计数，用无菌PBS缓冲液调配成5×106/mL悬液，在每只小鼠的背部经皮下注射方式，注入100μL细胞混悬液。待肿瘤细胞成功接种后，肿瘤体积达到100mm3左右时，将裸鼠分组为空白对照组、和厚朴酚衍生物VII-1(10mg/kg)、阳性对照组(顺铂,3mg/kg)，每组4只裸鼠。给药方式为腹腔注射，周期为3天一次，各药19天。每次给予化合物处理时，测定裸鼠瘤体的大小，计算公式为：瘤体积V＝length×width2/2。给药19天后，将裸鼠经脊椎脱臼处死，把瘤体从裸鼠体内剥离出，用PBS清洗、滤纸擦干，拍照并称量瘤组织的重量。统计学处理：用SPSS16.0统计软件处理数据，数值是用均数±标准差表示，实验组与空白组比较用单因素方差处理及Dunnette-t检验处理，P值小于0.05时可认为两组数据间差异具有统计学意义。
(2)实验结果：瘤体的生长曲线(图3)显示，和厚朴酚衍生物VII-1处理组与空白对照组比较，具有显著抑制肿瘤生长的活性，其抑制率为65.7％(P<0.05)。另外，VII-1组裸鼠体重与空白对照组比较，没有出现体重下降、消瘦情况。
实施例11、和厚朴酚衍生物VII-1诱导人鼻咽癌CNE-2Z细胞凋亡的作用：
(1)实验材料：
试剂与材料：6孔培养板购自Corning公司；Annexin V-FITC/PI双染试剂盒购自贝博生物。
仪器：流式细胞仪(美国BD公司)。
(2)方法：取处于对数生长期的CNE-2Z细胞，按每孔3×105个细胞的密度接种于6孔板中，置于培养箱中培养至贴壁。然后，更换含有和厚朴酚衍生物VII-1(2.5μmol/L,5μmol/L,10μmol/L)或等体积DMSO的新鲜培养液，继续培养24小时。药物作用时间结束后，用0.25％胰酶消化细胞，并收集细胞，置于1500rpm离心10分钟，弃上清液。用预冷的AnnexinV结合液重悬细胞，置冰浴，每管分别加入5μL的Annexin V-FITC染液和5μL的PI染液，避光染色20分钟后，用流式细胞仪检测分析。
(3)实验结果：如图4所示，和厚朴酚衍生物VII-1随着给药浓度(2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)的增加，诱导人鼻咽癌CNE-2Z细胞凋亡比列逐渐升高，其凋亡率分别为12.12％、12.07％、47.57％。
实施例12、免疫印迹法检测和厚朴酚衍生物VII-1对人鼻咽癌细胞中Bax、Bcl-2蛋白表达的影响：
(1)实验材料：
抗体：PVDF膜、曝光液购自美国Millipore公司；Bax、Bcl-2抗体购自Proteintech公司。
仪器：凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)。
(2)方法：
取处于对数生长期的CNE-2Z细胞，按每孔3×105个细胞的密度接种于6孔板中，置于培养箱中培养18小时至贴壁。按实验设计，更换含有不同浓度和厚朴酚衍生物VII-1(2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)或等体积DMSO的新鲜培养液，继续培养24小时。培养结束后，收集细胞，置于2500rpm离心10分钟，弃上清液。每孔加入50μL含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，置冰上裂解30分钟后，置12000rpm离心30分钟，取上清液用BCA法定量。每组取40μg蛋白进行SDS-PAGE电泳(积层胶恒压50V，分离胶恒压100V，电泳至溴酚蓝燃料到达凝胶最前沿，停止电泳)。
(转膜)：电泳结束后揭胶，并将凝胶浸于适量的Transfer buffer中。同时取适当大小的PVDF膜和4张3M滤纸，将PVDF先在无水甲醇中浸湿，然后同滤纸一起浸于Transferbuffer中，膜放阳极、胶放阴极，两面各垫2张3M滤纸，恒压60V，4℃层析柜中转膜2小时。
(封膜)：将转有蛋白的膜浸于含10％脱脂奶粉的TBST中封闭1小时。杂交：取出已封闭的膜，然后浸于一定比例稀释的Bax、Bcl-2一抗(含5％脱脂奶粉的TBST，pH 7.4配制)，在4℃过夜。TBST漂洗5次(每次5分钟)，再浸于1:2000稀释的二抗(含5％脱脂奶粉的TBST，pH 7.4配制)中，在室温1小时，TBST漂洗4次(每次5分钟)。配制显色液(ECL A 0.5mL,ECL B0.5mL)，放置凝胶成像系统中显色分析。
(3)实验结果：图5结果显示，和厚朴酚衍生物VII-1在2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L浓度条件下，上调促凋亡蛋白Bax的表达，而减少抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而使Bax、Bcl-2的比例明显升高。
实施例13、Transwell小室法检测和厚朴酚衍生物VII-1对人鼻咽癌CNE-2Z细胞迁移能力的影响
(1)实验材料：
多聚甲醛购自美国Sigma公司；Transwell购自Costar公司；倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)。
(2)方法：
取对数生长期CNE-2Z细胞，消化离心，用含和厚朴酚衍生物VII-1无血清培养基稀释细胞至5×105/mL，每个transwell小室中加入100μL，下室每孔加入含5％胎牛血清的DMEM高糖培养基600μL，培养24小时后取出小室，用棉签擦去小室上层未迁移的细胞，4％多聚甲醛室温固定15分钟，0.1％结晶紫染色15分钟，各取5个400×视野显微镜下观察拍照。迁移抑制率/％＝(1－实验组迁移细胞数/对照组迁移细胞数)×100％。
(3)实验结果：图6结构显示，和厚朴酚衍生物VII-1处理人鼻咽癌CNE-2Z细胞24小时后，可观察到该化合物具有显著的抑制CNE-2Z细胞迁移能力。和厚朴酚衍生物VII-1在不同浓度1μmol/L、3μmol/L、6μmol/L条件下，抑制细胞迁移能力，并呈现浓度依赖性。
实施例14、Transwell小室法检测和厚朴酚衍生物VII-1对人鼻咽癌CNE-2Z细胞侵袭能力的影响
(1)实验材料
多聚甲醛购自美国Sigma公司；Transwell购自Costar公司；倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)。
(2)方法
将预冷的matrigel胶与无血清的DMEM培养基按1:6稀释，用预冷的200μL枪头以每孔50μL均匀铺于transwell小室底部膜内，置培养箱30分钟使之成胶。取对数生长期CNE-2Z细胞，消化离心，用含和厚朴酚衍生物VII-1无血清培养基稀释细胞至5×105/mL，每个transwell小室中加入100μL，下室每孔加入含5％胎牛血清的DMEM高糖培养基600μL，培养36小时后取出小室，用棉签擦去小室上层未侵袭的细胞，4％多聚甲醛室温固定15分钟，0.1％结晶紫染色15分钟，各取5个400×视野显微镜下观察拍照。侵袭抑制率/％＝(1－实验组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数)×100％。
(3)实验结果：图7结构显示，和厚朴酚衍生物VII-1处理人鼻咽癌CNE-2Z细胞36小时后，可观察到该化合物具有显著的抑制CNE-2Z细胞迁移能力。和厚朴酚衍生物VII-1在不同浓度1μmol/L、3μmol/L、6μmol/L条件下，抑制CNE-2Z细胞侵袭作用，并呈现浓度依赖性。
实施例15、免疫印迹法检测和厚朴酚衍生物VII-1对人鼻咽癌细胞中MMP-2、MMP-9、HIF-1α蛋白表达的影响
(1)实验材料：
抗体：PVDF膜、曝光液购自美国Millipore公司；基质胶购自BD公司；MMP-2、MMP-9、HIF-1α抗体购自Abcam公司。
仪器：凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)。
(2)方法：
取处于对数生长期的CNE-2Z细胞，按每孔3×105个细胞的密度接种于6孔板中，置于培养箱中培养18小时至贴壁。按实验设计，更换含有不同浓度和厚朴酚衍生物VII-1(2.5μmol/L,5μmol/L,10μmol/L)或等体积DMSO的新鲜培养液，继续培养24小时。培养结束后，收集细胞，置于2500rpm离心10分钟，弃上清液。每孔加入50μL含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，置冰上裂解30分钟后，置12000rpm离心30分钟，取上清液用BCA法定量。每组取40μg蛋白进行SDS-PAGE电泳(积层胶恒压50V，分离胶恒压100V，电泳至溴酚蓝燃料到达凝胶最前沿，停止电泳)。
(转膜)：电泳结束后揭胶，并将凝胶浸于适量的Transfer buffer中。同时取适当大小的PVDF膜和4张3M滤纸，将PVDF先在无水甲醇中浸湿，然后同滤纸一起浸于Transferbuffer中，膜放阳极、胶放阴极，两面各垫2张3M滤纸，恒压60V，4℃层析柜中转膜2小时。
(封膜)：将转有蛋白的膜浸于含10％脱脂奶粉的TBST中封闭1小时。杂交：取出已封闭的膜，然后浸于一定比例稀释的Bax、Bcl-2一抗(含5％脱脂奶粉的TBST，pH 7.4配制)，在4℃过夜。TBST漂洗5次(每次5分钟)，再浸于1:2000稀释的二抗(含5％脱脂奶粉的TBST，pH 7.4配制)中，在室温1小时，TBST漂洗4次(每次5分钟)。配制显色液(ECL A 0.5mL,ECL B0.5mL)，放置凝胶成像系统中显色分析。
(3)实验结果：图8结构显示，和厚朴酚衍生物VII-1在2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L浓度条件下，降低迁移与侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9、HIF-1α的表达。

Claims (8)

1.和厚朴酚衍生物，其特征在于，具有如式VI-1、式VI-2、式VI-3、式VII-1、式VII-2或式VII-3所示的结构式：
2.权利要求1所述的和厚朴酚衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将和厚朴酚溶于二甲基甲酰胺中，加入25％碳酸钠水溶液和对氟苄氯、邻氟苄氯或间氟苄氯，在70～75℃温度下反应3～4h，纯化得第一步产物；
(2)将第一步产物置于反应瓶中，然后依次加入25％的氢氧化钠溶液、TBAB和氯仿，65℃温度下反应2～3h，降至室温后，纯化得第二步产物；
(3)取第二步产物加入无水乙醇中，加入碳酸氨基胍和冰醋酸，65℃温度下反应3～4h，减压浓缩，纯化得式VI-1、式VI-2、式VI-3、式VII-1、式VII-2或式VII-3所示的和厚朴酚衍生物；
其中，所述的第一步产物的结构式为：
第二步产物的结构式为：
3.如权利要求2所述的和厚朴酚衍生物的制备方法，其特征在于：步骤(1)中和厚朴酚与对氟苄氯、邻氟苄氯或间氟苄氯的摩尔比是1：(0.65～1)。
4.如权利要求2或3所述的和厚朴酚衍生物的制备方法，其特征在于：步骤(3)中第二步产物与碳酸氨基胍的摩尔比是1：(1.5～4)。
5.根据权利要求1所述的和厚朴酚衍生物在制备临床抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的肿瘤为人鼻咽癌、人胃癌、人乳腺癌或睾丸癌。
6.根据权利要求5所述和厚朴酚衍生物在制备临床抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的和厚朴酚衍生物被用于制成肠道或非肠道组合药的剂型。
7.根据权利要求6所述和厚朴酚衍生物在制备临床抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的剂型为液体制剂、片剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、胶囊、缓释剂、滴丸剂或注射剂。
8.根据权利要求6所述和厚朴酚衍生物在制备临床抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的剂型的给药方式为口服给药或注射给药。
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